CN112891523A - 猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法 - Google Patents
猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种猪带绦虫Ts14‑3‑3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法，属于基因工程疫苗技术领域，包含以下步骤：1）采用PAS法，全基因合成Ts14‑3‑3.3和sp‑Ts14‑3‑3.3；2）将目的基因克隆至真核表达载体，转入克隆菌株，挑取阳性克隆子测序鉴定和双酶切鉴定重组质粒；3）随后制备两种转染级别质粒，并分别转染人293F胚肾细胞，采用Western blot法鉴定；4）然后将小鼠分成4组；5）于首次免疫后0w、2w、4w、6w、8w收集小鼠血清和脾淋巴细胞进行鉴定。本发明成功制备了猪带绦虫pMZ‑X3‑Ts14‑3‑3.3和pMZ‑X3‑sp‑Ts14‑3‑3.3两种DNA疫苗。实现了猪带绦虫Ts14‑3‑3.3蛋白在人293F胚肾细胞中的表达。猪带绦虫pMZ‑X3‑Ts14‑3‑3.3和pMZ‑X3‑sp‑Ts14‑3‑3.3两种DNA疫苗均可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程疫苗技术领域，具体为一种猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法。
背景技术
猪带绦虫又称猪肉绦虫、有钩绦虫，是一种主要的人体寄生绦虫。古代医籍中称之为寸白虫或白虫。猪带绦虫病是由猪带绦虫成虫寄生在人体小肠所引起的一种肠绦虫病，又称猪肉绦虫病、链状带绦虫病。人在猪带绦虫生活史中既是终宿主也是中间宿主。猪带绦虫成虫寄生在人肠道为肠猪带绦虫病，其幼虫寄生在人皮下组织、肌肉、脑等组织器官内则为猪囊尾蚴病(囊虫病)。囊虫病是人重要寄生虫病之一。
根据有关研究，猪带绦虫Ts14-3-3蛋白中Ts14-3-3.3亚型在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达，进而利用该蛋白作为囊虫病的诊断和疫苗研究可能具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于利用猪带绦虫Ts14-3-3蛋白，提供一种猪带绦虫Ts14-3-3.3DNA疫苗制备及鉴定方法。
为达到上述目的，采用的技术方案为：
本研究在前期验证猪带绦虫Ts14-3-3蛋白中Ts14-3-3.3亚型在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达的基础上，进一步采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)法，全基因合成Ts14-3-3.3和sp-Ts14-3-3.3抗原编码基因。分别将目的基因克隆至真核表达载体pMZ-X3，转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序鉴定和双酶切鉴定重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3。随后制备两种转染级别质粒，并分别转染人293F胚肾细胞，采用Western blot法鉴定。然后将84只雌性Balb/c小鼠随机分成4组，分别为pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；pMZ-X3空质粒对照组；PBS空白对照组。于首次免疫后0w、2w、4w、6w、8w收集小鼠血清和脾淋巴细胞进行鉴定：①采用间接ELISA法检测血清中特异性IgG及其IgG1和IgG2a亚类水平；②采用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖水平；③采用流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群比例；④采用双抗夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。
采用上述方案的有益效果为：这种猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法具有以下成果：
1.成功构建了猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3重组质粒。2.成功制备了猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3两种DNA疫苗。3.成功实现了猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白在人293F胚肾细胞中的表达。4.猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3两种DNA疫苗均可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且后者免疫效果优于前者。
附图说明
图1为本发明重组质粒构建模式图。
图2为本发明重组质粒的双酶切鉴定。
图3为本发明转染级别质粒鉴定。
图4为本发明蛋白表达Western blot鉴定。
图5为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠血清特异性IgG水平。
图6为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠血清特异性IgG1水平。
图7为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠血清特异性IgG2a水平。
图8为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平。
图9为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗首次免疫后6w小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群比例。
图10为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+亚群比例变化。
图11为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾脏T淋巴细胞CD8+亚群比例变化。
图12为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平。
图13为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-2水平。
图14为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-4水平。
图15为本发明猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-10水平。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。若涉及附图，附图中的相同数字表示相同或同种要素。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公布了一种猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法。
目的：本研究构建pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3重组质粒，分别瞬时转染人293F胚肾细胞并鉴定。随后用两种猪带绦虫DNA疫苗免疫Balb/c小鼠，探讨两者在小鼠体内诱导的免疫应答效果。
方法：本研究在前期验证猪带绦虫Ts14-3-3蛋白中Ts14-3-3.3亚型在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达的基础上，进一步采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)法，全基因合成Ts14-3-3.3和sp-Ts14-3-3.3抗原编码基因。分别将目的基因克隆至真核表达载体pMZ-X3，转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序鉴定和双酶切鉴定重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3。随后制备两种转染级别质粒，并分别转染人293F胚肾细胞，采用Western blot法鉴定。然后将84只雌性Balb/c小鼠随机分成4组，分别为pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；pMZ-X3空质粒对照组；PBS空白对照组。于首次免疫后0w、2w、4w、6w、8w收集小鼠血清和脾淋巴细胞：①采用间接ELISA法检测血清中特异性IgG及其IgG1和IgG2a亚类水平；②采用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖水平；③采用流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群比例；④采用双抗夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。
2.1Ts14-3-3.3和sp-Ts14-3-3.3抗原编码基因的合成
根据在NCBI上查找的基因序列(登录号：AHB59733.1)，对Ts14-3-3.3进行密码子优化。采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，合成Ts14-3-3.3，其中，分泌表达型在N段添加sp信号肽序列，首尾引物分别引入XbaI(TCTAGA)-AgeI(ACCGGT)酶切位点和保护碱基，合成基因Ts14-3-3.3和sp-Ts14-3-3.3。
2.2重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3的构建与鉴定
分别将合成的Ts14-3-3.3和sp-Ts14-3-3.3目的基因经双酶切连入真核表达载体pMZ-X3的XbaI(TCTAGA)-AgeI(ACCGGT)两个酶切位点之间，构建重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3。之后分别转化至大肠杆菌Top 10感受态细胞，挑取阳性克隆子后抽提质粒，并进行测序鉴定和酶切鉴定。重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3酶切反应体系如下：
重组质粒pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3酶切反应体系如下：
如图1，重组质粒构建模式图，其中A：重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3构建模式图；B：重组质粒pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3构建模式图。
2.3猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3 DNA疫苗的制备及鉴定
2.3.1转染级别质粒的制备
将测序正确的阳性克隆质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3分别转入生长至对数期的DH5α感受态细胞，扩大培养。
(1)400mL菌液，9000rpm离心10min，收集菌体。
(2)25mL缓冲液重悬菌体沉淀，涡旋振荡至悬浮。
(3)25mL裂解液缓慢上下翻转4-7次，使菌体充分裂解，室温放置4min。
(4)25mL中和液立即缓慢上下翻转4-7次，充分混匀。冰上静置3-5min，13000rpm离心10min，小心将上清移至50mL离心管，冰上预冷。
(5)加入0.1体积冰预冷的内毒素清除剂，颠倒旋转混匀7-10次，冰浴10min，中途颠倒混匀几次。
(6)42℃水浴孵育20-30min。
(7)室温1200rpm离心10min分相。(上层水相含DNA，下层油状相含内毒素。)
(8)上层水相转移至新管，弃油状层。
(9)加入0.5体积结合液PB，充分混匀，转入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心30-60s，弃收集管中废液。
(10)加入漂洗液，13000rpm离心30-60s，弃废液。
(11)将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2min，除去漂洗液。
(12)取出吸附柱，放入离心管中，加500μL洗脱缓冲液，室温放置2min，13000rpm离心1min，收集质粒。
2.3.2琼脂糖凝胶电泳检测
(1)清洗制胶板并晾干，胶带封住两端，水平放置后插上样品梳。
(2)称取1g琼脂糖加入100mL电泳缓冲液中，摇匀。置微波炉中加热至完全融化。
(3)将冷却到60℃琼脂糖溶液倒入电泳槽水平板，室温下凝固。
(4)去掉两端胶布，将凝胶放入电泳槽并加电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，再垂直向上拔出梳子。
(5)将DNA样品与加样缓冲液按2：1混匀，用微量移液器加样，每槽加10μL。
(6)装好电极导线，点样孔端接负极，另一端接正极，调电压至3V/cm，电泳1.5h，当溴酚蓝移到距离凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。
(7)取出凝胶，放入GelStain染液中染色30min，之后用清水稍做漂洗。
(8)紫外灯下照相记录电泳图谱。
2.3.3哺乳动物细胞瞬时转染
(1)培养人293F胚肾细胞处于对数生长期，活力大于95％，细胞处于1.8-2.2×106cells/mL。
(2)提前预热PEI，DNA转染缓冲液。
(3)转染体系：转染体积30mL，摇瓶规格125mL，细胞体积27mL，转染缓冲液3mL，DNA30μg，人293F胚肾细胞(含PEI)90μg。
(4)转染缓冲液中加入质粒DNA和PEI，摇匀，37℃孵育7min。
(5)孵育好的质粒DNA加入细胞，37℃培养。
(6)培养24h后补充生长因子和N源。
(7)第6d进行细胞计数，观察细胞状态及死亡率。
(8)3000rpm离心10min，弃上清，收集细胞沉淀。
(9)细胞沉淀用PBS重悬，进行超声波破碎。
(10)收集细胞裂解上清液和细胞培养上清液用于Western blot检测。
2.3.4Western blot检测
(1)采用SDS-PAGE电泳仪，上层5％浓缩胶，下层12％分离胶。各孔样品上样量均10μL。
(2)上样后，100V跑完浓缩胶，调整电压至200V到电泳结束。
(3)采用PVDF膜，恒压100V，恒流250mA，转膜约1.5h。
(4)转膜结束后，PBST洗涤4次，每次5min，然后置于封闭液中37℃封闭1h。
(5)一抗(Ts14-3-3.3多克隆抗体)1:1000倍稀释后，膜置于一抗稀释液，4℃摇床孵育过夜。
(6)PBST洗膜4次，每次5min；二抗(羊抗兔-HRP)1：5000倍稀释后，膜置于二抗稀释液，37℃反应1h。
(7)反应结束后，PBST洗膜4次，每次5min。
(8)ECL显影，曝光2min，采集图像。
3结果
3.1重组质粒的酶切鉴定
重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3经XbaI-AgeI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，分别得到了792bp的Ts14-3-3.3和849bp的sp-Ts14-3-3.3目的基因片段，以及6011bp的pMZ-X3的真核载体片段，与预期结果相符，如图2，重组质粒的双酶切鉴定，M：DNA标准质量；1：酶切前；2：酶切后；A：重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3；B：重组质粒pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3。
3.2重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3及pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3的测序鉴定结果
测序结果分别与预期的Ts14-3-3.3和sp-Ts14-3-3.3序列进行比对，匹配度均为100％，表明重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3及pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3均构建成功。
猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的研究
3.3转染级别质粒的鉴定
将抽提好的质粒经1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示1泳道为重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3；2泳道为重组质粒pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3，如图3转染级别质粒鉴定。M：DNA标准质量；1：转染级别质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3；2：转染级别质粒pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3；3：转染级别质粒pMZ-X3。
3.4瞬转哺乳动物细胞的鉴定
分别将转染级别质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3瞬转入人293F胚肾细胞，培养至第6d后，收集pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3瞬转组细胞上清液待测，其他三组均收集细胞后超声破碎，收集细胞裂解上清液待测。Western blot检测结果显示3泳道为重组pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3胞外上清的Ts14-3-3.3蛋白特异性反应条带，4泳道为重组pMZ-X3-Ts14-3-3.3细胞裂解上清的Ts14-3-3.3蛋白特异性反应条带，特异性蛋白大小为Mr28.258KD左右，如图4蛋白表达Western blot鉴定。M：蛋白标准质量；1：人293F胚肾细胞裂解上清液；2：人293F胚肾细胞(pMZ-X3)裂解上清液；3：人293F胚肾细胞(pMZ-X3-sp-14-3-3.3)培养上清液；4：人293F胚肾细胞(pMZ-X3-14-3-3.3)裂解上清液。
2.1实验动物分组
将84只雌性Balb/c小鼠随机分为4组，每组21只。第1组为pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组，第2组为pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组，第3组为pMZ-X3对照组(空质粒)，第4组为PBS对照组。(注：84只小鼠中80只用于正式实验，剩余4只每组随机分配1只跟随免疫，防止免疫过程中各组小鼠意外死亡情况发生)。
2.2免疫程序
4组小鼠均免疫3次，间隔2周。免疫前各组小鼠腹腔注射10％水合氯醛100μL，麻醉后采用股四头肌肌肉注射法进行免疫(左右后肢交替进行)[59]。该免疫程序被证明是DNA疫苗发挥作用较好的方法，已被广泛应用于DNA疫苗实验。
第1组：每次均注射pMZ-X3-Ts14-3-3.3质粒100μL/只；
第2组：每次均注射pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3质粒100μL/只；
第3组：每次均注射pMZ-X3质粒100μL/只；
第4组：每次均注射PBS 100μL/只。
(注：前三组质粒浓度均为1μg/μL。)
2.3采集标本
2.3.1采集小鼠血清标本
每组于首次免疫后0w、2w、4w、6w和8w各取小鼠4只，无菌镊子摘除眼球后收集眼静脉血，室温静置2h，4℃静置12h，2000rpm离心10min，收集血清于离心管，-20℃保存。
2.3.2制备小鼠脾单细胞悬液
(1)每组于首次免疫后0w、2w、4w、6w和8w各取小鼠4只，断颈法处死，75％酒精浸泡5min，无菌取脾(超净台中操作)。
(2)将脾脏剪成小块，置于组织研磨器中，加3mL组织匀浆液研磨至匀浆，4mL组织匀浆液冲洗研棒，经200目不锈钢滤网过滤，收集脾脏单细胞悬液于离心管。(3)2000rpm离心15min后，弃上清，700μL样本稀释液(含80％胎牛血清)悬起细胞沉淀。
2.3.3分离小鼠脾淋巴细胞
(1)3mL脾淋巴细胞分离液加入15mL离心管，吸管吸取2.3.2步骤获得的脾单细胞悬液贴壁缓慢滴加于分离液表面。
(2)1200rpm离心10min，离心管液体分4层，由上到下为：①稀释液层，②淋巴细胞层(乳白色云雾状)，③分离液层(淡黄色)，④红细胞沉淀层。
(3)10mL脾淋巴细胞洗涤液加入15mL离心管，小心旋转吸取乳白色云雾层(即脾淋巴细胞层)于洗涤液，1000rpm离心10min，弃上清。
(4)5mL细胞清洗液悬起细胞沉淀，1000rpm离心10min，弃上清，重复此步骤。
(5)加2mL RPMI 1640完全培养基(含10％胎牛血清)，吹打均匀即脾淋巴细胞悬液。
(6)计数脾淋巴细胞，RPMI 1640完全培养基(含10％胎牛血清)稀释至终浓度为5×106cells/mL。
2.4免疫小鼠血清特异性IgG及其IgG1和IgG2a亚类水平的测定
2.4.1采用ELISA方阵滴定法确定最佳抗原-抗体反应条件
(1)Ts14-3-3.3抗原[36]用ELISA抗原包被稀释液稀释为6个浓度梯度：80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL
(2)6个浓度梯度加至96孔板，100μL/孔，每浓度梯度加一橫行，置于湿盒，4℃包被过夜。
(3)PBS稀释小鼠阴性和阳性血清，稀释倍数由低到高分别为：1:12.5、1:25、1:50、1:100、1:200、1:400。
(4)各稀释倍数的血清加一纵行，100μL/孔，与包被好的抗原浓度梯度形成交叉阵列。
(5)最终确定最佳抗原包被浓度为40μg/mL；最佳血清稀释倍数为1:100。
2.4.2采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性IgG及其IgG1和IgG2a亚类水平
(1)抗原包被稀释液将Ts14-3-3.3抗原稀释至40μg/mL，100μL/孔加至96孔板，置于湿盒，4℃包被过夜。
(2)弃包被液，PBST洗板3次，每次2min，加BSA封闭液100μL/孔，置于湿盒，37℃封闭2h。
(3)各血清样品1：100倍稀释，备用。
(4)弃封闭液，PBST洗板3次，每次2min，稀释好的血清样品100μL/孔，置于湿盒，37℃孵育1h。
(5)弃液体，PBST洗板3次，每次2min，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:10000倍稀释)、IgG1(1:1000倍稀释)、IgG2a(1:100倍稀释)，100μL/孔，置于湿盒，37℃孵育30min。
(6)弃液体，PBST洗板3次，每次2min，加入TMB显色液100μL/孔，37℃避光孵育20min。
(7)加入终止液50μL/孔，充分混匀。
(8)酶标仪测定波长450nm处的OD值(即OD450值)。
2.5脾淋巴细胞增殖水平的测定
采用CCK-8法检测。
(1)各标本均分为三组：原液组(阴性对照组)、Ts14-3-3.3抗原刺激组、ConA刺激组(阳性对照组)。
(2)以步骤2.3.3得到的终浓度为5×106cells/mL的脾淋巴细胞悬液，加至96孔板200μL/孔(即1×106cells/孔)。
(3)原液组保持不变；抗原刺激组再加入1μg/μL的Ts14-3-3.3抗原2μL；ConA刺激组再加入1μg/μL的ConA 2μL。
(4)5％二氧化碳培养箱孵育46h，倒置显微镜下观察脾淋巴细胞增殖情况。
(5)加入CCK-8溶液20μL/孔，充分混匀，5％二氧化碳培养箱中培养2h。
(6)酶标仪测定波长450nm处的OD值(即OD450值)。
2.6脾脏T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群比例的测定
采用流式细胞术检测。
(1)取步骤2.3.3所得的脾淋巴细胞悬液200μL于1.5mL离心管(即1×106cells/管)，1800rpm离心5min，弃上清。
(2)1mL预冷的染色Buffer悬起细胞沉淀，1800rpm离心5min，弃上清。
(3)100μL预冷的染色Buffer悬起细胞沉淀，避光，加入抗小鼠CD3e-APC(4μL)、抗小鼠CD4-FITC(4μL)、抗小鼠CD8-PE(8μL)抗体，轻拍振荡混匀，避光冰上孵育40min。
(4)避光1800rpm离心5min，弃上清。
(5)避光，1mL预冷的染色Buffer悬起细胞沉淀，1800rpm离心5min，弃上清，重复此步骤一次。
(6)避光，300μL预冷的染色Buffer悬起细胞沉淀，上流式仪。
2.7脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平的测定
2.7.1收集脾淋巴细胞培养上清液
(1)各标本均分为三组：原液组(阴性对照组)、Ts14-3-3.3抗原刺激组、ConA刺激组(阳性对照组)。
(2)以步骤2.3.3得到的终浓度为5×106cells/mL的脾淋巴细胞悬液，加至24孔板500μL/孔(即2.5×106cells/孔)。
(3)原液组保持不变；抗原刺激组再加1μg/μL的Ts14-3-3.3抗原5μL；ConA刺激组再加入1μg/μL的ConA 5μL。
(4)5％二氧化碳培养箱中培养48h。
(5)各孔培养液分别移入离心管，4000rpm离心5min，收集上清液至离心管，-20℃冻存。
2.7.2双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ水平
(1)于酶标板上设10个标准品孔位。
(2)配制标准品：第1、2孔加入标准品100μL混匀，之后在第1、2孔中加入稀释液50μL并混匀；从第1、2孔各取100μL加至第3、4孔中，之后在第3、4孔中加入稀释液50μL并混匀；在第3、4孔中先各取50μL弃掉，再各取50μL分别加入第5、6孔中，之后在第5、6孔中加入稀释液50μL并混匀；在第5、6孔中各取50μL分别加入第7、8孔中，之后在第7、8孔中加入稀释液50μL并混匀，从第7、8孔中分别取50μL加入第9、10孔中，之后在第9、10孔中加入稀释液50μL并混匀，再从第9、10孔各取50μL弃掉。此时10孔液体终体积均为50μL，终浓度从高到低分别为：1200ng/L、800ng/L、400ng/L、200ng/L、100ng/L。(10孔中两两为同一浓度)。
(3)酶标板上设空白孔和样品孔。解冻样品，在样品孔中加入40μL样品稀释液，并加10μL待测样品。(加样时枪头置于孔底，加完后混匀)。
(4)封板，37℃孵育30min。
(5)稀释试剂盒中的浓缩洗涤液；弃液体，每孔加满洗涤液，静置30s弃液体，重复5次，拍干孔内液体。
(6)各孔均加入酶标抗体50μL，封板，37℃孵育30min。
(7)按照步骤(5)再次洗板。
(8)加入显色剂A和B各50μL/孔，混匀，37℃避光孵育15min。
(9)加入终止液50μL/孔，振荡终止反应。
(10)以设置的空白孔调零酶标仪，之后测定各孔的OD450值。
(11)标准品测量值绘制标准曲线，各样品的OD450值通过标准曲线并乘以稀释倍数计算出脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ实际浓度。
2.7.3双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IL-2水平
参照步骤2.7.2进行IL-2水平检测，标准品终浓度为：2400ng/L、1600ng/L、800ng/L、400ng/L、200ng/L。
2.7.4双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IL-4水平
参照步骤2.7.2进行IL-4水平检测，标准品终浓度为：240ng/L、160ng/L、80ng/L、40ng/L、20ng/L。
2.7.5双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IL-10水平
参照步骤2.7.2进行IL-10水平检测，标准品终浓度为：600ng/L、400ng/L、200ng/L、100ng/L、50ng/L。
3结果
3.1小鼠血清特异性IgG水平
免疫后小鼠血清中特异性IgG水平，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组均在首次免疫后2～8w升高，且于免疫后6w达峰值，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
表2-1猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠血清特异性IgG水平(n＝4，OD450值)
如图5，猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠血清特异性IgG水平，1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
3.2小鼠血清特异性IgG1水平
免疫后小鼠血清中特异性IgG1水平，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组均在首次免疫后2～8w升高，且于免疫后4w达峰值，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
表2-2猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠血清特异性IgG1水平(n＝4，OD450值)
如图6，猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠血清特异性IgG1水平，
1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
3.3小鼠血清特异性IgG2a水平
免疫后小鼠血清中特异性IgG2a水平，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组均在首次免疫后2～8w升高，且于免疫后6w达峰值，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
表2-3猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠血清特异性IgG2a水平(n＝4，OD450值)
如图7猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠血清特异性IgG2a水平，
1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
3.4小鼠脾淋巴细胞增殖水平
免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖水平，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组经Ts14-3-3.3抗原及ConA刺激后，均在首次免疫后2～8w升高，均在免疫后6w达峰值，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。同时段组内，ConA刺激组＞抗原刺激组＞原液组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
表2-4猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平(n＝4，OD450值)
如图8猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平，
1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
3.5小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群比例
免疫后小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+亚群比例，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组分别在首次免疫后4～8w升高和2～8w升高，均在6w时达峰值；且pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组分别从首次免疫后6w和4w开始，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；同时段两疫苗组比较，虽pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组升高趋势较pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组高，但差异无统计学意义(P＞0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
免疫后小鼠脾脏T淋巴细胞CD8+亚群比例，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组均在首次免疫后2～8w升高，并分别在免疫后4w和6w达峰值；且两组均从首次免疫后4w开始，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组比较，仅在首次免疫后6w，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
表2-5猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+亚群比例(n＝4，％)
如图9猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗首次免疫后6w小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群比例。如图10猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+亚群比例变化。1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
表2-6猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾脏T淋巴细胞CD8+亚群比例(n＝4，％)
如图11猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾脏T淋巴细胞CD8+亚群比例变化，
1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
3.6小鼠脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平
免疫后小鼠脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组经Ts14-3-3.3抗原及ConA刺激后，均在首次免疫后2～8w升高，均在免疫后6w达峰值，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。同时段组内，ConA刺激组＞抗原刺激组＞原液组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
表2-7猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平(n＝4，ng/L)
如图12猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平，
1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
3.7小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-2水平
免疫后小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-2水平，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组经Ts14-3-3.3抗原及ConA刺激后，均在首次免疫后2～8w升高，均在免疫后6w达峰值，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。同时段组内，ConA刺激组＞抗原刺激组＞原液组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
表2-8猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-2水平(n＝4，ng/L)
如图13猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-2水平，
1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
3.8小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-4水平
免疫后小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-4水平，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组经Ts14-3-3.3抗原及ConA刺激后，均在首次免疫后2～8w升高，均在免疫后4w达峰值，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。同时段组内，ConA刺激组＞抗原刺激组＞原液组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)
表2-9猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-4水平(n＝4，ng/L)
如图14猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-4水平，
1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
3.9小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-10水平
免疫后小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-10水平，猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组经Ts14-3-3.3抗原及ConA刺激后，均在首次免疫后2～8w升高，均在免疫后4w达峰值，与同组0w及同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组和pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时段pMZ-X3对照组和PBS对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。同时段组内，ConA刺激组＞抗原刺激组＞原液组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
表2-10猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-10水平(n＝4，ng/L)
如图15猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清液IL-10水平，
1：pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；2：pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；3：pMZ-X3对照组；4：PBS对照组。
结果：全基因合成了Ts14-3-3.3和sp-Ts14-3-3.3抗原编码基因；测序和双酶切鉴定证实重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3构建成功；琼脂糖凝胶电泳证实两种转染级别质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3构建成功；Westernblot鉴定证实转染级别质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3可在人293F胚肾细胞内表达Ts14-3-3.3目的蛋白，而转染级别质粒pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3在人293F胚肾细胞培养上清液可表达Ts14-3-3.3目的蛋白。两种DNA疫苗免疫实验结果表明：①血清特异性IgG和IgG2a水平均在首免后2-8w升高，均在6w达到峰值；IgG1水平均在首免后2-8w升高，均在4w达到峰值；②脾淋巴细胞增殖水平均在首免后2-8w升高，均在6w达到峰值；③pMZ-X3-Ts14-3-3.3组脾脏T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群比例分别在首免后4-8w和2-8w升高，分别在6w和4w达到峰值；pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3组脾脏T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群比例均在首免后2-8w升高，均在6w达到峰值；④脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ、IL-2水平均在首免后2-8w升高，均在6w达到峰值；IL-4和IL-10水平均在首免后2-8w升高，均在4w达到峰值。
结论：
1.成功构建了猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3重组质粒。
2.成功制备了猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3两种DNA疫苗。
3.成功实现了猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白在人293F胚肾细胞中的表达。
4.猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3两种DNA疫苗均可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且后者免疫效果优于前者。
重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3测序结果，单划线区域为Ts14-3-3.3基因区域：
重组质粒pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3测序结果，单划线区域为14-3-3.3及sp信号肽基因(黄色)区域：
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (1)
1. 一种猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法，其特征是，包含以下步骤：
1）采用PAS法，全基因合成Ts14-3-3.3和sp-Ts14-3-3.3抗原编码基因；
2）分别将目的基因克隆至真核表达载体pMZ-X3，转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序鉴定和双酶切鉴定重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3；
3）随后制备两种转染级别质粒，并分别转染人293F胚肾细胞，采用Western blot法鉴定；
4）然后将84只雌性Balb/c小鼠随机分成4组，分别为pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组，pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组，pMZ-X3空质粒对照组，PBS空白对照组；
5）于首次免疫后0w、2w、4w、6w、8w收集小鼠血清和脾淋巴细胞进行鉴定：
①采用间接ELISA法检测血清中特异性IgG及其IgG1和IgG2a亚类水平；
②采用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖水平；
③采用流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群比例；
④采用双抗夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。
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| YUE ZHANG等: ""Analysis of immune response in BALB/c mice immunized with recombinant plasmids pMZ-X3-Ts14–3–3.3 and pMZ-X3-sp-Ts14–3–3.3 of Taenia solium"", 《ACTA TROPICA》, vol. 232, 17 May 2022 (2022-05-17), pages 1 - 10 * |
| 罗波等: ""猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备"", 《中国人兽共患病学报》 * |
| 罗波等: ""猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备"", 《中国人兽共患病学报》, vol. 35, no. 12, 7 November 2019 (2019-11-07), pages 1100 - 1105 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112891523B (zh) | 2023-07-04 |
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