KR20100045192A - 태아 흉선 및 간 조직과 제대혈 유래 조혈모 세포의 동시 이식에 기반한 인간화 ｎｏｇ 마우스 모델 및 그의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 태아의 흉선 및 간 조직과 제대혈에서 유래된 조혈모세포의 동시 이식에 의해 구축된, 인간화 NOG(NOD/SCID/IL2 receptor γc null) 마우스 모델 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
인간화 마우스, NOG 마우스, 조혈모세포, 흉선.
Description
본 발명은 태아의 흉선 및 간 조직과 제대혈에서 유래된 조혈모세포의 동시 이식에 의해 구축된, 인간화 NOG(NOD/SCID/IL2 receptor γc null) 마우스 모델 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
인간을 대상으로 한 질병의 연구는 한계가 있으므로, 인간과 유전적으로 매우 유사하다고 알려진 동물을 이용한 질병 모델이 유용하게 이용되고 있다. 대상이 되는 질병을 모델 동물에 발병시키고, 다양한 치료제를 적용하여 치료 방법을 탐색한다. 그러나, 동물 질병 모델에서 치료 효과를 갖는 치료제가 인간에게 적용 시에도 동일한 효과를 갖는지 여부는 알 수 없으므로, 동물 질병 모델에서 확인된 치료제를 직접 인간에 적용할 수는 없고 임상 적용까지 여러 단계를 거친다.
보다 효과적으로 동물 질병 모델을 이용하기 위해서, 최근에는, 인간의 면역 체계와 유사한 면역 체계를 갖는 인간화된 동물 모델을 구축하기 위한 노력이 활발하게 진행되고 있다. 인간화 동물 모델, 특히 인간화 마우스를 구축하기 위해 면역기능이 결핍된 마우스에 조혈모세포를 이식하는 방법이 이용되었다. SCID(severe combined immune deficiency) 마우스에 인간의 CD34+ 세포를 이식한 결과 마우스의 모든 조직에서 인간 유래 조혈 모세포가 소량 발현되고 조직적으로 재형성되었다는 것이 확인되었다(Greiner DL, Hesselton RA and Shultz LD, Stem Cells 1998; 16: 166-77). 그러나, 이식한 마우스에 형성된 소량의 인간 세포의 대부분은 B 세포이고, 어떤 조혈 기관에도 인간의 T 세포는 존재하지 않았다. 또한, NK 세포의 기능도 저하된 NOD/SCID(non-obese diabetics/SCID) 마우스에 인간 CD34+ 세포를 이식했을 때, SCID 마우스에 비해 훨씬 더 많은 인간 세포가 조직적으로 재형성되었으나, 여전히 인간의 T 세포는 발달하지 않았다(Bente DA, Melkus MW, Gracia JV and Rico-Hesse R, J Virol 2005; 79:13797-9). 한편, 조혈모세포 외에, 태아의 흉선과 간 조직을 이식한 SCID 마우스에서는 인간 T 세포가 많이 형성되었으나, 비장을 제외한 다른 곳에서는 인간 T 세포가 1% 미만으로 소량 존재했고, 인간의 세포가 흉선에만 제한적으로 존재했다(Aldrovandi GM, et. al., Nature 1993;363:732-6; McCune JM, et. al., Science 1988;8241:1632-9; and Vandekerckhove BA, et. al., J. Immunol 1991;146:4173-9).
또한, NOD/SCID 마우스는 T 세포와 B 세포 등은 결핍되어 있으나, NK 세포 기능이 남아있고, 자연적으로 림프종을 형성하여 그 수명이 짧은 단점이 있었다. 이를 개선하기 위해, T세포 및 B세포 외에 NK 세포의 기능도 결핍된 NOG 마우 스(NOD/SCID/IL2 receptor γc null)가 개발되었고(Mamoru Ito, et al., Blood. 2002; 100:3175-3182), NOG 마우스는 NOD/SCID에 비해 수명이 2배 이상 길기 때문에 인간의 조직을 이식 후 장기간 모니터링하기에 적합하다. NOG 마우스는 흉선이나 간 조직과 같은 인간의 조혈 조직의 동시 이식 없이, 조혈모세포의 이식에 의해 인간의 B세포, T세포 및 NK 세포를 재형성할 수 있는 것으로 확인되었다(Blood. 2002; 100: 3175-3182). NOG 마우스에 조혈모세포만 이식한 경우, 인간 세포의 생착 및 분화가 성공적으로 이루어져 30 내지 90%의 인간 세포가 관찰되었으나, 면역세포의 비율은 정상적인 인간의 면역세포 비율과 반대로 B세포가 우세했고, 매우 낮은 비율의 T세포가 존재하는 것으로 관찰되었다. 이와 같이, 면역기능이 결핍된 마우스에 인간의 조혈모세포를 이식하여 구축된 인간화 마우스의 경우, T 세포 면역 체계가 정상적인 인간에 비해 결핍되거나 또는 부족하므로, 정상적인 인체와 차이가 있고, 특히, 면역계의 자극에 의한 발병이나 치료 효과를 연구하기에는 한계가 있다. 따라서, 정상적인 인간과 유사한 면역계를 가져서, 질병 유발 물질이나 치료물질에 대한 인간의 반응을 예측할 수 있게 하는 인간화 마우스 모델의 구축이 여전히 요구된다.
본 발명자들은 NOG 마우스의 흉선이 매우 작기 때문에 T 세포로의 분화가 충분히 일어나지 못하는 것으로 판단하고, NOG 마우스에 정상적인 인간의 T 세포 면 역계를 구축하고자 태아의 흉선 및 간 조직을 제대혈 유래 조혈모세포와 동시에 이식하여 인간과 유사한 면역계를 갖는 인간화 NOG 마우스 모델을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간과 유사한 면역계를 갖는 인간화 NOG 마우스 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 태아의 흉선 및 간 조직과 제대혈 유래 조혈모세포의 동시 이식에 의해, 인간과 유사한 면역계를 갖는 인간화 NOG 마우스 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 태아의 흉선 및 간 조직과 제대혈에서 유래된 조혈모세포의 동시 이식에 의해 구축된, 인간화 NOG(NOD/SCID/IL2 receptor γc null) 마우스 모델을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, '인간화 마우스(humanized mouse)'는 인간의 면역계와 동일하거나 매우 유사한 면역계를 가져서, 특정한 물질이나 자극에 대한 반응이 인간의 반응을 대표하는 것으로 해석될 수 있는 마우스를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, 'NOG 마우스'는 이종이식을 위한 수용체로 개발된, SCID(severe combined immunodeficiency) 돌연변이와 인터루킨-2Rγ(IL-2Rγ) 대립형질 돌연변이(γc null)에 대한 이중 동형접합이고, 따라서, B세포와 T세포 외에 NK세포도 결핍된 면역결핍 마우스를 의미한다.
본 발명의 인간화 NOG 마우스 모델은 제대혈 유래 조혈모세포만을 이식하여 구축된 NOG 마우스 모델과 달리, 정상적인 인간의 면역계에서 관찰되는 B세포와 T세포의 비율을 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 인간화 NOG 마우스 모델은 말초혈액 내에서 T 세포의 비율이 B 세포의 비율보다 높다.
일반적으로 정상적인 인간의 면역계에서는 T세포가 면역세포의 약 70%를 차지하며, 세포성 면역 반응을 담당한다. 그러나, NOG 마우스는 흉선이 매우 작아서, 인간의 조혈모세포를 이식하는 경우, 상대적으로 T세포의 분화가 부족하여 인간과 달리, 말초혈액 내에서 B세포의 비율이 훨씬 높은 것으로 관찰되었다. 인간화 마우스 모델이 인간의 면역계의 반응을 모방하여 인간에서의 작용이나 효과를 예측할 수 있기 위해서는 정상적인 인간의 면역계와 유사한 면역세포의 비율 및 기능을 가져야 한다. 본 발명자들은 NOG 마우스에서 T세포의 분화 및 정상적인 조혈 작용을 보완하여 인간의 면역계와 유사한 면역계를 구축하기 위해, 조혈모세포와 함께, 흉선 및 간 조직을 동시에 이식하여 T 세포가 분화할 수 있는 환경을 조성하였다.
본 발명의 일 구체예에서, NOG 마우스에 조혈모세포 외에, 태아 유래 흉선 조직을 NOG 마우스의 신장 캡슐에 이식하고, 동시에 인간세포의 정상적인 조혈작용을 돕기 위해 태아 유래 간 조직을 흉선과 동일한 위치에 이식한 경우, T세포의 발달 및 분화가 강화되어 말초 혈액에서 B세포보다 높은 비율의 T세포가 관찰되었다.
본 발명의 인간화 NOG 마우스 모델은 T세포 기반 면역계가 강화되어, 기존의 인간화 마우스 모델보다 인간의 면역계에 보다 더 가깝다.
본 발명은 또한, B세포, T세포 및 NK 세포의 기능이 결핍된 면역결핍 NOG 마 우스에 태아의 흉선과 간 조직을 이식하는 단계 및 상기 마우스에 제대혈에서 유래된 조혈모세포를 이식하는 단계를 포함하는, 인간화 면역계를 갖는 인간화 NOG 마우스 모델을 구축하는 방법을 제공한다.
본 발명의 인간화 NOG 마우스 모델을 구축하는 방법은 NOG 마우스에 태아의 흉선과 간 조직을 이식하는 단계를 포함한다.
본 발명의 인간화 NOG 마우스 모델을 구축하는 방법에서, NOG 마우스의 흉선 기능에 의해 초래되는 T세포의 분화 부족 및 지연을 보완하기 위해, T 세포의 발달 및 생성을 위한 환경을 제공할 태아의 흉선 조직과 조혈작용을 도와줄 간 조직이 NOG 마우스에 이식되며, 바람직하게는, 신장의 캡슐에 이식된다.
본 발명의 인간화 NOG 마우스 모델을 구축하는 방법은 태아의 흉선과 간 조직이 이식된 NOG 마우스에 제대혈 유래 조혈모세포를 이식하는 단계를 포함한다.
본 발명의 인간화 NOG 마우스 모델을 구축하는 방법에서, 이식된 태아의 흉선과 간 조직이 조혈모세포의 T세포로의 분화 및 조혈 작용을 강화하여 정상적인 인간의 면역계와 유사한 면역계를 갖는 인간화 NOG 마우스 모델이 구축될 수 있다. 제대혈 유래 조혈모세포는 마우스의 골수에 생착하여 자가 복제하며 성숙한 면역세포 및 혈액세포로 분화된다. 신장에 이식된 태아의 간 조직은 인간 면역세포의 조혈작용을 도와주며, 흉선 조직은 조혈모세포로부터 T 세포가 발달할 환경을 제공하여 마우스 자체의 흉선에 의해서 생성되는 부족한 T 세포의 양을 보완한다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되 어서는 안 된다.
본 발명의 인간화 NOG 마우스 모델은 태아의 흉선 및 간 조직을 제대혈 유래 조혈모세포와 함께 이식하여 NOG 마우스에서 수적으로 부족한 T 세포를 증가시켜 인간과 매우 유사한 면역계를 가지므로, 질병의 발병 기작 및 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
실시예 1. 인간화 NOG 마우스 모델의 구축
태아의 흉선 및 간 조직과 제대혈 유래 조혈모세포를 동시에 이식하여, 인간의 면역계와 유사한 면역계를 갖는, 특히, T 세포의 생성 및 분화가 강화되어 정상적인 인간의 면역 세포 비율을 갖는 인간화 NOG 마우스를 구축하였다.
(1) 태아의 흉선 및 간 조직의 이식
22 내지 28g의 8주령 NOG 마우스(Jackson Laboratory, USA.)에 이식 하루 전에 2.4 Gy의 방사선을 조사하였다. 이식 당일 상기 마우스를 수면마취시키고, 동결보관된 태아의 흉선과 간 조직(Advanced Bioscience Resource, INC., USA)을 1 mm3로 잘랐다. 그 후, 마취된 마우스의 좌측 신장의 캡슐 내에 상기 잘라낸 흉선과 간 조직을 1조각씩 이식하고, 지혈기로 잘라진 막을 봉합하여 실험군 마우스를 준비하였다. 한편, NOG 마우스에 태아 흉선 및 간 조직의 이식 없이, 상기 실험군 마우스 에 대해 수행된 동일한 이식 수술 절차를 수행하여 음성 대조군을 준비하고, NOG 마우스가 아닌, Rag2-/-γc -/- 마우스(Taconic, USA)에 대상으로 동일한 절차에 따라 태아 흉선과 간 조직을 이식시켜 비교군을 준비하였다. Rag2-/-γc -/- 마우스는 재조합효소 활성 유전자 2(recombinase activating gene 2)와 다수의 사이토카인에 대한 기능성 수용체에 공통된 감마 사슬이 결핍되어 면역 거부 반응을 일으키지 않는 마우스이다.
(2) 조혈모세포의 이식
상기 (1)에서 조직을 이식받은 실험군, 비교군 및 음성 대조군 마우스가 마취에서 깨어나면 제대혈에서 유래된 순도 90% 이상의 CD34+ 조혈모세포를 31 게이지의 1cc 인슐린 주사기(insulin syringe)를 사용하여 꼬리 정맥에 1 x 105개로 주사하였다.
(3) 유세포형광분석법에 의한 이식/생착의 확인
상기와 같이 구축된 실험군과 대조군 NOG 마우스 및 비교군의 Rag2-/-γc -/- 마우스에서 조직 및 세포 이식 후 4주차부터 마우스의 꼬리에서 채혈하여 4주 간격으로 유세포 형광분석을 통해 면역세포를 관찰하였다. 면역 세포의 관찰을 위해, 각 마우스에서 200㎕의 혈액을 채취하고, 상온에서 적혈구를 용해시켜서 수득된 백혈구에 인간 CD 마커를 표지하기 위해 하기와 같이 염색시켰다. 백혈구 세포 105개를 우태혈청(FBS) 2%가 함유된 PBS(phosphate buffered saline)에서 FITC(Flourescein Isothocyanate)로 표지된 hCD45, hCD3, 피코에리트린(Phycoerythrin: PE)로 표지된 hCD19, hCD4 및 PE와 시아닌5(Cyanin 5: Cy5)로 표지된 hCD3, hCD8 CD 마커(eBioscience, Inc., USA)와 함께 암조건으로 4℃에서 20분간 반응시키고, PBS로 2회 세척하였다. 상기와 같이 수득된 백혈구 시료를 유세포 형광분석장치인 FACS Vantage(Beckton Dickinson, USA)을 사용하여 측정하고, 그 결과를 CELLQuest(BD Biosciences, USA) 프로그램으로 분석하였다.
도 1은 정상인(양성 대조군), 상기 (2)에서 준비된 NOG 마우스에 태아 유래 흉선 및 간 조직과 제대혈 유래 조혈모세포를 동시에 이식하여 구축된 마우스 모델(실험군) 및 NOG 마우스에 제대혈 유래 조혈모세포만을 이식하여 구축된 마우스 모델(음성 대조군)에서 골수 내 인간 유래 세포의 비율, 골수 및 말초혈액에서 T세포와 B세포의 비율을 보여주는 유세포 형광분석 사진이다. 실험군 NOG 마우스의 경우, 기존 모델과 달리 이식 4주 후부터 혈류 내에서 T 세포가 관찰되었고, 12주차에 건강한 인간의 말초 혈액 내의 T 세포와 비슷한 백분율에 도달하였다. 이식 12 주 후에, 제대혈 유래 조혈모세포 외에 태아 유래 흉선과 간 세포가 동시에 이식된 NOG 마우스(실험군) 및 제대혈 유래 조혈모세포만 이식된 NOG 마우스(대조군) 모두에서 골수 내에 생성된 인간 세포(hCD45+)의 수는 정상 인간의 경우와 거의 비슷한 수준까지 증가되었으나, 흉선 및 간 조직이 동시에 이식된 NOG 마우스의 경우 조혈모세포만 이식된 NOG 마우스에 비해 골수 및 말초 혈액 모두에서 10배 정도 높은 수준의 인간 CD3+ T 세포가 관찰되었다.
(4) 흉선 조직의 분화 및 T세포의 발달
도 2는 상기 (2)에서 준비된 실험군인 인간화 NOG 마우스 모델과 비교군인 Rag2-/-γc -/- 마우스에서 신장 캡슐에 이식된 흉선 조직의 시간의 경과에 다른 분화를 보여주는 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색 사진이다. 도 2의 좌측에 나타난 바와 같이, NOG 마우스의 왼쪽 신장 캡슐에 간 조직과 함께 이식된 흉선의 경우, 시간의 경과에 따라 피질(cortex)와 수질(medulla)이 더욱 뚜렷하게 구분되고, 성숙한 흉선의 수질에만 존재하는 Hassell's Corpuscle도 관찰되었다. Hassell's Corpuscle의 존재는 수질에서 T 세포의 성숙 과정이 일어나고 있다는 것을 의미한다. 그러나, 도 2의 우측에 표시된 비교군의 Rag2-/-γc -/- 마우스의 경우, 이식된 인간 세포의 생착 및 분화가 거의 이루어지지 않아, 1% 이하로 관찰되었다. 또한, Rag2-/-γc -/- 마우스의 경우, 이식된 흉선의 크기는 실험군과 유사한 크기로 커졌으나, 피질과 수질의 구역이 관찰되지 않았고, 신장 캡슐과 이식된 조직 사이에 지방세포가 많이 형성된 양상을 보였다.
또한, 이식된 흉선 조직에서 조혈모세포가 정상적인 발달과정을 거쳐 T 세포로 성숙, 분화되었는지 여부를 확인하기 위해 신장 캡슐에서 발달된 태아의 흉선 조직을 적출하고 세포를 분리하여 유세포 형광분석을 수행하였다. 이식 36주 후에, 실험군 마우스를 희생시키고, 신장에 이식했던 흉선 조직을 떼어내고, 균질화(homogenize)시켜서 세포 시료를 수득하였다. 상기 세포 시료를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, 세척된 세포에 인간 CD4 마이크로비드와 인간 CD8 마이크로비드(Miltenyi Biotech., Germany)를 첨가하고, 35분간 암 조건에서 인큐베이션시켜, 세포를 인간 CD4 및 CD8 마이크로비드로 표지화시켰다. 표지된 세포 시료를 AUTOMACS(Miltenyi Biotech., Germany)에 적용하여, 'depletes' 모드로 양성 분획에서 CD4+ SP(single positive), CD8+ SP 세포, CD4+CD8+ DP(double positive) 세포를 수득하고, 음성 분획에서는 CD4와 CD8이 모두 발현되지 않는 CD4-CD8- DN(double negative) 세포만을 수득하였다. 각각의 분획을 T 세포의 성숙도를 나타내는 대표적인 형광 CD 마커(hCD34. hCD1a, hCD38, hCD3, hCD4, 및 hCD8)(eBiosciences, Inc., USA)로 염색시키고 FACS Vantage(Beckton Dickinson)을 사용하여 측정하고, 그 결과를 CELLQuest(BD Biosciences, USA) 프로그램으로 분석하였다. 도 3은 실험군의 NOG 마우스에서 흉선 조직 내에 존재하는 발달 단계별 T세포의 존재를 분석한 유세포 형광분석 사진을 보여준다.
인간의 T 세포 발달 단계에서 DN은 4 단계로 나뉘며, hCD1a+hCD34-hCD38-를 발현하는 세포가 DN1, hCD1a+hCD34-hCD38+를 발현하는 세포가 DN2, hCD1a+hCD34+hCD38+를 발현하는 세포가 DN3 및 hCD3-hCD4+를 발현하는 세포가 DN4에 해당한다. 간 조직과 흉선 및 조혈모세포를 이식한 실험군의 NOG 마우스로부터 수득된 DN 분획에는 이와 같은 DN1, DN2, DN3, 및 DN4 단계의 세포가 모두 존재했다. 또한, 양성 선택이 일어난 단계의 세포가 모여있는 양성 분획에서는 hCD3+이면서 hCD4+hCD8+인 DP 세포와 선택이 끝난 단계의 hCD4+ SP 세포, hCD8+ SP 세포가 존재하는 것으로 확인되었다. 상기 결과는 실험군 마우스에 이식된 흉선 조직에서 T 세포 발달 과정의 각 단계에 해당하는 세포의 존재를 보여주며, 따라서, 정상적인 T세포의 발달이 이루어지고 있다는 것을 보여준다.
도 1은 인간(양성 대조군), 본 발명의 일 실시예에 따라 NOG 마우스에 태아 유래 흉선 및 간 조직과 제대혈 유래 조혈모세포를 동시에 이식하여 구축된 마우스 모델 및 NOG 마우스에 제대혈 유래 조혈모세포만을 이식하여 구축된 마우스 모델(음성 대조군)에서 골수 내 인간 유래 세포의 비율, 골수 및 말초혈액에서 T세포와 B세포의 비율을 보여주는 유세포 형광분석 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스 모델에서 신장 캡슐에 이식된 흉선 조직의 시간의 경과에 따른 분화를 보여주는 H&E 염색 사진이다. 사진의 우측은 NOG 마우스 모델과 동일하게 흉선 및 간 조직이 이식되었으나, 인간 세포의 생착이 거의 이루어지지 않은(1% 미만) Rag2-/-γc -/- 마우스(비교군)에서 신장 캡슐에 이식된 흉선 조직의 시간의 경과에 따른 분화를 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스 모델에서 흉선 조직 내에 존재하는 발달 단계별 T세포의 존재를 분석한 유세포 형광분석 사진이다.
Claims (5)
- 태아의 흉선 및 간 조직과 제대혈에서 유래된 조혈모세포의 이식에 의해 구축된, 인간화 NOG(NOD/SCID/IL2 receptor γc null) 마우스 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 마우스 모델은 T세포 기반 면역계가 강화된 것을 특징으로 하는 것인 마우스 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 태아의 흉선 및 간 조직은 NOG 마우스의 신장 캡슐에 이식된 것인 마우스 모델.
- B세포, T세포 및 NK 세포의 기능이 결핍된 면역결핍 NOG 마우스에 태아의 흉선과 간조직을 이식하는 단계 및 상기 마우스에 제대혈에서 유래된 조혈모세포를 이식하는 단계를 포함하는, 인간화된 면역계를 갖는 인간화 NOG 마우스 모델을 구축하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 태아의 흉선과 간 조직은 NOG 마우스의 신장 캡슐에 이식되는 것인 방법.
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