发明内容
针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供一种靶向AHRR基因的sgRNA组合及其应用,所述靶向AHRR基因的sgRNA组合特异性强,脱靶率低,配合Cas9核酸酶的mRNA,可实现AHRR基因的大片段敲除,突变效率高,基因型可稳定存在,应用价值高。
为达此目的,本发明采用如下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种靶向AHRR基因的sgRNA组合,所述靶向AHRR基因的sgRNA组合包括sgRNA1和/或sgRNA2,所述sgRNA1包括SEQ ID No.1所示的核酸序列,所述sgRNA2包括SEQ ID No.2所示的核酸序列。
SEQ ID No.1:GGAGATNTCGCCAAGTNCATGGG;
SEQ ID No.2:GGCACACTANCGTNATTATTGG;
其中,N代表A、T、C或G中的任意一种。
本发明中,sgRNA1和sgRNA2特异性靶向AHRR基因中的内含子序列,其中sgRNA1靶向AHRR基因的内含子5,sgRNA2靶向AHRR基因的内含子8,二者相互配合,可以降低脱靶率,特异性较高。
第二方面,本发明提供了一种AHRR基因编辑系统,所述AHRR基因编辑系统包括第一方面所述的靶向AHRR基因的sgRNA组合。
本发明中,通过将靶向AHRR基因的sgRNA组合结合使用,配合Cas9,所述AHRR基因编辑系统仅对AHRR基因进行编辑,脱靶率较低,可以避免非特异性的基因编辑;所述靶向AHRR基因的sgRNA组合在基因组中的距离较远,可以实现对AHRR基因的大片段敲除,基因编辑效率极高。
优选地,所述AHRR基因编辑系统还包括Cas9。
优选地,所述Cas9包括Cas9核酸酶和/或Cas9核酸酶的mRNA,优选为Cas9核酸酶的mRNA。
第三方面,本发明提供了一种重组细胞,所述重组细胞含有第一方面所述的靶向AHRR基因的sgRNA组合。
本发明中,通过对细胞的AHRR基因进行编辑,所述重组细胞可以通过细胞分裂的方式将突变的基因型传递给子代细胞,实现了基因突变的稳定性及可遗传性,降低了筛选的工作量,应用价值更为广泛。
优选地,所述重组细胞含有第二方面所述的AHRR基因编辑系统。
优选地,所述重组细胞为经过第二方面所述的AHRR基因编辑系统编辑后,基因组中敲除了AHRR基因的受精卵细胞。
第四方面,本发明提供了一种第三方面所述的重组细胞的构建方法,所述构建方法包括:
将第二方面所述的AHRR基因编辑系统导入受精卵细胞的细胞核内,得到所述重组细胞。
本发明中,将所述的AHRR基因编辑系统直接导入受精卵细胞的细胞核内,避免了sgRNA1、sgRNA2和Cas9核酸酶的mRNA只能在细胞分裂、核膜消失时对基因组进行编辑的弊端,提高了基因编辑的效率;选取受精卵细胞用于构建重组细胞,可以降低嵌合体出现的概率,保证有义突变可以传递给子代,降低后期筛选的工作量。
优选地,所述导入包括显微注射。
第五方面,本发明提供了一种肥胖动物模型的构建方法,所述肥胖动物模型的构建方法包括:
将第二方面所述的AHRR基因编辑系统导入哺乳动物受精卵细胞的细胞核内,得到重组细胞;
将所述重组细胞移植入代孕母体,获得的F0代与野生型交配,得到F1代杂合子;
将所述F1代杂合子自交,获得的F2代纯合子即为所述肥胖动物模型。
本发明中,所述肥胖动物模型的构建方法操作简单,成功率高,相关领域的技术人员很容易掌握,可以在相关的实验室中完成;筛选得到纯合子后,仅需对纯合子进行持续的自交,即可使突变的基因型稳定遗传,无需再次筛选,十分方便,也为相关的研究创造了便利的条件。
优选地,所述AHRR基因编辑系统的制备方法包括:
对Cas9核酸酶基因进行体外转录,得到所述Cas9核酸酶的mRNA;
将所述Cas9核酸酶的mRNA与第一方面所述的靶向AHRR基因的sgRNA组合混合,得到所述AHRR基因编辑系统。
优选地,所述哺乳动物包括小鼠、大鼠、兔、猪或食蟹猴中的任意一种。
优选地,所述哺乳动物为小鼠,优选为C57BL/6小鼠。
优选地,所述F0代、F1代杂合子和F2代纯合子利用PCR扩增和测序进行鉴定。
优选地,所述PCR扩增的正向引物的序列包括SEQ ID No.3所示的核酸序列;
优选地,所述PCR扩增的反向引物的序列包括SEQ ID No.4~5之一所示的核酸序列。
SEQ ID No.3:CAGAGCTTATCCACAAAGTCACC;
SEQ ID No.4:GCACCTCCAAAGAATATACAAGCAG;
SEQ ID No.5:CTGCAAAGGCTGACATGAAGG。
作为优选技术方案,本发明所述肥胖动物模型的构建方法,具体包括以下步骤:
(1)体外转录Cas9核酸酶基因的mRNA,与靶向AHRR基因的sgRNA组合混合,得到AHRR基因编辑系统;
对C57BL/6小鼠进行促排卵,体外受精后,培养受精卵;
(2)将所述AHRR基因编辑系统显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞的细胞核内,得到重组细胞;
(3)对所述重组细胞进行体外培养,并转移到代孕母鼠体内;
(4)提取出生小鼠尾部组织的DNA,使用SEQ ID No.3~5进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序鉴定,挑选AHRR基因缺失的小鼠作为F0代;
(5)将所述F0代与野生型C57BL/6小鼠交配,得到F1代杂合子小鼠;
(6)将所得F1代杂合子小鼠自交,使用SEQ ID No.3~5进行PCR扩增,并对扩增产物测序鉴定,筛选出F2代AHRR基因敲除的纯合子C57BL/6小鼠,即所述的肥胖动物模型。
第六方面,本发明提供了第一方面所述的靶向AHRR基因的sgRNA组合、第二方面所述的AHRR基因编辑系统、第三方面所述的重组细胞、第四方面所述的重组细胞的构建方法或第五方面所述的肥胖动物模型的构建方法中的任意一种或至少两种的组合在筛选降脂降糖药物和/或评价降脂降糖药物效果中的应用。
本发明中,所述靶向AHRR基因的sgRNA组合和基因编辑系统特异性高,脱靶率低;所述重组细胞和重组细胞的构建方法提高了基因编辑的效率,降低了筛选的工作量;所述肥胖动物模型的构建方法技术成熟,操作简单,突变后的基因型可稳定存在,重复性较强,且受外界环境因素的影响较小,适合应用于相关的机制研究及药物筛选中,应用价值极其广泛。
相比于现有技术,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明所述靶向AHRR基因的sgRNA组合和AHRR基因编辑系统特异性好,脱靶率低,可以实现对AHRR基因的大片段敲除,基因编辑效率高;通过将AHRR基因编辑系统直接导入受精卵细胞的细胞核内,构建的重组细胞可以通过细胞分裂的方式将突变的基因型传递给子代细胞,实现了基因突变的稳定性及可遗传性,降低了筛选的工作量;
(2)本发明通过敲除AHRR基因,建立了一种肥胖动物模型的构建方法,通过CRISPR/Cas9系统对AHRR基因进行编辑,实现了大片段的敲除,提高了基因编辑的效率;所采用的技术十分成熟,操作简单,成功率高,具有较好的重复性;构建得到的AHRR基因敲除的纯合子小鼠缺失了基因组中5451bp的片段,体型、体重和脂肪重量明显高于野生型小鼠,具有明显的肥胖表型,且受外界环境因素的影响较小,表型稳定,耗时较短,在相关药物筛选及科学研究中具有广泛的应用价值。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料:
体外转录试剂盒购自英茂盛业生物科技有限公司(Inovogen Tech);
PCR扩增试剂购自TOYOBO公司;
基因组DNA提取试剂盒购自TaKaRa公司;
无水乙醇购自广州化学试剂厂;
C57BL/6小鼠来自赛业模式生物研究中心(太仓)有限公司;
小鼠饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司;
小鼠的饲养条件为:
在温度为25℃、湿度为50%、气流速度为0.2m/s、噪音为50dB(A)、无菌等级为7级的无菌环境中进行饲养,光照时间为10h/天,每2天喂食一次,提供足够的饲料供小鼠自由取食,平均每只小鼠的进食量为3~7g/天。
实施例1
本实施例提供一种靶向AHRR基因的sgRNA组合,所述靶向AHRR基因的sgRNA组合包括sgRNA1和sgRNA2,所述sgRNA1包括SEQ ID No.1所示的核酸序列,所述sgRNA2包括SEQ IDNo.2所示的核酸序列。
SEQ ID No.1:GGAGATNTCGCCAAGTNCATGGG;
SEQ ID No.2:GGCACATCTANCGTNATTATTGG;
其中,N代表A、T、C或G中的任意一种。
所述sgRNA1特异性靶向AHRR基因的内含子5,所述sgRNA2特异性靶向AHRR基因的内含子8,特异性好,脱靶率低,应用价值广泛。
实施例2
本实施例提供一种AHRR基因编辑系统,所述AHRR基因编辑系统包括靶向AHRR基因的sgRNA组合sgRNA1和sgRNA2以及Cas9核酸酶的mRNA。
所述AHRR基因编辑系统具有敲除基因组中AHRR基因的能力,通过sgRNA组合的配合,可以降低脱靶率,降低非特异性编辑的概率,且具有大片段敲除的能力,编辑效率更高;选用Cas9核酸酶的mRNA,对细胞的毒害作用较小,编辑后的个体更容易存活,降低筛选工作的难度。
实施例3
本实施例提供一种重组细胞,所述重组细胞为经过实施例2中的AHRR基因编辑系统编辑后,基因组中AHRR基因发生突变的C57BL/6小鼠的受精卵细胞。
所述重组细胞通过如下方法进行构建:
(1)体外转录Cas9核酸酶基因的mRNA,与靶向AHRR基因的sgRNA组合混合,得到AHRR基因编辑系统;
对C57BL/6小鼠进行促排卵,体外受精后,培养受精卵;
(2)将所述AHRR基因编辑系统显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞的细胞核内,得到重组细胞。
通过将sgRNA1、sgRNA2和Cas9核酸酶的mRNA直接注射入受精卵细胞的细胞核中,提高了基因编辑的效率;选取受精卵构建重组细胞,有义突变可以通过细胞分裂进行遗传,降低了嵌合体出现的概率,编辑后的基因型可以遗传给子代,减小了筛选的工作量。
实施例4
本实施例将实施例3中构建的重组细胞移植到代孕母鼠的体内,构建肥胖动物模型,具体步骤如下:
(1)将实施例3所得的重组细胞进行体外培养,并转移到代孕母鼠的体内;
(2)提取出生小鼠尾部组织的DNA,使用SEQ ID No.3~5进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序鉴定,挑选AHRR基因缺失的小鼠作为F0代;
DNA提取的具体步骤如下:
a.剪取3mm小鼠尾巴置于离心管中,加入180μL缓冲液GL、20μL蛋白酶K和10μLRNase A;
b.将离心管在56℃孵育过夜;
c.将离心管在12000rpm下离心2min,去除杂质;
d.混合,加入200μL Buffer GB和200μL无水乙醇;
e.将离心柱放在收集管中,将样品转移至离心柱中,在12000rpm下离心,弃滤液;
f.向离心柱中加入500μL Buffer WA,在12000rpm下离心1min,弃滤液;
g.向离心柱中加入700μL Buffer WB,在12000rpm下离心1min,弃滤液;
h.重复步骤g 1次;
i.将离心柱放在收集管中,在12000rpm下离心2min;
j.将离心柱放入一个新的1.5mL离心管中,加入100μL无菌水于柱膜中心,静置5min;
k.在12000rpm下离心2min,洗脱DNA;
l.收集DNA并进行检测。
PCR扩增的体系如表1所示:
表1
组分 |
体积(μL) |
正向引物 |
1 |
反向引物 |
1 |
PCR酶 |
1 |
模板 |
1 |
2×缓冲液 |
25 |
dNTPs(浓度为2mM) |
10 |
水 |
11 |
总体积 |
50 |
其中,正向引物的序列为SEQ ID No.3所示的核酸序列,反向引物的序列为SEQ IDNo.4~5之一所示的核酸序列。
SEQ ID No.3:CAGAGCTTATCCACAAAGTCACC;
SEQ ID No.4:GCACCTCCAAAGAATATACAAGCAG;
SEQ ID No.5:CTGCAAAGGCTGACATGAAGG。
正向引物的序列为SEQ ID No.3、反向引物的序列为SEQ ID No.4时扩增的程序如下:
预变性:95℃孵育3min;
循环扩增:95℃孵育15s;55℃孵育15s;68℃孵育420s;
延伸:68℃孵育5min;
循环的次数为35次。
扩增产物在4℃下保存。
正向引物的序列为SEQ ID No.3、反向引物的序列为SEQ ID No.5时扩增的程序如下:
预变性:95℃孵育3min;
循环扩增:95℃孵育15s;55℃孵育15s;68℃孵育30s;
延伸:68℃孵育5min;
循环的次数为35次。
扩增产物在4℃下保存。
(3)将所述F0代与野生型C57BL/6小鼠交配,得到F1代杂合子小鼠;
(4)将所得F1代杂合子小鼠自交,采用步骤(2)中的体系与程序,使用SEQ ID No.3~5进行PCR扩增,并对扩增产物测序鉴定,筛选出F2代AHRR基因敲除的纯合子C57BL/6小鼠,即所述的肥胖动物模型。
所述基因敲除小鼠的筛选的原理如图1所示:
野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.4扩增产物的大小为6425bp,若编辑后缺失了部分基因片段,则扩增产物片段的大小减小;因此野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ IDNo.4扩增产物的大小为6425bp,基因敲除纯合子小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.4的扩增产物小于6425bp,杂合子小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.4扩增产物中同时含有两条带;
野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.5扩增产物的大小为400bp,若编辑后缺失了部分基因片段,则缺失了部分基因片段的基因敲除纯合子小鼠无对应的扩增产物;因此野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.5扩增产物的大小为400bp,基因敲除纯合子小鼠使用SEQ ID No.3/SEQ ID No.5无扩增产物,杂合子小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.5扩增产物的大小为400bp,但条带亮度较野生型小鼠弱。
通过上述方法,本实施例成功构建了AHRR基因敲除的纯合子C57BL/6小鼠,即所述的肥胖动物模型。经测序鉴定,敲除片段为13号染色体上的74278006~74283456区域,长度为5451bp,并且在敲除的片段后插入了长度为7bp的片段。具体敲除的序列如SEQ ID No.6所示。
SEQ ID No.6:
gctactactcacaggacagacaatagtgttaacaaacacaggctagcccttctcacccagaaatccgatataagtgaactaaaatatcccataataaaagtgaactttagtgtaagtaaaaagttcaaggtcaaaagacaatattttatttggctgttctgagttttcatttctacgtagtgacctttcttttcctatgtgactggttactttttccttggtttcttttgcagagacctcttcctttacctgttgcataaacgtttccaaagattttgacttaacttctcgcgtggcaggtgttcctcttggctcatatgtcttccactacaacctataagggaaaagactcctaagcagctatacctcagtctctctcctaagcgccagagagggagacaggacatttccaactggtggtctgaaagcatcttcaatatgagcaaaacttgctcagcatttgccacctaaacatgttcctcttccggtttttctggaaaaacagtaattccatctactcaggtaccaaatcgtcaatgtctccagttggagagatttcttggactcttccctctgtgtgactccctgcctgccccactctgataattacatctgccagttctgccttctaaaatctatccagcaatcctcccagtttatccccacagtggtggtctaccttgctttaggtcctttccaccttttaccaggaccagtttctaatgattctgtttctccgtcttgcctcctatgcacaccaatttattgtccatgctgtagagaaagaaaactttttgaaagataatctgatcatgccacttgttggccccatagtaccctgagacactctcttcacaccacgctgtgattgaaggttttcctctctgtccgactcagcagtgccgactcagcagtgccgtactgtggatgactttgagccttcttaccactgtatccccagggcctaacacattagtgctgtgtgctaataaagacttgttgatcaaaggagtgaaactactttaatttaaatactttgttcttttaaaaatagaacataggagggtcaacataagagtaatctattttgtgagacaaagagagtacactgtttacattctatctattctataatgttttcttgtctaatgaattagaatacatacttttgaaaataaaaatatatttgtgaggtatcatttaatactagtgccacttacagttctagtctgcaaacaaatattttgttttaaacctctgaaattagtaacgtgtgactgagccttgtattctgttgctcaaatgagcattattttaacatttaaaatatatctcttacaattgtattattcttagttatggagatttttaattgaattatcataagcattatgaatcaacattttatttatttatttattttgagatggagtcttgctctgtcgcccaggctggagtgcagtggcatggtctcagctcactgcaacctctgcctcccaggttcaagcgatgctcttgcctcagactcctgagtagctggtactacaggtgtacaccaccatgcccagctaatttttgtaattttagtagagatgggttttgccatgttggccaggctgttctagaagtcctgacctcagatgatcctcccacgtcagcctcccaaagagctaggattacaggtgtaagccaatgtgtccaatcctatttttatatattctttaatgatgaatctatgttctatcaaaatacaattccttattgtctttaataattccattaaaaccacaaattttatattagtagttaattttaccatttaggatatgaccaacactcaaatctagttattcttaggcagaatgagagaaagtagaaagactgaagatattattattccataccttttatataacccagctttgatggatgtatggataaaatgaagccagaagcaaaggaaggagaatgatgtcacaaagacacgataaagatcccatggcggccgggtgcagtggctcacgcctgtaatcccagcactttgggaagcagaggtgggtggatcacaaggtcatgagatcgagaccatcctgtccaacatggtgaaaccccgtctctattaaaaatacaaaaattagctgggcgtggtggcacacacttgtagtcccagccacttgggaggctgaggcaggagaatcacttgaacctgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgtgccactgtactcctctagcctggcgacagagtgagactccatctcaaaacaaacaaacaaacaaacaaacaaaaccaatggcatctttaactttgcactgtcattgataatttatatgctaacacaaacagaattatgaaacacaactcatttagttatttatttaaatgaggtaataatggataggtttagaagtcttttctaaatataggaaaaaagatcaacttatttttaattgataggtttagaagtcttttctaaatataggaaaaaagatcaactgttttttaaataaaaataaggtaaaacttttaaaacaaaatttgttcaactatgtacagaatggttgcctacattccaatcattgtaaatcttaagcatgtgtgtctaaacagtaactctccatgataggttaaaatgactctcttccccattgatgaaaataagtgctacacctgcaaaacattttgttaccaatccaaattttttgttttccttgttggaggtggcactgaaacatgcttgtctgcataggcaggtgatgcttgctgcatccccccagtcaggaccaatgaccccttcagtgctgctgtagcaacctgcatagagctcgctcagggctttcctattacgtattattttatatgctggatatgtgtgaatgaggctgtctctcccaccagatttaggactccttgctgtcttcatttgtacacagcacccattacattcaaagagctgtgtgccaaacaagcactcaagagcagcctatttaattttatttaatgattaatgcttttggtccacatcttctcactggcttctaacaaaattttagtagactatggagaaagaccactctatgttaattaaagccttaaaaacagattaaagtctcttgctctctcattactttaccgtccctgaagggctgatgctgaacaggtaggtactgctgggtagacatgcataggagcacggttccagtgaagagagaagactcgtaggttatcagcaaactagtctgagaccagatataaggaaaagcataggctcgagagaaaccagagtttcaatcctggctctactgctttcctaatacctgcccatgtccacgtgccctaaccttgctcctttccagggatttacatgtgtgatgagtatatgtaaagcactcgaagaggtatgtttgtgttcaaaggtaaaaaagaaaacctgagattcacacaagtagtttgtctaagttcactaacaagttaggggccaaagagattgaaacttttgtctctggacttcaagtttggtgatatttctattatattttctaatgtctcagcagttaccaatatagctcatattcatgagctatttgatcaggacttacaaacaacttacggggagaggatttttccttgaaaaatgtcagtgtgctcttaaatgatttattatcttggcatcactaagcactatgctttatctaacaaggaacctagatgggggggtctgaaatggagctttatgtggaatgagctatttaattaatgaatacagatgtgaagtcatgaacagcagcactcactcgtctgaagttaagatctagcaaccacaagcacctgcgaacaaaaggccaccaggatgcacagctgtcacaaagcccctgattttctttgtaggaatatcctcaaaccacttcagaatctcatccagtaaatgaagatgaagattcaaattagaagcaagaaatactggaatagcagcaagaaatgatgaggcaagtaagaaagtgagaaaagacagaatctgcaatcatttaggatcgctatgtgtggaggggcgtgtgtacatatgtgtgtgtgcattccaaatatgtaatcaaatataattaatggaataaacatgtaatagtatttgatattaattacagagacttcattcatcaagagaaaaattattaaataatgtgtggtttcataaaggtagggaagatcatactctggaaaccattaaatcagaattgcttaatatttttaagtgtctatatgaataaacttccttaatgtacaaaattcagatatgaataattcctaagaaatgtgactaccttaagtttactaatttttaaggttagaggtgtatggctttcatatgaattaaaatgaatattatacaggattacctactgggcctcacaaatttatcagagaacagtatgtcaattggggatagaaaatatttccagattcatttgaacagactatttttacatattgtaattcctttgcaaaaaaaatttgattttatctttattttgccttttaaaaaattcatcattaaattgtaatattctgcagaacactgataatgtcagtgtcattgttccattttaatgtcatgtcatacatactgttagagttctagtttctcttcagaccctcttctagactagacccaacatctggttctggtgcaccatctagtggctgtaggaatcactgatgcctgaatgttacttgcttttactgcattgtagaaattactagagcatttattttttagaaaatagtgagaattctaaaaggcaaaaccaaattcacaaaattattttcttctaaaattcaaatgcaaatcagttaataagcaatagaactcttaacgtgagggaatccatagtgcataattgttttgtatagcacatatttaaatgaccatattaatttaaatggcaatgcatactcatttaagtactaatatttatttgtgaatatgcatatttatttaaatactctgtaaactgcttcatgtacagagacccacaatttagacagtggatataaataattaacctgctgacaataatgtgtatgtgatggctgagatatattttttcctttttttgacatgccttaaatgattaagcacaagcaggcattaataaactcattcaaaaatacttggtcacatcttcgtgttattatctaaactgtacactcatgaaaatatacttatttttaatttagaaaggcactcctcagcatttctttttctattctaaattctttgctaatatctagaaaatgtacctctttcaaatacctacaaatatgtttaagttactaagttgtaaataaaaagatgactgatcaggtacttatatggtacaaaaagatgaagcattaaaggcaaaattaactttctcaaagcaagtttctca。
具体插入的序列如SEQ ID No.7所示。
SEQ ID No.7:CCTAACG。
实施例5
本实施例对实施例4筛选得到的AHRR基因敲除的纯合子C57BL/6小鼠进行PCR验证,扩增的体系和方法与实施例4相同,同时使用野生型小鼠进行相同的检测作为对照。
鉴定的原理为:
野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.4扩增产物的大小为6425bp,若编辑后缺失了部分基因片段,则扩增产物片段的大小减小;因此野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ IDNo.4扩增产物的大小为6425bp,基因敲除纯合子小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.4扩增产物的大小为981bp;
野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.5扩增产物的大小为400bp,若编辑后缺失了部分基因片段,则缺失了部分基因片段的基因敲除纯合子小鼠无对应的扩增产物;因此野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.5扩增产物的大小为400bp,基因敲除纯合子小鼠使用SEQ ID No.3/SEQ ID No.5无扩增产物。
野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.4扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图片如图2A所示,野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.5扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图片如图2B所示;
AHRR基因敲除纯合子小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.4扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图片如图3A所示,AHRR基因敲除纯合子小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.5扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图片如图3B所示。
由图2A、图2B、图3A和图3B可知,野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.4扩增产物的大小为6425bp,而基因敲除纯合子小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.4扩增产物的大小为981bp;野生型小鼠的SEQ ID No.3/SEQ ID No.5扩增产物的大小为400bp,而基因敲除纯合子小鼠使用SEQ ID No.3/SEQ ID No.5无扩增产物,实验结果与预期相符,表明所得的纯合子突变体小鼠确实为AHRR基因敲除的纯合子小鼠。
实施例6
本实施例对实施例4筛选得到的AHRR基因敲除的纯合子C57BL/6小鼠进行肥胖表型的鉴定。
将野生型C57BL/6小鼠和AHRR基因敲除的纯合子C57BL/6小鼠在相同的条件下进行饲养,8个月后,对小鼠的体重及脂肪重量进行统计学分析。
图4A为AHRR基因敲除纯合子小鼠和野生型小鼠的外观对比图片,从图片可以明显看出,敲除AHRR基因的突变体纯合子小鼠的体型更大,体内脂肪含量较多,较为肥胖。
随后,分别称取AHRR基因敲除纯合子小鼠和野生型小鼠的体重,并进行统计,结果如图4B所示。由图4B可知,AHRR基因敲除小鼠与野生型小鼠的体重呈现显著性差异,突变体小鼠的体重更重。
断颈处死小鼠后,对小鼠进行解剖,取出小鼠体内的棕色脂肪进行称重,统计结果如图4C所示。由图4C可知,AHRR基因敲除的突变体小鼠的棕色脂肪重量明显高于野生型小鼠,并具有统计学意义。
综合图4A、图4B和图4C,可知AHRR基因敲除的纯合子C57BL/6小鼠的外观、体重及体内棕色脂肪重量均显著高于野生型小鼠,具有明显的肥胖表型,表明本发明所述的肥胖动物模型的构建方法科学合理,真实可信。
综上所述,本发明通过合成靶向AHRR基因的sgRNA组合,与Cas9核酸酶的mRNA组成了AHRR基因编辑系统;将所述AHRR基因编辑系统显微注射入C57BL/6小鼠受精卵的细胞核内,成功构建了重组细胞;再将重组细胞转移到代孕母鼠的体内,对出生的小鼠进行鉴定及筛选,成功筛选到了AHRR基因敲除的纯合子小鼠。所述基因突变纯合子小鼠的外观、体重及脂肪重量均明显高于野生型小鼠,可用于降糖、降脂相关药物的筛选中;所述肥胖动物模型的构建方法技术成熟,效率极高,用时较短,且降低了筛选的工作量,具有广泛的应用价值。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
ggagatntcg ccaagtncat ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
ggcacatcta ncgtnattat tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cagagcttat ccacaaagtc acc 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gcacctccaa agaatataca agcag 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctgcaaaggc tgacatgaag g 21
<210> 6
<211> 5451
<212> DNA
<213> 鼠源
<400> 6
gctactactc acaggacaga caatagtgtt aacaaacaca ggctagccct tctcacccag 60
aaatccgata taagtgaact aaaatatccc ataataaaag tgaactttag tgtaagtaaa 120
aagttcaagg tcaaaagaca atattttatt tggctgttct gagttttcat ttctacgtag 180
tgacctttct tttcctatgt gactggttac tttttccttg gtttcttttg cagagacctc 240
ttcctttacc tgttgcataa acgtttccaa agattttgac ttaacttctc gcgtggcagg 300
tgttcctctt ggctcatatg tcttccacta caacctataa gggaaaagac tcctaagcag 360
ctatacctca gtctctctcc taagcgccag agagggagac aggacatttc caactggtgg 420
tctgaaagca tcttcaatat gagcaaaact tgctcagcat ttgccaccta aacatgttcc 480
tcttccggtt tttctggaaa aacagtaatt ccatctactc aggtaccaaa tcgtcaatgt 540
ctccagttgg agagatttct tggactcttc cctctgtgtg actccctgcc tgccccactc 600
tgataattac atctgccagt tctgccttct aaaatctatc cagcaatcct cccagtttat 660
ccccacagtg gtggtctacc ttgctttagg tcctttccac cttttaccag gaccagtttc 720
taatgattct gtttctccgt cttgcctcct atgcacacca atttattgtc catgctgtag 780
agaaagaaaa ctttttgaaa gataatctga tcatgccact tgttggcccc atagtaccct 840
gagacactct cttcacacca cgctgtgatt gaaggttttc ctctctgtcc gactcagcag 900
tgccgactca gcagtgccgt actgtggatg actttgagcc ttcttaccac tgtatcccca 960
gggcctaaca cattagtgct gtgtgctaat aaagacttgt tgatcaaagg agtgaaacta 1020
ctttaattta aatactttgt tcttttaaaa atagaacata ggagggtcaa cataagagta 1080
atctattttg tgagacaaag agagtacact gtttacattc tatctattct ataatgtttt 1140
cttgtctaat gaattagaat acatactttt gaaaataaaa atatatttgt gaggtatcat 1200
ttaatactag tgccacttac agttctagtc tgcaaacaaa tattttgttt taaacctctg 1260
aaattagtaa cgtgtgactg agccttgtat tctgttgctc aaatgagcat tattttaaca 1320
tttaaaatat atctcttaca attgtattat tcttagttat ggagattttt aattgaatta 1380
tcataagcat tatgaatcaa cattttattt atttatttat tttgagatgg agtcttgctc 1440
tgtcgcccag gctggagtgc agtggcatgg tctcagctca ctgcaacctc tgcctcccag 1500
gttcaagcga tgctcttgcc tcagactcct gagtagctgg tactacaggt gtacaccacc 1560
atgcccagct aatttttgta attttagtag agatgggttt tgccatgttg gccaggctgt 1620
tctagaagtc ctgacctcag atgatcctcc cacgtcagcc tcccaaagag ctaggattac 1680
aggtgtaagc caatgtgtcc aatcctattt ttatatattc tttaatgatg aatctatgtt 1740
ctatcaaaat acaattcctt attgtcttta ataattccat taaaaccaca aattttatat 1800
tagtagttaa ttttaccatt taggatatga ccaacactca aatctagtta ttcttaggca 1860
gaatgagaga aagtagaaag actgaagata ttattattcc atacctttta tataacccag 1920
ctttgatgga tgtatggata aaatgaagcc agaagcaaag gaaggagaat gatgtcacaa 1980
agacacgata aagatcccat ggcggccggg tgcagtggct cacgcctgta atcccagcac 2040
tttgggaagc agaggtgggt ggatcacaag gtcatgagat cgagaccatc ctgtccaaca 2100
tggtgaaacc ccgtctctat taaaaataca aaaattagct gggcgtggtg gcacacactt 2160
gtagtcccag ccacttggga ggctgaggca ggagaatcac ttgaacctgg gaggcagagg 2220
ttgcagtgag ccgagatcgt gccactgtac tcctctagcc tggcgacaga gtgagactcc 2280
atctcaaaac aaacaaacaa acaaacaaac aaaaccaatg gcatctttaa ctttgcactg 2340
tcattgataa tttatatgct aacacaaaca gaattatgaa acacaactca tttagttatt 2400
tatttaaatg aggtaataat ggataggttt agaagtcttt tctaaatata ggaaaaaaga 2460
tcaacttatt tttaattgat aggtttagaa gtcttttcta aatataggaa aaaagatcaa 2520
ctgtttttta aataaaaata aggtaaaact tttaaaacaa aatttgttca actatgtaca 2580
gaatggttgc ctacattcca atcattgtaa atcttaagca tgtgtgtcta aacagtaact 2640
ctccatgata ggttaaaatg actctcttcc ccattgatga aaataagtgc tacacctgca 2700
aaacattttg ttaccaatcc aaattttttg ttttccttgt tggaggtggc actgaaacat 2760
gcttgtctgc ataggcaggt gatgcttgct gcatcccccc agtcaggacc aatgacccct 2820
tcagtgctgc tgtagcaacc tgcatagagc tcgctcaggg ctttcctatt acgtattatt 2880
ttatatgctg gatatgtgtg aatgaggctg tctctcccac cagatttagg actccttgct 2940
gtcttcattt gtacacagca cccattacat tcaaagagct gtgtgccaaa caagcactca 3000
agagcagcct atttaatttt atttaatgat taatgctttt ggtccacatc ttctcactgg 3060
cttctaacaa aattttagta gactatggag aaagaccact ctatgttaat taaagcctta 3120
aaaacagatt aaagtctctt gctctctcat tactttaccg tccctgaagg gctgatgctg 3180
aacaggtagg tactgctggg tagacatgca taggagcacg gttccagtga agagagaaga 3240
ctcgtaggtt atcagcaaac tagtctgaga ccagatataa ggaaaagcat aggctcgaga 3300
gaaaccagag tttcaatcct ggctctactg ctttcctaat acctgcccat gtccacgtgc 3360
cctaaccttg ctcctttcca gggatttaca tgtgtgatga gtatatgtaa agcactcgaa 3420
gaggtatgtt tgtgttcaaa ggtaaaaaag aaaacctgag attcacacaa gtagtttgtc 3480
taagttcact aacaagttag gggccaaaga gattgaaact tttgtctctg gacttcaagt 3540
ttggtgatat ttctattata ttttctaatg tctcagcagt taccaatata gctcatattc 3600
atgagctatt tgatcaggac ttacaaacaa cttacgggga gaggattttt ccttgaaaaa 3660
tgtcagtgtg ctcttaaatg atttattatc ttggcatcac taagcactat gctttatcta 3720
acaaggaacc tagatggggg ggtctgaaat ggagctttat gtggaatgag ctatttaatt 3780
aatgaataca gatgtgaagt catgaacagc agcactcact cgtctgaagt taagatctag 3840
caaccacaag cacctgcgaa caaaaggcca ccaggatgca cagctgtcac aaagcccctg 3900
attttctttg taggaatatc ctcaaaccac ttcagaatct catccagtaa atgaagatga 3960
agattcaaat tagaagcaag aaatactgga atagcagcaa gaaatgatga ggcaagtaag 4020
aaagtgagaa aagacagaat ctgcaatcat ttaggatcgc tatgtgtgga ggggcgtgtg 4080
tacatatgtg tgtgtgcatt ccaaatatgt aatcaaatat aattaatgga ataaacatgt 4140
aatagtattt gatattaatt acagagactt cattcatcaa gagaaaaatt attaaataat 4200
gtgtggtttc ataaaggtag ggaagatcat actctggaaa ccattaaatc agaattgctt 4260
aatattttta agtgtctata tgaataaact tccttaatgt acaaaattca gatatgaata 4320
attcctaaga aatgtgacta ccttaagttt actaattttt aaggttagag gtgtatggct 4380
ttcatatgaa ttaaaatgaa tattatacag gattacctac tgggcctcac aaatttatca 4440
gagaacagta tgtcaattgg ggatagaaaa tatttccaga ttcatttgaa cagactattt 4500
ttacatattg taattccttt gcaaaaaaaa tttgatttta tctttatttt gccttttaaa 4560
aaattcatca ttaaattgta atattctgca gaacactgat aatgtcagtg tcattgttcc 4620
attttaatgt catgtcatac atactgttag agttctagtt tctcttcaga ccctcttcta 4680
gactagaccc aacatctggt tctggtgcac catctagtgg ctgtaggaat cactgatgcc 4740
tgaatgttac ttgcttttac tgcattgtag aaattactag agcatttatt ttttagaaaa 4800
tagtgagaat tctaaaaggc aaaaccaaat tcacaaaatt attttcttct aaaattcaaa 4860
tgcaaatcag ttaataagca atagaactct taacgtgagg gaatccatag tgcataattg 4920
ttttgtatag cacatattta aatgaccata ttaatttaaa tggcaatgca tactcattta 4980
agtactaata tttatttgtg aatatgcata tttatttaaa tactctgtaa actgcttcat 5040
gtacagagac ccacaattta gacagtggat ataaataatt aacctgctga caataatgtg 5100
tatgtgatgg ctgagatata ttttttcctt tttttgacat gccttaaatg attaagcaca 5160
agcaggcatt aataaactca ttcaaaaata cttggtcaca tcttcgtgtt attatctaaa 5220
ctgtacactc atgaaaatat acttattttt aatttagaaa ggcactcctc agcatttctt 5280
tttctattct aaattctttg ctaatatcta gaaaatgtac ctctttcaaa tacctacaaa 5340
tatgtttaag ttactaagtt gtaaataaaa agatgactga tcaggtactt atatggtaca 5400
aaaagatgaa gcattaaagg caaaattaac tttctcaaag caagtttctc a 5451
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<211> 7
<212> DNA
<213> 人工
<400> 7
cctaacg 7