JP2023533979A - ヒト自然免疫機能を支えるトランスジェニックマウスモデル - Google Patents

Abstract

本開示は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子、およびいくつかのモデルではさらなる遺伝子改変を含む免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ（商標））マウスモデルを提供する。これらのマウスモデルは、例えば、多様な造血系統の優れた生着に、ならびに免疫腫瘍学、免疫学および感染性疾患研究に有用である。したがって、本開示のいくつかの局面は、不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子および不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含む非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスを提供する。

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０２０年７月８日に出願された米国仮出願第６３／０４９，１７５号の恩典を主張する。

背景
マウスモデルは、ヒト患者を扱う複雑さを回避するために、インビボでヒト疾患を研究するために広く使用されている。それにもかかわらず、１つには、マウス免疫系とヒト免疫系間の重要な差異のために、マウスモデルは、ヒト疾患を不十分に再現することが多い（Ｈａｇａｉら、２０１８；Ｋａｎａｚａｗａ，２００７；Ｍｅｓｔａｓ＆Ｈｕｇｈｅｓ，２００４；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆｌａｖｅｌｌ，＆Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ，２０１０）。したがって、ヒト免疫系を有するマウスとして定義されるヒト化マウスは、魅力的な代替物であり得る（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｂｒｅｈｍ，Ｇａｒｃｉａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ，＆Ｇｒｅｉｎｅｒ，２０１２；Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｒｏｎｇｖａｕｘ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｆｌａｖｅｌｌ，＆Ｍａｎｚ，２０１６；Ｖｉｃｔｏｒ Ｇａｒｃｉａ，２０１６；Ｚｈａｎｇ＆Ｓｕ，２０１２）。この目的のために、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－Ｉｌ２γｃ^－／－（ＮＳＧ）またはＢＡＬＢ／ｃ－Ｒａｇ２^－／－－γｃ^－／－のような共通ガンマ鎖（γｃ）を欠く免疫不全マウス（ＢＲＧ）（Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、２００３；Ｔｒａｇｇｉａｉら、２００４）を、ヒトＣＤ３４^＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）の移植によってヒト化することができる。Ｔ細胞の供給源に基づいて、モデルは、以下の２つのタイプにさらに分類することができる。（１）ＨＰＣのドナーから成熟Ｔ細胞が単離され、養子移植されるモデル（Ａｓｐｏｒｄら、２００７；Ｐｅｄｒｏｚａ－Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２０１１；Ｗｕら、２０１４；Ｗｕら、２０１８；Ｙｕら、２００８）；この場合、Ｔ細胞はヒト胸腺において選択されている；（２）ヒトＣＤ３４^＋ＨＰＣから内因性Ｔ細胞がデノボ生成されるモデル（Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、２００３；Ｔｒａｇｇｉａｉら、２００４）；この場合、ヒトＴ細胞はマウス胸腺において選択される。

概要
本開示は、変異を有する動物を一段階作製するために主にＣＲＩＳＰＲ技術を使用して作製される複数の改良された免疫不全マウスを提供する（表１）（Ｗａｎｇら、２０１３）。これらのモデルは、上述のモデルの制限に対処するために作製された。成熟Ｔ細胞がＨＰＣのドナーから単離され、養子移植される第１のモデルの最大の制限は、移植片対宿主病であり、内因性Ｔ細胞がヒトＣＤ３４^＋ＨＰＣからデノボ生成される第２のモデルの最大の制限は、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）を認識することができる限られた数のＴ細胞である。さらに、１）好中球、赤血球、ランゲルハンス細胞のような広範な造血系統の不完全な発達（Ｓｈｕｌｔｚら、２０１２）；２）時間とともに骨髄系統とリンパ系統の間の不均衡をもたらす、特に骨髄系細胞の限られた長期生着（Ａｕｄｉｇｅら、２０１７）；３）腫瘍と免疫系が同一の患者に由来する完全な自家モデル構築の実現可能性を妨げる、血液または骨髄に由来する成人ＣＤ３４＋ＨＰＣの生着の不十分な支持（Ｓａｉｔｏら、２０１６）；４）非リンパ系組織（例えば、粘膜バリア）の骨髄系細胞およびリンパ系細胞の両方による不十分な定着（Ｈｅｒｎｄｌｅｒ－Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒら、２０１７；Ｒｏｎｇｖａｕｘら、２０１４）；ならびに最後ではあるが大事なこととして、マウス主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の状況におけるヒト適応免疫の成熟化など、高度なインビボ研究のためのヒト化マウスの使用を妨げる大きな制約が残存している。

ヒト化マウスを改善するために本明細書で使用される戦略は、少なくとも部分的には、ヒト骨髄系細胞、特にヒト樹状細胞（ＤＣ）の改善された発達が適応免疫を改善するという概念に基づく。本発明者らは、段階的にこれにアプローチした。ＤＣは適切な免疫恒常性および適応免疫の生成に極めて重要であるので（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ＆Ｓｔｅｉｎｍａｎ，１９９８）、本発明者らは、マウスＤＣの阻害によって、ヒトＤＣ発達のためのより許容され得る環境を作り出すために、マウスＦｍｓ関連受容体チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）ノックアウト（ＫＯ）モデルを作製することから始めた。次いで、本発明者らは、マウスＦｌｔ３ＫＯモデルにおいてヒトインターロイキン６（ＩＬ６）ノックイン（ＫＩ）、ヒトリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）ＫＩおよびヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）ＫＩを作製し、マウスＦｌｔ３ＫＯモデルにおいて、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン３（ＩＬ３）のトランスジェニック（Ｔｇ）発現を有する既存のＮＳＧマウス（ＮＳＧ－ＳＧＭ３、ＳＧＭ３）（Ｎｉｃｏｌｉｎｉ，Ｃａｓｈｍａｎ，Ｈｏｇｇｅ，Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，＆Ｅａｖｅｓ，２００４；Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、２０１０）を交配した。

本明細書で提供されるマウスＦｌｔ３ＫＯモデルは、ヒトＤＣのためのスペースを作り出し、受容体リガンドＦｌｔ３Ｌをヒト細胞に利用可能とすることによって、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣの移植時のヒト骨髄系細胞の発達を改善する。さらに、ヒトＨＰＣを移植された、追加のヒトＫＩまたはＴｇ遺伝子発現を有するＦｌｔ３ＫＯモデルは、インフルエンザウイルスに対する中和抗体を含むヒトワクチン特異的抗体を生成することができる。全体として、本発明の系統は、橋渡しの免疫学／免疫腫瘍学研究のためのヒト化マウスモデルの既存の制限に対処する。

したがって、本開示のいくつかの局面は、不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子および不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含む非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスを提供する。本開示のさらなる局面は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＳＧ（商標）マウスを提供する。本開示のさらなる局面は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＳＧ（商標）マウスを提供する。

不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子および不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤマウスを作製する方法、モデル系としてマウスを使用する方法、ならびにマウスを繁殖させる方法も本明細書で提供される。

本開示のいくつかの局面は、不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＴＳＬＰをコードする核酸を含むＮＯＤマウスを提供する。本開示のさらなる局面は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＴＳＬＰをコードする核酸を含むＮＳＧ（商標）マウスを提供する。

不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＴＳＬＰをコードする核酸を含むＮＯＤマウスを作製する方法、モデル系としてマウスを使用する方法、ならびにマウスを繁殖させる方法も本明細書で提供される。

本開示のいくつかの局面は、不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＩＬ６をコードする核酸を含むＮＯＤマウスを提供する。本開示のさらなる局面は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＩＬ６をコードする核酸を含むＮＳＧ（商標）マウスを提供する。

不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＩＬ６をコードする核酸を含むＮＯＤマウスを作製する方法、モデル系としてマウスを使用する方法、ならびにマウスを繁殖させる方法も本明細書で提供される。

本開示のいくつかの局面は、不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＬＴＢＲをコードする核酸を含むＮＯＤマウスを提供する。本開示のさらなる局面は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＬＴＢＲをコードする核酸を含むＮＳＧ（商標）マウスを提供する。

不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＬＴＢＲをコードする核酸を含むＮＯＤマウスを作製する方法、モデル系としてマウスを使用する方法、ならびにマウスを繁殖させる方法も本明細書で提供される。

本開示のいくつかの局面は、不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子、ヒトＩＬ３をコードする核酸；ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸；およびヒトＳＣＦをコードする核酸を含むＮＯＤマウスを提供する。本開示のさらなる局面は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子、ならびにヒトＩＬ３をコードする核酸、ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸およびヒトＳＦをコードする核酸を含むＮＳＧ（商標）マウスを提供する。

不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子、ヒトＩＬ３をコードする核酸；ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸；およびヒトＳＣＦをコードする核酸を含むＮＯＤマウスを作製する方法、モデル系としてマウスを使用する方法、ならびにマウスを繁殖させる方法も本明細書で提供される。

本開示のさらなる局面は、本明細書中に記載されるマウスモデルの任意の１つから得られる細胞を提供する。

図１Ａ～１Ｅは、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓによるＮＳＧマウスにおけるマウスＦｌｔ３ノックアウトを示す。図１Ａは、Ｆｌｔ３ノックアウトを有するＮＳＧマウス（ＮＳＧＦ）中のＦｌｔ３のエクソン３における染色体の欠失を示す概略図を示す。図１Ｂは、マウスＦｌｔ３野生型対立遺伝子（７９９ｂｐ）および変異体対立遺伝子（３６３ｂｐ）をＰＣＲによって検出するために尾部の先端切除を行ったＦ１同腹子を示す。図１Ｃは、ＦＡＣＳによって８～１０週齢のマウス中の骨髄ｍＣＤ４５＋細胞上で分析されたマウスＦｌｔ３タンパク質発現を示す。図１Ｄは、ｎ＝７のマウスから得られた図１Ｃからの要約データのグラフである。データ点の記号は、正方形：雄；丸：雌である。図１Ｅは、ＥＬＩＳＡによって血漿中のマウスＦｌｔ３Ｌ産生について分析された８～１０週齢マウスを示すグラフである。データ点の記号は、正方形：雄；丸：雌である。 同上。 同上。

図２Ａ～２Ｃは、マウスＦｌｔ３ノックアウトがマウス樹状細胞（ＤＣ）の減少をもたらしたことを示す。図２Ａは、特異的抗体で染色され、フローサイトメトリーによって分析された、８～１０週齢のマウスの骨髄、脾臓および肺の単一細胞懸濁液を示す。ＭＨＣクラスＩＩおよびＰＤＣＡ－１の発現とともにＤＡＰＩ－、ｍＣＤ４５＋、ｍＣＤ３／１９－、Ｆ４／８０－およびＧｒ１－として、ｐＤＣをゲーティングした。ＰＤＣＡ－１－細胞は、ｃＤＣについて、ＭＨＣクラスＩＩ＋およびｍＣＤ１１ｃ＋に対してさらにゲーティングした。ｃＤＣを、骨髄および脾臓におけるｍＣＤ１１ｂ＋またはｍＣＤ８＋サブセットおよび肺におけるｍＣＤ１０３＋サブセットに分けた。図２Ｂは、ｎ＝７のマウスから得られた図２Ａからの要約データのグラフである。図２Ｃは、８～１０週齢のＮＳＧまたはＮＳＧＦマウスの脾臓におけるマウスＭＨＣクラスＩＩ（ＩＡｇ７）およびＤＡＰＩの局在化を示す。スケールバー＝１００μｍ。 同上。 同上。

図３Ａ～３Ｆは、ヒト化ＮＳＧＦマウスにおける改善されたヒト生着を示す。図３Ａは、ヒト化マウスの構築を示す概略図である。マウスに、４週で致死量未満で放射線照射し、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣを移植し、毎月採血し、ＨＰＣ移植後１６週で分析した。図３Ｂは、１×１０^５個の胎児肝臓ＨＰＣの移植後のｈＮＳＧまたはｈＮＳＧＦマウスにおけるｈＣＤ４５＋細胞の百分率による血液中のヒト生着の動態を示すグラフである。図３Ｃは、図３ＢにおいてＦＡＣＳによって血液中で分析された異なるヒト免疫細胞の百分率を示すグラフである。図３Ｄは、胎児肝臓ＨＰＣ移植後１５週でのｈＮＳＧまたはｈＮＳＧＦマウスの脾臓および腸におけるヒトＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ、緑色）、マウスＭＨＣクラスＩＩ（ＩＡｇ７）およびＤＡＰＩの局在化を示す。スケールバー＝５０μｍ。図３Ｅは、１×１０^５個の臍帯血（ＣＢ）ＨＰＣによる新生児（ＮＢ）または４週（Ｗ４）のいずれかにおける移植後１２週での、百分率によって血液中で測定されたヒト生着、ｈＣＤ４５＋細胞の絶対数、ならびにヒトＣＤ３３＋、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞の百分率を示すグラフである。図３Ｆは、１×１０^５個の骨髄（ＢＭ）ＨＰＣによる４週での移植後１２週におけるヒト生着を示すグラフである。 同上。 同上。

図４Ａ～４Ｊは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを介したＮＳＧＦマウスにおけるヒトＩＬ６ノックインを示す。図４Ａは、ヒトＩＬ６－ノックイン配列の５’および３’接合部および完全長を標的とするポジティブＰＣＲアッセイならびにプラスミド骨格に対するネガティブによって選択された潜在的ファウンダーマウスを示す。図４Ｂは、１０μｇのＬＰＳ腹腔内で２時間処置された、異なるＩＬ６対立遺伝子を有するＮＳＧＦマウスの血漿におけるヒトＩＬ－６産生を示すグラフである。図４Ｃは、臍帯血からの１×１０^４個、３×１０^４個、１×１０^５個のＨＰＣによる１２週間の移植後のｈＮＳＧマウスまたはｈＮＳＧＦ６マウスにおけるｈＣＤ４５＋細胞の百分率（左パネル）および絶対数（右パネル）による血液中のヒト生着を示す。１人のドナーからｎ＝２～３のマウス。図４Ｄは、１×１０^５個の骨髄ＨＰＣの１２週間の移植後のｈＮＳＧマウスまたはｈＮＳＧＦ６マウスにおけるｈＣＤ４５＋細胞の百分率（左パネル）および絶対数（右パネル）による血液中のヒト生着を示す。１人の骨髄ドナーからｎ＝５。図４Ｅは、ＦＡＣＳによって２０週で分析されたヒト化マウスの脾臓および肺におけるヒト単球サブセットを示す。２人の臍帯血ドナーから＝４のマウス。系統あたり１匹のマウスからの代表的なＦＡＣＳプロットを示した。図４Ｆは、脾臓（左パネル）および肺（右パネル）におけるＣＤ１４^＋細胞の絶対数の要約を示す。図４Ｇは、脾臓および肺におけるＣＤ１４^＋細胞サブセットの絶対数の要約を示す。図４Ｈは、ＦＡＣＳによって２０週に分析されたヒト化マウスの脾臓中のヒトＣＸＣＲ５^＋ＰＤ１^＋ＣＤ４^＋Ｔｆｈ細胞を示す。図４Ｉは、脾臓中のＣＸＣＲ５^＋ＰＤ１^＋ＣＤ４^＋Ｔｆｈ細胞の絶対数の要約を示す。２人の臍帯血ドナーからｎ＝４のマウス。図４Ｊは、ＥＬＩＳＡによって１６週に分析されたヒト化マウスの血清中の総抗体を示す。総ＩｇＭ（左パネル）、ＩｇＧ（中央パネル）およびＩｇＡ（右パネル）の要約。２人の臍帯血ドナーからｎ＝９～２４のマウス。 同上。 同上。 同上。 同上。

図５Ａ～５Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを介したＮＳＧＦマウスにおけるヒトＴＳＬＰノックインを示す。図５Ａは、ヒトＴＳＬＰ－ノックイン配列の５’および３’接合部を標的とするポジティブＰＣＲアッセイによって選択された潜在的なファウンダーマウスを示す。図５Ｂは、ＰＭＡ／ＩＯＮＯで１８時間処置されたマウスの肺におけるヒトＴＳＬＰタンパク質産生を示すグラフである。図５Ｃは、１×１０^５個の臍帯血（ＣＢ）ＨＰＣによる新生児（ＮＢ）または４週（Ｗ４）のいずれかにおける移植後１２週での、ヒトＣＤ３３＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋細胞の百分率によって血液中で測定されたヒト生着を示すグラフである。 同上。

図６Ａ～６Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを介したＮＳＧＦマウスにおけるヒトＬＴＢＲノックインを示す。図６Ａは、ｂＧＨｐＡ ＳＴＯＰカセットが後続するプラスミドドナー挿入断片ヒトＬＴＢＲコード配列（イントロン１を含む）を使用した、マウスＬｔｂｒのＡＴＧコドンおよびＳＴＯＰコドンを標的とするノックイン戦略を示す概略図である。図６Ｂは、ＦＡＣＳによって６～８週齢のマウスの骨髄ｍＣＤ４５＋細胞上で分析されたマウスおよびヒトＬＴＢＲ発現を示すグラフである。要約データは、ｎ＝５のマウスからのものである。図６Ｃは、１×１０^５個の臍帯血（ＣＢ）ＨＰＣによる新生児（ＮＢ）または４週（Ｗ４）のいずれかにおける移植後１２週での、百分率によって血液中で測定されたヒト生着、ｈＣＤ４５＋細胞の絶対数、ならびにｈＣＤ４５＋細胞中のヒトＣＤ３３＋、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞の百分率を示すグラフである。 同上。

図７Ａ～７Ｂは、ＳＧＭ３Ｆマウスにおける優れたヒト生着を示す。図７Ａは、５人の臍帯血ドナーに由来する臍帯血ＨＰＣを移植されたマウス（ｎ＝６～１８、４週齢）の血液におけるヒト生着を示すグラフである。マウスの血液におけるヒト生着を移植後１２週で測定し、ＦＡＣＳによって、ｈＣＤ４５＋細胞の百分率およびＣＤ３３＋またはＣＤ１４＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋細胞の百分率によって分析した。ＡＮＯＶＡ検定を使用して、統計学的に有意な差を決定した。図７Ｂは、骨髄ＨＰＣを移植されたマウス（ｎ＝６～１８、４週齢）の血液におけるヒト生着を示すグラフである。マウスの血液におけるヒト生着を移植後１２週で測定し、ＦＡＣＳによって、ｈＣＤ４５＋細胞の百分率およびＣＤ３３＋またはＣＤ１４＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋細胞の百分率によって分析した。ＡＮＯＶＡ検定を使用して、統計学的に有意な差を決定した。

図８Ａ～８Ｄは、ＳＧＭ３Ｆマウスにおけるヒト骨髄区画の拡大を示す。図８Ａは、臍帯血ＨＰＣを移植されたヒト化マウス（４週齢）を示すグラフである。ヒト化マウスの脾臓中のヒト骨髄サブセットをＦＡＣＳによって２０週で分析した。マウス（ｎ＝３）からの骨髄および脾臓における異なる骨髄系細胞の概要。図８Ｂは、ＤＣサブセットの概要を示すグラフである。図８Ｃは、ｃＤＣサブセットの概要を示すグラフである。図８Ｄは、２０週に分析されたヒト化マウスの腸におけるヒトＨＬＡ－ＤＲ、ヒトＣＤ３およびＤＡＰＩの局在化を示す。スケールバー＝５０μｍ。 同上。

図９Ａ～９Ｄは、ＳＧＭ３Ｆマウスにおける増加したＴ細胞分化を示す。図９Ａは、臍帯血ＨＰＣを４週齢で移植されたヒト化マウスのＦＡＣＳ分析を示す。移植後２０週で、ＣＤ４およびＣＤ８サブセットについて、ヒトＣＤ３＋胸腺細胞をＦＡＣＳによって分析した。結果は、１人の臍帯血ドナーからのプールされたｎ＝３マウスを示す。図９Ｂは、２０週に分析されたヒト化マウスの胸腺におけるヒトＴ細胞の局在を示す。上のパネルにおけるヒトＨＬＡ－ＤＲおよびヒトＣＤ３対下のパネルにおけるヒトＣＤ４およびヒトＣＤ８。スケールバー＝３０μｍ。図９Ｃは、脾臓におけるＣＤ４＋対ＣＤ８＋Ｔ細胞比の要約を示すグラフである。一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して、統計学的に有意な差を決定した。図９Ｄは、脾臓中のＣＤ４５＋ＣＣＲ７＋ナイーブＴ細胞（Ｔｎ）、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋メモリーＴ細胞（Ｔｍ）およびＣＣＲ７－エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を含むＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの概要を示すグラフである。 同上。

図１０Ａ～１０Ｃは、ＳＧＭ３Ｆマウスにおける特異的抗体応答を示す。図１０Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定された、移植後２０週でのマウスの血漿中の全抗体を示すグラフである。ヒト化マウス（ｎ＝３、４週齢）に（１人の臍帯血ドナーからの）臍帯血ＨＰＣを移植した。図１０Ｂは、ヒト化マウス（ｎ＝３、４週齢）が（１人の臍帯血ドナーからの）臍帯血ＨＰＣを移植され、１４週後に３週間間隔でＫＬＨを３回ワクチン接種され、ＥＬＩＳＡによって分析されたＫＬＨ特異的ＩｇＧを測定されたことを示す。図１０Ｃは、ヒト化マウス（ｎ＝６～９、４週齢）が（２人の臍帯血ドナーからの）臍帯血ＨＰＣを移植され、３週間間隔でＦｌｕｚｏｎｅを２回ワクチン接種され、測定されたＦｌｕｚｏｎｅ特異的ＩｇＧがＥＬＩＳＡによって分析されたことを示す。インフルエンザＡ／Ｃａｌ９ウイルスに対する中和抗体を赤血球凝集アッセイによって測定した。 同上。

詳細な説明
本開示は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子、およびいくつかのモデルではさらなる遺伝子改変を含む免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ（商標））マウスモデルを提供する。本明細書において提供されるマウスモデルは、例えば、多様な造血系統の優れた生着に、ならびに免疫腫瘍学、免疫学および感染性疾患研究に有用である。

Ｆｌｔ３は、樹状細胞および単球系統の発達に重要な受容体である。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｌｔ３シグナル伝達は、様々なＤＣおよび単球系統の発達にとって重要であり（Ｄｉｎｇら、２０１４；Ｇｉｎｈｏｕｘら、２００９；ＭｃＫｅｎｎａら、２０００；Ｗａｓｋｏｗら、２００８）、その役割は、マウスおよびヒトにおけるインビボでのＦｌｔ３Ｌの投与後の循環通常型（ｃ）ＤＣおよび形質細胞様（ｐ）ＤＣの増加によってさらに裏付けられる（Ｋａｒｓｕｎｋｙ，Ｍｅｒａｄ，Ｃｏｚｚｉｏ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，＆Ｍａｎｚ，２００３；Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら、１９９６；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、２０００）。マウスＦｌｔ３をノックアウトすることによって、（１）マウスＤＣおよび他の骨髄系細胞の減少；および（２）ヒト細胞への（ヒト受容体を介して作用することができる）マウスＦｌｔ３Ｌの利用可能性の増大をもたらすことができ、それにより、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣの移植に際するヒト骨髄系細胞の長期発達を改善する。本開示は、いくつかの態様において、ＮＳＧ（商標）バックグラウンドでＦｌｔ３ＫＯマウスを作製するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する。

したがって、いくつかの局面において、本開示は、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ（商標））バックグラウンドを有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子をさらに含むマウスモデル（本明細書において、ＮＳＧＦマウスと呼ばれる）を提供する。いくつかの態様において、ＮＳＧＦマウスモデルの遺伝子型は、ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}である（ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}マウスを作製する例示的な方法については実施例１を参照されたい）。

本開示の他の局面は、ＮＳＧ（商標）バックグラウンドを有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびマウスＩｌ６の代わりにヒトＩＬ６をコードする核酸をさらに含むマウスモデル（本明細書ではＮＳＧＦ６マウスと呼ぶ）を提供する。いくつかの態様において、ＮＳＧＦ６マウスモデルの遺伝子型は、ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｉｌ６^{ｅｍ１（ＩＬ６）Ａｋｐ}である（ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｉｌ６^{ｅｍ１（ＩＬ６）Ａｋｐ}マウスを作製する例示的な方法については実施例２を参照されたい）。

本開示のさらに他の局面は、ＮＳＧ（商標）バックグラウンドを有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびマウスＴｓｌｐの代わりにヒトＴＳＬＰをコードする核酸をさらに含むマウスモデル（本明細書ではＮＳＧＦＴマウスと呼ぶ）を提供する。いくつかの態様において、ＮＳＧＦＴマウスモデルの遺伝子型は、ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}である（ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}マウスを作製する例示的な方法については実施例３を参照されたい）。

本開示のさらに他の局面は、ＮＳＧ（商標）バックグラウンドを有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびマウスＬｔｂｒの代わりにヒトＬＴＢＲをコードする核酸をさらに含むマウスモデル（本明細書ではＮＳＧＦＬマウスと呼ぶ）を提供する。いくつかの態様において、ＮＳＧＦＬマウスモデルの遺伝子型は、ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｌｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}である（ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｌｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}マウスを作製する例示的な方法については実施例４を参照されたい）。

本開示のさらなる局面は、ＮＳＧ（商標）バックグラウンドを有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＩＬ３、ＧＭ－ＣＳＦおよびＳＣＦをコードする核酸をさらに含むマウスモデル（本明細書ではＳＧＭ３Ｆマウスと呼ぶ）を提供する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスモデルの遺伝子型は、ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}－Ｔｇ（Ｈｕ－ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）^{１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ}（ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}－Ｔｇ（Ｈｕ－ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）^{１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ}マウスを作製する例示的な方法については実施例５を参照されたい。）である。
ＮＳＧ（商標）およびＮＳＧＦマウスモデル

ＮＳＧ（商標）マウスは、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠き、複数のサイトカインシグナル伝達経路が欠損しており、自然免疫に多くの欠陥を有する免疫不全マウスである（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｉｓｈｉｋａｗａ，＆Ｇｒｅｉｎｅｒ，２００７；Ｓｈｕｌｔｚら、２００５；Ｓｈｕｌｔｚら、１９９５）を参照されたい。）。非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス系統ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪに由来するＮＳＧ（商標）マウス（例えば、参照により本明細書に組み入れられる（Ｍａｋｉｎｏら、１９８０）を参照されたい。）は、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ変異（「重症複合免疫不全」変異または「ｓｃｉｄ」変異とも呼ばれる）およびＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}標的化変異を含む。Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ変異は、ヒトＰＲＫＤＣ遺伝子のマウスホモログにおける機能喪失変異であり、この変異は適応免疫を本質的に排除する（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｂｌｕｎｔら、１９９５；Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｈｅｓｓｅｌｔｏｎ，＆Ｓｈｕｌｔｚ，１９９８）を参照されたい。）。Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}変異は、インターロイキン２受容体γ鎖（ＩＬ２Ｒγ、ヒトにおけるＩＬ２ＲＧと相同）をコードする遺伝子におけるヌル変異であり、これはＮＫ細胞分化を遮断し、それによって初代ヒト細胞の効率的な生着を妨げる障害を除去する（Ｃａｏら、１９９５；Ｇｒｅｉｎｅｒら、１９９８；Ｓｈｕｌｔｚら、２００５）、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。）。当技術分野で公知であるように、機能喪失変異は、機能をほとんどまたは全く有しない遺伝子産物をもたらす。比較すると、ヌル変異は、機能を有しない遺伝子産物をもたらす。不活性化された対立遺伝子は、機能喪失対立遺伝子またはヌル対立遺伝子であり得る。

不活性化された対立遺伝子は、検出可能なレベルの機能的遺伝子産物（例えば、機能的タンパク質）を産生しない対立遺伝子である。いくつかの態様において、不活性化された対立遺伝子は転写されない。いくつかの態様において、不活性化された対立遺伝子は、機能的タンパク質をコードしない。したがって、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むマウスは、検出可能なレベルの機能的ＦＬＴ３を産生しない。いくつかの態様において、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むマウスは、機能的ＦＬＴ３を産生しない。

本明細書において提供されるマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウス、またはこれらの任意の組み合わせ）は、マウスＦｌｔ３対立遺伝子を不活性化するゲノム修飾を含む。核酸に関する修飾は、対応する野生型核酸（例えば、天然に存在する核酸）と比較した、核酸の任意の操作である。したがって、ゲノム修飾は、ゲノム中の対応する野生型核酸（例えば、天然に存在する核酸）と比較した、ゲノム中の核酸の任意の操作である。核酸（例えば、ゲノム）修飾の非限定的な例には、欠失、挿入、「インデル」（欠失および挿入）、および置換（例えば、点変異）が含まれる。いくつかの態様において、遺伝子における欠失、挿入、インデルまたは他の修飾は、その遺伝子がもはや機能的産物（例えば、タンパク質）をコードしないようなフレームシフト変異をもたらす。修飾には、化学的修飾、例えば、少なくとも１つの核酸塩基の化学的修飾も含まれる。核酸修飾の方法、例えば、遺伝子不活性化をもたらす方法は公知であり、限定されないが、ＲＮＡ干渉、化学的修飾および（例えば、リコンビナーゼまたは他のプログラム可能なヌクレアーゼ系、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＺＦＮを使用する）遺伝子編集が挙げられる。いくつかの態様において、本明細書の他の箇所に記載されるように、マウスＦｌｔ３対立遺伝子を不活性化するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集が使用される。

いくつかの態様において、ゲノム修飾（例えば、欠失またはインデル）は、コード領域、非コード領域および調節領域から選択されるマウスＦｌｔ３対立遺伝子の（少なくとも１つの）領域中にある。いくつかの態様において、ゲノム修飾（例えば、欠失またはインデル）は、マウスＦｌｔ３対立遺伝子のコード領域である。例えば、ゲノム修飾（例えば、欠失またはインデル）は、エクソン３中にあり得、またはマウスＦｌｔ３対立遺伝子のエクソン３にまたがり得る。いくつかの態様において、ゲノム修飾は、ゲノム欠失である。例えば、マウスＦｌｔ３対立遺伝子は、エクソン３中のヌクレオチド配列のゲノム欠失を含み得る。いくつかの態様において、配列番号１のヌクレオチド配列は、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子から欠失されている。いくつかの態様において、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様において、本明細書で提供されるマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウス、またはこれらの任意の組み合わせ）は、検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３を発現しない。検出可能なレベルのマウスＦＬＴ３は、フローサイトメトリーおよび／またはＥＬＩＳＡなどの標準的なタンパク質検出アッセイを使用して検出される任意のレベルのＦＬＴ３タンパク質である。いくつかの態様において、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウス、またはこれらの任意の組み合わせ）は、検出不能なレベルまたは低レベルのマウスＦＬＴ３を発現する。例えば、マウスモデルは、１，０００ｐｇ／ｍｌ未満のマウスＦＬＴ３を発現し得る。いくつかの態様において、マウスモデルは、５００ｐｇ／ｍｌ未満のマウスＦＬＴ３または１００ｐｇ／ｍｌ未満のマウスＦＬＴ３を発現する。マウスＦＬＴ３受容体は、表面抗原分類抗原ＣＤ１３５とも呼ばれる。したがって、いくつかの態様において、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウス、またはこれらの任意の組み合わせ）は、ＣＤ１３５^＋多能性前駆細胞を含まない（存在しない）。

Ｆｌｔ３ノックアウトマウスは、いくつかの態様において、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用してＣＲＩＳＰＲによって作製される。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例えば、５’－ＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡ－３’、配列番号５）は、ＮＳＧ（商標）マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：００５５５７）のマウスＦｌｔ３のエクソン３を標的とする。注入された胚に由来する胚盤胞は、いくつかの態様において、代理母に移植され、新生仔が得られる。いくつかの態様において、ヌル欠失を有するマウスは、ＮＳＧ（商標）に対して戻し交配される。Ｆ０およびＦ１同腹仔は、例えば、ＰＣＲおよびサンガー配列決定によって遺伝子ノックアウトの成功について試験され得る。例えば、変異対立遺伝子からマウスＦｌｔ３野生型対立遺伝子を検出するために、ＰＣＲ反応において、プライマー（５’－ＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＣ－３’、配列番号１２）および（５’－ＡＴＣＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ－３’、配列番号１３）が使用され得る（表２）。ＷＴ対立遺伝子は７９９ｂｐ長のＤＮＡ断片を生じるのに対して、変異した対立遺伝子は３６３ｂｐ長のＤＮＡ断片を生じる。
ノックインマウスモデル

ノックインマウスモデル（ＫＩマウス）は、例えば、遺伝子配列を導入遺伝子で置換することによって、または遺伝子座内に見出されない遺伝子配列を付加することによって、遺伝子配列を修飾するために作製され得る。本明細書で提供されるＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬおよびＳＧＭ３Ｆマウスモデルは、ノックイン対立遺伝子を含む。これらのマウスモデルは、マウスゲノム中に導入された外因性核酸を含む。

本明細書で提供されるように使用される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのキメラであり得る。いくつかの態様において、核酸（例えば、ＤＮＡ）は、特定の目的のタンパク質（例えば、ＩＬ６、ＴＳＬＰ、ＬＴＢＲ、ＩＬ３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、またはこれらの任意の組み合わせ）をコードする遺伝子を含む。遺伝子は、ヌクレオチドの別個の配列であり、その順序は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中の単量体の順序を決定する。遺伝子は、典型的にはタンパク質をコードする。遺伝子は、内因性（宿主生物中に天然に存在する）または外因性（自然にまたは遺伝子操作を通じて宿主生物に導入される）であり得る。対立遺伝子は、変異によって生じ、染色体上の同じ遺伝子座に見られる遺伝子の２つまたはそれを超える代替形態のうちの１つである。遺伝子は、いくつかの態様において、プロモーター配列、コード領域（例えば、エクソン）、非コード領域（例えば、イントロン）、および調節領域（調節配列とも呼ばれる）を含む。当技術分野で公知であるように、プロモーター配列は、そこで遺伝子の転写が始まるＤＮＡ配列である。プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位のすぐ上流（の５’末端）に位置する。エクソンは、アミノ酸をコードする遺伝子の領域である。イントロン（および他の非コードＤＮＡ）は、アミノ酸をコードしない遺伝子の領域である。

ヒト遺伝子を含むマウスは、ヒト導入遺伝子を含むと考えられる。導入遺伝子は、宿主生物に対して外因性の遺伝子である。すなわち、導入遺伝子は、自然にまたは遺伝子操作を通じて宿主生物に導入された遺伝子である。導入遺伝子は、宿主生物（導入遺伝子を含む生物、例えばマウス）中に天然には存在しない。

ノックインマウスモデルを作製する方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。
ＮＳＧＦ６マウスモデル

本開示は、ＮＳＧ（商標）バックグラウンドを有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびマウスＩｌ６の代わりにヒトＩＬ６をコードする核酸をさらに含むマウスモデル（本明細書ではＮＳＧＦ６マウスと呼ぶ）を提供する。いくつかの態様において、ＮＳＧＦ６マウスモデルの遺伝子型は、ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｉｌ６^{ｅｍ１（ＩＬ６）Ａｋｐ}である（ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｉｌ６^{ｅｍ１（ＩＬ６）Ａｋｐ}マウスを作製する例示的な方法については実施例２を参照されたい）。

ＩＬ６（例えば、ＮＣ＿０００００７．１；染色体：ＧＲＣｈ３８：７：２２７２５８８９－２２７３２００２）は、インターロイキン６受容体αを結合し、活性化することによって、炎症および免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）の成熟を刺激するサイトカインおよび増殖因子である。ＩＬ６は、ＨＰＣ維持（Ｅｎｃａｂｏ，Ｍａｔｅｕ，Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ－Ｕｂｅｒｏｓ，＆Ｍｉｎａｎａ，２００３）および活性化されたＢ細胞の抗体産生形質細胞への分化（Ｊｅｇｏら、２００３；Ｎｕｒｉｅｖａら、２００９）に不可欠である。ＮＳＧをベースとするヒト化マウスを改良するために、ヒトＩＬ６ノックインマウスを作製して、ＮＳＧＦマウス中のマウスオルソログを置き換えた。

いくつかの態様において、本明細書に記載されるＮＳＧＦ６マウスは、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびＩＬ６をコードする核酸を含む。いくつかの態様において、核酸はヒトＩＬ６をコードする。いくつかの態様において、核酸はヒトＩＬ６導入遺伝子を含む。いくつかの態様において、ヒトＩＬ６導入遺伝子などの導入遺伝子は、マウスゲノム中に組み込まれる。いくつかの態様において、ヒトＩＬ６導入遺伝子は、配列番号２の核酸配列を含む。

ヒトＩＬ６ノックインマウスは、いくつかの態様においては、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して作製される。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、マウスＩｌ６を標的とするｇＲＮＡおよび組換えヒトＩＬ６ＤＮＡを、受精したＮＳＧＦ卵母細胞（例えば、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}）中に同時注入し得る。ヒトＩＬ６は、いくつかの態様においては、相同組換えを介してエクソン１およびエクソン５中に挿入される。いくつかの態様において、ヒトＩＬ６を保有する得られたファウンダーは、例えば、複数（例えば、２世代）についてＮＳＧＦマウスに交配され、その後、すべての子孫がＩｌ６を標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配される。ＰＣＲ反応による遺伝子型のために使用され得るプライマーの例は、表２に列記されている。
ＮＳＧＦＴマウスモデル

本開示は、ＮＳＧ（商標）バックグラウンドを有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびマウスＴｓｌｐの代わりにヒトＴＳＬＰをコードする核酸をさらに含むマウスモデル（本明細書ではＮＳＧＦＴマウスと呼ぶ）も提供する。いくつかの態様において、ＮＳＧＦＴマウスモデルの遺伝子型は、ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}である（ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}マウスを作製する例示的な方法については実施例３を参照されたい）。

胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）（例えば、ＮＣ＿０００００５．１０；染色体：ＧＲＣｈ３８：５：１１１０７００８０－１１１０７８０２６）は、種特異的なサイトカインであり、種特異的な機能を示す（Ｈａｎａｂｕｃｈｉ，Ｗａｔａｎａｂｅ，＆Ｌｉｕ，２０１２）。ヒトＴＳＬＰは、ナイーブＴ細胞の増殖を誘導し、Ｔｈ２分化、Ｔｒｅｇ発達を推進する（Ｈａｎａｂｕｃｈｉら、２０１０；Ｉｔｏら、２００５；Ｌｕら、２００９）。ＴＳＬＰは、胸腺間質性リンパ球新生因子受容体鎖およびＩＬ－７Ｒα鎖から構成されるヘテロ二量体受容体複合体を結合し、活性化することによって、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）の産生を刺激する（例えば、（Ｈｅ＆Ｇｅｈａ，２０１０）を参照されたい。）。ＴＳＬＰは、樹状細胞の極性化にも重要である。ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して直接作用するＩＬ－７とは対照的に、ＴＳＬＰは、ヒトＤＣを介して間接的にＴ細胞恒常性を媒介する（Ｌｕら、２００９）。Ｔ細胞の発達および分化を改善するために、ヒトＴＳＬＰノックインマウスを作製して、ＮＳＧＦマウス中のマウスＴｓｌｐを置き換えた。

いくつかの態様において、本明細書に記載されるＮＳＧＦＴマウスは、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびＴＳＬＰをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、核酸はヒトＴＳＬＰをコードする。いくつかの態様において、核酸はヒトＴＳＬＰ導入遺伝子を含む。いくつかの態様において、ヒトＴＳＬＰ導入遺伝子などの導入遺伝子は、マウスゲノム中に組み込まれる。いくつかの態様において、ヒトＴＳＬＰ導入遺伝子は、配列番号３の核酸配列を含む。

ヒトＴＳＬＰノックインマウスは、いくつかの態様においては、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して作製される。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、マウスＴｓｌｐを標的とするｇＲＮＡおよび組換えヒトＴＳＬＰ ＤＮＡを、受精したＮＳＧＦ卵母細胞（例えば、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}）中に同時注入し得る。ヒトＴＳＬＰは、いくつかの態様においては、相同組換えを介してエクソン１およびエクソン５中に挿入される。いくつかの態様において、ヒトＴＳＬＰを保有する得られたファウンダーは、例えば、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}マウスに交配され、その後、すべての子孫がＴＳＬＰを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配される。ＰＣＲ反応による遺伝子型のために使用され得るプライマーの例は、表２に列記されている。
ＮＳＧＦＬマウスモデル

本開示は、ＮＳＧ（商標）バックグラウンドを有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびマウスＬｔｂｒの代わりにヒトＬＴＢＲをコードする核酸をさらに含むマウスモデル（本明細書ではＮＳＧＦＬマウスと呼ぶ）をさらに提供する。いくつかの態様において、ＮＳＧＦＬマウスモデルの遺伝子型は、ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｌｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}である（ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｌｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}マウスを作製する例示的な方法については実施例４を参照されたい）。

濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）は、リンパ濾胞およびＢ細胞応答の発達に不可欠である（Ｆｕｔｔｅｒｅｒ，Ｍｉｎｋ，Ｌｕｚ，Ｋｏｓｃｏ－Ｖｉｌｂｏｉｓ，＆Ｐｆｅｆｆｅｒ，１９９８）。Ｒａｇ２^－／－－γｃ^－／－マウスの血管周囲領域中のＰＤＧＦＲｂ^＋Ｍｆｇｅ８^＋ＦＤＣ前駆体は、リンパ球再構成を介してリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）（例えば、ＮＣ＿００００１２．１２；染色体：ＧＲＣｈ３８：１２：６３７５１６０－６３９１５７１）の活性化時に成熟ＦＤＣに分化し得る（Ｋｒａｕｔｌｅｒら、２０１２）。したがって、ＮＳＧＦマウス中のマウスＬｔｂｒを置き換えるために、ヒトＬＴＢＲノックインマウスを作製した。

いくつかの態様において、本明細書に記載されるＮＳＧＦＬマウスは、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびＬＴＢＲをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、核酸はヒトＬＴＢＲをコードする。いくつかの態様において、核酸はヒトＬＴＢＲ導入遺伝子を含む。いくつかの態様において、ヒトＬＴＢＲ導入遺伝子などの導入遺伝子は、マウスゲノム中に組み込まれる。いくつかの態様において、ヒトＬＴＢＲ導入遺伝子は、配列番号４の核酸配列を含む。

ヒトＬＴＢＲノックインマウスは、いくつかの態様においては、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して作製される。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、マウスＬｔｂｒを標的とするｓｇＲＮＡならびに５’および３’マウスＬｔｂｒ相同配列が隣接した合成ヒトＬＴＢＲミニ遺伝子（すべてのエクソンおよびイントロン１配列、その後にｂＧＨｐＡ ＳＴＯＰカセットを有するＮＭ＿００２３４２をコードする）を、受精したＮＳＧＦ卵母細胞（例えば、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}）中に同時注入し得る。ヒトＬＴＢＲは、いくつかの態様においては、相同組換えを介してエクソン１およびエクソン２中に挿入される。いくつかの態様において、ヒトＬＴＢＲを保有する得られたファウンダーは、例えば、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}マウスに交配され、その後、すべての子孫がＬＴＢＲを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配される。ＰＣＲ反応による遺伝子型のために使用され得るプライマーの例を表２に列記した。
ＳＧＭ３Ｆマウスモデル

さらに、本開示は、ＮＳＧ（商標）バックグラウンドを有し、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびヒトＩＬ３、ＧＭ－ＣＳＦおよびＳＣＦをコードする核酸をさらに含むマウスモデル（本明細書ではＳＧＭ３Ｆマウスと呼ぶ）を提供する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスモデルの遺伝子型は、ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}－Ｔｇ（Ｈｕ－ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）^{１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ}（ＮＳＧ（商標）Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}－Ｔｇ（Ｈｕ－ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）^{１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ}マウスを作製する例示的な方法については実施例５を参照されたい。）である。

マウスおよびヒトのサイトカインおよびサイトカイン受容体の間での限られた生物学的交差反応性は、ヒト自然免疫系、特に単球、マクロファージおよび好中球の発達を抑制する。トランスジェニックまたはノックインヒト遺伝子のいずれかを介してヒトサイトカインを発現させるための努力がなされてきた（Ｒａｔｈｉｎａｍら、２０１１；Ｒｏｎｇｖａｕｘら、２０１４；Ｗｉｌｌｉｎｇｅｒら、２０１１）。免疫不全マウスの１つのこのような変異型は、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン（ＩＬ）－３のトランスジェニック発現を有するＮＳＧマウス（ＮＳＧ－ＳＧＭ３、ＳＧＭ３）をベースとする（Ｎｉｃｏｌｉｎｉら、２００４；Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、２０１０）。ＩＬ３（例えば、ＮＣ＿０００００５．１０；染色体：ＧＲＣｈ３８：５：１３２０６０６５５－１３２０６３２０４）、ＧＭ－ＣＳＦ（例えば、ＮＣ＿０００００５．１０；染色体：ＧＲＣｈ３８：５：１３２０７３７８９－１３２０７６１７０）およびＳＣＦ（例えば、ＮＣ＿００００１２．１２；染色体：ＧＲＣｈ３８：１２：８８４９２７９３－８８５８０８５１）は、広範囲の造血細胞型の増殖を促進するサイトカインおよび増殖因子である。初期の研究は、ｈＣＤ３４^＋ＨＰＣが移植されると、ＳＧＭ３マウスは、非トランスジェニックの対応動物と比較して、ヒト免疫細胞、特にＣＤ３３^＋骨髄系細胞およびＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の発達を効率的に支援することを実証した（Ｂｉｌｌｅｒｂｅｃｋら、２０１１）。骨髄系の発達をさらに促進するために、Ｆｌｔ３変異マウス（ＮＳＧＦ）とＳＧＭ３マウスを交配してＳＧＭ３Ｆマウスを得た。

したがって、本明細書に記載されるＳＧＭ３Ｆマウスは、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子およびＩＬ３をコードする核酸、ＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸およびＳＣＦをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ヒトＩＬ３をコードする核酸、ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸およびヒトＳＣＦをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ヒトＩＬ３導入遺伝子、ヒトＣＳＦ２導入遺伝子およびヒトＫＩＴＬＧ導入遺伝子を含む。いくつかの態様において、ヒトＩＬ３、ＣＳＦ２および／またはＫＩＴＬＧ導入遺伝子などの導入遺伝子は、マウスゲノム中に組み込まれる。ヒトＩＬ３、ＣＳＦ２およびＫＩＴＬＧ導入遺伝子は、参照により本明細書に組み入れられる、（Ｎｉｃｏｌｉｎｉら、２００４）に記載されている。

ＳＧＭ３Ｆマウスは、いくつかの態様において、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｔｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）^{１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ}；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：０１３０６２）をＮＳＧＦマウスに交雑し、すべての子孫がホモ接合になるまで同系交配することによって作製される。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは、それぞれがヒトインターロイキン－３（ＩＬ－３）遺伝子、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）遺伝子またはヒトＳｔｅｅｌ因子（ＳＦ）遺伝子のうちの１つを有するように設計された３つの別個の導入遺伝子を有する。各遺伝子の発現は、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー配列によって駆動され、その後にヒト成長ホルモンカセットおよびポリアデニル化（ポリＡ）配列が続く（Ｎｉｃｏｌｉｎｉら、２００４）。受精したＣ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ／ＨｅＮ卵母細胞中に導入遺伝子を微量注入した。いくつかの態様において、３つすべての導入遺伝子（３ＧＳ）を有する得られたファウンダーは、数世代にわたってＢＡＬＢ／ｃ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに戻し交配され、その後、複数（例えば、少なくとも１１）世代にわたってＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスに戻し交配される。次いで、これらのマウスは、例えば、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：００５５５７）に交配され、次いで、すべての子孫が３ＧＳおよびＩＬ２ｒｇを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配され得る。トランスジェニックマウスは、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスを確立するために少なくとも１世代にわたってＮＳＧマウスに交配され得る。ＮＳＧＦマウスは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して作製され得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびマウスＦｌｔ３を標的とするｓｇＲＮＡは、いくつかの態様において、受精したＮＳＧ卵母細胞中に同時注入される。Ｆｌｔ３欠失を有する得られたファウンダーは、ＮＳＧマウスに交配され、次いで、すべての子孫がＦｌｔ３を標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配され得る。
ヒト免疫系モデル

本開示のマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）は、いくつかの態様において、ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣおよびヒト自然免疫系の発達を支えるために使用される。ヒト免疫系には、自然免疫系と適応免疫系が含まれる。自然免疫系は、免疫細胞を感染部位に動員すること、補体カスケードの活性化、白血球による異物の同定および身体からの異物の除去、適応免疫系の活性化、ならびに感染因子に対する物理的および化学的障壁として作用することを担う。

いくつかの態様において、本明細書に提供されるマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）は、常在マウスＨＳＣを死滅させるために致死量未満で放射線照射され（例えば、１００～３００ｃＧｙ）、次いで、放射線照射されたマウスは、ヒト自然免疫系の発達を開始させるために、ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣ（例えば、５万～２０万個のＨＳＣ）を移植される。したがって、いくつかの態様において、マウスは、ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣをさらに含む。ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣは、ヒト胎児肝臓、ヒト臍帯血、動員される末梢血および骨髄を含むがこれらに限定されない任意の供給源に由来し得る。いくつかの態様において、ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣは、ヒト臍帯血に由来する。

ヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣの多様な免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞）への分化は、連続する発達段階が複数のサイトカインによって調節される複雑な過程である。この過程は、表面抗原分類（ＣＤ）抗原などの細胞表面抗原を通じてモニターすることができる。例えば、ＣＤ４５は、ＨＳＣ、マクロファージ、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞の表面上に発現されるので、生着を示すマーカーとして使用することができる。Ｔ細胞上では、ＣＤ４５は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、細胞増殖および細胞分化を調節する。いくつかの態様において、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）はヒトＣＤ４５^＋細胞を含む。いくつかの態様において、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）はまた、肺、胸腺、脾臓、リンパ節および／または小腸中の、ただし、これらに限定されない組織へのヒトＣＤ４５^＋細胞の生着を示す。

ＣＤ４５＋細胞が成熟するにつれて、ＣＤ４５＋細胞は、様々な発達段階および分化している細胞型を示す追加のバイオマーカーを発現し始める。例えば、発達しているＴ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８も発現する。別の例として、発達している骨髄系細胞はＣＤ３３^＋を発現する。本明細書におけるマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）は、いくつかの態様において、ヒトＣＤ４５^＋細胞だけでなく、二重陽性ヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３^＋Ｔ細胞および二重陽性ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３３＋骨髄系細胞も含む。

したがって、いくつかの態様において、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）中のヒトＣＤ４５^＋細胞の集団は、ヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３^＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において、ヒトＣＤ４５^＋細胞の集団は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、増加した百分率のヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３^＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）におけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３^＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３^＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３^＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３^＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３^＋Ｔ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。

いくつかの態様において、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）中のヒトＣＤ４５^＋細胞の集団は、ヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３３^＋骨髄系細胞を含む。いくつかの態様において、ヒトＣＤ４５^＋細胞の集団は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、増加した百分率のヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３３^＋骨髄系細胞を含む。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３３^＋骨髄系細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３３^＋骨髄系細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３３^＋骨髄系細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３３^＋骨髄系細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ３３^＋骨髄系細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。

いくつかの態様において、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）中のヒトＣＤ４５^＋細胞の集団は、ヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ１９^＋Ｂ細胞を含む。いくつかの態様において、ヒトＣＤ４５^＋細胞の集団は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、減少した百分率のヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ１９^＋Ｂ細胞を含む。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ１９^＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも２５％減少する。例えば、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ１９^＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少し得る。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ１９^＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも５０％減少する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ１９^＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも１００％減少する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ４５^＋／ＣＤ１９^＋Ｂ細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％減少する。

本明細書で提供されるマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）は、驚くべきことに、樹状細胞（例えば、形質細胞様樹状細胞および骨髄樹状細胞）、ナチュラルキラー細胞および単球由来マクロファージ（単球マクロファージ）の生着も支えることができる。形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は高レベルのインターフェロンαを分泌し；骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）は、インターロイキン１２、インターロイキン６、腫瘍壊死因子およびケモカインを分泌し；ナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞などの損傷した宿主細胞を破壊し；マクロファージは、かなりの数の細菌または他の細胞または微生物を貪食する。

いくつかの態様において、本明細書に提供されるマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、増加した百分率のヒトＣＤ１４^＋単球またはマクロファージを含む。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ１４^＋単球またはマクロファージの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、マウスモデルにおけるヒトＣＤ１４^＋単球またはマクロファージの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ１４^＋単球またはマクロファージの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ１４^＋単球またはマクロファージの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、マウスモデルにおけるヒトＣＤ１４^＋単球またはマクロファージの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。

いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、増加した割合のヒトＣＤ６６ｂ^＋細胞を含む。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ６６ｂ^＋細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、ＮＳＧ（商標）ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ６６ｂ^＋細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ６６ｂ^＋細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ１１Ｃ^＋ＨＬＡ－ＤＲ^＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ６６ｂ^＋細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。

いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、増加した百分率のヒトＣＤ１１ｃ^＋骨髄樹状細胞を含む。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ１１ｃ^＋ＨＬＡ－ＤＲ^＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、ＮＳＧ（商標）ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ１１ｃ^＋ＨＬＡ－ＤＲ^＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ１１ｃ^＋ＨＬＡ－ＤＲ^＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ１１ｃ^＋ＨＬＡ－ＤＲ^＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるヒトＣＤ１１ｃ^＋ＨＬＡ－ＤＲ^＋骨髄樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。

いくつかの態様において、ＮＳＧＦマウスは、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、増加した百分率のヒトＣＤ３０３^＋形質細胞様樹状細胞を含む。いくつかの態様において、ＮＳＧＦマウスにおけるヒトＣＤ３０３^＋形質細胞様樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、ＮＳＧＦマウスにおけるヒトＣＤ３０３^＋形質細胞様樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、ＮＳＧＦマウスにおけるヒトＣＤ３０３^＋形質細胞様樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、ＮＳＧＦマウスにおけるヒトＣＤ３０３^＋形質細胞様樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、ＮＳＧＦマウスにおけるヒトＣＤ３０３^＋形質細胞様樹状細胞の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。

いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、ＣＣＲ７^－エフェクターＴ細胞のヒト割合の増加した百分率を含む。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるＣＣＲ７^－エフェクターＴ細胞のヒト割合の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、ＮＳＧ（商標）ＳＧＭ３ＦマウスにおけるＣＣＲ７^－エフェクターＴ細胞のヒト割合の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるＣＣＲ７^－エフェクターＴ細胞のヒト割合の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるＣＣＲ７^－エフェクターＴ細胞のヒト割合の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３ＦマウスにおけるＣＣＲ７^－エフェクターＴ細胞のヒト割合の百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。

いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、増加した百分率の総ヒトＩｇＧを含む。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスにおける総ヒトＩｇＧの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも２５％増加する。例えば、ＮＳＧ（商標）ＳＧＭ３Ｆマウスにおける総ヒトＩｇＧの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加し得る。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスにおける総ヒトＩｇＧの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも５０％増加する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスにおける総ヒトＩｇＧの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して少なくとも１００％増加する。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスにおける総ヒトＩｇＧの百分率は、ＮＳＧ（商標）対照マウスおよび／またはＮＳＧＦ対照マウスと比較して、２５％～１００％、２５％～７５％、２５％～５０％、５０％～１００％、５０％～７５％または７５％～１００％増加する。

いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ＳＧＭ３対照マウスと比較してヒト免疫系の大幅な機能的改善を含む。例えば、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ＳＧＭ３対照マウスと比較して、ミョウバンをアジュバントとして加えたＴｄａｐ／ＫＬＨワクチンＩＰ／ＳＣのワクチン接種後に、ＫＬＨに対する特異的ＩｇＧの増加を含み得る。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ＳＧＭ３対照マウスと比較して、Ｆｌｕｚｏｎｅ ＩＶ／ＩＰのワクチン接種後に、Ｆｌｕｚｏｎｅに対する特異的ＩｇＧの増加を含む。いくつかの態様において、ＳＧＭ３Ｆマウスは、ＳＧＭ３対照マウスと比較して、赤血球凝集抑制アッセイによって測定した場合に、Ｈ１Ｎ１ＦｌｕＡ／Ｃａｌ９ウイルスに対する中和抗体を含むが、インフルエンザＢウイルスに対する中和抗体は含まない。

いくつかの態様において、本開示のＮＳＧＦマウスは、ヒト造血細胞の生着およびヒト骨髄造血を支えるために使用される。

いくつかの態様において、本開示のＮＳＧＦ６マウスは、ヒト造血細胞の生着、ヒト骨髄造血およびヒトリンパ球新生を支えるために使用される。

いくつかの態様において、本開示のＮＳＧＦＴマウスは、ヒト造血細胞の生着、ヒト骨髄造血およびヒトリンパ球新生を支えるために使用される。

いくつかの態様において、本開示のＮＳＧＦＬマウスは、いくつかの態様において、ヒトリンパ組織の発達、特に適応免疫応答および胚中心形成を支えるために使用される。

本開示のＳＧＭ３Ｆマウスは、いくつかの態様において、骨髄系統および制御性Ｔ細胞集団の生着を支えるために使用される。
トランスジェニック動物を作製する方法

いくつかの局面において、ヒトＩＬ６、ヒトＴＳＬＰ、ヒトＬＴＢＲ、ヒトＩＬ３、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ヒトＳＣＦまたはこれらの任意の組み合わせを発現するトランスジェニック動物を作製する方法が本明細書で提供される。トランスジェニック動物は、本明細書では、外来（外因性）核酸（例えば、導入遺伝子）がそのゲノムに挿入されている（組み込まれている）動物を指す。いくつかの態様において、トランスジェニック動物は、マウスまたはラットなどのトランスジェニック齧歯動物である。いくつかの態様において、トランスジェニック動物はマウスである。トランスジェニック動物の作製のために使用される３つの従来の方法には、ＤＮＡ微量注入（Ｇｏｒｄｏｎ＆Ｒｕｄｄｌｅ，１９８１）、参照により本明細書に組み入れられる）、胚性幹細胞媒介遺伝子導入（Ｇｏｓｓｌｅｒ，Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｋｏｒｎ，Ｓｅｒｆｌｉｎｇ，＆Ｋｅｍｌｅｒ，１９８６）、参照により本明細書に組み入れられる）、およびレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，１９７６）、参照により本明細書に組み入れられる）が含まれ、これらのいずれもが本明細書に提供されているように使用され得る。電気穿孔も、トランスジェニックマウス（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１６／０５４０３２号および国際公開第２０１７／１２４０８６号を参照されたい。）を作製するために使用され得る。

ヒトＩＬ６、ヒトＴＳＬＰ、ヒトＬＴＢＲ、ヒトＩＬ３、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ヒトＳＣＦまたはこれらの任意の組み合わせをコードする核酸は、いくつかの態様においては、導入遺伝子、例えば、ヒトＩＬ６、ヒトＴＳＬＰ、ヒトＬＴＢＲ、ヒトＩＬ３、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ヒトＳＣＦまたはこれらの任意の組み合わせをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーター（例えば、構成的に活性なプロモーター）を含む導入遺伝子を含む。いくつかの態様において、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製するために使用されるヒトＩＬ６、ヒトＴＳＬＰ、ヒトＬＴＢＲ、ヒトＩＬ３、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ヒトＳＣＦまたはこれらの任意の組み合わせをコードする核酸は、例えば、核酸が動物ゲノム中にランダムに組み込まれる受精胚の前核／核に送達されるプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）などのベクター上に存在する。いくつかの態様において、受精胚は、単一細胞胚（例えば、接合子）である。いくつかの態様において、受精胚は、多細胞胚（例えば、胚盤胞などの、接合子に続く発達段階）である。いくつかの態様において、本開示のマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）を作製するために、（例えば、ＢＡＣ上に担持される）核酸がＮＳＧ（商標）マウスの受精胚に送達される。受精胚の注入後に、受精胚は、偽妊娠雌に導入され得、その後、偽妊娠雌はヒトＩＬ６、ヒトＴＳＬＰ、ヒトＬＴＢＲ、ヒトＩＬ３、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ヒトＳＣＦまたはこれらの任意の組み合わせをコードする核酸を含む子孫を出産する。ヒトＩＬ６、ヒトＴＳＬＰ、ヒトＬＴＢＲ、ヒトＩＬ３、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ヒトＳＣＦまたはこれらの任意の組み合わせをコードする核酸の存在または非存在は、例えば、任意の数の遺伝子型判定法（例えば、配列決定および／またはゲノムＰＣＲ）を用いて確認され得る。

いくつかの態様において、本明細書で提供されるマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬ、マウスモデルまたはこれらの任意の組み合わせ）の内因性マウスＩｌ６、マウスＴｓｌｐまたはマウスＬｔｂｒをコードする特定の標的部位において欠失を生じさせるために、ＣＲＩＳＰＲ系が使用される。ヒトＩＬ６、ヒトＴＳＬＰまたはヒトＬＴＢＲをコードするドナーＤＮＡを同時注入することによって、相同配列依存的修復によって遺伝子編集が正確に達成される（例えば、参照により本明細書に組み入れられる（Ｙａｎｇら、２０１３）を参照されたい。）。例えば、Ｉｌ６遺伝子中に正確なゲノム編集を生成するために、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはタンパク質、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ならびに５’および３’マウスＩｌ６相同配列によって隣接されたヒトＩＬ６遺伝子を包含するドナープラスミドテンプレートをマウス胚中に直接注入することができる。これらの胚から発生するマウスは、所望の導入遺伝子を保有しているかどうかを決定するために、遺伝子型決定または配列決定することができ、所望の導入遺伝子を保有しているマウスは、生殖細胞系列伝達を確認するために交配され得る。

内因性Ｆｌｔ３対立遺伝子を不活性化する方法も本明細書で提供される。いくつかの態様において、内因性Ｆｌｔ３対立遺伝子は、トランスジェニック動物において不活性化されている。いくつかの態様において、遺伝子／ゲノム編集方法が、遺伝子（対立遺伝子）不活性化のために使用される。本明細書で記載されるように使用され得る操作されたヌクレアーゼベースの遺伝子編集系には、例えば、クラスター化して規則的に配置された短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれる。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｃａｒｒｏｌｌ，２０１１；Ｇａｊ，Ｇｅｒｓｂａｃｈ，＆Ｂａｒｂａｓ，２０１３；Ｊｏｕｎｇ＆Ｓａｎｄｅｒ，２０１３）を参照されたい。

いくつかの態様において、本明細書に提供されるマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）の内因性Ｆｌｔ３対立遺伝子を不活性化するために、ＣＲＩＳＰＲ系が使用される。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｈａｒｍｓら、２０１４；Ｉｎｕｉら、２０１４）を参照されたい）。例えば、Ｆｌｔ３遺伝子中への正確なゲノム編集を生成するために、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはタンパク質および１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をマウス胚中に直接注入することができる。これらの胚から発生するマウスは、所望の変異を保有しているかどうかを決定するために、遺伝子型決定または配列決定することができ、所望の変異を保有しているマウスは、生殖細胞系列伝達を確認するために交配され得る。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子編集のためのＲＮＡによってガイドされるＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されてきた原核生物における天然に存在する防御機構である。操作されたＣＲＩＳＰＲ系は、２つの主要成分：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）を含有する。ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ結合のための足場配列と、修飾されるべきゲノム標的を規定するユーザによって定義されるヌクレオチドスペーサー（例えば、約１５～２５ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド）とで構成される短い合成ＲＮＡである。したがって、ｇＲＮＡ中に存在する標的配列を単に変更することによって、Ｃａｓタンパク質のゲノム標的を変更することができる。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３から選択される。いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９である。

ガイドＲＮＡは、標的核酸配列にハイブリダイズする（結合する）スペーサー配列と、エンドヌクレアーゼを結合し、エンドヌクレアーゼを標的核酸配列にガイドするＣＲＩＳＰＲリピート配列とを少なくとも含む。当業者に理解されるように、各ｇＲＮＡは、そのゲノム標的配列（例えば、Ｆｌｔ３対立遺伝子の領域）に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａら、２０１１；Ｊｉｎｅｋら、２０１２）を参照されたい。いくつかの態様においては、本明細書に提供される方法で使用されるｇＲＮＡは、マウスＦｌｔ３対立遺伝子の領域（例えば、エクソン３）に結合する。いくつかの態様において、マウスＦｌｔ３対立遺伝子の領域に結合するｇＲＮＡは、５’－ＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡ－３’（配列番号５）のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本明細書中に提供される方法において使用されるｇＲＮＡは、マウスＩｌ６対立遺伝子の領域（例えば、エクソン１およびエクソン５）に結合する。いくつかの態様において、マウスＩｌ６対立遺伝子の領域に結合するｇＲＮＡは、５’－ＡＧＧＡＡＣＴＴＣＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＣ－３’（配列番号６）および５’－ＡＴＧＣＴＴＡＧＧＣＡＴＡＡＣＧＣＡＣＴ－３’（配列番号７）のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本明細書中に提供される方法において使用されるｇＲＮＡは、マウスＴｓｌｐ対立遺伝子の領域（例えば、エクソン１およびエクソン５）に結合する。いくつかの態様において、マウスＴｓｌｐ対立遺伝子の領域に結合するｇＲＮＡは、５’－ＣＣＡＣＧＴＴＣＡＧＧＣＧＡＣＡＧＣＡＴ－３’（配列番号８）および５’－ＴＴＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＧＡ－３’（配列番号９）のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本明細書中に提供される方法において使用されるｇＲＮＡは、マウスＬｔｂｒ対立遺伝子の領域（例えば、エクソン１およびエクソン２）に結合する。いくつかの態様において、マウスＬｔｂｒ対立遺伝子の領域に結合するｇＲＮＡは、５’－ＧＣＴＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＣＧＧＧ－３’（配列番号１０）および５’－ＧＡＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号１１）のヌクレオチド配列を含む。
使用の方法

本明細書で提供されるマウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）は、任意の数の用途に使用され得る。例えば、特定の作用物質（例えば、治療剤）または医学的処置（例えば、組織移植）がどのようにヒト自然免疫系（例えば、ヒト自然免疫細胞応答）およびヒト適応免疫系（例えば、抗体応答）に影響を及ぼすかを試験するために、マウスモデルが使用され得る。

いくつかの態様においては、ヒト自然免疫系の発達に対する作用物質の効果を評価するために、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）が使用される。したがって、本明細書では、マウスモデルに作用物質を投与すること、およびマウスにおけるヒト自然免疫系の発達に対する作用物質の効果を評価することを含む方法が提供される。作用物質の効果は、例えば、ヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）およびヒト適応免疫応答（例えば、抗体産生）を測定することによって評価され得る。作用物質の非限定的な例としては、抗癌剤および抗炎症剤などの治療剤、ならびに免疫原性組成物（例えば、ワクチン）などの予防剤が挙げられる。

他の態様において、ヒト腫瘍に対する免疫療法応答を評価するために、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）が使用される。したがって、本明細書では、ヒト腫瘍を有するマウスモデルに作用物質を投与することと、マウスにおけるヒト自然免疫系に対するおよび／または腫瘍に対する作用物質の効果を評価することとを含む方法が提供される。作用物質の効果は、ヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答、ヒト適応免疫応答（例えば、抗体産生）および／または腫瘍細胞応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）を測定することによって評価され得る。いくつかの態様において、作用物質は抗癌剤である。

さらに他の態様において、感染性微生物に対するヒト免疫応答を評価するために、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）が使用される。したがって、本明細書では、マウスモデルを感染性微生物（例えば、細菌および／またはウイルス）に曝露すること、およびヒト免疫応答に対する感染性微生物の影響を評価することを含む方法が提供される。感染性微生物の影響は、ヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）およびヒト適応免疫応答（例えば、抗体産生）を測定することによって評価され得る。これらの方法は、マウスに薬物または抗微生物剤（例えば、抗菌剤または抗ウイルス剤）を投与すること、および感染性微生物に対する薬物または抗微生物剤の効果を評価することをさらに含み得る。

さらなる態様において、組織移植に対するヒト免疫応答を評価するために、マウスモデル（例えば、ＮＳＧＦ、ＮＳＧＦ６、ＮＳＧＦＴ、ＮＳＧＦＬもしくはＳＧＭ３Ｆマウスモデル、またはこれらの任意の組み合わせ）が使用される。したがって、組織（例えば、同種異系組織）をマウスモデルに移植すること、およびヒト自然免疫応答に対する移植された組織の影響を評価することを含む方法が本明細書で提供される。移植された組織の影響は、移植された組織に対するヒト自然免疫細胞（例えば、Ｔ細胞および／または樹状細胞）応答（例えば、細胞死、細胞シグナル伝達、細胞増殖など）およびヒト適応免疫応答（例えば、抗体産生）を測定することによって評価され得る。

実施例
マウスＦｌｔ３ＫＯは、ヒトＤＣのためのスペースを作り出し、受容体リガンドＦｌｔ３Ｌをヒト細胞に利用可能とすることによって、ヒトＣＤ３４^＋ＨＰＣの移植時のヒト骨髄系細胞の発達を改善する。ＳＧＭ３マウスと本明細書で作製されたＮＳＧＦマウスを対照比較することによって、いくつかの類似性が明らかになったが、２つの系統間の実質的な差異も明らかになった。例えば、（１）ＮＳＧＦマウスは、臍帯血および成人骨髄ＨＰＣの移植時にヒト造血を支える；（２）ＮＳＧＦマウスはヒトＤＣサブセットの分化を支える；（３）ｈＳＧＭ３マウスはヒト抗体価を生成することができる。これらの結果は、本発明者らが２つの系統を交雑させて新規な系統ＳＧＭ３Ｆを作製する動機となった。本発明者らの研究は、ワクチン接種時に、ｈＳＧＭ３Ｆマウスが、ヒト骨髄系細胞に起因し得る結果である抗体応答の生成を支えることを示しているので、したがって、ｈＳＧＭ３Ｆマウスは、改善されたモデルへの一歩となる。これに沿って、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して複数の改善された免疫不全マウスを作製した。各系統のマウスを交雑することによって、本発明者らは、ヒト免疫細胞の様々なサブセットを発達させる能力を有するマウスモデルを得るために、およびヒトＨＰＣでの再構成時に特異的免疫応答を開始するために、ヒト導入遺伝子の様々な特徴を組み合わせることを目的とする。
実施例１．ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}（ＮＳＧＦ）マウスモデル

Ｆｌｔ３は、樹状細胞および単球系統の発達に重要な受容体である。Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｌｔ３シグナル伝達は、様々なＤＣおよび単球系統の発達にとって重要であり（Ｄｉｎｇら、２０１４；Ｇｉｎｈｏｕｘら、２００９；ＭｃＫｅｎｎａら、２０００；Ｗａｓｋｏｗら、２００８）、その役割は、マウスおよびヒトにおけるインビボでのＦｌｔ３Ｌの投与後の循環通常型（ｃ）ＤＣおよび形質細胞様（ｐ）ＤＣの増加によってさらに裏付けられる（Ｋａｒｓｕｎｋｙら、２００３；Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら、１９９６；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、２０００）。マウスＦｌｔ３をノックアウトすることは、１．マウスＤＣおよび他の骨髄系細胞の減少；および２．ヒト細胞への（ヒト受容体を介して作用することができる）マウスＦｌｔ３Ｌの利用可能性の増大をもたらすことができ、それにより、ヒトＣＤ３４＋ＨＰＣの移植に際するヒト骨髄系細胞の長期発達を改善する。したがって、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＮＳＧ背景でＦｌｔ３ＫＯマウスを作製した。エクソン３に染色体欠失を有するファウンダーマウスをＮＳＧに対して戻し交配し、近親交配させてホモ接合性Ｆｌｔ３^－／－対立遺伝子を得て（図１Ａ）、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}マウス（ＮＳＧＦ）を得た。Ｆｌｔ３遺伝子型は、３６３ｂｐ産物を有するＰＣＲおよびサンガー配列によって確認された（図１Ｂ）。一貫して、本発明者らは、骨髄細胞におけるマウスＦｌｔ３発現の減少（図１Ｃ～１Ｄ）および血漿中のマウスＦｌｔ３Ｌの量の増加（図１Ｅ）を観察した。マウスＤＣ発達に対するＦｌｔ３ＫＯの影響を確認するために、本発明者らは、ＰＤＣＡ－１^＋ｐＤＣ、ＣＤ１１ｃ^＋ｃＤＣを含むマウスＤＣの異なるサブセットを分析した。マウスｃＤＣを、骨髄および脾臓におけるＣＤ１１ｂ^＋またはＣＤ８^＋サブセットと、肺におけるＣＤ１０３^＋サブセットとにさらに分けた。（図２Ａ）。この目的のために、本発明者らは、ＦＡＣＳによって、年齢および性別が一致するＮＳＧマウスと比較して、ＮＳＧＦマウスの骨髄、脾臓および肺におけるＤＣサブセットの８０～９０％の減少を観察した（図２Ａ～２Ｂ）。これは、免疫蛍光染色による脾臓におけるマウスＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ－Ａ^ｇ７）＋細胞の欠乏によってさらに確認された（図２Ｃ）。全体として、本発明者らのデータは、ＮＳＧＦマウスにおけるマウスＦｌｔ３の機能的欠失を確認した。

１つの疑問は、マウスＤＣの欠失がヒト生着を改善し、ヒトＤＣのための「スペース」を生成するかどうかであった。この目的のために、致死量未満で放射線照射されたＮＳＧＦマウスに、１×１０^５個の胎児肝臓ＣＤ３４^＋ＨＰＣを移植し、移植後の異なる時点において、ヒト細胞の生着を血液中で測定した（図３Ａ）。図３Ｂに示されるように、ヒト化（ｈ）ＮＳＧＦマウスは、ＦＡＣＳによって、移植後に、ＣＤ１４^＋単球、ＣＤ１９^＋Ｂ細胞、ＣＤ３^＋Ｔ細胞を含むヒト細胞の異なる系列とともに、血液中でヒトＣＤ４５^＋免疫細胞のより高い再構成を可能にした（図３Ｃ）。さらに、本発明者らは、マウスＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ－Ａ^ｇ７）^＋細胞の欠如、および脾臓におけるＨＬＡ－ＤＲ^＋細胞の発達、およびＤＣの形態を有する小腸の粘膜固有層中のＨＬＡ－ＤＲ^＋細胞の存在によって、ヒトＤＣを有する粘膜組織の定着も観察した（図３Ｄ）。非胎児ＨＰＣの生着を支える能力を試験するために、本発明者らは、新生児マウスまたは４週齢マウスに致死量未満で放射線照射し、臍帯血または成人骨髄からの１×１０^５個のＣＤ３４＋ＨＰＣを移植した（図３Ｅ～３Ｆ）。ｈＮＳＧＦマウスは、血中におけるＣＤ３３＋骨髄系細胞およびＣＤ３^＋Ｔ細胞の両方のわずかな増大を伴った、移植後１２週でのｈＣＤ４５^＋生着の増強を実証する（図３Ｅ）。さらに、成人骨髄ＨＰＣを限定した数（１×１０^５）で移植されたｈＮＳＧＦマウスは、血中におけるｈＣＤ４５^＋生着の有意な改善を示した（図３Ｆ）。改善は、血液中のｈＣＤ４５^＋細胞の百分率および絶対細胞数に反映された（図３Ｆ）。したがって、マウスＦｌｔ３ノックアウトは、マウスＤＣの減少およびヒト細胞へのマウスＦｌｔ３リガンドの利用可能性の増大をもたらし、それにより、ヒトＣＤ３４^＋造血前駆細胞の移植に際するヒト骨髄系細胞の長期発達を改善した。

マウスモデルの作製：Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：００５５５７）の受精卵中のマウスＦｌｔ３のエクソン３を標的とするｓｇＲＮＡ（５’－ＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡ－３’、配列番号５）を使用するＣＲＩＳＰＲによって、マウスＦｌｔ３ノックアウトマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}）を作製した。注入された胚に由来する胚盤胞を代理母に移植し、新生仔を得た。ヌル欠失を有するマウスをＮＳＧに戻し交配した。Ｆ０およびＦ１同腹仔の尾部の先端を切除し、ＰＣＲおよびサンガー配列決定によって遺伝子ノックアウトの成功について試験した。変異対立遺伝子からマウスＦｌｔ３野生型（ＷＴ）対立遺伝子を検出するために、ＰＣＲ反応において、フォワードプライマー（５’－ＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＣ－３’、配列番号１２）およびリバースプライマー（５’－ＡＴＣＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ－３’、配列番号１３）を使用した（表２）。ＷＴ対立遺伝子は７９９ｂｐ長のＤＮＡ断片を生じるのに対して、変異した対立遺伝子は３６３ｂｐ長のＤＮＡ断片を生じる。
実施例２．ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｉｌ６^{ｅｍ１（ＩＬ６）Ａｋｐ}（ＮＳＧＦ６）マウスモデル

ＩＬ６は、ＨＰＣ維持（Ｅｎｃａｂｏ，Ｍａｔｅｕ，Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ－Ｕｂｅｒｏｓ，＆Ｍｉｎａｎａ，２００３）および活性化されたＢ細胞の抗体産生形質細胞への分化（Ｊｅｇｏら、２００３；Ｎｕｒｉｅｖａら、２００９）に不可欠である。現行のＮＳＧをベースとするヒト化マウスを改良するために、本発明者らは、ＮＳＧＦマウス中のマウスオルソログを置き換えるヒトＩＬ６ノックインを作製した。この目的のために、本発明者らは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、マウスＩｌ６遺伝子中の開始コドンおよび終止コドンに隣接するｓｇＲＮＡ、ならびに５’および３’マウスＩｌ６相同配列によって隣接される４，３０８ｂｐのヒトＩＬ６遺伝子（開始コドンから停止コドンまで、すべてのエクソン／イントロン配列を保持）を包含するドナープラスミドテンプレートを使用して、接合子においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子ターゲティングを使用した。最初に、ヒトＩＬ６のイントロン３および５領域に対して特異的に設計されたＰＣＲアッセイを用いて、潜在的なファウンダーマウスを選択した。ヒトＩＬ６がマウスＩｌ６遺伝子座に正しく標的化されたかどうかを決定するために、本発明者らは、５’および３’接合部（一方のプライマーは、マウスゲノム中に、ただし、ドナープラスミド相同アームの外に固定され、他方のプライマーは、ヒトＩＬ６遺伝子内に固定される）ならびに２つの相同アーム間の全長配列（ＫＩでは８．４ｋｂ、野生型マウスでは１０．５ｋｂと予想される）を標的とする長距離ＰＣＲアッセイを開発した（図４Ａ）。これらのＰＣＲ産物の配列決定により、ヒトＩＬ６の適切な標的化が確認された。さらに、本発明者らは、ランダムまたはマルチコピーターゲティング事象から正しいオンターゲットな単一コピー組み込み事象を識別するためにプラスミドドナー配列の非存在も確認した（図４Ａ）。ヒトＩＬ６ＫＩのオンターゲット単一コピー組み込み事象を有する５匹のファウンダーマウスを同定した（図４Ａ）。ヒトＩＬ６ノックイン（配列番号２）を有するファウンダーマウスを交雑させてホモ接合動物を作製し、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｉｌ６^{ｅｍ１（ＩＬ６）Ａｋｐ}マウス（ＮＳＧＦ６）を得た。ヒトＩＬ６が忠実に発現されるかどうかを決定するために、本発明者らは、２０μｇのＬＰＳ ＩＰを２時間与えられた後のマウスでＥＬＩＳＡによって血清中のヒトＩＬ６産生を測定した。本発明者らは、ＩＬ６^ｍ／ｈおよびＩＬ６^ｈ／ｈ遺伝子型を有するマウスの血清中に高レベルのヒトＩＬ６を見出したが、ＩＬ６^ｍ／ｍ遺伝子型には見出さなかった（図４Ｂ）。１つの疑問は、ヒトＩＬ６ノックインが、異なるタイプのＨＰＣの移植後にヒト生着を改善し得るかどうかであった。評価するために、ＮＳＧマウスおよびＮＳＧＦ６マウスの両方に、滴定量の臍帯血ＨＰＣを移植した。より多数のＨＰＣを移植されたマウスの両系統で同等の生着が見出されたが、少数のＨＰＣを移植された場合、ｈＮＳＧＦ６マウスは、より多くの生着を生じた（図４Ｃ）。これと一致して、成人骨髄ＨＰＣを限定した数（１×１０^５）で移植されたｈＮＳＧＦ６マウスは、血中におけるｈＣＤ４５＋生着の有意な改善を示した（図４Ｄ）。次に、ｈＮＳＧＦ６マウスにおける造血の発達を測定した。著しくより多数の総単球が脾臓および肺に見られた（図４Ｅ～４Ｆ）。さらに、より多数のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋中間的およびＣＤ１４ｌｏｗＣＤ１６＋非古典的単球の両方が脾臓および肺中に見出され（図４Ｇ）、ヒトＩＬ－６がＣＤ１６＋単球の発達のために重要であることが示唆された。さらに、ヒトＩＬ６ノックインが、ヒト化マウスにおける濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞の分化および抗体産生を改善するかどうかを評価した。この目的のために、脾臓中のＣＸＣＲ５＋ＰＤ１＋ＣＤ４＋Ｔｆｈ細胞をＦＡＣＳによって測定した（図４Ｈ）。図４Ｉに示されるように、ＣＸＣＲ５＋ＰＤ１＋ＣＤ４＋Ｔｆｈ細胞の有意な増加がｈＮＳＧＦ６マウスの脾臓において見出された。Ｔｆｈの増加と合致して、血漿中の有意により多量の総ヒトＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡが見出された（図４Ｊ）。要約すると、データは、ヒトＩＬ６ノックインを有するヒト化マウスが、ヒトＨＰＣの移植時に機能的なヒト生着を改善することを実証している。

マウスモデルの作製：ヒトＩＬ６ノックインマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｉｌ６^{ｅｍ１（ＩＬ６）Ａｋｐ}）を、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して作製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、マウスＩｌ６を標的とするｓｇＲＮＡ（５’－ＡＧＧＡＡＣＴＴＣＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＣ－３’、配列番号６および５’－ＡＴＧＣＴＴＡＧＧＣＡＴＡＡＣＧＣＡＣＴ－３’、配列番号７）および組換えヒトＩＬ６ＤＮＡを、受精したＮＳＧＦ卵母細胞（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}）中に同時注入した。相同組換えを介して、エクソン１およびエクソン５中にヒトＩＬ６を挿入した。ヒトＩＬ６を保有する得られたファウンダーを２世代にわたってＮＳＧＦマウスに交配し、その後、すべての子孫がＩｌ６を標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配した。ＰＣＲ反応による遺伝子型のために使用されるプライマーを表２に列記した。
実施例３．ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}（ＮＳＧＦＴ）マウスモデル

胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）は、種特異的なサイトカインであり、種特異的な機能を示す（Ｈａｎａｂｕｃｈｉ，Ｗａｔａｎａｂｅ，＆Ｌｉｕ，２０１２）。ヒトＴＳＬＰは、ナイーブＴ細胞の増殖を誘導し、Ｔｈ２分化、Ｔｒｅｇ発達を推進する（Ｈａｎａｂｕｃｈｉら、２０１０；Ｉｔｏら、２００５；Ｌｕら、２００９）。ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対して直接作用するＩＬ－７とは対照的に、ＴＳＬＰは、ヒトＤＣを介して間接的にＴ細胞恒常性を媒介する（Ｌｕら、２００９）。Ｔ細胞の発達および分化を改善するために、本発明者らは、ヒトＴＳＬＰノックインを作製して、ＮＳＧＦマウス中のマウスＴｓｌｐを置き換えた。ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、マウスＴｓｌｐ遺伝子中の開始コドンおよび終止コドンに隣接するｓｇＲＮＡ、ならびに５’および３’マウスＴｓｌｐ相同配列によって隣接されるヒトＴＳＬＰ遺伝子（開始コドンから停止コドンまで、すべてのエクソン／イントロン配列を保持）を包含するドナープラスミドテンプレートを受精したＮＳＧＦ卵母細胞に注入した。相同組換えを介して、エクソン１およびエクソン５中にヒトＴＳＬＰを挿入した。ヒトＴＳＬＰがマウスＴｓｌｐ遺伝子座に正しく標的化されたかどうかを決定するために、本発明者らは、５’および３’接合部（一方のプライマーは、マウスゲノム中に、ただし、ドナープラスミド相同アームの外に固定され、他方のプライマーは、ヒトＴＳＬＰ遺伝子内に固定される）を標的とする長距離ＰＣＲアッセイを開発した。これらのＰＣＲ産物の配列決定により、ヒトＴＳＬＰの適切な標的化が確認された。ヒトＴＳＬＰ ＫＩ（配列番号３）を有する２匹ファウンダーマウスを同定した（図５Ａ）。ヒトＴＳＬＰを保有する得られたファウンダーをＮＳＧＦマウスに交配し、次いで、すべての子孫がＴＳＬＰを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配して、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}（ＮＳＧＦＴ）を得た。ヒトＴＳＬＰが機能的であるかどうかを決定するために、本発明者らは、５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡおよび１μｇ／ｍＬのイオノマイシンで１８時間刺激された肺の上清中で、ヒトＴＳＬＰ産生をエクスビボで測定した。本発明者らは、ホモ接合のヒトＴＳＬＰ対立遺伝子を有するマウスの肺による様々なレベルのヒトＴＳＬＰ産生を見出したが、野生型対立遺伝子を有するマウスでは見出さなかった（図５Ｂ）。ヒト化に対するＴＳＬＰ ＫＩの効果を試験するために、致死量未満で放射線照射された新生ＮＳＧＦＴマウスに１×１０^５個の臍帯血ＣＤ３４^＋ＨＰＣを移植し、ヒト細胞の生着を移植後１２週に血液中で測定した。図５Ｃに示されるように、ヒト化（ｈ）ＮＳＧＦＴマウスは、血液中のヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞のより高い再構成を可能にしたが、全体的なｈＣＤ４５^＋生着に差は見られなかった。

マウスモデルの作製：ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して、ヒトＴＳＬＰノックインマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}）を作製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、マウスＴｓｌｐを標的とするｓｇＲＮＡ（５’－ＣＣＡＣＧＴＴＣＡＧＧＣＧＡＣＡＧＣＡＴ－３’、配列番号８および５’－ＴＴＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＧＡ－３’、配列番号９）および組換えヒトＴＳＬＰ ＤＮＡを、受精したＮＳＧＦ卵母細胞（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}）中に同時注入した。相同組換えを介して、エクソン１およびエクソン５中にヒトＴＳＬＰを挿入した。ヒトＴＳＬＰを保有する得られたファウンダーは、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}マウスに交配され、その後、すべての子孫がＴＳＬＰを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配された。ＰＣＲ反応による遺伝子型のために使用されるプライマーを表２に列記した。
実施例４．ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}－Ｌｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}（ＮＳＧＦＬ）マウスモデル

濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）は、リンパ濾胞およびＢ細胞応答の発達に不可欠である（Ｆｕｔｔｅｒｅｒら、１９９８）。Ｒａｇ２^－／－－γｃ^－／－マウスの血管周囲領域中のＰＤＧＦＲｂ^＋Ｍｆｇｅ８^＋ＦＤＣ前駆体は、リンパ球再構成を介してリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）の活性化時に成熟ＦＤＣに分化し得る（Ｋｒａｕｔｌｅｒら、２０１２）。したがって、本発明者らは、ＮＳＧＦマウス中のマウスＬｔｂｒを置き換えるために、ヒトＬＴＢＲノックインを作製した。この目的のために、本発明者らは、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、マウスＬｔｂｒ遺伝子のエクソン１および２に隣接するｓｇＲＮＡ、ならびに５’および３’マウスＬｔｂｒ相同配列によって隣接される合成ヒトＬＴＢＲミニ遺伝子（すべてのエクソンおよびイントロン１配列、その後にｂＧＨｐＡ ＳＴＯＰカセットを有するＮＭ＿００２３４２をコードする）を包含するドナープラスミドテンプレートを使用して、接合子においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子ターゲティングを使用した（図６Ａ）。相同組換えを介して、エクソン１およびエクソン２中にヒトＬＴＢＲを挿入した。ヒトＬＴＢＲがマウスＬｔｂｒ遺伝子座に正しく標的化されたかどうかを決定するために、本発明者らは、５’および３’接合部（一方のプライマーは、マウスゲノム中に、ただし、ドナープラスミド相同アームの外に固定され、他方のプライマーは、ヒトＬＴＢＲ遺伝子内に固定される）ならびに２つの相同アーム間の全長配列を標的とする長距離ＰＣＲアッセイを開発した。これらのＰＣＲ産物の配列決定により、ヒトＬＴＢＲの適切な標的化が確認された。ヒトＬＴＢＲ ＫＩ（配列番号４）のオンターゲット組込み事象を有する２匹のファウンダーマウスを同定した。ヒトＬＴＢＲノックインを有するファウンダーマウスを交雑してホモ接合動物を作製し、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}－Ｌｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}（ＮＳＧＦＬ）を得た。ヒトＬＴＢＲが発現されているかどうかを決定するために、本発明者らは、骨髄細胞におけるＬＴＢＲの表面発現を測定し、ＬＴＢＲ^ｍ／ｈおよびＬＴＢＲ^ｈ／ｈを有するマウスでヒトＬＴＢＲの発現を観察したが、ＬＴＢＲ^ｍ／ｍを有するマウスでは観察しなかった（図６Ｂ）。ヒト化に対するＬＴＢＲ ＫＩの効果を試験するために、致死量未満で放射線照射された新生ＮＳＧＦＬマウスに１×１０^５個の臍帯血ＣＤ３４^＋ＨＰＣを移植し、ヒト細胞の生着を移植後１２週に血液中で測定した。図６Ｃに示されるように、ヒト化ＮＳＧＦＬマウスは、異なる免疫サブセットの分化を伴った、移植後１２週での血液におけるヒトＣＤ４５^＋免疫細胞の再構成を可能にした。

マウスモデルの作製：ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して、ヒトＬＴＢＲノックインマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}－Ｌｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}）を作製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、マウスＬｔｂｒを標的とするｓｇＲＮＡ（５’－ＧＣＴＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＣＧＧＧ－３’、配列番号１０および５’－ＧＡＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧ－３’、配列番号１１）ならびに５’および３’マウスＬｔｂｒ相同配列がによって隣接された合成ヒトＬＴＢＲミニ遺伝子（すべてのエクソンおよびイントロン１配列、その後にｂＧＨｐＡ ＳＴＯＰカセットを有するＮＭ＿００２３４２をコードする）を、受精したＮＳＧＦ卵母細胞（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}）中に同時注入した。相同組換えを介して、エクソン１およびエクソン２中にヒトＬＴＢＲを挿入した。ヒトＬＴＢＲを保有する得られたファウンダーは、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}マウスに交配され、その後、すべての子孫がＬＴＢＲを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配された。ＰＣＲ反応による遺伝子型のために使用されるプライマーを表２に列記した。
実施例５．ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）^{１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ}（ＮＳＧ－ＳＧＭ３－Ｆｌｔ３ＫＯ、ＳＧＭ３Ｆ）マウスモデル

マウスおよびヒトのサイトカインおよびサイトカイン受容体の間での限られた生物学的交差反応性は、ヒト自然免疫系、特に単球、マクロファージおよび好中球の発達を抑制する。トランスジェニックまたはノックインヒト遺伝子のいずれかを介してヒトサイトカインを発現させるための努力がなされてきた（Ｒａｔｈｉｎａｍら、２０１１；Ｒｏｎｇｖａｕｘら、２０１４；Ｗｉｌｌｉｎｇｅｒら、２０１１）。免疫不全マウスの１つのこのような変異型は、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン（ＩＬ）－３のトランスジェニック発現を有するＮＳＧマウス（ＮＳＧ－ＳＧＭ３、ＳＧＭ３）をベースとする（Ｎｉｃｏｌｉｎｉら、２００４；Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、２０１０）。初期の研究は、ｈＣＤ３４^＋ＨＰＣが移植されると、これらのマウスは、非トランスジェニックの対応動物と比較して、ヒト免疫細胞、特にＣＤ３３^＋骨髄系細胞およびＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞の発達を効率的に支援することを実証した（Ｂｉｌｌｅｒｂｅｃｋら、２０１１）。骨髄系の発達をさらに促進するために、本発明者らは、Ｆｌｔ３変異マウス（ＮＳＧＦ）とＳＧＭ３マウスを交雑して、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）^{１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ}（ＮＳＧ－ＳＧＭ３－Ｆｌｔ３ＫＯ、ＳＧＭ３Ｆ）マウスを得た。ヒト免疫系の生着を支えるそれらの能力を試験するために、本発明者らは、致死量未満で放射線照射され、臍帯血または成人骨髄からの１×１０^５個のＣＤ３４^＋ＨＰＣが移植された免疫不全マウスの４つの系統：ＮＳＧ、ＮＳＧＦ、ＳＧＭ３、ＳＧＭ３Ｆマウスを比較した。マウスの４つの系統すべてが臍帯血ＨＰＣを支えるが、ｈＳＧＭ３Ｆマウスは、血液中のＣＤ３３＋骨髄系細胞およびＣＤ３^＋Ｔ細胞の両方の拡大を伴って、移植後１２週で優れたｈＣＤ４５^＋生着を示す（図７Ａ）。対照的に、限定した数（１×１０^５）で成人骨髄ＨＰＣを移植されたｈＮＳＧＦ、ｈＳＧＭ３およびｈＳＧＭ３Ｆマウスのみが、血中においてより高いｈＣＤ４５＋生着を示した（図７Ｂ）。改善は、本発明者らが血液中でより高い百分率のＣＤ１４^＋単球およびＣＤ３^＋Ｔ細胞を観察したｈＳＧＭ３Ｆにおいて特に顕著であった（図７Ｂ）。

次に、本発明者らは、異なる系統のヒト化マウスにおけるＣＤ６６ｂ^＋顆粒球性、ＣＤ１４^＋単球性骨髄系細胞およびＤＣを含む骨髄系区画の発達を比較した。マウスの４つの系統すべてが骨髄中の異なる骨髄系細胞の分化を支えるが、ｈＳＧＭ３ＦマウスはＣＤ１４^＋およびＤＣのより高い拡大増殖を示す（図８Ａ）。より重要なことに、本発明者らは、脾臓においてＣＤ１４^＋およびＣＤ６６ｂ^＋細胞の両方のより高い百分率を観察した（図８Ａ）。注目すべきことに、ＣＤ６６ｂ^＋細胞はｈＮＳＧおよびｈＮＳＧＦには存在せず、ＣＤ６６ｂ^＋細胞の発達におけるヒトＳＣＦ／ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３サイトカインの重要な役割を示唆している。ヒトＤＣはＣＤ３０３^＋ｐＤＣおよびＣＤ１１ｃ^＋ｃＤＣを構成し、これらはさらにＣＤ１ｃ＋またはＣＬＥＣ９Ａ＋サブセットに分けられた。ヒトＤＣ発達の分析により、ｈＳＧＭ３およびｈＳＧＭ３Ｆの両マウスのマウス骨髄におけるｃＤＣの有意な増加が明らかになったのに対して、ｈＳＧＭ３Ｆマウスの脾臓ではｐＤＣの有意な減少およびｃＤＣの増加が観察された（図８Ｂ）。ｐＤＣはｈＮＳＧＦにおいて有意に増加したが、ｈＳＧＭ３において減少したので、ｈＳＧＭ３ＦにおけるｐＤＣの減少は、他の細胞サブセットを犠牲にして未成熟骨髄系細胞の発達を促進するヒトＩＬ３／ＣＳＦ２／ＫＩＴＬＧ導入遺伝子に主に起因するものであり得る。ｈＳＧＭ３およびｈＳＧＭ３Ｆマウスの両方の脾臓で見出された、ｈＮＳＧまたはｈＮＳＧＦマウスよりも古典的ＣＤ１ｃ^＋ｃＤＣの割合がより小さいｃＤＣのサブセットにおいて、同様の効果が観察された（図８Ｃ）。さらに、本発明者らは、ｈＮＳＧＦおよびｈＳＧＭ３Ｆマウスにおいて、ＤＣの形態を有する小腸の粘膜固有層中のＨＬＡ－ＤＲ^＋細胞の存在によって、ヒトＤＣを有する粘膜組織の定着も観察した（図８Ｄ）。全体として、本発明者らのデータは、ヒト化マウスにおけるヒトＤＣ発達に対するマウスＦｌｔ３ＫＯおよびヒトＩＬ３／ＣＳＦ２／ＫＩＴＬＧ導入遺伝子の生物学的効果を示唆している。

胸腺では、ｈＮＳＧおよびｈＮＳＧＦマウスにおいて、ヒトＣＤ３^＋胸腺細胞の大部分がＣＤ４およびＣＤ８に関して二重陽性であったが、ｈＳＧＭ３マウスとｈＳＧＭ３Ｆマウスの両方で、より高い百分率の単一陽性ＣＤ４またはＣＤ８胸腺細胞が見られた（図９Ａ～９Ｂ）。これは、成熟した胸腺細胞の潜在的なより高い出力を示唆しており、本発明者らがｈＳＧＭ３マウスおよびｈＳＧＭ３Ｆマウスの血液中により多くのＣＤ３^＋Ｔ細胞を見出したことと一致する（図７）。移植後２０週に、本発明者らは、脾臓において、ｈＳＧＭ３マウスとｈＳＧＭ３Ｆマウスの両方でわずかにより高いＣＤ４：ＣＤ８Ｔ細胞比を観察した（図９Ｃ）。重要なことに、ＣＤ４５ＲＡ^＋／－ＣＣＲ７^－エフェクターＴ細胞の割合は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方について、ｈＮＳＧＦマウスでは減少したが、ｈＳＧＭ３およびｈＳＧＭ３Ｆマウスでは増加し、ただし、後者では程度はより低かった（図９Ｄ）。その結果、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋ナイーブＴ細胞の割合は、ｈＳＧＭ３およびｈＳＧＭ３Ｆマウスにおいて大きく減少した（図９Ｄ）。全体として、本発明者らのデータは、ＳＧＭ３Ｆマウスにおける優れたヒト生着を示唆する。

最後に、本発明者らは、ワクチン接種に対する抗体応答を開始するヒト化マウス株の能力を探索することを試みた。本発明者らはまず、ヒト化マウスの血漿中の異なる免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプのレベルを測定した。ｈＮＳＧおよびｈＮＳＧＦは、血漿中にヒトＩｇＧおよびＩｇＡをほとんど有さなかったが、ｈＳＧＭ３およびｈＳＧＭ３Ｆは、より高いレベルの異なるＩｇアイソタイプを有し（図１０Ａ）、効率的なＩｇクラススイッチおよびＴ細胞依存性応答の能力を示唆した。次に、本発明者らは、移植後１７、２０、および２３週目に、異なる系統のヒト化マウスにミョウバンアジュバントを添加したＴｄａｐ／ＫＬＨワクチンＩＰ／ＳＣを接種した（図１０Ｂ）。ｈＳＧＭ３Ｆマウスでは、ワクチン接種された３匹のマウスのうち３匹がＫＬＨに対する特異的ＩｇＧを産生し、特異的抗体は３回目のワクチン接種の６週後でもなお検出可能であった（図１０Ｂ）。さらに、本発明者らは、移植後１７週および２０週に、ヒト用量の１／１０のＦｌｕｚｏｎｅ ＩＶ／ＩＰをさらなるマウスにワクチン接種した。２回目のワクチン接種の１０日後に、本発明者らは、ｈＳＧＭ３Ｆマウスにおいて、ワクチン接種された４匹のマウスのうち２匹がＦｌｕｚｏｎｅに対する特異的ＩｇＧを産生したことを観察した（図１０Ｃ）。より重要なことには、４匹のｈＳＧＭ３Ｆマウスのうち１匹が、赤血球凝集抑制アッセイによって測定されたところ、ワクチン株の１つであるＨ１Ｎ１ＦｌｕＡ／Ｃａｌ９ウイルスに対する中和抗体を産生したが、インフルエンザＢウイルスに対する中和抗体は産生しなかった（図１０Ｃ）。要約すると、本発明者らのデータは、ｈＳＧＭ３Ｆマウスにおけるヒト免疫系の顕著な機能的改善を示す。

マウスモデルの作製：ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}Ｔｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）^{１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ}；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ Ｓｔｏｃｋ ＃０１３０６２）をＮＳＧＦマウスに交雑することによって、ＮＳＧ－ＳＧＭ３－Ｆｌｔ３ｋｏまたはＳＧＭ３Ｆマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}－Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}Ｔｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）^{１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ}）を作製し、すべての子孫がホモ接合になるまで同系交配した。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは、それぞれがヒトインターロイキン－３（ＩＬ－３）遺伝子、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）遺伝子またはヒトＳｔｅｅｌ因子（ＳＦ）遺伝子のうちのいずれかを有するように設計された３つの別個の導入遺伝子を有した。各遺伝子の発現は、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー配列によって駆動され、その後にヒト成長ホルモンカセットおよびポリアデニル化（ポリＡ）配列が続く。受精したＣ５７ＢＬ／６ｘＣ３Ｈ／ＨｅＮ卵母細胞中に導入遺伝子を微量注入した。３つすべての導入遺伝子（３ＧＳ）を有する得られたファウンダーは、数世代にわたってＢＡＬＢ／ｃ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに戻し交配され、その後、少なくとも１１世代にわたってＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスに戻し交配された。これらのマウスは、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}；ＲＲＩＤ：ＩＭＳＲ ＪＡＸ：００５５５７）に交配され、次いで、すべての子孫が３ＧＳおよびＩＬ２ｒｇを標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配された。Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに到着したら、トランスジェニックマウスをＮＳＧマウスに一世代交配させて、ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスを樹立した。ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ系を使用して、ＮＳＧＦマウスを作製した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびマウスＦｌｔ３を標的とするｓｇＲＮＡは、受精したＮＳＧ卵母細胞中に同時注入された。Ｆｌｔ３欠失を有する得られたファウンダーは、ＮＳＧマウスに交配され、次いで、すべての子孫がＦｌｔ３を標的とした変異についてホモ接合になるまで同系交配された。

表１．マウス系統のリスト。

表２．マウス遺伝子型のためのＰＣＲプライマーのリスト。
追加の材料および方法
ヒト化マウス

Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手したＮＳＧバックグラウンドのマウスの異なる系統に対してヒト化マウスを作製した。すべてのプロトコルは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１４００５）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ（１０１１６３－０２２０＆１０１８３１－０３２１；Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）の動物実験委員会によって検討され、承認された。４週齢でガンマ線照射を用いて、致死量未満の放射線（体重１グラム当たり１０ｃＧｙ）をマウスに照射した。胎児肝臓または正期臍帯血からの１０万個のＣＤ３４^＋ＨＰＣ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＲｅｓｏｕｒｃｅｓまたはＬｏｎｚａ）を、２００μＬのＰＢＳ中で尾静脈静脈内（ＩＶ）注射によって与えた。あるいは、マウスには、示されるように骨髄からの成人ＣＤ３４^＋ＨＰＣ（Ｌｏｎｚａ）が与えられた。生着を評価するために、ＨＰＣ移植後４～１２週でマウスを採血し、個々の実験計画に従って安楽死させた。
フローサイトメトリー分析

マウスを安楽死させ、血液をヘパリンで採取した。骨（大腿骨および脛骨）、脾臓および肺を収集して単一細胞懸濁液を作製した。５０μｇ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および２４Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）で、脾臓を３７℃で１０分間消化した。５０μｇ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅおよび２４Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）で、肺を３７℃で３０分間消化した後、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で機械的に解離させた。まず、マウスＦｃブロッカー（ＢＤ）で細胞を処置し、次いで、抗体カクテルで氷上にて３０分間染色した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＬＳＲＩＩまたはＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩ（ＢＤ）で試料を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。マウスＦｌｔ３の発現のために、マウスＣＤ４５－ＢＶ６５０（３０－Ｆ１１、ＢＤ）およびＦＬＴ３－ＢＶ４２１（Ａ２Ｆ１０．１、ＢＤ）に対する抗体で細胞を染色した。ヒトＬＴＢＲの発現のために、マウスＣＤ４５－ＢＶ６５０（３０－Ｆ１１、ＢＤ）およびヒトＬＴＢＲ－ＰＥ（３１Ｇ４Ｄ８、ＢＤ）に対する抗体で細胞を染色した。マウスＤＣの分析のために、マウスＣＤ４５－ＢＶ６５０（３０－Ｆ１１、ＢＤ）、ＣＤ３－ＰＥ－ＣＦ５７９（１４５－２Ｃ１１、ＢＤ）、ＣＤ１９－ＰＥ－ＣＦ５７９（ＩＤ３、ＢＤ）、ＣＤ１０３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｍ２９０、ＢＤ）、Ｆ４／８０－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｆ４／８０、ＢＤ）、Ｇｒ１－ＰＯ（ＲＢ６－８Ｃ５、ＢＤ）、ＩＡｇ７－ＦＩＴＣ（１０－２－１６、ＢＤ）、ＣＤ１１ｃ－Ｖ４５０（ＨＬ３、ＢＤ）、ＣＤ１７２ａ－ＰＥ（Ｐ８４、ＢＤ）、ＣＤ８－ＰＥ（５３－６．７２、ＢＤ）およびＰＤＣＡ－１－ＡＰＣ（９２７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する抗体で細胞を染色した。血液中でのヒト生着のために、マウスＣＤ４５－ＢＶ６５０（３０－Ｆ１１、ＢＤ）およびヒトＣＤ４５－ＢＶ５１０（ＨＩ３０、ＢＤ）、ＣＤ３３－ＰＥ（Ｐ６７．６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１４－ＰＥ－Ｃｙ７（ＭｑＰ９、ＢＤ）、ＣＤ１９－ＡＰＣ（ＨＩＢ１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＣＤ３－ＡＰＣ－Ｈ７（ＳＫ７、ＢＤ）に対する抗体で細胞を染色した。ヒト免疫細胞表現型のために、ヒトＣＤ１ｃ－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（Ｌ１６１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＬＥＣ９Ａ－ＰＥ（８Ｆ９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３０３－ＦＩＴＣ（ＡＣ１４４、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＰＣ－ｅＦｏｕｒ７８０（ＬＮ３、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＣＤ１１ｃ－Ｖ４５０（Ｂ－ｌｙ６、ＢＤ）、ＣＤ６６ｂ－ＦＩＴＣ（Ｇ１０Ｆ５、ＢＤ）、ＣＤ８－ＥＣＤ（ＳＦ１２１Ｔｈｙ２Ｄ３、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４－ＢＵＶ３９５（ＳＫ３、ＢＤ）、ＣＤ４５ＲＡ－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（ＨＩ１００、ＢＤ）およびＣＣＲ７－ＰＥ－Ｃｙ７（３Ｄ１２、ＢＤ）に対する抗体を含む追加の抗体を使用して骨髄、脾臓および胸腺を染色した。
免疫蛍光染色

組織をＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ Ｕ．Ｓ．Ａ．）に包埋し、液体窒素中で急速凍結した。凍結切片を６μｍで切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔを加えたスライド上で風乾し、冷アセトンで５分間固定した。まず、０．０３％ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で組織切片を１５分間処置した後、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ＢｕｓｔｅｒおよびＦｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋ（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処置した。次いで、マウスＩ－Ａ^ｇ７に対するモノクローナル抗体（１０．２．１６、ＢＤ）、ヒトＣＤ３に対するモノクローナル抗体（ＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体（ＲＰＡ－Ｔ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８に対するモノクローナル抗体（ＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ）、ＣＤ１１ｃに対するモノクローナル抗体（Ｓ－ＨＣＬ－３、ＢＤ）またはＨＬＡ－ＤＲに対するモノクローナル抗体（Ｌ２４３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で、切片を室温で１時間染色した後、アイソタイプ特異的な二次抗体で、室温で３０分間染色した。それぞれのアイソタイプ抗体を対照として使用した。最後に、１μｇ／ｍｌの４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で切片を対比染色し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を載せ、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳ ＡＦ２．０ソフトウェアを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡またはＺＥＮソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
ＥＬＩＳＡ

製造プロトコルに従ってＥＬＩＳＡキットを用いて、サイトカイン産生を測定した。マウスＦｌｔ３Ｌについては、ＷＴおよびＦｌｔ３－ＫＯマウスの両方からの血漿を、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓからのマウスＦｌｔ３Ｌ ＥＬＩＳＡ Ｄｕｏ Ｓｅｔで試験した。ヒトＩＬ６については、２０μｇのＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）ＩＰで２時間処置されたＷＴおよびＩＬ６－ＫＩマウスの両方からの血漿を、ＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのヒトＩＬ６ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔで試験した。ヒトＴＳＬＰについては、ＷＴおよびＴＳＬＰ－ＫＩマウスの両方からのマウス肺を、５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）および１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）で１８時間エクスビボで刺激し、ＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのヒトＴＳＬＰ ＥＬＩＳＡ Ｍａｘ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔを用いて培養上清中のヒトＴＳＬＰを測定した。総ヒトＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡについては、血漿試料をヒトＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で試験した。ＫＬＨ特異的ヒトＩｇＧについては、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍＬの精製されたＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でコーティングし、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡキットで検出した。Ｆｌｕｚｏｎｅ特異的ヒトＩｇＧについては、ＥＬＩＳＡプレートをＦｌｕｚｏｎｅ（２０１５－２０１６シーズン、Ｓａｎｏｆｉ）でコーティングし、Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡキットで検出した。
赤血球凝集抑制アッセイ

赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイを実施して、血清中の抗ウイルス抗体を検出および定量した。まず、血清（すべての試験血清および陽性対照としての参照ヒト血清を含む）の５０μｌの一定分量を受容体破壊酵素（Ｓｉｇｍａ）で、３７℃で１６～１８時間処置した。次いで、血清を５６℃に３０分間加熱して酵素活性を除去し、２００μｌの１％ニワトリ赤血球（ＣＲＢＣ）と共に室温で３０分間インキュベートして、血清中の非特異的赤血球凝集活性を除去した。希釈された試料（１／５希釈）を、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって回収した。４ＨＡ単位を含有する５０μｌのインフルエンザウイルスと５０μｌの２倍連続希釈血清の混合物を、９６ウェルＵ底プレート上で、２つ組で室温にて３０分間インキュベートする。次いで、５０μｌの１％ＣＲＢＣを各ウェル中に添加し、室温で４５分間インキュベートした。ＨＡＩ力価は、赤血球凝集をもたらさない最終希釈の逆数として定義された。
統計解析

統計解析は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。任意の２つの群間の比較は、マン・ホイットニー検定または両側ｔ検定を使用して解析した。任意の３またはそれを超える群間の比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって解析した。
配列
配列番号１、Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}

配列番号２、Ｉｌ６^{ｅｍ１（ＩＬ６）Ａｋｐ}

配列番号３、Ｔｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}

配列番号４、Ｌｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}
配列番号５、マウスＦｌｔ３に対するｇＲＮＡ、５’－ＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡ－３’
配列番号６～７、５’－ＡＧＧＡＡＣＴＴＣＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＣ－３’（配列番号６）および５’－ＡＴＧＣＴＴＡＧＧＣＡＴＡＡＣＧＣＡＣＴ－３’（配列番号７）を含むマウスＩｌ６に対するｇＲＮＡ。
配列番号８～９、５’－ＣＣＡＣＧＴＴＣＡＧＧＣＧＡＣＡＧＣＡＴ－３’（配列番号８）および５’－ＴＴＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＴＴＧＣＡＴＧＡ－３’（配列番号９）を含むマウスＴｓｌｐに対するｇＲＮＡ。
配列番号１０～１１、５’－ＧＣＴＣＧＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＣＧＧＧ－３’（配列番号１０）および５’－ＧＡＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号１１）を含むマウスＬｔｂｒに対するｇＲＮＡ
配列番号１２～１３、５’－ＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＣ－３’（配列番号１２）および５’－ＡＴＣＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ－３’（配列番号１３）を含むマウスＦｌｔ３に対するＰＣＲプライマー
配列番号１４～１７、５’－ＣＡＴＣＴＣＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＡＴＴＣＴＴＣ－３’（配列番号１４）、５’－ＡＧＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧ－３’（配列番号１５）、５’－ＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣ－３’（配列番号１６）および５’－ＧＧＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＴＣ－３’（配列番号１７）を含むヒトＩＬ６に対するＰＣＲプライマー
配列番号１８～１９、５’－ＧＡＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＡＧＧＧＴＣ－３’（配列番号１８）および５’－ＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧ－３’（配列番号１９）を含むヒトＩＬ６ドナーＤＮＡ骨格用のＰＣＲプライマー
配列番号２０～２３、５’－ＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧＴＧＡＡＴＡＡＧＣＴＧＣ－３’（配列番号２０）、５’－ＣＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＴＡＧ－３’（配列番号２１）、５’－ＣＡＧＧＧＡＧＧＴＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧＣ－３’（配列番号２２）および５’－ＣＣＡＧＧＣＴＧＴＡＧＣＡＴＴＴＧＧＧＴＧ－３’（配列番号２３）を含むヒトＴＳＬＰに対するＰＣＲプライマー。
配列番号２４～２７、５’－ＧＴＧＡＡＡＴＧＴＡＴＣＴＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣ－３’（配列番号２４）、５’－ＴＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＡＧＧＴＧ－３’（配列番号２５）、５’－ＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＧ－３’（配列番号２６）、および５’－ＡＴＧＣＧＴＣＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣ－３’（配列番号２７）を含むヒトＬＴＢＲに対するＰＣＲプライマー。

参考文献

本明細書に開示されるすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み入れられ、一部の事例では文書全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、反対の意味が明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

そうでないことが明確に示されていない限り、１より多くの工程または行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、その方法の工程または行為の順序は、その方法の工程または行為が記述されている順序に必ずしも限定されないことも理解されたい。

特許請求の範囲および上記の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などのすべての移行句は、非限定的である、すなわち、含むが限定されないことを意味すると理解されるべきである。米国特許庁特許審査便覧セクション２１１１．０３に記載されているように、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句のみが、それぞれ限定的または準限定的な移行句であるものとする。

数値の前の「約」および「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。

値の範囲が提供されている場合、その範囲の上端と下端の間およびその範囲の上端と下端を含む各値が本明細書において具体的に企図され、記載される。

Claims (71)

1. 不活性化されたマウスＰｒｋｄｃ対立遺伝子、不活性化されたマウスＩＬ２ｒｇ対立遺伝子および不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含む非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス。
2. 前記マウスが、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ）マウスである、請求項１に記載のマウス。
3. ＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウス中のマウスＦｌｔ３対立遺伝子を不活性化することを含む、請求項２に記載のマウスを作製する方法。
4. （ａ）ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ遺伝的背景および不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を有するファウンダーマウスを発生させることと；
   （ｂ）不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子についてホモ接合の子孫マウスを作製するために前記ファウンダーマウスを同系交配することと；
   を含む、請求項１または２に記載のマウスを作製する方法。
5. （ａ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質とマウスＦｌｔ３を標的とするｇＲＮＡとを受精したＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ卵母細胞中に同時注入することであって、マウスＦｌｔ３対立遺伝子は不活性化されている、ことと；
   （ｂ）Ｆ１子孫マウスを作製するために、前記ファウンダーマウスをＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスに交配することと；
   （ｃ）前記不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子についてホモ接合であるＦ２子孫マウスを作製するために、前記Ｆ１子孫マウスを同系交配することと；
   を含む、請求項１または２に記載のマウスを作製する方法。
6. 子孫マウスを作製するために、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてホモ接合であり、およびＦｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合である雌マウスを、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｘ連鎖Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてヘミ接合であり、およびＦｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合である雄マウスと交配させることを含む方法。
7. 必要に応じて前記ｇＲＮＡが配列番号５の配列を含む、マウスＦｌｔ３を標的とするｇＲＮＡ。
8. 必要に応じて前記マウス卵母細胞が受精されている、請求項７に記載のｇＲＮＡを含むマウス卵母細胞。
9. Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質をさらに含む、請求項８に記載のマウス卵母細胞。
10. ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）をコードする核酸をさらに含む、請求項１または２に記載のマウス。
11. 前記ヒトＴＳＬＰをコードする核酸がヒトＴＳＬＰ導入遺伝子を含む、請求項１０に記載のマウス。
12. 前記ヒトＴＳＬＰ導入遺伝子が、配列番号３の核酸配列を含む、請求項１１に記載のマウス。
13. 前記マウスがヒトＴＳＬＰを発現する、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のマウス。
14. 前記マウスが、不活性化されたマウスＴｓｌｐ対立遺伝子を含み、および／またはマウスＴｓｌｐを発現しない、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のマウス。
15. ＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウス中のマウスＦｌｔ３対立遺伝子を不活性化することと、前記ヒトＴＳＬＰをコードする核酸を導入することと、を含む、請求項１０～１４のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
16. （ａ）ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ遺伝的背景と、不活性化されたマウスＴｓｌｐと、ヒトＴＳＬＰをコードする核酸とを有するファウンダーマウスを発生させることと；
    （ｂ）Ｆ１子孫マウスを作製するために、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスに前記ファウンダーマウスを交配することと；
    （ｃ）ヒトＴＳＬＰをコードする核酸についてホモ接合のＦ２子孫マウスを作製するために、前記Ｆ１子孫マウスを同系交配することと；
    を含む、請求項１０～１４のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
17. （ａ）ファウンダーマウスを作製するために、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質、マウスＴｓｌｐを標的とするｇＲＮＡ、およびヒトＴＳＬＰをコードする核酸を、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含む受精したＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ卵母細胞中に同時注入することであって、前記ヒトＴＳＬＰをコードする核酸は相同組換えを介してゲノム的に挿入されている、同時注入することと；
    （ｂ）Ｆ１子孫マウスを作製するために、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスに前記ファウンダーマウスを交配することと；
    （ｃ）前記ヒトＴＳＬＰをコードする核酸についてホモ接合のＦ２子孫マウスを作製するために、前記Ｆ１子孫マウスを同系交配することと；
    を含む、請求項２０２４のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
18. 子孫マウスを作製するために、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてホモ接合であり、Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合であり、およびＴｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}についてホモ接合である雌マウスを、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｘ連鎖Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてヘミ接合であり、Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合であり、Ｔｓｌｐ^{ｅｍ３（ＴＳＬＰ）Ａｋｐ}についてホモ接合である雄マウスと交配させることを含む方法。
19. 必要に応じて、前記ｇＲＮＡが配列番号８または配列番号９の配列を含む、マウスＴｓｌｐを標的とするｇＲＮＡ。
20. 必要に応じて前記マウス卵母細胞が受精されている、請求項１９に記載のｇＲＮＡを含むマウス卵母細胞。
21. Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質をさらに含む、請求項２０に記載のマウス卵母細胞。
22. ヒトＴＳＬＰをコードする核酸をさらに含む、請求項２１に記載のマウス卵母細胞。
23. ヒトインターロイキン６（ＩＬ６）をコードする核酸をさらに含む、請求項１または２に記載のマウス。
24. 前記ヒトＩＬ６をコードする核酸がヒトＩＬ６導入遺伝子を含む、請求項２３に記載のマウス。
25. 前記ヒトＩＬ６導入遺伝子が、配列番号２の核酸配列を含む、請求項２４に記載のマウス。
26. 前記マウスがヒトＩＬ６を発現する、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のマウス。
27. 前記マウスが、不活性化されたマウスＩＬ６対立遺伝子を含み、および／またはマウスＩＬ６を発現しない、請求項２３～２６のいずれか一項に記載のマウス。
28. ＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウス中のマウスＦｌｔ３対立遺伝子を不活性化することと、前記ヒトＩＬ６をコードする核酸を導入することと、を含む、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
29. （ａ）ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ遺伝的背景と、不活性化されたマウスＩＬ６と、ヒトＩＬ６をコードする核酸とを有するファウンダーマウスを発生させることと；
    （ｂ）Ｆ１子孫マウスを作製するために、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスに前記ファウンダーマウスを交配することと；
    （ｃ）ヒトＩＬ６をコードする核酸についてホモ接合のＦ２子孫マウスを作製するために、前記Ｆ１子孫マウスを同系交配することと；
    を含む、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
30. （ａ）ファウンダーマウスを作製するために、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質、マウスＩｌ６を標的とするｇＲＮＡ、およびヒトＩＬ６をコードする核酸を、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含む受精したＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ卵母細胞中に同時注入することであって、前記ヒトＩＬ６をコードする核酸は相同組換えを介してゲノム的に挿入されている、同時注入することと；
    （ｂ）Ｆ１子孫マウスを作製するために、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスに前記ファウンダーマウスを交配することと；
    （ｃ）前記ヒトＩＬ６をコードする核酸についてホモ接合のＦ２子孫マウスを作製するために、前記Ｆ１子孫マウスを同系交配することと；
    を含む、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
31. 子孫マウスを作製するために、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてホモ接合であり、Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合であり、およびＩｌ６^{ｅｍ３（ＩＬ６）Ａｋｐ}についてホモ接合である雌マウスを、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｘ連鎖Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてヘミ接合であり、Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合であり、Ｉｌ６^{ｅｍ３（ＩＬ６）Ａｋｐ}についてホモ接合である雄マウスと交配させることを含む方法。
32. 必要に応じて、前記ｇＲＮＡが配列番号６または配列番号７の配列を含む、マウスＩｌ６を標的とするｇＲＮＡ。
33. 必要に応じて前記マウス卵母細胞が受精されている、請求項３２に記載のｇＲＮＡを含むマウス卵母細胞。
34. Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質をさらに含む、請求項３３に記載のマウス卵母細胞。
35. ヒトＩＬ６をコードする核酸をさらに含む、請求項３４に記載のマウス卵母細胞。
36. ヒトリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）をコードする核酸をさらに含む、請求項１または２に記載のマウス。
37. 前記ヒトＬＴＢＲをコードする核酸がヒトＬＴＢＲ導入遺伝子を含む、請求項３６に記載のマウス。
38. 前記ヒトＬＴＢＲ導入遺伝子が、配列番号４の核酸配列を含む、請求項３７に記載のマウス。
39. 前記マウスがヒトＬＴＢＲを発現する、請求項３６～３８のいずれか一項に記載のマウス。
40. 前記マウスが、不活性化されたマウスＬｔｂｒ対立遺伝子を含み、および／またはマウスＬｔｂｒを発現しない、請求項３６～３９のいずれか一項に記載のマウス。
41. ＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウス中のマウスＦｌｔ３対立遺伝子を不活性化することと、前記ヒトＬＴＢＲをコードする核酸を導入することと、を含む、請求項３６～４０のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
42. （ａ）ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ遺伝的背景と、不活性化されたマウスＬｔｂｒと、ヒトＬＴＢＲをコードする核酸とを有するファウンダーマウスを発生させることと；
    （ｂ）Ｆ１子孫マウスを作製するために、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスに前記ファウンダーマウスを交配することと；
    （ｃ）ヒトＬＴＢＲをコードする核酸についてホモ接合のＦ２子孫マウスを作製するために、前記Ｆ１子孫マウスを同系交配することと；
    を含む、請求項３６～４０のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
43. （ａ）ファウンダーマウスを作製するために、Ｃａｓ９ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質、マウスＬｔｂｒを標的とするｇＲＮＡ、およびヒトＬＴＢＲをコードする核酸を、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含む受精したＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ卵母細胞中に同時注入することであって、前記ヒトＬＴＢＲをコードする核酸は相同組換えを介してゲノム的に挿入されている、同時注入することと；
    （ｂ）Ｆ１子孫マウスを作製するために、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスに前記ファウンダーマウスを交配することと；
    （ｃ）前記ヒトＬＴＢＲをコードする核酸についてホモ接合のＦ２子孫マウスを作製するために、前記Ｆ１子孫マウスを同系交配することと；
    を含む、請求項３６～４０のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
44. 子孫マウスを作製するために、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてホモ接合であり、Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合であり、およびＬｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}についてホモ接合である雌マウスを、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｘ連鎖Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてヘミ接合であり、Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合であり、Ｌｔｂｒ^{ｅｍ１（ＬＴＢＲ）Ａｋｐ}についてホモ接合である雄マウスと交配させることを含む方法。
45. 必要に応じて、前記ｇＲＮＡが配列番号１０または配列番号１１の配列を含む、マウスＬｔｂｒを標的とするｇＲＮＡ。
46. 必要に応じて前記マウス卵母細胞が受精されている、請求項４５に記載のｇＲＮＡを含むマウス卵母細胞。
47. Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質をさらに含む、請求項４６に記載のマウス卵母細胞。
48. ヒトＬＴＢＲをコードする核酸をさらに含む、請求項４７に記載のマウス卵母細胞。
49. ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸と；ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸と；ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をコードする核酸と、をさらに含む、請求項１または２に記載のマウス。
50. （ａ）前記ヒトＩＬ３をコードする核酸がヒトＩＬ３導入遺伝子を含み；（ｂ）前記ヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸がヒトＧＭ－ＣＳＦ導入遺伝子を含み；および（ｃ）前記ヒトＳＦをコードする核酸がヒトＳＦ導入遺伝子を含む、請求項４９に記載のマウス。
51. 前記マウスが、ヒトＩＬ３、ヒトＧＭ－ＣＳＦおよびヒトＳＦを発現する、請求項４９または５０に記載のマウス。
52. ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸およびヒト幹細胞因子（ＳＦ）をコードする核酸を、不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスに導入することを含む、請求項４９～５１のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
53. 不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスを、ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸、ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸およびヒト幹細胞因子（ＳＦ）をコードする核酸を含むＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウスと交雑することを含む、請求項４９～５１のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
54. 子孫マウスを作製するために、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてホモ接合であり、Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合であり、ＩＬ３についてホモ接合であり、ＧＭ－ＣＳＦについてホモ接合であり、およびＳＦについてホモ接合である雌マウスを、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄについてホモ接合であり、Ｘ連鎖Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}についてヘミ接合であり、Ｆｌｔ３^{ｅｍ１Ａｋｐ}についてホモ接合であり、ＩＬ３についてホモ接合であり、ＧＭ－ＣＳＦについてホモ接合であり、ＳＦについてホモ接合である雄マウスと交配させることを含む方法。
55. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスから得られた細胞。
56. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスから得られた細胞と同じ遺伝子型を有する細胞を含むマウス。
57. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスの子孫マウス。
58. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスを作製する方法。
59. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスを繁殖させる方法。
60. 子孫マウスを作製するために、先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスを第２のマウスと交配させることを含む、請求項５９に記載の方法。
61. 前記第２のマウスが、先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスである、請求項６０に記載の方法。
62. 先行する請求項のいずれか一項に記載のマウスを使用する方法
63. 前記マウスに致死量未満で放射線を照射することと、前記マウスにヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を注射することとを含む、請求項６２に記載の方法。
64. 前記マウスに目的の作用物質を投与することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
65. 前記マウス中のヒト免疫細胞に対する前記作用物質の効果を評価することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
66. 前記ヒト免疫細胞が、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージから選択される、請求項６５に記載の方法。
67. 不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子
    を含むＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス。
68. 不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子および
    ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）をコードする核酸
    を含むＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス。
69. 不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子および
    ヒトインターロイキン６（ＩＬ６）をコードする核酸
    を含むＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス。
70. 不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子および
    ヒトリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）をコードする核酸
    を含むＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス。
71. 不活性化されたマウスＦｌｔ３対立遺伝子、
    ヒトインターロイキン３（ＩＬ３）をコードする核酸、
    ヒト顆粒球／マクロファージ刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸、および
    ヒト幹細胞因子（ＳＦ）をコードする核酸
    を含むＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪマウス。