CN112852870B

CN112852870B - IL-18基因融合H2Kk基因在制备增强细胞免疫的细胞中的应用、细胞及制备方法

Info

Publication number: CN112852870B
Application number: CN202110040024.XA
Authority: CN
Inventors: 焦顺昌; 张嵘; 张艳玲; 袁翰
Original assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2041-01-13
Also published as: CN112852870A

Abstract

本发明提供了IL‑18基因融合H2Kk基因在制备增强细胞免疫的细胞中的应用、细胞及制备方法，涉及疫苗制备技术领域。本发明将IL‑18基因融合H2Kk基因后具有增强细胞免疫的作用。

Description

IL-18基因融合H2Kk基因在制备增强细胞免疫的细胞中的应用、细胞及制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及IL-18基因融合H2Kk基因在制备增强细胞免疫的细胞中的应用、细胞及制备方法。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)是一种β属的冠状病毒，现有多种疫苗策略可以诱导出针对新型冠状病毒的免疫保护。如通过重组表达的新冠病毒亚单位疫苗、病毒灭活疫苗或者细胞疫苗等。免疫保护主要是通过疫苗诱导出抗体或细胞免疫来清除新冠病原体。在疫苗刺激下，一部分T细胞会分化为具有长期记忆性的记忆T细胞(在小鼠体内，这种细胞高表达CD44分子)。这种记忆T细胞细胞再次遇到抗原之后会产生大量的效应细胞(Effector T)和效应记忆型T细胞(Effective Memory T Cell，Tem)细胞，从而起到长期对新冠病毒的免疫保护作用。但是现有技术中还未有关于IL-18基因融合H2Kk基因具有增强细胞免疫的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供IL-18基因融合H2Kk基因在制备增强细胞免疫的细胞中的应用、细胞及制备方法，本发明将IL-18基因融合H2Kk基因后具有增强细胞免疫的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了IL-18基因融合H2Kk基因在制备增强细胞免疫的细胞中的应用。

优选的，所述IL-18基因融合H2Kk基因后的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种增强细胞免疫的K562细胞，将上述技术方案所述的IL-18基因融合H2Kk基因转化到K562细胞中，得到增强细胞免疫的K562细胞。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的K562细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)将跨膜表达RBD基因插入到质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；

所述跨膜表达RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

2)将所述IL-18基因融合H2Kk基因克隆到步骤1)得到的PB-S-RBD-NGFR质粒中，得到含融合基因质粒；

3)将所述步骤2)得到的含融合基因质粒电转化到K562细胞中，得到增强细胞免疫的K562细胞。

优选的，所述步骤1)质粒包括PB-713质粒。

优选的，所述跨膜表达RBD基因通过Bsu36I和BmgBI双酶切插入到质粒中。

优选的，所述步骤3)电转化的条件包括：电压560mV，电击时间30ms。

优选的，所述步骤3)含融合基因质粒的质量与K562细胞的数量比为7μg∶1×10⁷个。

本发明还提供了上述技术方案所述的增强细胞免疫的K562细胞在制备增强细胞免疫的疫苗中的应用。

本发明提供了IL-18基因融合H2Kk基因在制备增强细胞免疫的细胞中的应用、细胞及制备方法，IL-18是一种具有多向和多层次免疫调节功能的细胞因子，参与诱导免疫细胞活性的激活，从而介导细胞免疫，本发明将IL-18基因融合H2Kk基因后，使IL18表达在K562细胞膜表面，加强IL18对免疫细胞的刺激，具有增强细胞免疫的作用。

本发明实施例的结果显示：共表达IL18因子和H2Kk跨膜结构，可增强S蛋白RBD在小鼠体内细胞免疫(记忆T细胞)反应。

附图说明

图1为流式细胞术检测RBD蛋白的表达结果；

图2为因子IL-18/GM-CSF与Flag的融合表达检测结果；

图3为四种结构K562细胞免疫小鼠后抗体滴度检测结果；

图4为四种结构的K562细胞免疫小鼠后各型T细胞比例结果；

图5为用于构建细胞疫苗的穿梭质粒结构示意图，其中，质粒含双阅读框，MSCV启动子用于表达增强免疫记忆作用的细胞因子，而EF1启动子用于跨膜表达新冠病毒刺突蛋白的受体结合区域(S-RBD)，跨膜表达S-RBD主要通过NGFR蛋白片段介导。

具体实施方式

本发明提供了IL-18基因融合H2Kk基因在制备增强细胞免疫的细胞中的应用。在本发明中，所述IL-18基因融合H2Kk基因后的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

1)将跨膜表达RBD基因插入到质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；

所述跨膜表达RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

本发明将跨膜表达RBD基因插入到质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；所述跨膜表达RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

其中，加粗部分为酶切后补足的EF1启动子序列，斜体部分为编码NGFR信号肽的核苷酸序列，斜体加下划线部分为编码S-RBD的核苷酸序列，粗斜体部分为使蛋白能跨膜表达的NGFR跨膜结构域，下划线部分为T2A序列，小写碱基部分为Bsu36I酶切位点，加框部分为BmgBI酶切位点。

在本发明中，所述质粒优选包括PB-713质粒，本发明对所述PB-713质粒的来源没有特殊限定，采用常规市售即可，如购买于SBI公司。在本发明中，所述跨膜表达RBD基因优选通过Bsu36I和BmgBI双酶切插入到质粒中，本发明对双酶切到质粒中的方法没有特殊限定，本领域技术人员依据常规方法即可。

本发明将所述IL-18基因融合H2Kk基因克隆到步骤1)得到的PB-S-RBD-NGFR质粒中，得到含融合基因质粒。本发明优选通过5′NheI和3′BamHI酶切位点将IL-18基因融合H2Kk基因克隆至PB-S-RBD-NGFR质粒中，本发明对克隆的其他操作没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。

本发明将得到的含融合基因质粒电转化到K562细胞中，得到增强细胞免疫的K562细胞。本发明对所述K562细胞的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。在本发明中，所述电转化的条件优选包括：电压560mV，电击时间30ms。在本发明中，所述含融合基因质粒的质量与K562细胞的数量比优选为7μg∶1×10⁷个。在本发明中，所述电转化后再优选经过嘌呤霉素筛选后，得到增强细胞免疫的K562细胞，本发明对使用嘌呤霉素筛选的方法没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作筛选皆可。

本发明还提供了上述技术方案所述的增强细胞免疫的K562细胞在制备增强细胞免疫的疫苗中的应用。本发明对将增强细胞免疫的K562细胞制备成疫苗的方法没有特殊限定，采用常规将细胞制备成疫苗的方法即可。在本发明中，所述疫苗制备方法优选包括：按需取所述增强细胞免疫的K562细胞，400g，5min离心弃去培养基，加入生理盐水洗涤，400g，5min离心弃尽生理盐水，加入新生理盐水重悬细胞至对应体积。

为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

载体的构建：

第一步：跨膜表达RBD结构的装入

通过上游Bsu36I和下游BmgBI双酶切位点，将跨膜表达RBD基因(SEQ ID No.2)整合进入PB-713质粒(购自SBI公司)。新质粒命名为PB-S-RBD-NGFR质粒。

第二步：将鼠IL-18或GM-CSF基因分别与四种跨膜蛋白基因融合后克隆入第一步完成的质粒。

1、获取氨基酸序列信息

1)由于部分氨基酸拥有多个密码子，不同种属间存在密码子偏好，所以采用蛋白的氨基酸序列，在基因合成时进行人的密码子优化，使得蛋白在K562细胞中更有效的表达，在Uniprot数据库上获得鼠目的蛋白IL-18、GM-CSF的氨基酸序列：

IL-18的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

GM-CSF的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2)在Uniprot数据库上获得鼠来源的跨膜结构CD4、H2Kk、B7-H1、PDGFR的氨基酸序列，获得其信号肽和跨膜区的氨基酸序列：

CD4-SP的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；CD4-TM的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；H-2Kk-SP的氨基酸序列图SEQ ID No.7所示；H-2Kk-TM的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；PDGFR-SP的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；PDGFR-TM的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；B7-H1-SP的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；B7-H1-TM的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。

密码子优化后的对应核酸序列：

CD4-SP的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；CD4-TM的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；H-2Kk-SP的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；H-2Kk-TM的核苷酸序列如SEQ IDNo.23所示；PDGFR-SP的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；PDGFR-TM的核苷酸序列如SEQ IDNo.25所示；B7-H1-SP的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；B7-H1-TM的核苷酸序列如SEQ IDNo.27所示；Flag的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；IL-18的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示；GM-CSF的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示。

3)将序列信息按照表1进行组合，并委托金唯智进行快速基因合成，将基因通过5′NheI和3′BamHI酶切位点克隆至第一步完成的载体PB-S-RBD-NGFR，构建成同时拥有S-RBD-NGFR以及增强免疫记忆作用的细胞因子结构的质粒(即穿梭质粒)。

表1载体信息

基因合成(由苏州金唯智生物技术有限公司完成)的最终DNA基因序列如下：

CD4-FLAG-IL-18的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；

CD4-FLAG-GM-CSF的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；

H-2Kk-FLAG-IL-18的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

H-2Kk-FLAG-GM-CSF的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；

PDGFR-FLAG-IL-18的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；

PDGFR-FLAG-GM-CSF的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；

B7-H1-FLAG-IL-18的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；

B7-H1-FLAG-GM-CSF的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示。

实施例2

一、通过四种结构分别跨膜表达IL-18与GM-CSF的细胞验证(K562-B7-18、K562-B7-G、K562-CD4-18、K562-CD4-G、K562-H-18、K562-H-G、K562-P-18、K562-P-G)的K562细胞系。

1、K562细胞培养：在IMDM(BI，01-058-1ACS)培养基培养，补加10％FBS(gibco，11099-141)，于细胞培养箱37℃，5％CO₂培养，每36h更换培养基，调整细胞密度至5×10⁵个/ml。

2、电转方法构建稳定表达8种结构(K562-B7-18、K562-B7-G、K562-CD4-18、K562-CD4-G、K562-H-18、K562-H-G、K562-P-18、K562-P-G)的K562细胞系。其中K562-H-18、K562-H-G、K562-P-18、K562-P-G依次简写为K-H-18、K-H-G、K-P-18以及K-P-G。分别取8份1×10⁷个K562细胞400g离心5min，尽量去除上清，每组各重悬于120μl电转液(Celetrix试剂盒，12-0104)中，分别加入对应质粒7μg，每组均加入2.8μgSuper PB(购自SBI公司)，混匀，加至120μl电击管(Celetrix试剂盒，12-0104)中，电转仪(Celetrix，CTX-1500A)电转条件为电压560mV，电击时间30ms。电转后细胞立即转入20ml IMDM培养基中(包含10％FBS)培养48h后换液继续培养。

3、嘌呤霉素药物筛选：电转细胞培养48h后，向细胞内加入嘌呤霉素5μg/ml进行药物筛选，之后培养方法为每48h更换培养基，调整细胞密度至5×10⁵个/ml，重新加入嘌呤霉素5μg/ml培养。

4、流式细胞术检测药物筛选后8种细胞RBD蛋白的表达：取筛选后的8种细胞各1×10⁶个细胞，600g，3min离心去培养基得细胞沉淀，重悬于50μl PBS(Hyclone SH30256.01)中，分别加入Anti-protein S抗体(博奥龙，BF03082-1P)1μg/样，室温孵育40min，每管中各加入1ml的PBS清洗一遍细胞，600g，3min离心，弃去上清，目的是去除未结合抗体，细胞沉淀重悬于50ul PBS中，每管中各加入1ul PE anti-human IgG FC抗体(Biolegend公司)，室温避光孵育20min，PBS洗一次，通过BD LSRFortessa流式分析仪检测结果见图1。

结果如图1所示，纵坐标MFI为流式分析仪检测到样品PE荧光的平均荧光强度，具体数据见表2。在流式染色时，一抗Anti-protein S抗体可以识别8种细胞表面的RBD蛋白，二抗PE anti-human IgG FC带有PE荧光，并且可以识别已经与RBD结合的一抗Anti-protein S抗体，由此可以认为PE荧光间接标记了细胞表面的RBD蛋白。图1中K562组为没有转染过的野生型细胞，无RBD蛋白的表达，作为阴性对照，由图1可见，8种结构质粒构建的细胞系均有RBD蛋白的表达，且表达量良好，证明8种结构均可良好的表达目的蛋白RBD，并成功的构建了稳定表达8种结构的K562细胞系。

表2流式检测RBD表达结果

细胞名称	K562	K562-B7-18	K562-B7-G	K5662-CD4-18	K562-CD4-G	K562-H-18	K562-H-G	K562-P-18	K562-P-G
										MFI	240	8410	9899	9634	11112	9983	6779	8972	10457

二、Westem-Blot法检测8种结构中IL-18/GM-CSF与Flag融合表达情况。

1、蛋白样品制备。取细胞培养液于15mL离心管中，400g离心5min，弃上清，加入1mLPBS重悬，400g离心5min，离心洗涤两次；取1.5mL的EP管，加入100×PhosphataseInhibitor(TargetMol公司)蛋白抑制剂和PierceTM RIPA Buffer蛋白裂解液(Thermoscientmc公司)，充分混匀后备用；200μL上述混合液重悬细胞沉淀，冰浴孵育15min，4℃预冷离心机，12000rpm离心15min，取上清备用。

2、BCA法测样品蛋白浓度。使用Thermo scientific公司的BCA蛋白定量试剂盒，按照说明书，准备标准曲线样品，制定标准曲线，根据说明书要求进行检测并计算各样品浓度。

3、SDS-PAGE电泳。根据各样品浓度，按照20μg/孔制备电泳样品，蛋白样品中加入5×Lane Marker Loading Buffer(CWBIO公司)混匀，金属浴(MiuLab)105℃，10min，12000rpm离心1min；

取样，加入Tris-MOPS胶孔中(胶浓度为12％，12孔，金斯瑞公司)，电泳仪(Bio-Rad公司)电压设置为80V，电泳约90-120min。

4、将SDS-PAGE胶中蛋白转印至PVDF膜。将PVDF膜(Immobilon公司)置于无水甲醇浸泡30s-1min进行活化，之后置于1×eBlot L1 PVDF膜平衡液(金斯瑞公司)中浸泡进行平衡备用；将胶与PVDF膜叠加在一起，中间不可有气泡，设置转膜仪参数，24V，11min，进行转印。

5、抗体孵育。转印结束后，将PVDF膜取出，置于封闭液(PBS，5％脱脂奶粉)中，室温摇床封闭2h，以降低后续抗体的非特异性结合；用封闭液按1∶1000的比例分别稀释抗体(SIGMA公司的鼠单抗Monoclonal ANTI-FLAG

M2，Clone M2 produced in mouse，affinity isolated antibody)，混匀后备用；将PVDF膜分别置于上述对应的一抗稀释液中，4℃冰箱摇床孵育过夜；次日将膜放入TBST中，于摇床上洗膜，洗去未结合及非特异结合抗体，5min×5次；用封闭液按1∶10000的比例分别稀释鼠二抗(HRP-山羊抗小鼠IgG，博奥龙公司)混匀，将PVDF膜分别置于上述二抗稀释液中，室温摇床孵育1h；将膜放入TBST进行洗膜，3min×4次。

6、显色。配制显色液(现配现用，博奥龙公司)，按照化学发光液I∶化学发光液II＝1∶1的比例配制，用超纯水进行1∶1稀释；将PVDF膜置于显色液中，立即在凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司)成像拍照，观察并分析结果，结果见图2。

如图2所示，与第二泳道未转染的野生型K562细胞相比，8种结构的K562细胞均显示了RBD-Flag的融合蛋白条带，且通过参照第一泳道的蛋白Marker标定的各分子量蛋白的位置，RBD-Flag分子量大小与预期一致；同时8种结构的K562细胞中K-H-18、K-H-G、K-P-18以及K-P-G存在共表达因子IL-18-Flag或GM-CSF-Flag的融合蛋白条带，且分子量大小与预期一致，证明K-H-18、K-H-G、K-P-18以及K-P-G四种结构的K562细胞系可成功同时表达目的蛋白RBD和因子IL18/GM-CSF，而其余四种跨膜结构(包括K562-B7-18、K562-B7-G、K562-CD4-18、K562-CD4-G)与细胞因子融合表达效果不理想，中止进一步的动物验证。选取K-H-18、K-H-G、K-P-18以及K-P-G四种结构的K562细胞进行小鼠体内免疫实验。

三、RBD共表达细胞因子K562细胞免疫小鼠后的抗体滴度检测。

1、四种结构的K562细胞(K-H-18、K-H-G、K-P-18、K-P-G)免疫小鼠。阴性对照组注射细胞为未转染任何质粒的野生型K562细胞，未优化结构组注射细胞为K562-RBD，即转染了实施例一中第一步所获PB-S-RBD-NGFR质粒的细胞；24只BALB/c小鼠，随机分为6组，每组4只。如下表3：

表3小鼠免疫分组

免疫疫苗制备方法：按照所需注射小鼠数目，取上述注射细胞各1×10⁸个，400g，5min离心弃去培养基，加入20ml生理盐水重悬，400g，5min离心弃尽生理盐水，加入新生理盐水重悬细胞至2.5ml，置于冰上待用。

免疫方法：每只小鼠皮下多点注射2×10⁷个细胞(0.5ml体积)，首次注射后第14天加强免疫皮下多点注射2×10⁷个细胞(0.5ml体积)，二次免疫两天后眼球取血及脾脏进行血清及细胞表型检测。

2、外周血分离血清。将采集的外周血先放37℃培养箱温浴1h，然后3000rpm离心20min，离心结束后将上层血清转移到标记好的1.5ml离心管，然后进行ELISA检测。

3、ELISA包被。将S-RBD蛋白(北京博奥龙免疫技术有限公司)按照1μg/ml的浓度包被3块ELISA板，50μl/孔，4℃过夜包被。

4、ELISA封闭。先用TBST配置60ml的5％脱脂牛奶。然后用PBST将包被结束的ELISA板清洗4次，300μl/孔，每次间隔1min。最后将配置好的5％脱脂牛奶按照200μl/孔的剂量加入到ELISA板中，37℃培养箱孵育1h。

5、ELISA上样。先将24管血清分别按照1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000稀释四个浓度梯度，每个浓度梯度设置3个复孔。最后将稀释好的血清按照100μl/孔的体积加入到封闭好的ELISA板中，37℃培养箱孵育2-3h。

6、ELISA二抗结合：先将Goa Anti-Mouse IgG-HRP抗体(北京博奥龙免疫技术有限公司)按照1∶5000的比例用PBS稀释30ml。然后用PBST将包被结束的ELISA板清洗4次，300μl/孔，每次间隔1min。最后将稀释好的Goa Anti-Mouse IgG-HRP抗体按照100μl/孔的体积加入到ELISA板中，室温孵育40min。

7、ELISA显色：先用PBST将包被结束的ELISA板清洗4次，300μl/孔，每次间隔1min。然后每孔加入50μl TMB显色液(Biolengend公司)避光显色5min后再加入50μl终止液。酶标仪检测波长为450nm时的OD值，结果见图3与表4。

表4 ELSA抗体滴度检测结果

	K562	K562-RBD	K-P-G	K-P-18	K-H-G	K-H-18
							平均值	328	145944	41635	54861	56193	73206
标准差	70.93	32483	10932	14863	7635	17360

如图3所示，与野生型K562对照组相比，无共表达因子的K-RBD-NGFR细胞与带有共表达因子的四种结构的K562细胞，免疫小鼠后，均可使小鼠产生针对S-RBD的抗体，且抗体滴度水平相当。证明同时表达因子IL18或GM-CSF亦可使小鼠对K562细胞表达的RBD产生免疫反应。

四、检测不同跨膜因子共表达结构细胞株免疫小鼠的细胞免疫反应。

1、脾细胞制取。脾脏来源为第三部分中表1的动物实验获得，70μm细胞筛网(Falcon，352350)置于50ml离心管上，离心管插于冰上，将脾脏放在筛网上，少量预冷PBS湿润筛网，用注射器活塞底部多次按压脾脏至破裂并通过筛网，PBS冲洗筛网上脾脏细胞，400g，5min离心收集通过筛网的细胞，准备流式检测。

2、流式检测。取各小鼠脾脏细胞1e6个，重悬于100μl PBS中，加入T细胞相关表面标记物流式抗体各5μl，室温避光孵育20min，加入1ml PBS，翻转混匀，600g 3min离心，弃去上清，加入300μl PBS重悬细胞，通过BD LSRFortessa流式分析仪检测，结果见图4与表5。

表5流式检测各T细胞分型占比结果

如图4所示，流式结果的各表型T细胞占比以柱状图表示结果显示，纵坐标表示在CD4阳性的T细胞中各型T细胞的占比；二次免疫后K562-H-18的效应T细胞(Effector T)与效应性记忆性T细胞(Tem)占比优于其他组(图4中红星标记)；但K562-H-18的中枢记忆性T细胞(Tcm)占比与其他组相比并无明显优势，考虑到中枢记忆性T细胞的特点是，再次接触抗原时可迅速分化为能够分泌淋巴因子的效应T细胞，所以认为是此两组的中枢记忆性T细胞在第14天二次免疫时受到抗原刺激，迅速分化为效应T细胞，导致第16天检测时效应T细胞占比优于其他组，使得Tcm占比无明显优势。综上所述，K562-H-18，即应用共表达IL18因子H2Kk跨膜结构，可增强S蛋白RBD在小鼠体内细胞免疫(记忆T细胞)反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司

焦顺昌

<120> IL-18基因融合H2Kk基因在制备增强细胞免疫的细胞中的应用、细胞及制备方法

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcccctt gcatgctgct cctgctcctg gccgctgccc tggcccctac acagacaaga 60

gccgtcgacg actacaagga cgatgacgac aagaacttcg gcagactgca ctgcaccacc 120

gccgtgatca gaaacatcaa cgaccaagtg ctgttcgtgg acaagagaca gcctgtgttc 180

gaggacatga ccgacatcga tcagagcgcc tccgagcctc agacaagact gatcatctac 240

atgtacaagg acagcgaggt gagaggcctg gccgtgaccc tgagcgtgaa ggacagcaag 300

atgagcaccc tgagctgcaa gaacaagatc atcagcttcg aggagatgga ccctcctgag 360

aacatcgacg acattcagag cgacctgatc ttctttcaga agagagtgcc tggccacaac 420

aagatggagt tcgagagcag cctgtacgag ggccacttcc tggcctgtca gaaggaggac 480

gacgccttca agctgatcct gaagaaaaag gacgagaacg gcgacaagag cgtgatgttc 540

accctgacca acctgcatca gagcctcgag gtgatcatcg ccgtgctggt ggtgctgggc 600

gccgccatcg tgaccggcgc cgtggtggcc ttcgtgatg 639

<210> 2

<211> 1841

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct 60

cctgaactgc gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc 120

cggcgctccc ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc 180

ttgctcaact ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga tccaagctgt 240

gaccggcgcc tacgctagac gccaccgaat tcatgggggc aggtgccacc ggccgcgcca 300

tggacgggcc gcgcctgctg ctgttgctgc ttctgggggt gtcccttgga ggtgccgtcg 360

acagagtgca gcccacagag agcattgtga gattccccaa catcaccaac ctgtgcccct 420

ttggggaggt gttcaatgcc acaagatttg cctctgtgta tgcctggaac agaaagagaa 480

tcagcaactg tgtggctgac tactctgtgc tctataattc tgctagcttc agcaccttca 540

agtgctatgg ggtgagcccc accaagctga atgacctgtg cttcaccaat gtgtatgctg 600

acagctttgt gatcagaggg gatgaggtga gacagattgc ccctgggcag actggcaaga 660

ttgctgacta caactacaag ctgcctgatg acttcactgg ctgtgtgatt gcctggaaca 720

gcaacaacct ggacagcaag gtggggggca actacaacta cctctataga ctgttcagaa 780

agagcaacct gaagcccttt gagagagaca tcagcacaga gatctaccaa gctggcagca 840

ccccctgcaa tggggtggag ggcttcaact gctacttccc cctgcagagc tatggctttc 900

agcccaccaa tggggtgggc tatcagccct acagagtggt ggtgctgagc tttgagctgc 960

tgcatgcccc tgccacagtg tgtggcccca agaagagcac caacctggtg aagaacaagt 1020

gtgtgaactt tgactacaag gatgatgatg acaagacgcg taaggaggca tgccccacag 1080

gcctgtacac acacagcggt gagtgctgca aagcctgcaa cctgggcgag ggtgtggccc 1140

agccttgtgg agccaaccag accgtgtgtg agccctgcct ggacagcgtg acgttctccg 1200

acgtggtgag cgcgaccgag ccgtgcaagc cgtgcaccga gtgcgtgggg ctccagagca 1260

tgtcggcgcc gtgcgtggag gccgacgacg ccgtgtgccg ctgcgcctac ggctactacc 1320

aggatgagac gactgggcgc tgcgaggcgt gccgcgtgtg cgaggcgggc tcgggcctcg 1380

tgttctcctg ccaggacaag cagaacaccg tgtgcgagga gtgccccgac ggcacgtatt 1440

ccgacgaggc caaccacgtg gacccgtgcc tgccctgcac cgtgtgcgag gacaccgagc 1500

gccagctccg cgagtgcaca cgctgggccg acgccgagtg cgaggagatc cctggccgtt 1560

ggattacacg gtccacaccc ccagagggct cggacagcac agcccccagc acccaggagc 1620

ctgaggcacc tccagaacaa gacctcatag ccagcacggt ggcaggtgtg gtgaccacag 1680

tgatgggcag ctcccagccc gtggtgaccc gaggcaccac cgacaacctc atccctgtct 1740

attgctccat cctggctgct gtggttgtgg gccttgtggc ctacatagcc ttcaagaggc 1800

tcgaggaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt g 1841

<210> 3

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn

1 5 10 15

Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met

20 25 30

Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile

35 40 45

Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser

50 55 60

Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile

65 70 75 80

Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser

85 90 95

Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu

100 105 110

Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu

115 120 125

Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp

130 135 140

Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser

145 150 155

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His Val

1 5 10 15

Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val Thr

20 25 30

Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys Lys

35 40 45

Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu Arg

50 55 60

Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser Tyr

65 70 75 80

Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr Gln

85 90 95

Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu Thr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Gly Gln Lys

115 120

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Cys Arg Ala Ile Ser Leu Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Gln Leu Leu Ala Val Thr Gln Gly

20 25

<210> 6

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Val Phe Leu Ala Cys Val Leu Gly Gly Ser Phe Gly Phe Leu Gly Phe

1 5 10 15

Leu Gly Leu Cys Ile Leu Cys

20

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Pro Cys Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Pro

1 5 10 15

Thr Gln Thr Arg Ala

20

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Val Ile Ile Ala Val Leu Val Val Leu Gly Ala Ala Ile Val Thr Gly

1 5 10 15

Ala Val Val Ala Phe Val Met

20

<210> 9

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Gly Leu Pro Gly Val Ile Pro Ala Leu Val Leu Arg Gly Gln Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ser Val Leu Trp Leu Leu Gly Pro Gln Thr Ser Arg Gly

20 25 30

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Val Ile Ser

1 5 10 15

Leu Ile Ile Leu Ile

20

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Arg Ile Phe Ala Gly Ile Ile Phe Thr Ala Cys Cys His Leu Leu

1 5 10 15

Arg Ala

<210> 12

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Trp Val Leu Leu Gly Ser Ile Leu Leu Phe Leu Ile Val Val Ser Thr

1 5 10 15

Val Leu Leu Phe Leu

20

<210> 13

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgtgcagag ccatcagcct gagaagactg ctcctgctcc tgctgcagct gagccaactg 60

ctggccgtga cccaaggcgt cgacgactac aaggacgatg acgacaagaa cttcggcaga 120

ctgcactgca ccaccgccgt gatcagaaac atcaacgacc aagtgctgtt cgtggacaag 180

agacagcctg tgttcgagga catgaccgac atcgatcaga gcgcctccga gcctcagaca 240

agactgatca tctacatgta caaggacagc gaggtgagag gcctggccgt gaccctgagc 300

gtgaaggaca gcaagatgag caccctgagc tgcaagaaca agatcatcag cttcgaggag 360

atggaccctc ctgagaacat cgacgacatt cagagcgacc tgatcttctt tcagaagaga 420

gtgcctggcc acaacaagat ggagttcgag agcagcctgt acgagggcca cttcctggcc 480

tgtcagaagg aggacgacgc cttcaagctg atcctgaaga aaaaggacga gaacggcgac 540

aagagcgtga tgttcaccct gaccaacctg catcagagcc tcgaggtgtt cctggcctgc 600

gtgctgggcg gcagcttcgg ctttctgggc ttcctgggcc tgtgcatcct gtgc 654

<210> 14

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgtgcagag ccatcagcct gagaagactg ctcctgctcc tgctgcagct gagccaactg 60

ctggccgtga cccaaggcgt cgacgactac aaggacgatg acgacaaggc ccctacaaga 120

agccctatca ccgtgacaag accttggaag cacgtggagg ccatcaagga ggccctgaac 180

ctgctggacg acatgcctgt gaccctgaac gaagaggtgg aggtggtgag caacgagttc 240

agcttcaaga agctgacctg cgtgcagaca agactgaaga tcttcgagca aggcctgaga 300

ggcaacttca ccaagctgaa gggcgccctg aacatgaccg cctcctacta tcagacctac 360

tgccctccta cccctgagac cgactgcgag acccaagtga ccacctacgc cgacttcatc 420

gacagcctga agaccttcct gaccgacatc cctttcgagt gcaagaagcc tggacagaag 480

ctcgaggtgt tcctggcctg cgtgctgggc ggcagcttcg gctttctggg cttcctgggc 540

ctgtgcatcc tgtgc 555

<210> 15

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggcccctt gcatgctgct cctgctcctg gccgctgccc tggcccctac acagacaaga 60

gccgtcgacg actacaagga cgatgacgac aaggccccta caagaagccc tatcaccgtg 120

acaagacctt ggaagcacgt ggaggccatc aaggaggccc tgaacctgct ggacgacatg 180

cctgtgaccc tgaacgaaga ggtggaggtg gtgagcaacg agttcagctt caagaagctg 240

acctgcgtgc agacaagact gaagatcttc gagcaaggcc tgagaggcaa cttcaccaag 300

ctgaagggcg ccctgaacat gaccgcctcc tactatcaga cctactgccc tcctacccct 360

gagaccgact gcgagaccca agtgaccacc tacgccgact tcatcgacag cctgaagacc 420

ttcctgaccg acatcccttt cgagtgcaag aagcctggac agaagctcga ggtgatcatc 480

gccgtgctgg tggtgctggg cgccgccatc gtgaccggcg ccgtggtggc cttcgtgatg 540

<210> 16

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgggcctgc ctggcgtgat ccctgccctg gtgctgagag gacagctgct cctgagcgtg 60

ctgtggctgc tgggccctca gacaagcaga ggcgtcgacg actacaagga cgatgacgac 120

aagaacttcg gcagactgca ctgcaccacc gccgtgatca gaaacatcaa cgaccaagtg 180

ctgttcgtgg acaagagaca gcctgtgttc gaggacatga ccgacatcga tcagagcgcc 240

tccgagcctc agacaagact gatcatctac atgtacaagg acagcgaggt gagaggcctg 300

gccgtgaccc tgagcgtgaa ggacagcaag atgagcaccc tgagctgcaa gaacaagatc 360

atcagcttcg aggagatgga ccctcctgag aacatcgacg acattcagag cgacctgatc 420

ttctttcaga agagagtgcc tggccacaac aagatggagt tcgagagcag cctgtacgag 480

ggccacttcc tggcctgtca gaaggaggac gacgccttca agctgatcct gaagaaaaag 540

gacgagaacg gcgacaagag cgtgatgttc accctgacca acctgcatca gagcctcgag 600

gtggtgatca gcgccatcct ggccctggtg gtgctgaccg tgatcagcct gatcatcctg 660

atc 663

<210> 17

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgggcctgc ctggcgtgat ccctgccctg gtgctgagag gacagctgct cctgagcgtg 60

ctgtggctgc tgggccctca gacaagcaga ggcgtcgacg actacaagga cgatgacgac 120

aaggccccta caagaagccc tatcaccgtg acaagacctt ggaagcacgt ggaggccatc 180

aaggaggccc tgaacctgct ggacgacatg cctgtgaccc tgaacgaaga ggtggaggtg 240

gtgagcaacg agttcagctt caagaagctg acctgcgtgc agacaagact gaagatcttc 300

gagcaaggcc tgagaggcaa cttcaccaag ctgaagggcg ccctgaacat gaccgcctcc 360

tactatcaga cctactgccc tcctacccct gagaccgact gcgagaccca agtgaccacc 420

tacgccgact tcatcgacag cctgaagacc ttcctgaccg acatcccttt cgagtgcaag 480

aagcctggac agaagctcga ggtggtgatc agcgccatcc tggccctggt ggtgctgacc 540

gtgatcagcc tgatcatcct gatc 564

<210> 18

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgagaatct tcgccggcat catcttcacc gcctgctgcc acctgctgag agccgtcgac 60

gactacaagg acgatgacga caagaacttc ggcagactgc actgcaccac cgccgtgatc 120

agaaacatca acgaccaagt gctgttcgtg gacaagagac agcctgtgtt cgaggacatg 180

accgacatcg atcagagcgc ctccgagcct cagacaagac tgatcatcta catgtacaag 240

gacagcgagg tgagaggcct ggccgtgacc ctgagcgtga aggacagcaa gatgagcacc 300

ctgagctgca agaacaagat catcagcttc gaggagatgg accctcctga gaacatcgac 360

gacattcaga gcgacctgat cttctttcag aagagagtgc ctggccacaa caagatggag 420

ttcgagagca gcctgtacga gggccacttc ctggcctgtc agaaggagga cgacgccttc 480

aagctgatcc tgaagaaaaa ggacgagaac ggcgacaaga gcgtgatgtt caccctgacc 540

aacctgcatc agagcctcga gtgggtgctg ctgggcagca tcctcctgtt cctgatcgtg 600

gtgagcaccg tgctgctgtt tctg 624

<210> 19

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgagaatct tcgccggcat catcttcacc gcctgctgcc acctgctgag agccgtcgac 60

gactacaagg acgatgacga caaggcccct acaagaagcc ctatcaccgt gacaagacct 120

tggaagcacg tggaggccat caaggaggcc ctgaacctgc tggacgacat gcctgtgacc 180

ctgaacgaag aggtggaggt ggtgagcaac gagttcagct tcaagaagct gacctgcgtg 240

cagacaagac tgaagatctt cgagcaaggc ctgagaggca acttcaccaa gctgaagggc 300

gccctgaaca tgaccgcctc ctactatcag acctactgcc ctcctacccc tgagaccgac 360

tgcgagaccc aagtgaccac ctacgccgac ttcatcgaca gcctgaagac cttcctgacc 420

gacatccctt tcgagtgcaa gaagcctgga cagaagctcg agtgggtgct gctgggcagc 480

atcctcctgt tcctgatcgt ggtgagcacc gtgctgctgt ttctg 525

<210> 20

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atgtgcagag ccatcagcct gagaagactg ctcctgctcc tgctgcagct gagccaactg 60

ctggccgtga cccaaggc 78

<210> 21

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtgttcctgg cctgcgtgct gggcggcagc ttcggctttc tgggcttcct gggcctgtgc 60

atcctgtgc 69

<210> 22

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atggcccctt gcatgctgct cctgctcctg gccgctgccc tggcccctac acagacaaga 60

gcc 63

<210> 23

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtgatcatcg ccgtgctggt ggtgctgggc gccgccatcg tgaccggcgc cgtggtggcc 60

ttcgtgatg 69

<210> 24

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atgggcctgc ctggcgtgat ccctgccctg gtgctgagag gacagctgct cctgagcgtg 60

ctgtggctgc tgggccctca gacaagcaga ggc 93

<210> 25

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtggtgatca gcgccatcct ggccctggtg gtgctgaccg tgatcagcct gatcatcctg 60

atc 63

<210> 26

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atgagaatct tcgccggcat catcttcacc gcctgctgcc acctgctgag agcc 54

<210> 27

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgggtgctgc tgggcagcat cctcctgttc ctgatcgtgg tgagcaccgt gctgctgttt 60

ctg 63

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gactacaagg acgatgacga caag 24

<210> 29

<211> 471

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aacttcggca gactgcactg caccaccgcc gtgatcagaa acatcaacga ccaagtgctg 60

ttcgtggaca agagacagcc tgtgttcgag gacatgaccg acatcgatca gagcgcctcc 120

gagcctcaga caagactgat catctacatg tacaaggaca gcgaggtgag aggcctggcc 180

gtgaccctga gcgtgaagga cagcaagatg agcaccctga gctgcaagaa caagatcatc 240

agcttcgagg agatggaccc tcctgagaac atcgacgaca ttcagagcga cctgatcttc 300

tttcagaaga gagtgcctgg ccacaacaag atggagttcg agagcagcct gtacgagggc 360

cacttcctgg cctgtcagaa ggaggacgac gccttcaagc tgatcctgaa gaaaaaggac 420

gagaacggcg acaagagcgt gatgttcacc ctgaccaacc tgcatcagag c 471

<210> 30

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcccctacaa gaagccctat caccgtgaca agaccttgga agcacgtgga ggccatcaag 60

gaggccctga acctgctgga cgacatgcct gtgaccctga acgaagaggt ggaggtggtg 120

agcaacgagt tcagcttcaa gaagctgacc tgcgtgcaga caagactgaa gatcttcgag 180

caaggcctga gaggcaactt caccaagctg aagggcgccc tgaacatgac cgcctcctac 240

tatcagacct actgccctcc tacccctgag accgactgcg agacccaagt gaccacctac 300

gccgacttca tcgacagcct gaagaccttc ctgaccgaca tccctttcga gtgcaagaag 360

cctggacaga ag 372

Claims

1.一种K562细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将跨膜表达RBD基因插入到质粒中，得到PB-S-RBD-NGFR质粒；

所述跨膜表达RBD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

2)将IL-18基因融合H2Kk基因克隆到步骤1)得到的PB-S-RBD-NGFR质粒中，得到含融合基因质粒；

3)将所述步骤2)得到的含融合基因质粒电转化到K562细胞中，得到增强细胞免疫的

K562细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)质粒包括PB-713质粒。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述跨膜表达RBD基因通过Bsu36I和BmgBI双酶切插入到质粒中。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)电转化的条件包括：电压560mV，电击时间30ms。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)含融合基因质粒的质量与K562细胞的数量比为7μg:1×10⁷个。

6.一种增强细胞免疫的K562细胞，其特征在于，采用权利要求1~5任一项所述制备方法制备得到。

7.根据权利要求6所述的增强细胞免疫的K562细胞，其特征在于，所述IL-18基因融合H2Kk基因后的核苷酸序列如SEQ ID No .1所示。

8.权利要求6或7所述的增强细胞免疫的K562细胞在制备增强细胞免疫的疫苗中的应用。