KR102209979B1 - 랫트의 유전자 변형 - Google Patents
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Abstract
랫트 배아줄기(ES) 세포를 비롯한, 랫트 다분화능 및 전분화능 세포의 제조를 위한 조성물 및 방법에 제공된다. 랫트에서 유전자 변형의 생식선 전이의 효율 또는 빈도를 향상시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.이와 같은 방법 및 조성물은 배양보조 세포층 및 랫트 ES 세포의 집단 또는 랫트 ES 세포주를 포함하는 체외 배양을 포함하고, 여기서 상기 체외 배양 조건은 상기 ES 세포의 다분화능을 유지하고, 마우스 백혈병 억제제 인자(LIF) 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 갖는 배지를 포함한다. 이와 같은 랫트 ES 세포주를 성립시키는 다양한 방법이 추가로 제공된다. 본원에 제공되는 유전자 변형된 랫트 ES 세포에서 형질전환 랫트를 생성하기 위한 다양한 방법과 함께, 유전자 변형된 랫트 ES 세포의 선택 방법 역시 제공된다. 제조업체의 다앙한 키트 및 물품이 추가로 제공된다.
Description
기술 분야
비-인간 다분화능, 전분화능 및 배아줄기(ES) 세포, 특히 랫트 다분화능, 전분화능 및/또는 랫트 ES 세포 및 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 랫트 다분화능, 전분화능 및 ES 세포의 제조 방법이 제공된다. 랫트 다분화능, 전분화능, 및/또는 ES 세포를 적중하는 방법이 제공된다. 랫트 세포에서 유전 변이의 생식선 전이를 달성하기 위한 방법이 제공된다. 랫트 다분화능, 전분화능 및 ES 세포를 유도, 생장 및 유지하기 위한 배지가 제공된다.
EFS-WEB을 통한 텍스트 파일로 제출된
서열 목록의 참조
본 서열 목록의 공식 사본은 ASCII (American Standard Code for Information Interchange) 표준을 따르는, EFS-Web을 통해 텍스트 파일, 파일명 441914seqlist.txt (생성 일자 2014년 2월 20일 및 크기 2 Kb)로 본 명세서와 함께 제출되었다. EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부분이며, 본원에 참조로 전체가 편입되었다.
래트는 비제한적으로 약물 발견에서의 응용을 비롯하여, 여러 응용을 위한 소중한 동물모델로 자리매김해왔다. 랫트의 유용성은 유전자 변형된 랫트 획득의 어려움, 특히 랫트의 유전자 변형 방법의 개발 및 유전자 변형 프로토콜, 예컨대, 비제한적으로 랫트 게놈 중 유전자 변형의 생식선 전이를 초래하는 프로토콜에서 사용될 수 있는 유용한 랫트 세포를 생성하는 것에서의 어려움 때문에 반감되어 왔다.
당해 기술에 유전자 변형 될 수 있고, 그래서 상기 유전자 변형가 생식선을 통해 전달될 수 있는 랫트 세포(예를 들어, 배아줄기세포)에 대한 필요성이 존재한다. 당해기술에서, 랫트에서의 유전 변이의 생식선 전이의 빈도 향상에 대한 필요성이 존재한다.
당해기술에서, F0, 또는 온전한 공여-세포 유도 F0 랫트를 생성시킬 수 있는 랫트의 다양한 변종에서 유래되는 공여 랫트 랫트 다분화능, 전분화능 및/또는 ES 세포에 대한 필요성이 존재한다. 당해기술에서, 생식선 유전자 변형을 포함하는 랫트를 생성할 수 있는 공여 랫트 다분화능, 전분화능 및/또는 ES 세포에 대한 필요성이 존재한다.
요약
랫트 배아줄기(ES) 세포를 비롯하여, 랫트 다분화능 및/또는 전분화능 세포를 제조하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 랫트에서 유전자 변형의 생식선 전이의 효율 또는 빈도를 향상시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.다양한 측면에서, 상기 방법 및 조성물은 배양보조 세포층 및 랫트 ES 세포의 집단 또는 랫트 ES 세포주를 포함하는 체외 배양을 포함하고, 여기서 체외 배양 조건은 랫트 ES 세포의 다분화능의 유지를 허용한다. 랫트 ES 세포주를 성립시키는 다양한 방법들이 추가로 제공된다. 또한 본원에 제공된 유전자 변형된 랫트 ES 세포에서 유래된 형질전환된 랫트를 생성하기 위한 다양한 방법과 함께, 유전자 변형된 랫트 ES 세포를 선택하는 방법이 제공된다. 제조업체의 다앙한 키트 및 물품이 추가로 제공된다.
비제한적 구현예는 다음과 같다:
1. ACI 또는 DA에서 선택된 변종의 단리된 랫트 ES 세포로서, 상기 단기된 랫트 ES 세포가 상기 생식선을 통해 자신의 게놈을 전이하고/전이할 수 있는 것인, 단리된 랫트 ES 세포.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 세포가 ACI 랫트에서 유도된 것인 단리된 랫트 ES 세포.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 세포가 흑색 아구티(DA) 랫트.2에서 유도된 것인 단리된 랫트 ES 세포.
4. 구현예 1, 구현예 2 또는 구현예 3에 있어서, 상기 세포가 정배수체이고 생식선을 통해 적중된 유전자 변형을 전이할 수 있는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
5. 구현예 4에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 생식선 전이 효율성이 최소한 3%인 적중된 유전자 변형을 포함하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
6. 구현예 4에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 생식선 전이 효율이 최소한 60%인 적중된 유전자 변형을 갖는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
7. 구현예 1 내지 구현예 6 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 최소한 2%의 적중 효율의 상동 재조합을 나타내는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
8. 구현예 1 내지 구현예 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 연속적인 1차례의 전기천공 이후에 상기 랫트 ES 세포가 적중된 유전자 변형을 후대로 전이할 수 있는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
9. 구현예 1 내지 구현예 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 이상의 적중된 유전자 변형을 포함하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
10. 구현예 4 내지 구현예 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 적중된 유전자 변형가 삽입, 결실, 녹아웃(knockout, 특정 유전자를 제거), 녹인, 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
11. 구현예 9에 있어서, 상기 적중된 유전자 변형가 상기 세포의 게놈으로의 이종 폴리뉴클레오티드의 최소한 하나의 삽입을 포함하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
12. 구현예 11에 있어서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드가 선택 표지를 포함하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
13. 구현예 12에 있어서, (a) 상기 선택 표지가 프로모터에 작동가능하게 결합된 비약독화된 선택 표지 유전자를 포함하거나; 또는 (b) 상기 랫트 ES 세포가 상기 선택 표지를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 최소한 2개의 복제본(copy)를 포함하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
14. 구현예 12에 있어서, 상기 선택 표지가 야생형 선택 표지와 비교하여 증가된 활성을 갖는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
15. 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 LIF 폴리펩티드, GSK3 억제제 및 MEK 억제제를 포함하는 배양 중 배양보조 세포층 상에 플레이팅되었을 경우, 구형 콜로니를 형성하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
16. 구현예 1 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가, 체외 배양될 때, 배양보조 세포층에 느슨하게 접착되는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
17. 구현예 1 내지 구현예 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 다분화능의 유지를 위해 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
18. 구현예 1 내지 구현예 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 수컷(XY) 랫트 ES 세포인 것인 단리된 랫트 ES 세포.
19. 구현예 1 내지 구현예 19에 있어서, 상기 세포가 암컷(XX) 랫트 ES 세포인 것인 단리된 랫트 ES 세포.
20. 구현예 1 내지 구현예 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가, 적중된 유전자 변형의 적중 효율 또는 생식선 전이 효율을 감소시키지 않고, GSK3 억제제 및 MEK 억제제를 포함하는 배지에서 최소한 최대 11회 계대배양될 수 있는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
21. 구현예 1 내지 구현예 20 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 또는 이들의 조합에서 선택되는 최소한 하나의 다분화능 표지를 발현하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
22. 구현예 1 내지 구현예 21 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 c-Myc, Ecat1, Rexo1 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 다분화능 표지를 발현하지 않는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
23. 구현예 1 내지 구현예 22 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 Brachyury, Bmpr2, 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 중배엽 표지를 발현하지 않는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
24. 구현예 1 내지 구현예 23 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 Gata6, Sox17, Sox7 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 내배엽 표지를 발현하지 않는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
25. 구현예 1 내지 구현예 24 중 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 Nestin, Pax6 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 신경 표지를 발현하지 않는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
26. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 Oct-4, Sox2, 알칼리성 인산가수분해효소, 또는 이들의 조합을 포함하는 다분화능 표지를 발현하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
27. 구현예 1 내지 구현예 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 하나 이상의 부착연접 관련 단백질(Adheres Junctions Associate Protein)(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존 단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터루킨 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2와 관련된 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632 또는 이들의 조합에서 선택되는 랫트 ESC-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현을 특징으로 하는 것인 단리된 랫트 ES 세포.
28. 최소한 랫트 ES 세포의 70%가 정배수체이고 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅되면, 구형 콜로니를 형성하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
29. 구현예 28에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 ACI 랫트에서 유도된 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
30. 구현예 28에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 흑색 아구티(DA) 랫트에서 유도된 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
31. 구현예 28 내지 구현예 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 자신의 게놈을 생식선을 통해 전이(transmit)할 수 있는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
32. 구현예 28 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예에서 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 최소한 3%의 적중된 유전자 변형의 생식선 전이 효율을 갖는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
33. 구현예 28 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예에서 있어서, 랫트 ES 세포가 최소한 60%의 적중된 유전자 변형의 생식선 전이 효율을 갖는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
34. 구현예 28 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예에서 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 최소한 2%의 상동 재조합의 적중 효율을 나타내는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
35. 구현예 28 내지 구현예 34 중 어느 한 구현예에서 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 1차례의 전기천공 이후, 적중된 유전자 변형을 후대에 전이할 수 있는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
36. 구현예 28 내지 구현예 35 중 어느 한 구현예에서 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 이상의 적중된 유전자 변형을 포함하고, 상기 생식선을 통해 적중된 유전자 변형을 전이할 수 있는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
37. 구현예 36에 있어서, 상기 적중된 유전자 변형가 랫트 Rosa26 유전자자리에 존재하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
38. 구현예 36에 있어서, 상기 적중된 유전자 변형가 삽입, 결실, 녹아웃, 녹인, 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
39. 구현예 36에 있어서, 상기 적중된 유전자 변형가 이종 폴리뉴클레오티드의 최소한 하나의 삽입을 상기의 세포의 게놈에 포함시키는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
40. 구현예 39에 있어서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드가 하나의 선택 표지를 포함하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
41. 구현예 40에 있어서,
(a) 상기 선택 표지가 프로모터에 작동가능하게 연결된 비-약독화된 선택 표지 유전자를 포함하거나; 또는
(b) 상기 랫트 ES 세포가 상기 선택 표지를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 최소한 2개의 복제본(copy)을 포함하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
42. 구현예 40에 있어서, 상기 선택 표지가 야생형 선택 표지와 비교하여 증가된 활성을 갖는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
43. 구현예 28 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 LIF 폴리펩티드, GSK3 억제제 및 MEK 억제제를 포함하는 배양 중 배양보조 세포층에 플레이팅되면, 구형 콜로니를 형성하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
44. 구현예 28 내지 구현예 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가, 체외 배양되면, 배양보조 세포층에 느슨하게 접착되는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
45. 구현예 28 내지 구현예 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세포가 다분화능의 유지를 위해 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
46. 구현예 28 내지 구현예 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 수컷(XY) 랫트 ES 세포인 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
47. 구현예 28 내지 구현예 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 암컷(XX) 랫트 ES 세포인 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
48. 구현예 28 내지 구현예 47 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 그것의 적중 효율 또는 적중된 유전자 변형의 생식선 전이 효율을 감소시키는 것 없이, GSK3 억제제 및 MEK 억제제를 포함하는 배지에서 최소 11회 계대배양될 수 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
49. 구현예 28 내지 구현예 48 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 또는 이들의 조합에서 선택되는 최소한 하나의 다분화능 표지를 발현하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
50. 구현예 28 내지 구현예 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 c-Myc, Ecat1, Rexo1 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 다분화능 표지를 발현하지 않는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
51. 구현예 28 내지 구현예 50 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 Brachyury, Bmpr2 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 중배엽 표지를 발현하지 않는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
52. 구현예 28 내지 구현예 51 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 Gata6, Sox17, Sox7 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 내배엽 표지를 발현하지 않는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
53. 구현예 28 내지 구현예 52 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 Nestin, Pax6 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 신경 표지를 발현하지 않는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
54. 구현예 28 내지 구현예 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 Oct-4, Sox2, 알칼리성 인산가수분해효소 또는 이들의 조합을 포함하는 다분화능 표지를 발현하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
55. 구현예 28 내지 구현예 54 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터루킨 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합 중 하나 이상에서 선택되는 랫트 ESC-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현을 특징으로 하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
56. 구현예 28 내지 구현예 55 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 집단이 최소한 104개 세포를 포함하는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
57. 구현예 28 내지 구현예 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 하기의 특징들 중하나 이상을 갖는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단:
a. 상기 랫트 ES 세포의 최소한 90%가 정배수체임;
b. 상기 랫트 ES 세포들 중 최소한 70%는 최소한 한 개의 다분화능 표지를 발현하며; 여기서 상기 최소한 한 개의 다분화능 표지는 Oct-4, Sox2, 알칼리성 인산가수분해효소 또는 이들의 조합을 포함한다;
c. 상기 랫트 ES 세포 집단에서 유래된 세포가, 랫트 숙주 배아와 조합되면, 상기 랫트 ES 세포주의 게놈을 후손에게 전이함;
d. 상기 랫트 ES 세포가, 체외배양되면, 배양보조 세포층에 느슨하게 접착됨;
e. 상기 랫트 ES 세포가 체외 배양보조 세포층에 플레이팅되면, 구형 콜로니를 형성함;(f) 상기 랫트 ES 세포가 GSK3 억제제, MEK 억제제, LIF 및 LIF를 발현하도록 유전자 변형되지 않은 배양보조 세포층을 포함하는 배지에서 체외 배양되면, 다분화능을 유지함;
f. 상기 랫트 ES 세포가 최소한 2%의 상동 재조합의 적중 효율을 나타냄;
g. 상기 랫트 ES 세포가 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않으면서 체외에서 다분화능을 유지함;
h. 상기 랫트 ES 세포의 최소한 70%가 정배수체이고 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅되면, 구형 콜로니들을 형성함;
i. 상기 랫트 ES 세포가 Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 또는 이들의 조합에서 선택되는 최소한 하나의 다분화능 표지를 발현함;
j. 상기 랫트 ES 세포가 c-Myc, Ecat1, Rexo1에서 선택되는 하나 이상의 분화 표지를 발현하지 않음;
k. 상기 랫트 ES 세포가 Brachyury, Bmpr2, 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 중배엽 표지를 발현하지 않음;
l. 상기 랫트 ES 세포가 Gata6, Sox17, Sox7, 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 내배엽 표지를 발현하지 않음; 및/또는
m. 상기 랫트 ES 세포가 Nestin, Pax6 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 신경 표지를 발현하지 않음.
58. 구현예 28 내지 구현예 57 중 어느 한 구현예에서, (a) 상기 랫트 ES 세포가 랫트 배반포에서 유도되거나; (b) 상기 랫트 ES 세포가 랫트 상실기 배아에서 유도되거나; 및/또는 (c) 상기 랫트 ES 세포주가 과배란 처리된 랫트에서 유도되는 것인 랫트 ES 세포의 단리된 집단.
59. 배양보조 세포층, 랫트 배아줄기(ES) 세포의 집단 및, 백혈병 억제 인자(LIF), GSK3 억제제 및 MEK 억제제를 포함하는 배지를 포함하는 체외 배양으로, 여기서 랫트 ES 세포의 최소한 70%가 정배수체이고, 상기 랫트 ES 세포가 구형 콜로니를 형성하는 것인 체외 배양.
60. 구현예 59 또는 구현예 60에서, 상기 랫트 ES 세포가 상기 배양보조 세포층에 느슨하게 접착된 것인 체외 배양.
61. 구현예 59, 60 또는 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 상기 생식선을 통해 자신의 게놈을 전이할 수 있는 것인 체외 배양.
62. 구현예 59, 60 또는 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 ACI 랫트에서 유도되는 것인 체외 배양.
63. 구현예 59, 60 또는 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 흑색 아구티(DA) 랫트.2에서 유도되는 것인 체외 배양.
64. 구현예 59 내지 구현예 63 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 상기 생식선을 통해 적중된 유전자 변형을 전이할 수 있는 것인 체외 배양.
65. 구현예 64에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 생식선 전이 효율이 최소한 3%인 적중된 유전자 변형을 포함하는 것인 체외 배양.
66. 구현예 64에 있어서, 상기 랫트 ES 세포가 생식선 전이 효율이 최소한 60%인 적중된 유전자 변형을 갖는 것인 체외 배양.
67. 구현예 59 내지 구현예 66 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 최소한 2%의 적중 효율의 상동 재조합을 나타내는 것인 체외 배양.
68. 구현예 59 내지 구현예 67 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 1차례의 전기천공 이후 적중된 유전자 변형을 후대에 전이할 수 있는 것인 체외 배양.
69. 구현예 59 내지 구현예 68 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 하나 이상, 둘 이상 또는 셋 이상 적중된 유전자 변형을 포함하는 것인 체외 배양.
70. 구현예 69에 있어서, 상기 적중된 유전자 변형가 삽입, 결실, 녹아웃, 녹인, 점 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 체외 배양.
71. 구현예 69에 있어서, 상기 적중된 유전자 변형가 상기 세포의 게놈으로의 이종 폴리뉴클레오티드의 최소한 하나의 삽입을 포함하는 것인 체외 배양.
72. 구현예 71에 있어서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드가 선택 표지를 포함하는 것인 체외 배양.
73. 구현예 72에 있어서, (a) 상기 선택 표지가 프로모터에 작동가능하게 연결된 비약독화된 선택 표지 유전자를 포함하거나; 또는(b) 상기 랫트 ES 세포가 상기 선택 표지를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 최소한 2개의 복제본을 포함하는 것인 체외 배양.
74. 구현예 72에 있어서, 상기 선택 표지가 야생형 선택 표지와 비교하여 증가된 활성을 갖는 것인 체외 배양.
75. 구현예 59 내지 구현예 74 중 어느 한 구현예에서, 상기 세포가 다분화능의 유지를 위해 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않는 것인 체외 배양.
76. 구현예 59 내지 구현예 75 중 어느 한 구현예에서, 상기 세포가 수컷(XY) 랫트 ES 세포인 것인 체외 배양.
77. 구현예 59 내지 구현예 75 중 어느 한 구현예에서, 상기 세포가 암컷(XX) 랫트 ES 세포인 것인 체외 배양.
78. 구현예 59 내지 구현예 77 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 그것의 적중 효율 또는 적중된 유전자 변형의 생식선 전이 효율을 감소시키지 않으면서 GSK3 억제제 및 MEK 억제제를 포함하는 배지에서 최소한 11회 계대배양될 수 있는 것인 체외 배양.
79. 구현예 59 내지 구현예 78 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 또는 이들의 조합에서 선택되는 최소한 하나의 다분화능 표지를 발현하는 것인 체외 배양.
80. 구현예 59 내지 구현예 79 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 c-Myc, Ecat1, Rexo1 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 다분화능 표지를 발현하지 않는 것인 체외 배양.
81. 구현예 59 내지 구현예 80 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 Brachyury, Bmpr2 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 중배엽 표지를 발현하지 않는 것인 체외 배양.
82. 구현예 59 내지 구현예 81 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 Gata6, Sox17, Sox7 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 내배엽 표지를 발현하지 않는 것인 체외 배양.
83. 구현예 59 내지 구현예 82 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 Nestin, Pax6 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 신경 표지를 발현하지 않는 것인 체외 배양.
84. 구현예 59 내지 구현예 83 중 어느 한 구현예에서, 상기 세포가 Oct-4, Sox2, 알칼리성 인산가수분해효소, 또는 이들의 조합을 포함하는 다분화능 표지를 발현하는 것인 체외 배양.
85. 구현예 59 내지 구현예 84 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터루킨 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합 중 하나에서 선택되는 랫트 ESC-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현을 특징으로 하는 것인 체외 배양.
86. 구현예 59 내지 구현예 84 중 어느 한 구현예에서, 상기 LIF의 농도가 50~150 U/ml인 것인 체외 배양.
87. 구현예 59 내지 구현예 85 중 어느 한 구현예에서, 상기 LIF의 농도가 100 U/ml인 것인 체외 배양.
88. 구현예 59 내지 구현예 87 중 어느 한 구현예에서, 상기 LIF가 마우스에서 유래되었거나 또는 서열식별 번호: 1과 최소한 92% 서열 동일성을 포함하는 것인 체외 배양.
89. 구현예 59 내지 구현예 88 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포가 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않으면서 다분화능을 유지할 수 있는 것인 체외 배양.
90. 구현예 59 내지 구현예 89 중 어느 한 구현예에서, 상기 배양보조 세포층이 유전자 변형되어 LIF를 발현하지 않는 것인 체외 배양.
91. 구현예 59 내지 구현예 90 중 어느 한 구현예에서, 상기 배양보조 세포층이 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)의 단일층을 포함하는 것인 체외 배양.
92. 구현예 59 내지 구현예 91 중 어느 한 구현예에서, 상기 MEK 억제제가 PD0325901을 포함하는 것인 체외 배양.
93. 구현예 59 내지 구현예 92 중 어느 한 구현예에서, 상기 GSK-3 억제제가 CHIR99021을 포함하는 것인 체외 배양.
94. 구현예 59 내지 구현예 93 중 어느 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포의 집단이 랫트 배반포기 배아 또는 랫트 상실기 배아에서 유도되는 것인 체외 배양.
95. 구현예 94에 있어서, 상기 배반포기 또는 상실기 랫트 배아가 비정질 미분화 질량의 랫트 ES 세포의 파생물을 추가로 포함하는 것인 체외 배양.
96. 구현예 94에 있어서, 상기 상기 랫트 ES 세포의 집단이 비정질 미분화 질량의 랫트 ES 세포의 단리된 파생물을 포함하는 것인 체외 배양.
97. 랫트 배아줄기(ES) 세포주를 생성하는 방법으로, 상기 방법이 (a) 제1 배양보조 세포층 및 상실기 또는 배반포기 랫트 배아를 체외에서 배양하는 단계(상실기 또는 배반포기 랫트 배아의 투명대가 제거되었고, 상기 배양 조건들이 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하고 마우스 백혈병 억제제 인자(LIF) 또는 서열식별 번호:1과 최소한 91% 서열 동일성을 갖고 LIF 활성을 갖는 서열, 및 GSK3 억제제 및 MEK 억제제를 갖는 배지를 포함함); 및 (b) 비정질 미분화 질량의 랫트 ES 세포의 파생물을 체외 배양 웰에 전달하면서 동시에 제 2 배양보조 세포층을 포함시켜, 마우스 LIF 또는 마우스 LIF의 활성 변이체를 갖는 배지를 포함하는 조건 하에서 상기 파생물을 배양하는 단계를 포함함으로써, 상기 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하고, 이것으로부터 랫트 ES 세포주를 성립시키는 것인 방법.
98. 구현예 97에 있어서, 상기 랫트 ES 세포주가 최소한 5회 계대배양되는 것인 방법.
99. 구현예 97 또는 구현예 98에 있어서, 상기 랫트 ES 세포주가 최소한 10회 계대배양되는 것인 방법.
100. 구현예 97, 98 또는 99 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 배지가 마우스 LIF를 약 50 U/ml 내지 약 150 U/ml 포함하는 것인 방법.
101. 구현예 97 내지 구현예 100 중 어느 한 구현에에서, 상기 배지가 약 100 U/ml의 마우스 LIF를 포함하는 것인 방법.
102. 구현예 97 내지 구현예 101 중 어느 한 구현에에서, 상기 배양보조 세포층이 유전자 변형되어 LIF를 발현하지 않는 것인 방법.
103. 구현예 97 내지 구현예 102 중 어느 한 구현에에서, 상기 배양보조 세포층이 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)의 단일층을 포함하는 것인 방법.
104. 구현예 97 내지 구현예 103 중 어느 한 구현에에서, 상기 MEK 억제제가 PD0325901을 포함하는 것인 방법.
105. 구현예 97 내지 구현예 104 중 어느 한 구현에에서, 상기 GSK-3 억제제가 CHIR99021을 포함하는 것인 방법.
106. 구현예 97 내지 구현예 105 중 어느 한 구현에에서, (a) 상기 랫트 ES 세포주가 ACI 랫트에서 유도된 것이거나 또는 흑색 아구티(DA) 랫트에서 유도된 것; (b) 상기 랫트 ES 세포주가 상실기 또는 배반포기 랫트 배아에서 유도된 것; 및/또는 (c) 상기 랫트 ES 세포주가 과배란 처리된 랫트에서 유래된 상실기 또는 배반포기 배아에서 유도된 것인 방법.
107. 구현예 97 내지 구현예 106 중 어느 한 구현에에서, 상기 배지가 FGF 수용체 억제제, ROCK 억제제 또는 ALK 억제제 중 최소한 하나를 추가로 포함하는 것인 방법.
108. of 구현예 107에 있어서, 상기 FGF 수용체 억제제가 PD184352를 포함하거나, 상기 ROCK 억제제가 Y-27632를 포함하거나, 또는 상기 ALK 억제제가 A-83-01을 포함하는 것인 방법.
109. 구현예 97 내지 구현예 108 중 어느 한 구현에에서, 최소한 하나의 랫트 ES 세포가 상기 적중된 유전자 변형의 생식선 전이 효율이 최소한 3%인 것인 방법.
110. 구현예 97 내지 구현예 109 중 어느 한 구현에에서, 상기 적중된 유전자 변형의 생식선 전이 효율이 최소한 60%인 것인 방법.
111. 이종 폴리뉴클레오티드를 게놈에 안정적으로 편입시킨 랫트 배아줄기(ES) 세포를 선택하는 방법으로, 상기 방법이 (a) 랫트 ES 세포의 체외 집단을 제공하고; (b) 프로모터 활성 랫트 ES 세포에 작동가능하게 연결된 선택 표지를 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 최소한 하나의 랫트 ES 세포에 도입하고; 및(c) 제1 및 제2 배지를 바꿔가면서, 상기 랫트 ES 세포 집단을 체외에서 배양하는 것을 포함하고, 여기서 제1 배지는 제1 기간 동안 선택 제제의 유효량을 포함하고, 제2 배지는 상기 선택 제제를 포함하지 않고, 체외 배양 조건이 다분화능을 유지하기에 충분함으로써; 게놈에 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 통합시키는 랫트 ES 세포를 선택할 수 있는 것인 방법.
112. 구현예 111에 있어서, 상기 제1 및 제2 배지가 24시간마다 교체되는 것인 방법.
113. 구현예 111 또는 구현예 112에 있어서, 상기 선택 표지가 항생제에 대한 내성을 갖는 것인 방법.
114. 구현예 111 내지 구현예 113 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항생제가 G418을 포함하는 것인 방법.
115. 구현예 111 내지 구현예 114 중 어느 한 구현예에서, 상기 선택 표지가 네오마이신 인산전달 효소(neor), 히그로마이신 B 인산전달 효소(hygr), 퓨로마이신-N-아세틸전달효소(puror), 블라스티시딘 S 탈아미노효소(bsrr), 크산틴/구아닌 포스포리보실 전달효소(gpt) 및 단순포진 바이러스 티미딘 인산화효소(HSV-k), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
116. 구현예 111 내지 구현예 115 중 어느 한 구현예에서, (a) 상기 선택 표지가 야생형 선택 표지와 비교하여, 증가된 활성을 갖고; 및/또는(b) 상기 선택 표지의 다수의 복제본이 상기 랫트 ES 세포의 게놈에 안정적으로 편입되는 것인 방법.
117. 구현예 116에 있어서, 상기 선택 표지가 비약독화된 선택 표지인 것인 방법.
118. 단리된 랫트 배아줄기(ES) 세포를 유전자 변형하는 방법으로, 상기 방법이 구현예 1 내지 구현예 58 중 어느 한 구현에의 단리된 랫트 ES 세포의 게놈에 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하여 유전자 변형된 랫트 ES 세포를 형성하는 것을 포함하는 것인 방법.
119. 유전자 변형된 랫트를 제조하는 방법으로, 상기 방법이:
(a) 구현예 1 내지 구현예 58 중 어느 한 구현에의 단리된 랫트 배아줄기(ES) 세포의 게놈에 이종 폴리뉴클레오티드을 도입하여 유전자 변형을 갖는 랫트 ES 세포를 형성하고;
(b) 적중된 유전자 변형을 포함하는 최소한 하나의 랫트 ES 세포를 랫트 숙주 배아에 도입하여 F0 배아를 생산하고;
(c) 상기 F0 배아를 대리모에 이식시키고;
(d) 상기 F0 배아를 출산 시까지 대리모가 품고 있게 하고; 및(e) 상기 적중된 유전자 변형을 갖는 F0 랫트를 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
120. 구현예 119에 있어서, 수컷F0 랫트를 야생형 암컷 랫트와 교배시켜 적중된 유전자 변형에 대해 이형접합적인 F1 후대를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
121. 구현예 120에 있어서, 수컷F0 랫트를 야생형 암컷 랫트와 교배시켜 적중된 유전자 변형에 대해 이형접합적인 F1 후대를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
122. 구현예 119에 있어서, F1 후대 중 수컷 랫트를 F1 후대 중 암컷 랫트와 교배시켜 유전자 변형에 동형접합적인 F2 후대를 획득하는 단계를 포함하는 방법.
123. 구현예 119 내지 구현예 122 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 유전자 변형을 갖는 F0 랫트의 최소한 3%가 유전자 변형을 F1 후대에 전이하는 것인 방법.
124. 구현예 119 내지 구현예 123 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 유전자 변형을 갖는 F0 랫트 중 최소한 10%가 상기 유전자 변형을 상기 F1 후대에 전이하는 것인 방법.
125. 구현예 119 내지 구현예 124 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 유전자 변형을 갖는 F0 랫트 중 최소한 60%가 상기 유전자 변형을 상기 F1 후대에 전이하는 것인 방법.
126. 구현예 119 내지 구현예 125 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 유전자 변형된 랫트 ES 세포가 랫트 숙주 배아와 동일한 랫트 변종에서 유래된 것인 방법.
127. 구현예 119 내지 구현예 127 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 유전자 변형된 랫트 ES 세포가 랫트 숙주 배아와 상이한 랫트 변종에서 유래된 것인 방법.
128. 청구항 1 내지 청구항 128 중 어느 한 청구항의 랫트 ES 세포의 단리된 집단, 청구항 1 내지 청구항 128 중 어느 한 청구항의 체외 배양 또는 청구항 1 내지 청구항 128 중 어느 한 청구항의 방법으로, 상기 집단 중 랫트 ES 세포가 하기를 포함한다:
(a) 상기 랫트 ES 세포의 최소한 90%가 정배수체이고;
(b) 상기 랫트 ES 세포의 최소한 70%가 최소한 하나의 다분화능 표지를 발현하고(최소한 하나의 다분화능 표지가 Oct-4, Sox2, 알칼리성 인산가수분해효소, 또는 이들의 조합을 포함하고);
(c) 랫트 숙주 배아와 조합될 경우, 상기 랫트 ES 세포 집단에서 유래된 세포가 상기 랫트 ES 세포주의 게놈을 후손에게 전이하고;
(d) 체외에서 배양되면, 상기 랫트 ES 세포가 배양보조 세포층에 느슨하게 접착되고;
(e) 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅되면, 상기 랫트 ES 세포가 구형 콜로니를 형성하고;
(f) GSK3 억제제, MEK 억제제, LIF 및 유전자 변형되어 LIF를 발현하지 않는 배양보조 세포층를 포함하는 배지에서 체외 배양된 경우, 상기 랫트 ES 세포가 다분화능을 유지하고;
(g) 상기 랫트 ES 세포가 최소한 2%의 상동 재조합의 적중 효율을 나타내고;
(h) 상기 랫트 ES 세포가 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않으면서 체외에서 다분화능을 유지하고;
(i) 상기 랫트 ES 세포의 최소한 70%가 정배수체이고 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅되면, 구형 콜로니를 형성하고;
(j) 상기 랫트 ES 세포가 Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 또는 이들의 조합에서 선택되는 최소한 하나의 다분화능 표지를 발현하고;
(k) 상기 랫트 ES 세포가 c-Myc, Ecat1, Rexo1에서 선택되는 하나 이상의 분화 표지를 발현하지 않고;
(l) 상기 랫트 ES 세포가 Brachyury, Bmpr2 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 중배엽 표지를 발현하지 않고;
(m) 상기 랫트 ES 세포가 Gata6, Sox17, Sox7 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 내배엽(endomermal) 표지를 발현하지 않고; 및/또는
(n) 상기 랫트 ES 세포가 Nestin, Pax6 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 신경 표지를 발현하지 않는다.
도면의 간략한 설명
본 특허 또는 출원 파일에 색으로 실행된 최소한 하나의 도면이 함유되었다. 컬러 도면(들)이 첨부된 본 특허 또는 특허출원 공보의 복사본들은 요청 및 필요한 비용의 지불 시, 관련 당국에 제공될 것이다.
도 1은 접시에서 정기적으로 떨어져나가 부유하는 조밀한 구형 콜로니들로 성장하는 rESCs를 나타낸다.
도 2a~2d는 rESCs에 의해 발현되는 다양한 다분화능 표지를 묘사하고, 2a는 Oct-4(초록); 2b는 Sox-2(빨강); 2c는 DAPI(파랑); 2d는 rESCs에 의해 발현되는 다분화능 표지들의 오버레이(overlay)를 나타낸다.
도 3은 rESCs가 가벼운 수준의 알칼리성 인산가수분해효소(다분화능 표지)(왼쪽)를 발현하고, 선 DA.2B에 대한 핵형(karyotype)은 42X,Y(오른쪽)임을 나타낸다. rESCs가 종종 사배체가 되기 때문에 핵형분석이 완성되었다; 세포주는 중기 염색체 전개의 개수를 셈으로써, 사전검사를 받고, 가장 정상적인 개체수를 갖는 세포주가 이어서 공식적으로 개 핵형분석되었다.
도 4는 도 1의 rESC의 좀 더 근접한 모습을 나타낸다.
도 5는 배반포 주입 및 rESC 게놈의 전이에 의한 키메라 생산을 나타낸다; 모체(parental) ACI.G1 rESC를 사용하는 배반포 주입에 의해 생산된 키메라; 고 비율의 키메라가 일반적으로 알비노 주둥이를 갖는다.
도 6은 도 5에서 별표(*)가 달린 ACI/SD 키메라에 의한 후손인, 알비노 한배 새끼들 F1 아구티 새끼들을 나타낸다.
도 7 패널 A는 마우스에서와 마찬가지로, 동일한 이격거리로, Setd5와 Thumpd3 유전자 사이에 놓인 랫트 Rosa 26 유전자자리의 적중을 나타낸다. 패널 A는 마우스 Rosa 26 유전자자리의 구조를 나타낸다. mRosa26 전사물은 2 또는 3개의 엑손으로 구성된다. 패널 B는 rRosa26 유전자자리의 구조를 묘사하고; 상기 랫트 유전자자리는 마우스 엑손1 (Ex1b)에 대한 상동 엑손과 더불어 두 번째 엑손1 (Ex1a)을 함유하고; 랫트에서 세 번째 엑손은 확인되지 않았다. 패널 C는 적중된 rRosa26 대립형질 유전자를 묘사하고; 각각 5kb 길이의 상동 염기서열이 DA rESC의 게놈 DNA를 사용한 PCR에 의해 복제되었고; 적중된 대립형질 유전자가 rRosa26 인트론의 117bp 결실을 대체하는 SA-lacZ-hUB-neo 카세트를 함유한다.
도 8a는 X-gal로 처리된, 14주령 야생형 랫트의 대조군 뇌를 나타낸다. 대조군 뇌는 LacZ에 대해 낮은 수준의 배경 염색을 나타내었다(등 부분).
도 8b는 rRosa26 이형접합적 랫트(14주령)의 뇌에서의 LacZ 발현을 나타낸다. lacZ 리포터가 rRosa26 이형접합체의 뇌 전반에 걸쳐 보편적으로 발현되었다.
도 8c는 X-gal로 처리된, 14주령 야생형 랫트의 대조군 심장 및 가슴샘(삽화)을 나타낸다. 상기 대조군 심장 및 가슴샘은 LacZ에 대해 낮은 수준의 배경 염색을 나타내었다.
도 8d는 14주령 rRosa26 이형접합적 랫트의 심장과 가슴샘(삽화) 에서의 LacZ 발현을 나타낸다. lacZ 리포터가 rROSA26 이형접합체의 심장 및 가슴샘 전반에서 보편적으로 발현되었다.
도 8e는 X-gal로 처리된, 14주령 야생형 랫트의 대조군 폐를 나타낸다. 대조군 폐가 LacZ에 대해 낮은 수준의 배경 염색을 나타내었다.
도 8f는 14주령 rRosa26 이형접합체 랫트의 폐에서의 LacZ 발현을 나타낸다. lacZ 리포터가 rRosa26 이형접합체의 폐 전반에서 보편적으로 발현되었다.
도 8g 및 h는 e12.5 배아에서의 LacZ 발현을 나타낸다. 낮은 수준의 배경 LacZ 염색을 나타내는 야생형 대조군 배아(H)와 대조적으로, 상기 rRosa26 이형접합적 배아는 상기 배아 전체에서 LacZ 리포터의 보편적 발현을 보였다.
도 8i 및 8j는 e14.5 배아에서의 LacZ 발현을 나타낸다. 낮은 수준의 배경 LacZ 염색을 나타내는 야생형 대조군 배아(j)와 대조적으로, 상기 rRosa26 이형접합적 랫트 배아는 상기 배아 전체에서 LacZ 리포터의 보편적 발현을 보였다.
도 9a-b는 ACI.G1 랫트 ES 세포주의 염색체 개수의 분석을 나타내는 사진을 제공한다.
도 10a-b는 DA.2B 랫트 ES 세포주의 염색체 개수의 분석을 나타내는 사진을 제공한다.
도 11a-b는 DA.C2 랫트 ES 세포주의 염색체 개수의 분석을 나타내는 사진을 제공한다.
상세한 내용
본 방법 및 조성물이, 상기 방법 및 조성물의 전부는 아니지만, 일부인 구현예가 나타난, 첨부된 도면과 관련하여, 이후 좀 더 자세히 설명될 것이다. 사실상, 이와 같은 방법 및 조성물은 여러 다른 형태로 구현될 수 있기에, 본원에 제시된 구현예에 국한되는 것으로 여겨져서는 안 되고; 오히려, 이와 같은 구현예들이 제공됨으로써 본 개시가 해당 법적 요구사항을 충족시킬 것이다. 유사 숫자는 전반적으로 유사 요소를 가리킨다.
본원에 제시된 방법 및 조성물의 여러 변형 및 기타 구현예는, 앞서 설명 및 관련 도면에 제시된 지침의 혜택을 갖는 본 방법 및 조성물이 관련된 당해기술의 숙련가에게 익숙할 것이다. 따라서, 상기 방법 및 조성물은 본원에 개시된 특정 구현예에 국한되지 않으며, 변형 및 기타 구현예가 첨가된 청구항의 범위 내에 포함됨이 이해될 것이다. 구체적인 용어들이 본원에서 사용되지만, 일반적으로 설명을 위해서만 사용될 뿐, 제한하기 위해 사용되는 것은 아니다.
I. 개요
래트는 오랜 동안 심혈관 질환, 대사, 독물학, 신경생물학 및 행동학과 같은 여러 생의학 연구 분야에서 선호되는 설치류 모형 생명체였다. 랫트의 수백 가지 변종이 개발되어 왔고; 일부는 고혈압, 당료 및 암과 같은 복잡한 인간 질병을 위한 우수한 모형이다. 그러나, 이들 모형의 유전체계를 이해하는 것의 진전은 통제방식으로 랫트 게놈을 변형시키는 것의 어려움에 의해 상당히 방해되어 왔다. 위치-특이적 엔도뉴클레아제의 사용을 통해, 관심대상의 유전자에서 변이체를 생산하는 것이 가능하지만, 이와 같은 방법은 여전히 부정확하고 비용이 많이 든다. 랫트 ES 세포의 적중 및 생식선 전이는 여전히 달성하기 어려운 과제이다.
랫트의 두 가지 근친교배한 변종에서 랫트 ES 세포(rESC)의 단리가 본원에 기술된다. DA 및 ACI 변종에서 유래된 rESC가 유도되었다. 이와 같은 세포들은 다분화능 표지를 발현하고, 정상적인 42X,Y 핵형을 보인다. 높은 비율의 키메라가 배반포 단계에서 SD 숙주 배아로의 미량주입법에 의해 생산되어 왔고, rESC 게놈의 전이가 양쪽 변종에 있어 생식선을 통해 이루어진다는 것이 입증되어 왔다. 플라스미드 적중 벡터를 사용하여, 본 발명가들은 ROSA26 유전자자리의 랫트 동등체에서 적중된 변이체를 생산해왔고, 양쪽 변종에서 적중된 대립형질 유전자의 생식선 전이를 달성해 왔다. 이와 같은 이형접합적 동물들은 연구한 모든 단계의 모든 조직에서 lacZ를 발현한다.
다양한 측면에서, ACI 공여 ES 세포에서 바람직하게 많은 수컷 후대를 획득하기 위해, ES 세포가 ACI 변종에서 유도되었다. 한 구현예에서, 수컷후대의 양은 약 50%이다.
다양한 측면에서, 주로 암컷후대를 획득하기 위해 ES 세포가 DA 변종에서 유도되었다.
II.
랫트
배아줄기
(
ES
) 세포
다양한 조성물 및 방법이 본원에 제공되고, 이것은 랫트에서 유래된 배아줄기(ES) 세포를 포함한다. 줄기 세포는 무한대의 자기재생 능력을 보유한 세포 집단으로 다분화능을 갖는다. "배아줄기세포" 즉 "ES 세포"는 배아 또는 태아에서 획득한 줄기 세포를 포함한다. 본원에 제시된 다양한 랫트 ES 세포는 다음의 특성들 중 하나 이상을 가질 수 있다;
(a) 생식선 역량을 갖는다(상기 랫트 ES 세포가 랫트 숙주 배아에 이식될 때, 상기 랫트 ES 세포주의 게놈이 후손에 전이됨을 뜻한다);
(b) 최소한 하나의 적중된 유전자 변형 이후에 생식선 역량을 갖는다(적중된 유전자 변형을 갖는 상기 랫트 ES 세포가 랫트 숙주 배아에 이식되었을 때, 랫트 ES 세포주의 게놈 내의 적중된 유전자 변형가 후손에 전이됨을 뜻한다);
(c) 체외에서 다분화능을 갖는다;
(d) 체외에서 전분화능을 갖는다;
(e) 체외에서 배양되면, 배양보조 세포층에 느슨하게 접착된다;
(f) 체외에서 배양될 경우, 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅되면, 구형 콜로니를 형성한다;
(g) 유전자 변형되어 백혈병 억제제 인자(LIF)를 발현하지 않는 배양보조 세포층을 포함하는 조건 하에 체외에서 배양될 때(상기 배지는 충분한 농도의 LIF를 포함한다), 다분화능을 유지한다;
(h) 배양보조 세포층을 포함하는 조건 하에 체외에서 배양될 때(상기 배지는 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 포함한다), 다분화능을 유지한다;
(i) 하기의 특징을 갖는 분자 서명(molecular signature)를 포함한다
i) 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터류린 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합을 포함하는 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현;
ii) 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터류린 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합을 포함하는 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상의 발현;
iii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 14에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
iv) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 14에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
v) 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현;;
vi) 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현;
vii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
viii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
ix) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표12에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 감소; 및/또는
x) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 12에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현의 최소한 20배 감소;
xi) 항목 (i)-(x)의 랫트 ES 세포-특이적 유전자의 발현의 모든 조합;
xii) 상기 나열된 다분화능 표지 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 대해, 표 15에 표시된 다분화능 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 다분화능 순위열 참조;
xiii) 상기 나열된 중배엽 표지 중 최소한 2, 3 또는 4개에 대해, 표 15에 표시된 중배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 중배엽 순위열 참조;
xiv) 상기 나열된 내배엽 표지 중 최소한 2, 3, 4, 5 또는 6개에 대해, 표 15에 표시된 내배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 내배엽 순위열 참조;
xv) 상기 나열된 신경 표지 중 최소한 2 및 3개에 대해, 표 15에 표시된 신경 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 신경 순위열 참조;
xvi) 상기 나열된 영양외배엽 표지에 대해, 표 15에 표시된 영양외배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 영양외배엽 순위열;
xvii) 표 15에 제시된 다분화능 표지, 중배엽 표지, 내배엽 표지, 신경 표지 및/또는 영양외배엽 표지 중 하나 이상(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,2 4, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 모든 상대적 발현 수준;
xviii) 표 15에 제시된 표지들 각각의 상대적 발현 수준;
xix) 항목 xii-xiix에 제시된 표지들의 모든 조합; 및/또는
xx) 항목 i-xiix에 제시된 표지의 모든 조합;
(j) F0 랫트 생산 능력을 갖는다;
(k) 계대배양될 수 있고 미분화 상태를 유지할 수 있다;
(l) 정상적인 랫트 세포와 동일한 수의 염색체를 갖는다;
(m) 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않으며 체외에서 다분화능을 유지한다; 및/또는
(n) 자기재생이 가능하다(다분화능을 유지하면서, 무한대로 분열한다).
(a)-(n)에 개요가 서술된 특징들 중 하나 이상이 본원에 제시된 단리된 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포 집단 또는 랫트 ES 세포주에 존재할 수 있다(상기 랫트 ES 세포는 적중된 유전자 변형을 거치지 않음). 다른 구현예에서, (a)-(n)에 개요가 서술된 하나 이상의 특징들이 하나 이상의 적중된 유전자 변형을 갖는, 본원에 제시된 단리된 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포 집단 랫트 ES 세포주에 존재할 수 있다. 적중된 유전자 변형는 상기 랫트 ES 세포의 게놈에서의 변형을 포함하고, 예를 들어 삽입, 결실, 녹아웃, 녹인, 변이체 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 경우들에서는, 상기 적중된 유전자 변형가 랫트 ES 세포의 게놈으로의 이종 폴리뉴클레오티드의 최소한 하나의 삽입을 포함한다. 이와 같은 적중된 유전자 변형의 추가적인 설명이 본원의 다른 곳에서 논의된다.
특정 구현예에서, 본원에 제시된 다양한 랫트 ES 세포 및 세포주는 생식선 역량(competent)이 있다(상기 랫트 ES 세포가 랫트 숙주 배아에 이식된 경우, 상기 랫트 ES 세포의 게놈이 후손에 전이됨을 뜻한다). 상기 랫트 ES 세포가 적중된 유전자 변형을 겪지 않았을 경우, 이와 같은 상기 후손(즉, F1 집단)으로의 전이가 발생할 수 있다. 또한, 적중된 유전자 변형을 갖는 랫트 ES 세포 역시 생식선 역량을 갖는다(적중된 유전자 변형 를 갖는 상기 랫트 ES 세포가 랫트 숙주 배아에 이식되면, 상기 랫트 ES 세포의 적중된 유전자 변형가 상기 후손(즉, F1 집단)에 전이됨을 뜻한다). 따라서, 다양한 측면에서, 상기 랫트 ES 세포 및 본원에 기술된 방법이 활용되어 적중된 유전자 변형을 겪지 않은 랫트 ES 세포 및 적중된 유전자 변형을 겪은 랫트 ES 세포 모두에서 유래된 랫트 세포 게놈의 높은 빈도 또는 높은 효율의 생식선 전이를 획득할 수 있다. 다양한 구현예에서, 생식선 전이의 빈도는 1:600보다 크거나, 1:500보다 크거나, 1:400 보다 크거나, 1:300 보다 크거나, 1:200보다 크거나, 1:100 보다 크다. 다양한 구현예에서, 생식선 전이의 빈도는 1%보다 크거나, 2%보다 크거나, 3%보다 크거나, 4%보다 크거나, 5%보다 크거나, 6%보다 크거나, 7%보다 크거나, 8%보다 크거나, 9%보다 크거나, 10%보다 크거나, 최대 약 16%이거나, 25%보다 크거나, 50%보다 크거나, 60%보다 크거나, 65%보다 크거나, 70%보다 크거나, 75%보다 크거나 그 이상이다. 다양한 구현예에서, 생식선 전이의 빈도 범위는 9% 내지 16%이다. 다양한 측면에서, F1 생성에서의 공여 rESC-유도 후대의 비율은 1%이상, 2%이상, 3%이상, 10%이상, 20%이상, 30%이상, 40%이상, 50%이상, 60%이상, 3% 내지 약 10%이상; 3% 이상 내지 약 63%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 65%, 또는 약 40% 내지 70%이다. 따라서, 본원에 제시된, 적중된 유전자 변형을 겪지 않은 랫트 ES 세포 또는, 선택적으로, 적중된 유전자 변형을 갖는 랫트 ES 세포는 그들의 게놈을 F1 집단에 전이하는 능력을 갖는다.
적중된 유전자 변형을 겪지 않은 랫트 ES 세포 또는 적중된 유전자 변형을 갖는 랫트 ES 세포는 다분화능 및/또는 전분화능을 보유할 수 있다. "다분화능" 또는 "다분화능"은 세 가지 배엽: 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 중 하나로 분화할 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 가리킨다. 세포능은 다른 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포의 능력을 묘사하는 일반적인 용어이다. 예를 들어, Hans 등(2007). "The Potential of Stem Cells: An Inventory". Human biotechnology as Social Challenge. Ashgate Publishing, Ltd. p. 28, (본원에 참조로 편입됨) 참조. 용어 "전분화능" 또는 "전분화능"은 하나의 생명체에서 분열되어 모든 분환된 세포를 생산할 수 있는 단일 세포의 능력이다. 예를 들어, Western P (2009). Int . J. Dev . Biol. 53 (2-3): 393-409, (본원에 참조로 편입됨) 참조. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 다양한 ES 세포는 다분화능 및/또는 전분화능이다.
랫트 ES 세포의 다분화능 여부를 확인하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 ES 세포는 비제한적으로, Oct-4, Sox2, 알칼리성 인산가수분해효소, 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 다분화능 표지의 발현에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어 이와 같은 표지의 존재 또는 수치의 다양한 분석 방법은 Okamoto, K. 등, Cell, 60: 461-472 (1990), Scholer, H. R. 등, EMBO J. 9: 2185-2195 (1990)) and Nanog (Mitsui, K. 등, Cell, 113: 631-642 (2003), Chambers, I. 등, Cell, 113: 643-655 (2003) 참조. 또한 본원에 제시된 도 2 및 도 3 참조. 기타 다분화능 표지는, 예를 들어 Nanog, Klf4, Dppa2, Fgf4, Rex1, Eras, Err-베타 및/또는 Sall3을 포함하는 최소한 1, 2, 3, 4 또는 5개의 다분화능 표지의 존재를 포함한다. 기타 다분화능 표지는, 예컨대, T/Brachyury, Flk1, Nodal, Bmp4, Bmp2, Gata6, Sox17, Hhex1, Sox7, 및/또는 Pax6을 포함하는 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 다분화능 표지의 부재를 포함한다.
특정 구현예에서, 이들 표지의 발현 및/또는 발현 수준이 RT-PCR을 사용하여 결정될 수 있다. 알칼리성 인산가수분해효소의 수치 및/또는 존재를 결정하기 위해, 예컨대 ALP 조직 염색 키트(Sigma) 및 벡터 레드 알칼리성 인산가수분해효소 기재 키트 I(Funakoshi) 등을 비롯한 다양한 키트를 사용할 수 있다. 추가적인 분석법에는 가시적분자결합화, 면역조직화학, 면역 형광법이 포함된다.특정 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 예를 들어 발현 of Oct-4, Sox2, 알칼리성 인산가수분해효소, 또는 이들의 조합 및, 바람직하게는 이들 세 가지 표지 모두의 발현을 포함하여, 최소한 하나의 다분화능 표지의 발현을 특징으로 한다.
본원에 제시된 다양한 랫트 ES 세포(즉, 적중된 유전자 변형을 겪지 않은 랫트 ES 세포 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 랫트 ES 세포)는 체외 배양 조건에서 유지되면서 다분화능 및/또는 전분화능을 유지할 수 있다. 따라서, 본원에 제시된 다양한 랫트 ES 세포는, 일부 구현예에서, 여전히 미분화 상태를 유지하면서, 계대배양될 수 있다. 랫트 ES 세포의 다양한 배양 방법이 본원의 다른 곳에서 좀 더 상세히 다뤄진다.
본원에 제시된 랫트 배아줄기세포는, 본원의 다른 곳에서 상세히 다뤄지는 다양한 단리, 정제 및 배양 확장 기법들을 활용하여 랫트 배아에서 단리되었다. 본원에서 사용되는 용어 "세포"는 개별 세포, 세포주, 또는 이와 같은 세포에서 유도된 배양을 가리킨다. "단리된" 랫트 ES 세포 또는 랫트 배아는 이것의 자연적 환경으로부터 분리된 것이다. 용어 "단리된"은 한 성분이 그것의 자연 상태에서 함께 발견되는 구성 성분들의 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 자유롭다는 것을 의미할 수 있다. 본원에 사용되는 랫트 ES "세포주"는 단일 랫트 ES 세포에서 개발된 단리된 랫트 세포의 집단을 포함하고, 따라서 소정의 세포주 내의 세포의 집단은 증식 중 또는 적중된 유전자 변형 중 발생하는 돌연변이 또는 핵형의 변화의 경우 이외에 균일한 유전자 구성을 갖는다. 예를 들어, 다른 곳에 명시된 바와 같이, 상기 개시된 랫트 ES 세포는 높은 수치의 정배수체를 특징으로 한다. 그럼에도 불구하고, 일부 세포주에서는, 정배수체의 수치가 단일 세포로부터 세포주의 증식에서의 핵형의 변화 때문에 100% 미만이다.게다가, 랫트 ES 세포의 소정의 집단은 최소한 10 exp 3, 10 exp4, 10x104, 10x105, 10x106, 10x107, 10x108, 10x109, 또는 10x1010개 또는 그 이상의 세포를 포함한다. 일부 세포 집단은 바람직하게 변이된 세포의 선택을 허용할 만큼 충분한 세포를 갖는데, 그러나 세포주에서 발달되는 돌연변이 또는 핵형의 변화의 가능성을 감소시킬 만큼 과도하게 많은 양은 아니다. 예를 들어, 일부 세포 집단은 10exp3 내지 10exp6 세포를 갖는다.
본원의 다른 곳에서 다뤄지는 바와 같이, 랫트 ES 세포주의 적중된 유전자 변형을 위해 다양한 방법이 제공된다. 이런 방법이 실행될 때, 랫트 ES 세포주 내의 최소한 하나의 세포는 적중된 유전자 변형을 함유한다. 다양한 배양 및/또는 선택 기법을 통해, 하나 이상의 바람직한 적중된 유전자 변형을 갖는 랫트 ES 세포주가 생산된다.
특정 구현예에서, 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포 또는 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)의 집단은 정배수체이고, 따라서 반수체 개수의 정확한 배수인 염색체 수를 갖는다. 추가적인 구현에에서, 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포 또는 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)의 집단은 이배수체이고, 따라서 상동 염색체의 반수체 세트 2개를 갖는다. 랫트 ES 세포 집단 또는 랫트 ES 세포 또는 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)의 소정의 집단에서 유래된 세포의 집단을 가리킬 경우, 소정의 집단 내 세포의 최소한 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 정배수체 및/또는 이배수체이다. 다른 경우들에서는, 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주 (적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)에서의 세포의 집단을 가리킬 경우, 상기 소정의 집단 내 세포의 최소한 약 50% 내지 95%, 약 60% 내지 90%, 약 60% 내지 95%, 약 60% 내지 85%, 약 60% 내지 80%, 약 70% 내지 80%, 약 70% 내지 85%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 98%, 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 95%가 정배수체 및/또는 이배수체이다.
또 다른 추가의 구현예에서, 랫트 ES 세포, 또는 랫트 ES 세포 또는 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)의 집단은 42개 염색체를 갖는다. 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)에서 유래된 세포의 집단을 가리킬 경우, 소정의 집단 내 세포의 최소한 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 42개 염색체를 갖는다. 다른 경우들에서는, 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)에서 유래된 세포의 집단을 가리킬 경우, 소정의 집단 내 세포의 최소한 약 50% 내지 95%, 약 60% 내지 90%, 약 60% 내지 95%, 약 60% 내지 85%, 약 60% 내지 80%, 약 70% 내지 80%, 약 70% 내지 85%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 98%, 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 95%가 42개 염색체를 갖는다.
추가적인 구현에에서, 본원에 제시된 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포 또는 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)의 집단이 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅되면 구형 콜로니를 형성한다."구형" 형태는 개별 ES 세포의 형태보다, 오히려 배양에서의 랫트 ES 세포의 형태를 가리킨다. 상기 랫트 ES 세포 콜로니는 구형이다. 상기 배양보조 세포에 느슨하게 접착된 콜로니는 원형(원형 형태)이다. 자유-부유 콜로니는 구형이다. 상기 랫트 ES 세포 콜로니는 구형으로 아주 조밀하다(세포들 사이의 경계선이 거의 보이지 않음을 뜻한다). 콜로니의 가장자리는 밝고 선명하게 보인다. 개별 핵들은 상기 세포가 너무 작아서(상기 핵이 상기 세포의 부피의 대부분을 차지한다), 구분하기 어렵다.마우스 ES 세포는 타원형 콜로니를 형성하고, 배양보조 세포에 강하게 접착된다. mESC 형태는 변종에 따라 다를 수 있다; 예컨대, B6 콜로니는 F1H4 콜로니보다 좀 더 둥글고 좀 더 돔 형태면서, rESC보다 좀 더 타원형이 된다. 인간 ES 세포 콜로니는 mESC 콜로니보다 더 납작하고 더 많이 퍼져 있다상기 즉석 랫트 ES 콜로니는 납작하지 않고 인간 ES 세포 콜로니와 유사하지 않다.
또 다른 추가 구현예에서, 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포 또는 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 가진 것)의 집단은 원형을 갖는다. 원형의 척도는 아래 제시되는데, 10점은 완전한 원형을 의미하고, 1점은 타원형을 의미한다.
원형의 척도:
10=상기 구조의 중심을 통과하며 길이가 같은 가로축 및 세로축을 갖는 구조의 원형.
9 = 상기 구조의 중심을 통과하며, 두 축 중 한 축이 다른 축의 길이의 0.9999 내지 0.9357인 것인 구조.
8 = 상기 구조의 중심을 통과하는 가로축과 세로축을 갖고, 두 축 중 한 축이 다른 축의 길이의 0.9357 내지 0.875인 구조.
7 = 상기 구조의 중심을 통과하는 가로축과 세로축을 갖고, 두 축 중 한 축이 다른 축의 길이의 0.875 내지 약 0.8125인 구조.
6 = 상기 구조의 중심을 통과하는 가로축과 세로축을 갖고, 두 축 중 한 축이 다른 축의 길이의 0.8125 내지 0.750인 구조.
5 = 상기 구조의 중심을 통과하는 가로축과 세로축을 갖고, 두 축 중 한 축이 다른 축의 길이의 0.750 내지 0.6875인 것인 구조.
4 = 상기 구조의 중심을 통과하는 가로축과 세로축을 갖고, 두 축 중 한 축이 다른 축의 길이의 0.6875 내지 0.625인 것인 구조.
3 = 상기 구조의 중심을 통과하는 가로축과 세로축을 갖고, 두 축 중 한 축이 다른 축의 길이의 0.625 내지 0.5625인 것인 구조.
2= 상기 구조의 중심을 통과하는 가로축과 세로축을 갖고, 두 축 중 한 축이 다른 축의 길이의 0.5625 내지 0.523인 것인 구조.
1= 상기 구조의 중심을 통과하는 가로축과 세로축을 갖고, 두 축 중 한 축이 다른 축의 길이의 0.523 내지 0.500이라고 정의되는 타원형.
하나의 비제한적 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)에서 유래된 세포의 집단은 상기 소정의 집단 내 세포의 최소한 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 10, 9 또는 8점의 원형을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 가진 것)에서 유래된 세포의 집단은 상기 소정의 집단 내 세포의 최소한 약 50% 내지 95%, 약 60% 내지 90%, 약 60% 내지 95%, 약 60% 내지 85%, 약 60% 내지 80%, 약 70% 내지 80%, 약 70% 내지 85%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 98%, 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 95%가 10, 9 또는 8점의 원형을 갖는다.
또 다른 비제한적 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포 집단 또는 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 가진 것)에서 유래된 세포의 집단은 상기 소정의 집단 내 세포의 최소한 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 7, 6, 5, 4 또는 3점의 원형을 갖는다. 다른 비제한적 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 가진 것)에서 유래된 세포의 집단은 소정의 집단 내 세포의 최소한 약 50% 내지 95%, 약 60% 내지 90%, 약 60% 내지 95%, 약 60% 내지 85%, 약 60% 내지 80%, 약 70% 내지 80%, 약 70% 내지 85%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 98%, 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 95%가 7, 6, 5, 4 또는 3점의 원형을 갖는다.
또 다른 추가 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 가진 것)가 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅된 경우, 구형 콜로니가 형성된다. 구형의 척도는 아래 제시되는데, 10점은 완전한 구를 의미하고, 1점은 입체적 타원형 구조를 의미한다.
구형 구조의 형태 척도:
10= X-축 및 Y-축 그리고 Z-축을 가지며, 이들 각각이 상기 구조의 중심을 통과하고, 길이가 같은 구조를 갖는 구.
9 = 상기 구조의 중심을 통과하는 X 축, Y-축 및 Z-축을 갖고, 세 축 중 하나의 축이 다른 축 중 적어도 하나의 축의 길이의 0.9999 내지 0.9357인 것인 구조.
8 = 상기 구조의 중심을 통과하는 X 축, Y-축 및 Z-축을 갖고, 세 축 중 하나의 축이 다른 축 중 적어도 하나의 축 또는 양쪽 축의 길이의 0.9357 내지 0.875인 것인 구조.
7 = 상기 구조의 중심을 통과하는 X 축, Y-축 및 Z-축을 갖고, 세 축 중 하나의 축이 다른 축 중 적어도 하나의 축 또는 양쪽 축의 길이의 0.875 내지 0.8125인 것인 구조.
6 = 상기 구조의 중심을 통과하는 X 축, Y-축 및 Z-축을 갖고, 세 축 중 하나의 축이 다른 축 중 적어도 하나의 축 또는 양쪽 축의 길이의 0.8125 내지 0.750인 것인 구조.
5 = 상기 구조의 중심을 통과하는 X 축, Y-축 및 Z-축을 갖고, 세 축 중 하나의 축이 다른 축 중 적어도 하나의 축 또는 양쪽 축의 길이의 0.750 내지 0.6875인 것인 구조.
4 = 상기 구조의 중심을 통과하는 X 축, Y-축 및 Z-축을 갖고, 세 축 중 하나의 축이 다른 축 중 적어도 하나의 축 또는 양쪽 축의 길이의 0.6875 내지 0.625인 것인 구조.
3 = 상기 구조의 중심을 통과하는 X 축, Y-축 및 Z-축을 갖고, 세 축 중 하나의 축이 다른 축 중 적어도 하나의 축 또는 양쪽 축의 길이의 0.625 내지 0.5625인 것인 구조.
2= 상기 구조의 중심을 통과하는 X 축, Y-축 및 Z-축을 갖고, 세 축 중 하나의 축이 다른 축 중 적어도 하나의 축 또는 양쪽 축의 길이의 0.5625 내지 0.523인 것인 구조.
1= 상기 구조의 중심을 통과하는 X 축, Y-축 및 Z-축을 갖고, 세 축 중 하나의 축이 다른 축 중 적어도 하나의 축 또는 양쪽 축의 길이의 0.523 내지 0.500인 것인 구조.
하나의 비제한적 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주 (적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)에서 유래된 세포의 집단은, 상기 세포가 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅되는 경우, 형성되는 콜로니의 최소한 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 10, 9 또는 8점의 구형을 갖는다. 다른 구현예에서, 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 가진 것)에서 유래된 세포의 집단은, 상기 세포가 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅된 경우, 형성되는 콜로니의 최소한 약 50% 내지 95%, 약 60% 내지 90%, 약 60% 내지 95%, 약 60% 내지 85%, 약 60% 내지 80%, 약 70% 내지 80%, 약 70% 내지 85%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 98%, 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 95%가 10, 9 또는 8점의 구형을 갖는다.
또 다른 비제한적 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주 (적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 가진 것)에서 유래된 세포의 집단은, 상기 세포가 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅된 경우, 형성되는 콜로니의 최소한 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 7, 6, 5, 4 또는 3점의 구형을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포 집단 또는 소정의 랫트 ES 세포주(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 가진 것)에서 유래된 세포의 집단은 상기 세포가 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅된 경우 형성되는 콜로니의 최소한 약 50% 내지 95%, 약 60% 내지 90%, 약 60% 내지 95%, 약 60% 내지 85%, 약 60% 내지 80%, 약 70% 내지 80%, 약 70% 내지 85%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 98%, 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 95%가 7, 6, 5, 4 또는 3점의 구형을 갖는다.
본원에 제시된 소정의 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포의 집단 또는 랫트 ES 세포주는 수컷(XY) 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포의 수컷(XY) 집단 또는 수컷(XY) 랫트 ES 세포주일 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 제시된 랫트 ES 세포의 집단 또는 랫트 ES 세포주는 암컷(XX) 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포의 암컷(XX) 집단, 또는 암컷(XX) 랫트 ES 세포주일 수 있다. 이와 같은 랫트 ES 세포, 랫트 ES 세포의 집단 또는 랫트 ES 세포주는 앞에서 기술된 바와 같이, 정배수체 및/또는 이배수체를 포함할 수 있다.
본원에 제시된 다양한 랫트 ES 세포는 모든 랫트 변종, 예컨대, 비제한적으로, ACI 랫트 변종, 흑색 아구티(DA) 랫트 변종, Wistar 랫트 변종, LEA 랫트 변종, Sprague Dawley(SD) 랫트 변종, 또는 Fisher F344 또는 Fisher F6과 같은 Fischer 랫트 변종에서 유래될 수 있다. 상기의 다양한 랫트 ES 세포는 또한 앞서 언급된 둘 이상의 변종의 혼합물에서 유도된 변종에서 획득될 수도 있다. 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 DA 변종 및 ACI 변종에서 선택되는 하나의 변종에서 유도된다. 구체적 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 ACI 변종에서 유도된다. 상기 ACI 랫트 변종은 배와 발이 하얗고 RT1 av1 haplo유형인 검정 아구티를 갖는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 변종은 다양한 공급원, 예컨대 Harlan Laboratories에서 구매할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 다양한 랫트 ES 세포는 아구티 코트 및 RT1 av1 haplo유형을 갖는 것을 특징으로 하는 흑색 아구티(DA) 랫트 변종에서 유래된다. 이와 같은 랫트는 다양한 공급원, 예컨대 Charles River 및 Harlan Laboratories에서 구매할 수 있다. 추가 구현예에서, 본원에 제시된 상기 다양한 랫트 ES 세포는 근친교배한 랫트 변종에서 유래된다.
특정 구현예에서 상기 랫트 ES 세포주는 ACI 랫트에서 유래되고 본원에 기술된 ACI.G1 랫트 ES 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포주는 DA 랫트에서 유래되고, 본원에 기술된 DA.2B 랫트 ES 세포주 또는 DA.2C 랫트 ES 세포주를 포함한다.
본원에 제시된 소정의 랫트 ES 세포는 랫트 배아의 모든 발달단계에서의 랫트 배아에서 획득될 수 있다. 랫트 배아 발달의 대표적 단계가 아래 표 1에 개략적으로 제시되었다. 상기 랫트 ES 세포를 유도하기 위해 활용되는 랫트 배아는 상실기 배아, 배반포기 배아, 또는 상실기 배아 및 배반포기 배아 사이의 발단 달계에 위치한 랫트 배아일 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 활용된 상기 랫트 배아는 Witschi 단계 5 및 7에 또는 이들 사이에 위치한다. 다른 구현예에서, 활용된 상기 랫트 배아는 Witschi 단계 5, 6 또는 7에 위치한다.
한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 랫트 배반포에서 획득된다. 다른 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 과배란 처리된 랫트의 배반포에서 획득된다. 다른 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 이것이 상실기, 배반포 단계, Witschi 단계 5 내지 7 사이의 배아, 또는 Witschi 단계 5, 6 또는 7의 단계로 발달될 때까지 체외에서 배양되는 8-세포 단계 배아에서 획득된다. 상기 배아가 플레이팅되는 시점.상실기 배아는 내부 빈공간이 없는 조밀한 구형 세포를 포함한다. 배반포기 배아는 가시적인 내부 빈공간(포배강)이 있고 내부 세포 질량(ICM)을 함유한다 ICM 세포는 ES 세포를 형성한다.
표 1. 랫트 배아 발단 단계
추가로 하기의 특징을 갖는 다양한 랫트 ES 세포(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 갖는 것)가 제시된다.
상기 랫트 ES 세포는 다음과 같은 특징을 갖는다:
i) 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터류린 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합을 포함하는 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현;
ii) 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터류린 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합을 포함하는 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상의 발현;
iii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 14에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
iv) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 14에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
v) 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현;;
vi) 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현;
vii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
viii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
ix) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 12에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 감소; 및/또는
x) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 12에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현의 최소한 20배 감소;
xi) 항목 (i)-(x)의 랫트 ES 세포-특이적 유전자의 발현의 모든 조합;
xii) 상기 나열된 다분화능 표지 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 대해, 표 15에 표시된 다분화능 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 다분화능 순위열 참조;
xiii) 상기 나열된 중배엽 표지 중 최소한 2, 3 또는 4개에 대해, 표 15에 표시된 중배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 중배엽 순위열 참조;
xiv) 상기 나열된 내배엽 표지 중 최소한 2, 3, 4, 5 또는 6개에 대해, 표 15에 표시된 내배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 내배엽 순위열 참조;
xv) 상기 나열된 신경 표지 중 최소한 2 및 3개에 대해, 표 15에 표시된 신경 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 신경 순위열 참조;
xvi) 상기 나열된 영양외배엽 표지에 대해, 표 15에 표시된 영양외배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 영양외배엽 순위열;
xvii) 표 15에 제시된 다분화능 표지, 중배엽 표지, 내배엽 표지, 신경 표지 및/또는 영양외배엽 표지 중 하나 이상(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,2 4, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 모든 상대적 발현 수준;
xviii) 표 15에 제시된 표지들 각각의 상대적 발현 수준;
xix) 항목 xii-xiix에 제시된 표지들의 모든 조합; 및/또는
xx) 항목 i-xiix에 제시된 표지들의 모든 조합.
한 구현예에서, 전-상실기 랫트 배아에 이식된 경우, 상기 랫트 ES 세포(적중된 유전자 변형을 겪지 않은 것 및/또는 적중된 유전자 변형을 가진 것)는 F0 생성에서 상기 세포의 최소한 90%에 이겨할 수 있고, F0 생성에서 상기 세포의 최소한 95%에 기여할 수 있고, F0 생성에서 상기 세포의 최소한 96%에 기여할 수 있고, F0 생성에서 상기 세포의 최소한 97%에 기여할 수 있고, F0 생성에서 상기 세포의 최소한 98%에 기여할 수 있고, 또는 F0 생성에서 상기 세포의 최소한 99%에 기여할 수 있다.
III.
랫트
배아줄기
(
ES
) 세포의 유도 및 증식
본원에 개시된 랫트 ES 세포를 획득하기 위해 다양한 방법들이 제시된다. 특정 구현예에서, 이와 같은 방법은 (a) 배양보조 세포층 및 단리된 랫트 배아줄기(ES) 세포의 집단을 포함하는 체외 배양을 제공하는 단계; (b) 상기 단리된 랫트 ES 세포의 다분화능 및/또는 전분화능을 유지하게 충분한 조건 하에 체외 배양하는 단계를 포함한다. 따라서 이와 같은 방법은 랫트 ES 세포 집단 및/또는 랫트 ES 세포주의 증식을 가능하게 한다.
한 구현예에서, 랫트 배아줄기 세포주를 배양하는 방법이 제시된다. 이와 같은 방법은 체외에서 배양보조 세포층 및 랫트 ES 세포주를 배양하는 단계(상기 배양 조건은 상기 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하며 마우스 백혈병 억제제 인자(LIF) 또는 그것의 활성 변종 또는 절편을 갖는 배지를 포함한다)를 포함한다. 상기 다양한 방법은 추가로 세포 상기 랫트 ES 세포주의 세포를 체외에서 계대배양 및 배양하는 단계를 추가로 포함한다(각각의 차후 체외 배양은 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하고 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 갖는 배지를 포함하는 조건 하에 상기 배양보조 세포층에서 상기 랫트 ES 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
i
. 배양 조건들
상기의 다양한 방법 및 조성물에 활용되는 배지는 랫트 ES 세포를 유지할 것이다. 용어 "유지하다" 및 "유지"는 본원에 개략적으로 제시된 랫트 ES 세포의 특징들 또는 표현형 중 최소한 하나 이상의 안정적인 보존을 가리킨다. 이와 같은 표현형에는 본원에 기술된 랫트 줄기 세포의 다분화능 및/또는 전분화능, 세포 형태, 유전자 발현 프로파일 및 기타 기능적 특징들을 유지하는 것이 포함될 수 있다. 용어 "유지하다"는 또한 줄기 세포의 증식, 즉, 배양된 줄기 세포의 개체수의 증가를 아우를 수 있다. 상기 용어는 추가로 줄기 세포가 계속 분열하여 그 수가 증가하거나, 또는 그렇지 않은 동안, 여전히 다분화능을 갖도록 하는 배양 조건을 의미한다.
용어 "배양보조 세포" 또는 "배양보조 세포층"은 체외에서 자라서, 상기 배양 내 관심 대상인 다른 세포의 성장을 지원하기 위해 사용되는 배지에 최소한 하나의 인자를 분비하는 세포의 배양을 가리킨다. 본원에 활용되는 배양보조 세포는 랫트 ES 세포의 다분화능을, 특정 구현예에서, 본원에 기술된 기타 특징들 또는 표현형을 유지하는 데 일조한다. 다양한 배양보조 세포가 사용될 수 있는데, 예컨대 마우스 배아 섬유아세포(임신 제12 및 제16일 사이에 획득된 마우스 배아 섬유아세포 포함)가 포함된다. 특정 구현예에서, 배양보조 세포층은 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)의 단일층을 포함한다.
상기 랫트 ES 세포의 체외 배양은 추가로 백혈병 억제제 인자(LIF) 또는 이것의 활성 변종 또는 절편의 유효량을 포함한다. 백혈병 억제 인자(LIF)는 IL-6 수용체 계열에 속한다. LIF는 LIF-특이적 하부단위, gp190 또는 LIFR, IL-6 계열의 다른 구성원과 공유되는 하위단위 gp130로 이루어진 이형이량체 막 수용체에 결합한다. LIF는 마우스에서 배아줄기세포의 분화를 억제하고, 줄기 세포의 자기 재생에 기여한다. 인간 및 마우스 LIF는 서열 상동 79%를 공유하고, 교차종 활성을 보인다. 랫트 LIF(rtLIF)는 쥣과 LIF와 91% 아미노산 서열 동일성을 보이는 202개 아미노산 잔기 함유 22.1 kDa 단백질이다(Takahama등 1998). 다양한 종에서 유래된 LIF 폴리펩티드 사이에서 보존될 수 있는 6개 아스파라긴-연결 글리코실화반응(N-글리코실화반응) 위치 및 랫트 LIF에 특이적인 Asn150의 추가적 위치가 존재한다. 마우스 LIF의 3차 구조 및 그것의 기능이 Aikawa등(1998) Biosci . Biotechnol . Biochem . 62 1318-1325 and Senturk등(2005) Immunology of Pregnancy, editor Gil Mor., US Patent No. 5,750,654 및 D P Gearing(1987) EMBO Journal 1987-12-20(각각은 그 전체가 본원에 참조로 편입되었다)에 좀 더 상세히 기술되었다. 부분적 마우스 LIF 서열이 승인번호 P09056로 SwissProt웹사이트에 보고되었다.
마우스 LIF 활성이 M1 골수 백혈병 세포의 분화를 유도하는 능력으로 평가된다. 특이적 활성은 1 x 106 units/ml(Cat. No. 03-0011, Stemgent) 및 1 x 107 units/ml(Cat. No. 03-0011-100, Stemgent)이고, 여기서 50 units은 배지 1 ml에서 M1 콜로니 중 50%에서 분화를 유도하기 위해 필요한 마우스 LIF의 양으로 정의된다. 또한Williams, R.L. 등(1988) Nature 336: 684-687.; Metcalf, D. 등 (1988) Leukemia 2: 216-221; Niwa, H. 등 (2009) Nature 460: 118-122; Xu, J. 등 (2010) Cell Biol Int . 34: 791-797; Fukunaga, N. 등 (2010) Cell Reprogram. 12: 369-376; and, Metcalf D. (2003) Stem Cells 21: 5-14, (이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 편입됨) 참조. "LIF의 유효량"은 체외 배양의 랫트 ES 세포가 미분화 다분화능 상태로 유지되도록 하는 LIF의 농도를 포함한다. 다분화능 상태로 유지되는 세포에 대한 검증을 위해 사용될 수 있는 다양한 표지가 본원의 다른 곳에서 다뤄진다.
본원에 제시된 다양한 방법 및 조성물에 활용되는 LIF 폴리펩티드는 다양한 생명체 예컨대, 포유류, 설치류, 인간, 랫트 또는 마우스에서 유래될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 LIF 폴리펩티드는 마우스에서 유래된다. 또 다른 추가 구현예에서, 상기 마우스 LIF 폴리펩티드는 SwissProt 승인 번호: P09056로 제시된 아미노산 서열을 포함하는데, 이는 그 전체가 참조로 본원에 편입되었고, 또한 서열식별 번호: 1에 제시된다.
다른 구현예에서, 서열식별 번호: 1 또는 SwissProt승인 번호: P09056에 제시된 마우스 LIF 폴리펩티드의 활성 변종 또는 절편이 사용될 수 있다. 이와 같은 활성 변종 및 절편(서열식별 번호: 1과 최소한 75%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 활성 변종)이 본원의 다른 곳에서 좀 더 상세히 다뤄진다.
LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편은 다양한 방식으로 체외 배양에 제공될 수 있다. 한 구현예에서, LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편의 유효량이 상기 배지에 첨가된다. 다른 구현예에서, 배양보조 세포가 유전자 변형되어 LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 과발현하였다. 이와 같은 배양보조 세포는 기질-관련 LIF를 발현하는, 감마선 조사된 또는 미토마이신-C 처리된 DIA-M 마우스 섬유아세포에서 제조된 배양보조 세포를 포함한다. 이와 같은 유전자 변형된 배양보조 세포를 생성하고 사용하는 방법은, 예를 들어 Buehr 등 (2003) Biol Reprod 68:222-229, Rathjen 등 (1990) Cell 62 1105-1115, and Buehr 등 (2008) Cell 135:1287-1298, (각각이 본원에 참조로 편입됨)에서 찾아볼 수 있다. 상기 배양보조 세포에서 발현된 이종 LIF는 배양보조 세포와 동일한 생명체 또는 배양보조 세포와 상이한 생명체에서 유래될 수 있다. 또한, 상기 배양보조 세포에서 발현되는 이종 LIF는 배양보조층이 지지하는 ES 세포와 동일한 또는 상이한 생명체에서 유래될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 다양한 방법에서 활용되는 상기 배양보조 세포는 유전자 변형되어 이종 LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 발현하지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, 상기 방법에서 활용되는 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 단일층이 유전자 변형되어 이종 LIF 폴리펩티드를 발현한 적이 없다.
다른 구현예에서, 상기 LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편이 상기 배지에 첨가된다. LIF가 상기 배지에 첨가될 때, 상기 LIF는 포유류, 설치류, 인간, 랫트 또는 마우스를 비롯한 모든 생명체에서 유래될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 배지에 존재하는 LIF는 마우스에서 유래된 것이다. 또 다른 추가 구현예에서, 상기 마우스 LIF 폴리펩티드는 서열식별 번호:1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.. 다른 구현예에서, 서열식별 번호:1에 제시된 마우스 LIF 폴리펩티드의 활성 변종 또는 절편이 사용될 수 있다. 이와 같은 활성 변종 및 절편(서열식별 번호: 1과 최소한 75%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 활성 변종)이 본원의 다른 곳에서 좀 더 상세히 다뤄진다.
특정 구현예에서, 본원에 제시되는 상기 랫트 ES 세포 및 랫트 ES 세포주는 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않으면 체외에서 다분화능을 유지한다.
특정 구현예에서, LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편이 랫트 ES 세포를 유지하는 모든 농도로 상기 배지에 존재한다. LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편이 약 25U/ml 내지 약 50U/ml, 약 50U/ml 내지 약 100U/ml, 약 100U/ml 내지 약 125U/ml, 약 125U/ml 내지 약 150U/ml, 약 150U/ml 내지 약 175U/ml, 약 175U/ml 내지 약 200U/ml, 약 200U/ml 내지 약 225U/ml, 약 225U/ml 내지 약 250U/ml, 약 250U/ml 내지 약 300U/ml, 내지 약 300U/ml 내지 약 325U/ml, 약 325U/ml 내지 약 350U/ml, 약 350U/ml 내지 약 400U/ml, 약 400U/ml 내지 약 425U/ml, 약 425U/ml 내지 약 450U/ml, 약 450U/ml 내지 약 475U/ml, 약 475U/ml 내지 약 500U/ml, 약 75U/ml 내지 약 500U/ml 또는 그 이상의 농도로 상기 배지에 존재한다. 다른 구현예에서, LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편이 약 25U/ml 내지 약 50U/ml, 약 25U/ml 내지 약 100U/ml, 약 75U/ml 내지 약 125U/ml, 약 50U/ml 내지 약 150U/ml, 약 90U/ml 내지 약 125U/ml, 약 90U/ml 내지 약 110U/ml, 약 80U/ml 내지 약 150U/ml, 약 80U/ml 내지 약 125U/ml의 농도로 상기 배지에 존재한다. 구체적 구현예에서, LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편이 약 100U/ml의 농도로 상기 배지에 존재한다.
마우스 LIF가 활용되는 경우, 상기 마우스 LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편은 상기 랫트 ES 세포를 유지하는 모든 농도로 배지에 존재한다. 마우스 LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편이 약 25U/ml 내지 약 50U/ml, 약 50U/ml 내지 약 100U/ml, 약 100U/ml 내지 약 125U/ml, 약 125U/ml 내지 약 150U/ml, 약 150U/ml 내지 약 175U/ml, 약 175U/ml 내지 약 200U/ml, 약 200U/ml 내지 약 225U/ml, 약 225U/ml 내지 약 250U/ml, 약 250U/ml 내지 약 300U/ml, 내지 약 300U/ml 내지 약 325U/ml, 약 325U/ml 내지 약 350U/ml, 약 350U/ml 내지 약 400U/ml, 약 400U/ml 내지 약 425U/ml, 약 425U/ml 내지 약 450U/ml, 약 450U/ml 내지 약 475U/ml, 약 475U/ml 내지 약 500U/ml, 약 75U/ml 내지 약 500U/ml 또는 그 이상의 농도로 존재한다. 다른 구현예에서, 마우스 LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편이 약 25U/ml 내지 약 50U/ml, 약 25U/ml 내지 약 100U/ml, 약 75U/ml 내지 약 125U/ml, 약 50U/ml 내지 약 150U/ml, 약 90U/ml 내지 약 125U/ml, 약 90U/ml 내지 약 110U/ml, 약 80U/ml 내지 약 150U/ml, 약 80U/ml 내지 약 125U/ml의 농도로 존재한다. 구체적 구현예에서, 마우스 LIF 폴리펩티드 또는 이것의 활성 변종 또는 절편이 배지 약 100U/ml의 농도로 배지에 존재한다.
활용된 배지는 랫트 ES 세포를 유지한다. 이와 마찬가지로, 특정 구현예에서, 상기 다양한 방법 및 조성물에 활용된 배지는 최소한 5, 10 또는 15회 계대배양의 기간 동안 세포주 중의 랫트 ES 세포의 전부 또는 대부분(즉, 50% 이상)의 다분화능을 유지한다. 한 구현예에서, 상기 배지는 다분화능의 유지에 도움을 주는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 배지는 MEK 경로 억제제 및 글리코겐 합성효소 키나아제-3(GSK-3) 억제제를 포함한다.상기 배지는 추가로 ES 세포의 유지에 도움을 주는 추가적 성분들, 예컨대, 예를 들어 FGF 수용체 억제제, ROCK 억제제, 및/또는 ALK(TGFb 수용체) 억제제를 포함할 수 있다. FGF 수용체 억제제의 비제한적인 예에는 PD184352이 포함된다. ROCK 억제제의 비제한적인 예에는 Y-27632가 포함되고, ALK(TGFb 수용체) 억제제의 비제한적인 예에는 A-83-01이 포함된다. 특정 구현예에서, 동결보존된 rESC를 해빙하거나 또는 트립신으로 분해 후 rESC를 다시 플레이팅할 때, 2i 배지(표 2)가 10 μMROCKi와 사용된다.
다른 구현예에서, 상기 배지는 MEK 경로 억제제 및 글리코겐 합성효소 키나아제-3(GSK-3) 억제제로 이루어진 억제제의 조합을 포함한다.
하나의 비제한적 구현예에 있어서, 상기 배지는 CHIR99021을 포함하는 GSK-3 억제제를 포함하고 및/또는 PD0325901을 포함하는 MEK 억제제를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 배지는 CHIR99021 및 PD0325901로 이루어진 억제제의 조합을 포함한다. 이들 화합물들 중 하나는 예를 들어, Stemgent에서 획득될 수 있다. 특정 구현예에서, CHIR99021은 약 0.5μ 내지 약 3 μM, 약 0.5μ 내지 약 3.5μM, 약 0.5μM 내지 약 4 μM, 약 0.5μM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 1.5μM, 약 1.5μM 내지 약 2μM, 약 2μM 내지 약 2.5μM, 약 2.5 내지 약 3μM, 3μM 내지 약 3.5 μM의 농도로 상기 배지에 존재한다. 추가적인 구현에에서, CHIR99021은 약 3mM의 농도로 상기 배지에 존재한다. 다른 구현예에서, PD0325901은 약 0.4μM 내지 약 1μM, 약 0.4μM 내지 약 1.5μM, 약 0.4μM 내지 약 2μM, 약 0.4μM 내지 약 0.8μM, 0.8μM 내지 약 1.2μM, 약 1.2 내지 약 1.5μM의 농도로 상기 배지에 존재한다. 추가적인 구현에에서, PD0325901은 약 1μM의 농도로 상기 배지에 존재한다. 특정 구현예에서, CHIR99021은 약 3μM의 농도로 상기 배지에 존재하고, PD0325901은 약 1μM의 농도로 존재한다.
하나의 비제한적 구현예에 있어서, 본원에 개시된 다양한 방법 및 조성물에 활용되는 상기 배지는 표 2에 제시된다. 본 출원의 문맥 내에서, 표 2에 기술된 배지는 2i 배지라 일컫는다.
| 시약 | 농도 |
| DMEM/F12 기본 배지 | 1x (50%) |
| 신경기본 배지 | 1x (50%) |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 1% |
| L-글루타민 | 4 mM |
| 2-메르캅토에탄올 | 0.1 mM |
| N2 보충제 | 1x |
| B27 보충제 | 1x |
| LIF | 100 U/ml |
| PD0325901 (MEK 억제제). | 1mM |
| CHIR99021 (GSK 억제제). | 3 mM |
활용될 수 있는 추가적 배지에는 Li 등 (2008) Cell 135:1299-1310, Yamamoto 등 (2012) Transgenic Rats 21:743-755, Ueda 등 (2008) PLoS ONE 3(6):e2800, Meek 등 (2010) PLoS ONE 4 (12): e14225; Tong 등 (2010) Nature 467:211-213; US Patent Publication 2012/0142092, Buehr 등 (2008) Cell 135:1287-1298, Li 등 (135) Cell 1299-1310(이들 각각은 본원에 전체가 참조로 편입됨)에서 개시된 배지들이 포함된다. 이와 같은 배지를 활용할 때, LIF의 농도 및 공급원은 본원에 개략적으로 제시된 바와 같이 변경될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 다양한 배지가 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편과 병행하여 사용될 수 있고, 그 밖의 추가적 구현예에서는, 상기의 다양한 배지가 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 약 50U/ml 내지 약 100U/ml, 약 50U/ml 내지 약 150U/ml, 또는 약 100U/ml의 농도로 포함할 수 있다.
ES 세포주의 생산 및 ES 세포주의 배양 및 유지를 위해, 전형적으로 수행되는 랫트 ES 세포의 배양 온도는 약 35°C 내지 약 37.5°C이다. 특정 구현예에서, 상기 온도는 37.0°C이다. 상기 배양은 전형적으로 7.5% CO2에서 수행된다.
ii. 랫트 ES 세포주 성립
랫트 배아줄기(ES) 세포주를 생성하는 방법이 제공된다. 이와 같은 방법은 (a) 제1 배양보조 세포층 및 상실기 배아, 배반포기 배아, 또는 상실기 배아 및 배반포기 배아 사이의 발달 단계에 있는 랫트 배아를 체외에서 배양하는 단계(상기 랫트 배아의 투명대가 제거되었고, 상기 배양 조건이 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하며, 마우스 백혈병 억제제 인자(LIF) 또는 이것의 활성 변종 또는 절편 을 갖는 배지를 포함한다); 및 (b) 비정질 미분화 질량의 랫트 ES 세포의 파생물을 제2 배양보조 세포층을 포함하는 체외 배양 웰(well)에 옮기고 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하고 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 갖는 배지를 포함하는 조건 하에서 상기 파생물을 배양함으로써, 랫트 ES 세포주를 성립시키는 단계를 포함한다. 상기 다양한 방법은 추가로 세포 상기 랫트 ES 세포주의 세포를 체외에서 계대배양 및 배양하는 단계를 추가로 포함한다(각각의 차후 체외 배양은 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하고 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 갖는 배지를 포함하는 조건 하에 상기 배양보조 세포층에서 상기 랫트 ES 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 이와 같은 방법으로 제조된 랫트 ES 세포주 또한 제공된다.
본원에서 다뤄지는 다양한 특징들을 갖는 배지에서 랫트 ES 세포주 성립 방법의 비제한적인 예들이 실시예 3에서 명시된다. 요약하면, 랫트 배아(즉, 상실기 배아, 배반포기 배아, 또는 상실기 배아 및 배반포기 배아 사이의 발단 달계에 위치한 랫트 배아)가 암컷 랫트의 자궁에서 씻어 내려진다. 특정 구현예에서, 배반포 또는 8개 세포 배아가 획득된다. 상기 투명대가 제거되고, 상기 랫트 배아가 특정 구현예에서, 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)의 단일층을 포함하는 배양보조 세포(본원의 다른 곳에서 다뤄짐)에서 배양된다. 상기의 상실기 배아, 배반포기 배아, 또는 상실기 배아 및 배반포기 배아 사이의 발단 달계에 위치한 랫트 배아의 세포가 ES 랫트 세포를 유지하고, 그럼으로써 ES 세포의 다분화능 및/또는 전분화능을 유지하기에 충분한 조건 하에 체외에서 배양된다. 다양한 배지가 이 단계에서 활용될 수 있는데, 예컨대 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 비롯한 LIF를 상기 배지에 갖는 앞서 논의된 모든 다양한 배지가 포함된다.
상기 배양은 파생물(비정질 미분화 질량의 세포)의 존재 여부에 대해 모니터링된다. 상기 파생물이 적정 크기에 도달하면, 소정의 파생물이 새로운 배양보조 플레이트에 옮겨져 배양된다. 플레이트로 옮긴 후, 다수의 콜로니를 생산하기 위해, 트립신을 사용한 효소 분해가 수반된다. 상기의 옮김은 보통 "계대배양 1"이라 일컬어진다. 각 세포주가 확장되는 속도는 다양하다. 랫트 ES 세포의 다분화능 또는 전분화능을 유지하기 위해 필요에 따라 배지는 변경된다. 상기 배양은 배아줄기세포 형태를 갖는 콜로니의 존재 여부에 대해 모니터링된다. 이와 같은 형태는 다음과 같은 특징들 중 하나 이상을 포함한다: (a) 배양보조 세포의 단일층 위로 솟아오르는 둥근 원형 언덕; (b) 서로 조밀하게 쌓여 세포 경계를 관찰하기 어려운 세포; (c) 더 작은 세포 크기; (d) 적은 양의 세포질 및 확대된 핵, (e) 체외에서 배양보조 세포에 플레이팅된 경우 구형 콜로니를 형성. 이와 같은 콜로니가 나타나면, 대략 50% 세포군집(confluency)에 도달할 때까지 배양이 계속될 수 있다. 상기 콜로니는 이어서 새로운 배양보조 플레이트에 옮겨진다. 옮김에 이어 콜로니의 수를 확장하기 위해 트립신을 사용한 효소 분해가 수반된다. 이것은 "계대배양 2"라고 일컬어진다. 상기 세포가, 추가 계대배양을 겪어 상기 세포주를 유지하거나 또는 상기 세포주가 동결될 수 있는 시점인 대략 50% 세포군집에 도달할 때까지, 배양보조 세포와 함께 계속 배양된다. 또한 Tong 등 (2010) Nature 467 (9):211-215; Li 등 (2008) Cell 135:1299-1310, and Buehr 등 (2008) Cell 135:1287-1298, (각각은 본원에 참조로 편입됨) 참조. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 개시된 다양한 랫트 ES 세포, 세포주 및 세포 집단은 계대배양될 수 있고, 미분화 상태를 유지할 수 있다.
하나의 비제한적 구현예에 있어서, 상기 랫트 ES 세포의 유도가 아래와 같이 발생한다. 0일, 암컷 랫트를 안락사시키고, 난관과 자궁각을 적출하여 따뜻한 N2B27 배지가 담긴 조직 배양 접시에 담는다. 자궁각과 난관을 배지로 씻어 내려 배반포를 상기 배지로 내보낸다. 상기 배반포를 수집하여 KSOM + 2i(1mMPD0325901, 3 mM CHIR99021)이 담긴 배아 배양 접시에 ?ケ芽?. KSOM은 Millipore에서 구입할 수 있고, 카탈로그 번호는 MR-106-D이다. 본원에서 2i 배지라고 불리는 배지는 표 2에 명시된 배지를 포함한다. 상기 세포를 37°, 7.5% CO2에서 밤새 배양한다.
기타 비제한적 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 8-세포 배아 또는 동결된 8-세포 배아에서 유도된다. 상기 배아를 실온에서 10분 동안 M2 배지에서 배양하고, 이어서 KSOM + 2i 배지로 옮겨 밤새 배양한다.
랫트 ES 세포의 유도의 비제한적인 예는 다음과 같다: 1일, 공동이 만들어진 배아를 2i 배지(표 2)로 옮겨 밤새 배양하였다. 상기 배양은 KSOM +2i에서 공동이 만들어지지 않으면서 계속된다. 2일, 공동이 만들어 졌는지 여부와 상관없이, 남아 있는 모든 배아를 2i 배지로 옮긴다. 2i 배지에서 밤새 계속 배양한다. 3일, 배아를 타이로드 산성액(산성 타이로드액)으로 배양하여 투명대를 제거하고, 2i 배지에서 3회 세척하여 타이로드 산성액을 제거한다. 각각의 웰에 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)의 단일층이 담긴, 별개의 웰 배양 플레이트에 각각의 배아를 놓는다. 상기 세포를 2i 배지에서 밤새 배양한다. 4일 및 5일, 파생물, 비정질 미분화 질량의 세포의 존재 여부에 대해 상기 세포가 플레이팅된 배아를 모니터링한다. 파생물은 플레이팅된 배아 크기가 대략 2배가 되었을 때, 옮길 준비가 된 것이다. 매일, 사용된 배지를 제거하고, 새로운 2i 배지로 교체한다. 상기 파생물을 새로운 배양 웰로 옮기고, 다시 사용된 배지를 제거하고, 상기 웰을 PBS로 세척한다. 상기 PBS를 제거하고 트립신을 첨가하여 약 10분 동안 배양한다. 30ml 2i 배지 및 10% FBS의 첨가로 상기 트립신 반응을 멈춘다. 상기 세포를 조심스럽게 분해하고, 내용물 전체를 배양 플레이트의 웰 하나에 옮긴다. 이것을 계대배양 1(P1)이라 일컫는다. 상기 세포를 2i 배지에서 밤새 배양한다. 5일부터 8일까지, 각각의 세포자가 얼마나 빠르게 확장되는지에 따라, 매일 상기의 2i 배지를 바꾸고, ESC 형태의 콜로니의 존재 여부에 대해 배양을 모니터링한다. 이와 같은 ESC 형태는 본원의 다른 곳에서 상세히 다뤄진다. 콜로니가 약 50% 세포군집으로 확장될 때까지 배양을 계속한다. 이어서 상기 콜로니를 트립신화하여 계대배양한 후, 배양 웰에 옮긴다. 이것을 계대배양 2라 일컫는다. 대략 50% 세포군집에 도달할 때까지 각각의 세포주의 공급 및 모니터링을 계속한다. 상기 세포를 보통 때처럼 트립신화한다. 상기 트립신 반응을 2i 배지 + 10% FBS로 중단시킨다. 상기 세포를 원심분리로 펠릿화하고, 400 ml 동결 배지(70% 2i, 20% FBS, 10% DMSO)에 옮긴다. 상기 세포는, 이어서 동결시킬 수 있다. 이것을 계대배양 3이라 일컫는다.
iii. 랫트 ES 세포주 유지 및 계대배양
랫트 배아줄기 세포주를 유지하거나 또는 배양하기 위한 방법이 추가로 제공된다. 상기 방법은 체외에서 배양보조 세포층 및 랫트 ES 세포주를 배양하는 단계를 포함한다(상기 배양 조건은 랫트 배아줄기(ES) 세포의 다분화능을 유지하고, 마우스 백혈병 억제제 인자(LIF) 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 갖는 배지를 포함한다). 이와 같은 방법은 앞서 개략적으로 제시된 배지 및 배양보조 세포층을 활용한다. 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포주는 최소한 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50회 이상 계대배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 GSK3 억제제 및 MEK 억제제를 포함하는 배지에서, 그것의 적중 효율 또는 적중된 유전자 변형의 생식선 전이 효율을 줄이지 않으면서, 최소한 11회까지 계대배양될 수 있다.
상기 랫트 ES 세포주가 공급되고 모니터링된다. 특정 구현예에서, 계대배양은 상기 배양이 대략 30%, 40%, 50% 또는 60% 세포군집일 때 발생한다. 다른 구현예에서, 계대배양은 상기 배양이 50% 세포군집일 때 발생한다. 각각의 세포주가 얼마나 빨리 확장되는가에 따라, 계대배양이 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95 또는 100 시간마다 발생할 수 있다. 다른 구현예에서, 계대배양 간 간격의 범위는 24 내지 96 시간, 약 30 내지 50 시간, 약 25 내지 75 시간, 약 50 내지 96 시간, 약 25 내지 75 시간, 약 35 내지 85 시간, 또는 약 40 내지 70 시간이다. 한 구현예에서, 본원에 개시된 상기 랫트 ES 세포, 세포주 또는 세포 집단은 약 24 시간 내지 약 36 시간 범위의 배가 시간(doubling time)을 갖는다. 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 배가 시간이 25시간이다.
본원에 개략적으로 제시된 바와 같이 유도 및 유지될 때, 상기의 다양한 랫트 ES 세포주는 다음 특성들 중 하나 이상을 가질 수 있다:
(a) 생식선 역량을 갖는다(상기 랫트 ES 세포가 랫트 숙주 배아에 이식될 때, 상기 랫트 ES 세포주의 게놈이 후손에 전이됨을 뜻한다);
(b) 적중된 유전자 변형 후 생식선 역량을 갖는다(상기 랫트 ES 세포가 랫트 숙주 배아에 이식되면, 상기 랫트 ES 세포주의 게놈 내 적중된 유전자 변형가 후손에 전이됨을 뜻한다);
(c) 체외에서 다분화능을 갖는다;
(d) 체외에서 전분화능을 갖는다;
(e) 체외에서 배양되면, 배양보조 세포층에 느슨하게 접착된다;
(f) 체외에서 배양될 때, 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅될 경우, 구형 콜로니를 형성한다;
(g) 유전자 변형되어 백혈병 억제제 인자(LIF)를 발현하지 않는 배양보조 세포층을 포함하는 조건 하에 체외에서 배양될 때(상기 배지는 충분한 농도의 LIF를 포함한다), 다분화능을 유지한다;
(h) 배양보조 세포층을 포함하는 조건 하에 체외에서 배양될 때(상기 배지는 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 포함한다), 다분화능을 유지한다;
(i) 다음을 특징으로 하는 분자 서명을 포함한다
i) 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터류린 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합을 포함하는 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현;
ii) 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터류린 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합을 포함하는 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상의 발현;
iii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 14에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
iv) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 14에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
v) 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현;;
vi) 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현;
vii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
viii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
ix) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 12에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 감소; 및/또는
x) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 12에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현의 최소한 20배 감소;
xi) 항목 (i)-(x)의 랫트 ES 세포-특이적 유전자의 발현의 모든 조합;
xii) 상기 나열된 다분화능 표지 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 대해, 표 15에 표시된 다분화능 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 다분화능 순위열 참조;
xiii) 상기 나열된 중배엽 표지 중 최소한 2, 3 또는 4개에 대해, 표 15에 표시된 중배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 중배엽 순위열 참조;
xiv) 상기 나열된 내배엽 표지 중 최소한 2, 3, 4, 5 또는 6개에 대해, 표 15에 표시된 내배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 내배엽 순위열 참조;
xv) 상기 나열된 신경 표지 중 최소한 2 및 3개에 대해, 표 15에 표시된 신경 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 신경 순위열 참조;
xvi) 상기 나열된 영양외배엽 표지에 대해, 표 15에 표시된 영양외배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 영양외배엽 순위열;
xvii) 표 15에 제시된 다분화능 표지, 중배엽 표지, 내배엽 표지, 신경 표지 및/또는 영양외배엽 표지 중 하나 이상(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,2 4, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 모든 상대적 발현 수준;
xviii) 표 15에 제시된 표지들 각각의 상대적 발현 수준;
xix) 항목 xii-xiix에 제시된 표지들의 모든 조합; 및/또는
xx) 항목 i-xiix에 제시된 표지의 모든 조합;
(j) F0 랫트 생산 능력을 갖는다;
(k) 계대배양되어 미분화 상태를 유지할 수 있다;
(l) 정상적인 랫트 세포와 동일한 수의 염색체를 갖는다; 및/또는
(m) 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않고 체외에서 다분화능을 유지한다.
(n)자기재생 능력을 갖는다(다분화능을 유지하면서 무한대로 분열함을 뜻한다).
소정의 랫트 ES 세포주의 이와 같은 특성들은 계대배양 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 또는 그 이후를 비롯하여, 상기 계대배양 중 어느 한 시점에 존재할 수 있다.
따라서, 하나의 비제한적 구현예에 있어서, 배양보조 세포층 및 랫트 ES 세포의 집단을 포함하는 체외 배양이 제공되는데, 상기 체외 배양 조건은 상기 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하고, 마우스 백혈병 억제제 인자(LIF) 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 갖는 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 이와 같은 조건 하에 배양된 랫트 ES 세포는 최소한 10회 계대배양의 기간에 걸쳐 세포 집단의 최소한 50%의 다분화능을 유지하거나, 최소한 10회 계대배양의 기간에 걸쳐 세포 집단의 최소한 60%의 다분화능을 유지하거나, 최소한 10회 계대배양의 기간에 걸쳐 세포 집단의 최소한 70%의 다분화능을 유지하거나, 최소한 10회 계대배양의 기간에 걸쳐 세포 집단의 최소한 75%의 다분화능을 유지하거나, 최소한 10회 계대배양의 기간에 걸쳐 세포 집단의 최소한 80%의 다분화능을 유지하거나, 최소한 10회 계대배양의 기간에 걸쳐 세포 집단의 최소한 85%의 다분화능을 유지하거나, 최소한 10회 계대배양의 기간에 걸쳐 세포 집단의 최소한 90%의 다분화능을 유지하거나 또는 최소한 10회 계대배양의 기간에 걸쳐 세포 집단의 최소한 95%의 다분화능을 유지한다.
본원에 개시된 다양한 랫트 ES 세포, 세포 집단 및 세포주를 포함하는 체외 배양뿐만 아니라, 이와 같이 다양한 ES 세포용 배양 키트가 추가로 제공된다. 예를 들어, 앞서 논의된 바와 같이, 특정 구현예에서, 본원에 제시된 다양한 랫트 ES 세포는 다음의 특징들 중 하나 이상을 갖는다: (1) 체외에서 배양될 때 배양보조 세포층에 느슨하게 접착된다; (2) 체외에서 배양될 때, 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅될 경우, 구형 콜로니를 형성한다; (3) 유전자 변형되어 백혈병 억제제 인자(LIF)를 발현하지 않는 배양보조 세포층를 포함하는 조건 하에 체외에서 배양될 때(상기 배지는 충분한 농도의 LIF를 포함함), 다분화능을 유지한다; 및/또는(4) 계대배양되어 미분화 상태를 유지한다. 게다가, 이와 같은 체외배양들 중 어느 것으로 이루어진 상기 랫트 ES 세포 집단은 예를 들어, 상기 집단 내 세포의 최소한 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 정배수체, 이배수체 및/또는 42개 염색체를 갖는 세포의 집단을 포함한다.
체외에서 랫트 배아줄기세포를 배양하는 한 가지 방법은 (a) 배양보조 세포층 및 단리된 랫트 배아줄기(ES) 세포의 집단을 포함하는 체외 배양을 제공하는 단계; 및 (b) 단리된 랫트 배아줄기(ES) 세포의 다분화능 또는 전분화능을 유지하기에 충분한 조건 하에 체외 배양을 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 랫트 ES 세포는 배양보조 세포층에 느슨하게 접착되는 콜로니를 형성한다. "느슨한 접착" 또는 "느슨하게 접착된다"는 상기 배양 접시가 일정 시간(최소 8 시간)의 기간 동안 흔들리지 않았을 경우, 일부 콜로니가 배양보조에 접착되어 상기 접시를 조심스럽게 움직일 경우 접착을 유지할 수 있음을 뜻한다. 더 작은 웰(상기 배지가 덜 움직임)에서, 느슨한 접착이 더 빠르게 일어날 수 있다. 어떤 경우이든지, 이와 같은 콜로니들은 a) 접시에 담긴 배지를 흔들거나, 또는 b) 배양 보조의 표면에서 상기 배지를 조심스럽게 피펫팅함으로써 자리에서 이탈할 수 있다. 이와 같인 느슨하게 접착된 콜로니의 형태는 여전히 구형이다. 이와 같은 경우에, 상기 랫트 ES 세포는 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅될 경우, 구형 콜로니를 형성한다. 이와 같은 구형 콜로니가 예를 들어 도 1에 나타나 있다.
iv. 키트 및 체외 배양
본원에 제공되는 상기 랫트 ES 세포 및 랫트 ES 세포주는 제조업체의 키트 또는 물품 내에 포함되어 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 제조업체의 키트 또는 물품은 본원에 개시된 랫트 ES 세포주 또는 집단 중 어느 것이든 포함할 수 있다. 상기 키트는 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하는 배지를 비롯하여, 상기 랫트 ES 세포를 유지하는 모든 배지를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 배지는 본원의 다른 곳에서 좀 더 상세히 논의되는 바와 같이 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 갖는 배지를 포함할 수 있다. 상기 키트 내 배지는 추가로 MEK 억제제 및 GSK-3 억제제를 포함하거나, 또는 선택적으로, 상기키트 내 배지는 추가로 MEK 억제제 및 GSK-3 억제제로 이루어진 억제제들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 키트 내 배지는 PD0325901을 포함하는 MEK 억제제 및/또는 </c0 CHIR99021을 포함하는 >GSK-3 억제제를 포함할 수 있다. 본원에서 논의되는 다양한 모든 배지는 상기 키트 내에 담겨 있을 수 있다.
본원에 개시된 랫트 ES 세포주 또는 집단, 본원에 개시된 다양한 배지, 및 배양보조 세포의 집단중 어느 것이든 포함하는 제조업체의 키트 또는 물품이 추가로 제공된다. 한 구현예에서, 제조업체의 키트 또는 물품 내 배양보조 세포는 유전자 변형되어 LIF를 발현하지 않고 및/또는 상기 배양보조 세포는 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 포함한다. 본원에 개시된 기타 배양보조 세포들 중 어떤 것이든 제조업체의 키트 또는 물품에 활용될 수 있다.
IV.
랫트
배아줄기
(
ES
) 세포의 유전자 변형
본원에 개시된 다양한 랫트 ES 세포 및 세포주는 변이되어 최소한 하나의 적중된 유전자 변형을 함유할 수 있다. 따라서, 다양한 방법이 본원에 개시된 바와 같이 단리된 랫트 배아줄기(ES) 세포를 유전자 변형하는 다양한 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에 개시된 단리된 랫트 ES 세포의 게놈에 적중된 유전자 변형을 유입시켜 유전자 변형된 랫트 ES 세포를 형성하는 단계를 포함한다. 상기 적중된 유전자 변형는 예를 들어, 삽입, 결실, 녹아웃, 녹인, 돌연변이 또는 이들의 조합을 비롯하여, 랫트 ES의 게놈에 대한 모든 변형을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 적중된 유전자 변형는 이종 폴리뉴클레오티드의 랫트 ES 세포의 게놈으로의 삽입을 포함한다. 서열과 관련하여, 본원에 사용되는 "이종"은 외래종에서 기원한 서열, 또는 동일종에서 기원한 경우, 고의적인 인간의 개입에 의해 조성물 및/또는 게놈 유전자자리에서의 그것의 본래 형태에서 실질적으로 변형된 서열이다.
한 측면에서, 체외에서 하나 이상의 유전자 변형 이후 다분화능을 유지할 수 있고, 유전자 변형된 게놈을 F1 생성의 생식선에 전이할 수 있는 단리된 랫트 ES 세포 또는 랫트 ES 세포주가 제공된다. 따라서, 상기 랫트 ES 세포는 그것의 다분화능을 유지하여 체외에서 하나 이상의 연속 유전자 변형(예컨대, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여성 이상의 연속 유전자 변형) 이후 다수의 세포 유형으로 발달한다. 다른 구현예에서, 다수의 적중된 유전자 변형는 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15개 이상이 소정의 랫트 ES 세포에서 제조된다. 이와 마찬가지로, 다수의 이종 폴리뉴클레오티드가 또한 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15개 이상이 상기 게놈에 통합될 수 있다.
한 구현예에서, 1회 내지 15회 연속 유전자 변형 중 어느 것 이후에, 분화 배지에 노출되었을 때 상기 유전자 변형된 랫트 ES 세포는 분화 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있다. 한 구현예에서, 1회 내지 15회 연속 유전자 변형 중 어느 것 이후에, 상기 유전자 변형된 랫트 ES 세포는 배양에서 미분화 상태로 유지될 수 있다. 한 구현예에서, 미분화 상태의 유전자 변형되고 배양된 랫트 ES 세포는, 랫트 숙주 배아에서 공여 세포로 활용될 경우, 상기 배아를 채우고, 1개 내지 15개 유전자 변형을 포함하는 배반포를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 배반포는, 임신에 적합한 조건 하에서 대리모에 이식된 후, 1개 내지 15개 유전자 변형을 포함하는 F0 랫트 후손으로 발달한다.
랫트 ES 세포의 게놈 내에서 적중된 유전자 변형을 제조하는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 경우에, 상기 적중된 유전자 변형는 상동 재조합 이벤트를 통해 하나의 적중된 유전자 변형을 생성하는 시스템을 활용한다. 다른 경우에는, 상기 랫트 ES 세포가 적중된 게놈 위치에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유발하는 뉴클레아제 제제를 사용하여 변형될 수 있다. 상기 단일 또는 이중 가닥 절단은 이어서 비-상동 말단 결합 경로(NHEJ)에 의해 복구된다. 이와 같은 시스템은, 예를 들어, 기능 유전자 변형의 적중된 손실을 유발하는 데 유용하게 사용된다. 예를 들어, Tesson 등(2011) Nature Biotechnology 29:695-696(본원에 참조로 편입됨) 참조. 이와 같은 제제에는 전사 활성자-유사 효능기 뉴클레아제(TALEN) (WO 2010/079430; Morbitzer 등 (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian 등Genetics (2010) 186:757-761; Li 등 (2010) Nuc . Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; 및 Miller 등(2011) Nature Biotechnology 29:143-148; US Patent Application No. 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1, 및 2006/0063231 A1, 각각 본원에 참조로 편입됨); 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)(US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; 및 WO/2011/017293A2, 각각은 본원에 참조로 편입됨); 메가뉴클레아제(Epinat등,(2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier 등, (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble 등, (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman 등, (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman 등, (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen 등, (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames 등, (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith 등, (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen 등, (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; and WO2004031346); and a CAS/CRISPER system (Mali P 등 (2013) Science2013 Feb 15;339(6121):823-6; Jinek M 등 Science2012 Aug 17;337(6096):816-21; Hwang WY 등 Nat Biotechnol 2013 Mar;31(3):227-9; Jiang W 등 Nat Biotechnol 2013 Mar;31(3):233-9; and, Cong L 등 Science2013 Feb 15;339(6121):819-23, 각각은 본원에 참조로 편입됨)이 포함된다.
다른 구현예에서, 상기 적중된 게놈 변형은 상동 재조합 적중 벡터를 활용하여 제조될 수 있다. 이와 같은 경우에서는, 상기 적중 벡터가 삽입 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 추가로 삽입 폴리뉴클레오티드의 측면에 위치한 업스트림 및 다운스트림 상동 염기서열(homology arm)을 포함한다. 삽입 폴리뉴클레오티드의 측면에 위치한 상기 상동 염기서열은 적중된 게놈 유전자자리 내부의 게놈 영역에 상응한다. 용이한 참조를 위해, 상기 적중된 게놈 유전자자리 내에 상응하는 게놈 영역은 본원에서 "적중 위치"라 일컫는다. 따라서, 한 예에서, 적중 벡터는 적중된 게놈 유전자자리에 위치한 제1 및 제2 적중 위치에 상응하는 제1 및 제2 상동 염기서열의 측면에 위치한 제1 삽입 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서 상기 적중 벡터는 상기 세포의 게놈 내 상동 염기서열s과 상응하는 적중 위치 사이에 발생하는 상동 재조합을 통해 적중된 게놈 유전자자리로의 상기 삽입 폴리뉴클레오티드의 통합에 도움을 준다.
본원에 사용되는 상동 염기서열 및 적중 위치는 두 영역이 상동 재조합 반응을 위한 기재로서 작용하기에 서로에게 충분한 수준의 서열 동일성을 공유할 때, 서로 "상응하거나" 또는 "상응하는 것"이다. "상동"이란 상응하는 서열과 동일하거나 또는 그것과 서열 동일성을 공유하는 DNA 서열을 의미한다. 소정의 적중 위치와 상기 적중 벡터에서 발견된 상응하는 상동 염기서열 사이의 서열 동일성은 상동 재조합의 발생을 가능하게 하는 모든 수준의 서열 동일성일 수 있다. 예를 들어, 적중 벡터의 상동 염기서열(또는 이것의 절편)과 적중 위치(또는 이것의 절편)에 의해 공유되는 서열 동일성의 양은, 상기 서열들이 상동 재조합을 겪도록, 최소한 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성일 수 있다. 게다가, 상동 염기서열과 상기의 상응하는 적중 위치 사이의 상동의 상응 영역은 분할된 인식 위치에서의 상동 재조합을 촉진하기에 충분한 모든 길이일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 단리된 랫트 ES 세포, 세포주 또는 세포 집단은 최소한 2%, 최소한 3%, 최소한 4%, 최소한 5%, 최소한 6%, 최소한 7%, 최소한 8%, 최소한 9%, 최소한 10%, 최소한 11%, 최소한 12%, 최소한 13%, 최소한 14%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75% 또는 최소한 80%의 상동 재조합 효율을 보인다. 한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포를 활용하는 상동 재조합 효율은 4%보다 크다.
특정 구현예에서, 랫트 ES 세포에서 적중된 유전자 변형을 생성시킬 때, 선택 표지가 활용된다. 상기 선택 표지를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 게놈에 상기 적중된 유전자 변형을 도입하기 위해 고안된 적중 벡터 상에 존재하거나, 또는 별개의 플라스미드 또는 벡터 상에서 발견될 수 있다. 상기 선택 표지를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트에서 내부에 함유될 수 있다. 이와 같은 발현 카세트의 다양한 성분들은 본원의 다른 곳에서 좀 더 상세히 논의된다.
다양한 선택 표지는 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 이와 같은 선택 표지는, 예를 들어, G418, 히그로마이신, 블라스티시딘, 퓨로마이신 또는 네오마이신와 같은 항생제에 내성을 보일 수 있다. 이와 같은 선택 표지에는 네오마이신 인산전달 효소(neor), 히그로마이신 B 인산전달 효소(hygr), 퓨로마이신N-아세틸-전이효소 및 블라스티시딘 S 탈아미노효소(bsrr)가 포함된다. 그 밖의 기타 구현예에서, 상기 선택 표지는 유도 가능한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 상기 선택 표지의 발현은 상기 세포에 독성이 있다. 이와 같은 선택 표지의 비제한적인 예에는 크산틴/구아닌 포스포리보실 전달효소(gpt), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT) 또는 단순포진 바이러스 티미딘 인산화효소(HSV-TK)이 포함된다. 예를 들어, 등 (1984) Gene 30:147-56; Joyner (1999) The Practical Approach Series, 293; Santerre 등 (1984) Gene 30:147-56; Bernard 등 (1985) Exp Cell Res 158:237-43; Giordano and McAllister (1990) Gene, 88:285-8; Izumi 등 (1991) Exp Cell Res 197:229-33(각각은 그 전체가 본원에 참조로 편입됨) 참조.특정 구현예에서, neoR 선택가능 표지는 Beck 등(1982) Gene, 19:327-36(본원에 참조로 편입됨)의 네오마이신 인산전달 효소(neo) 유전자이다. neoR 선택 표지는 US Patent No, 7,205,148 또는 6,596,541(각각은 본원에 참조로 편입됨)에 사용된 것이다.
특정 구현예에서, 활용된 상기 선택 표지는 비약독화된 선택 표지이다. "비약독화된 선택 표지"는 본연의 폴리펩티드의 활성을 유지하는 선택 표지를 표함하거나 또는 상기 선택 표지는 상기 폴리펩티드의 본연의 형태와 비교할 때 증가된 활성을 갖는다. 선택 표지의 활성에서의 증가는 예컨대, 최소한 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80% 또는 그 이상의 증가를 비롯하여, 활성에서의 모든 통계학적으로 유의미한 증가를 포함할 수 있다. 따라서, 숙주 세포에 발현될 때 비약독화된 선택 표지는 약독화된 선택 표지를 활용할 때보다 더 높은 농도의 선택 제제의 존재 하에 더 높은 비율의 숙주 세포가 생존할 수 있게 할 것이다. 비약독화된 선택 표지는 예컨대, 네오마이신 비약독화된 선택 표지를 포함한다. 예를 들어, Beck 등(1982) Gene, 19:327-36 또는 US Patent No, 7,205,148 또는 6,596,541(각각은 본원에 참조로 편입됨) 참조.
다른 경우에서는, 약독화된 선택 표지 및/또는 야생형(본연) 선택 표지와 비교할 때 선택 표지의 증가된 활성은 상기 랫트 ES 세포의 게놈 내의 비-약독화된, 약독화된 또는 본연의 선택 표지 중 하나의 복제 개수를 증가시킴으로써 초래될 수 있다. 이와 마찬가지로, 소정의 랫트 ES 세포는 이것의 게놈 내에 소정의 선택 표지(즉, 비약독화된 선택 표지, 약독화된 선택 표지 또는 본연의(야생형) 선택 표지)의 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 복제본을 포함할 수 있다.
활용되는 상기의 다양한 선택 표지는 랫트 ES 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 특정 구현예에서, 상기 선택 표지의 활성의 증가는 상기 선택 표지의 발현의 증가에 의해 초래될 수 있다. 따라서, 프로모터가 활용되어 소정의 선택 표지의 발현 수치를 상승시킬 수 있다. 관심대상의 프로모터는, 비제한적으로, CMV 프로모터, PGK 프로모터 및 CAG 프로모터를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 인간 유비퀴틴(hUb) 프로모터가 사용되어 상기 선택 표지를 발현한다. Valenzuela 등 (2003) Nature Biotechnology 21:652-659(본원에 전체가 참조로 편입됨) 참조.
한 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 그것의 다분화능을 유지하여 외인성 핵산으로의 단일 차례의 전기천공 이후 다수의 세포 유형으로 발달한다. 또 다른 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는 이것의 다분화능을 유지하여, 외인성 핵산으로의 두번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 세 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 네 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 다섯 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 여섯 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 일곱 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 여덟 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 아홉 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 열 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 열한 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 열두 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 열세 번째 차례의 전기천공 이후에, 외인성 핵산으로의 열네 번째 차례의 전기천공 이후에, 및/또는 외인성 핵산으로의 열다섯 번째 차례의 전기천공 이후에, 다수의 세포 유형으로 발달한다. 다른 구현예에서, 상기 랫트 ES 세포는, 연속적인 차례의 전기천공(즉, 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 차례의 전기천공) 이후에, 적중된 유전자 변형을 후대에 전이할 수 있다.
i.
랫트
배아줄기세포로의 서열 도입
본원에 제공된 방법은 상기 적중된 게놈 변형을 이루기 위해 필요한 다양한 성분들을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 구성체를 세포로 도입하는 단계를 포함한다. "도입"은 서열이 상기 세포의 내부에 접속하게 하는 방식으로, 상기 서열(폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)을 상기 세포에 제공하는 것을 의미한다. 본원에 제공된 방법은 상기 세포로의 적중된 게놈 통합 시스템의 어떤 성분의 유입을 위한 특정한 방법에 의존하지 않고, 단지 상기 폴리뉴클레오티드가 최소한 하나의 세포의 내부에 접속하는 방식이다. 다양한 세포 유형으로의 폴리뉴클레오티드의 도입 방법은 당해 기술에 알려져 있고, 비제한적으로, 안정적 형질전환 방법, 일시적 형질전환 방법, 및 바이러스-매개 방법을 포함한다. 이와 같은 방법은, 비제한적으로, 전기천공법, 세포질간 주입, 바이러스 감염(아데노바이러스, 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터), 형질전환, 지질-매개 형질전환 및/또는 Nucleofaction™을 포함한다. 예를 들어, Stadtfeld 등 (2009) Nature Methods 6(5):329-330; Yusa 등 (2009) Nat. Methods 6:363-369; Woltjen 등 (2009) Nature 458, 766-770 참조. 이와 같은 방법은, 비제한적으로, 임의로 Fugene6(Roche) 또는 리포펙타민(Lipofectamine)(Invitrogen)과 함께 탈체(ex vivo) 형질전환(Wilson 등, Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987)에 의해, 미량주입법(Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; U.S. Pat. No. 5,789,215, (본원에 참조로 편입됨)을 비롯하여, 주입(U.S. Pat. Nos.5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859(각각이 본원에 참조로 편입됨)에 의해; 전기천공법(U.S. Pat. No. 5,384,253, 본원에 참조로 편입됨; Tur-Kaspa 등, Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984)에 의해; 인산 칼슘 침전법 (Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe 등, Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990)에 의해; DEAE-덱스트란과, 이후 폴리에틸렌 글리콜(Gopal, Mol. 세포 Biol., 5:1188-1190, 1985)에 의해; 직접 음파 로딩 (Fechheimer 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987)에 의해; 리포솜 매개 형질전환(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau 등, Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong 등, Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda 등, Science, 243:375-378, 1989; Kato 등, Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991)에 의해; 및 수용체-매개 형질전환(Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987)에 의해; 그리고 이와 같은 방법의 모든 조합들에 의해(각각이 본원에 참조로 편입됨), DNA의 직접적인 전달을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법 및 조성물에 활용된 상기 세포는 그것의 게놈에 안정적으로 편입된 DNA 구헝체를 포함한다. "안정적으로 편입된" 또는 "안정적으로 도입된"이란 상기 뉴클레오티드 서열이 상기 세포의 게놈에 통합되고, 그것의 후대에 의해 유전될 수 있도록 하는, 상기 세포로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 의미한다. 적중된 게놈 변형을 생성하기 위해 활용되는 DNA 구성체 또는 다양한 성분들의 안정적인 편입을 위해 모든 프로토콜이 사용될 수 있다.
형질전환 프로토콜 및 세포로의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 도입을 위한 프로토콜은 다양할 수 있다. 비제한적인 형질전환 방법에 리포솜; 나노입자; 인산 칼슘(Graham 등(1973)의 사용을 비롯한, 화학약품-기반 형질전환 방법이 포함된다. Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti 등 (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 and, Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); 덴드리머; 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 중합체. 비 화학적 방법에는 전기천공법; 초음파 천공법; 및 광 형질전환이 포함된다. 입자-기반 형질전환에는 유전자총, 자석도움 형질전환 (Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28)의 사용이 포함된다. 형질전환을 위해 바이러스 방법 역시 사용될 수 있다.
랫트 ES 세포로의 이종 폴리뉴클레오티드의 도입 방법의 비제한적인 예는 다음과 같다. 본원에 기술된 바와 같이, 상기 랫트 ES 세포가 전기천공법을 시행하기 전에 24시간 내지 약 48시간 동안 계대배양된다. 전기천공법을 시행하기 전 약 24 시간 동안, 상기 배지가 RVG2i + ROCKi(10μM Y-27632)로 변경된다. 상기 랫트 ES 세포가 트립신화되고, 상기 랫트 ES 세포가 단리된다. 상기 랫트 ES 세포가 현탁되어, 75 ul당 약 2 x 10^6 내지 약 10 x 10^6 세포의 최종 세포 농도를 달성한다. 랫트 ES 세포 약 75λ가 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약 50λ DNA에 첨가되고, 약 125λ EP 완충용액이 첨가된다. 하나의 비제한적 구현예에 있어서, 상기 전기천공법은 다음의 매개변수와 함께 시행된다: 400V; 400V; Ω; 100 μF. 이어서, 상기 세포는 RVG2i 및 10μM ROCKi 에서 배양되어, 배양보조 세포 위에 옮겨질 수 있다.
ii. 적중된 게놈 변이를 갖는
랫트
배아줄기세포의 선택
적중된 유전자 변형을 게놈에 안정적으로 편입시킨 랫트 ES 세포를 선택하고 유지하기 위한 다양한 방법이 제공된다. 하나의 비제한적인 실시예에서, 이종 폴리뉴클레오티드를 랫트 ES 세포에 도입할 때, 상기 방법은 (a) 랫트 ES 세포의 체외 집단을 제공하는 단계; (b) 최소한 하나의 랫트 ES 세포에 랫트 ES 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 표지를 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; 및 (c) 제1 및 제2 배지로 바꿔가면서, 체외에서 상기 랫트 ES 세포 집단을 배양하는 단계(제1 배지는 제1 시기 동안 선택 제제의 유효량을 포함하고, 제2 배지는 상기 선택 제제를 포함하지 않고, 상기 체외 배양 조건은 다분화능 또는 전분화능을 유지한다)를 포함함으로써; 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 게놈에 안정적으로 편입시킨 랫트 ES 세포를 선택할 수 있다. 적중된 유전자 변형을 갖는 상기 랫트 ES 세포를 소정의 집단에서 선택하기 위한 다양한 방법은 상기 랫트 ES 세포가 다분화능을 유지하게 하는 체외 배양 시스템을 활용할 수 있다. 따라서, 본원에서 논의된 모든 체외 배지 및 배양보조 세포가 활용될 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 및 제2 배지가 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 시간마다, 또는 그 이상의 시간마다 교체된다. 구체적 구현예에서, 제1 및 제2 배지는 24 시간마다 교체된다.
모든 적절한 선택 표지가 사용될 수 있고, 이에 상응하는 선택 제제는 상기 배지와 함께 유효한 농도로 존재할 것이다. 이와 같은 선택 표지에 본원에서 논의된 본연의, 약독화된 또는 비약독화된 선택 표지 중 어떤 것이든 포함된다. 한 구현예에서, 활용되는 선택 표지는 예를 들어 G418과 같은 항생제에 내성을 보인다. 비제한적인 선택 표지는 네오마이신 인산전달 효소 II(nptII) 또는 히그로마이신 인산전달 효소(hpt)를 포함한다.
선택 제제의 농도는 상기의 선택 표지를 가지면서 상기 배양 내 존재하는 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하는 랫트 ES 세포의 선택을 가능하게 할 정도이다. 예를 들어, G418을 활용할 경우, 선택 배지 내 G418의 농도의 범위는 약 50 ug/ml 내지 약 125 ug/ml, 약 60 ug/ml 내지 약 125ug/ml, 약 70 ug/ml 내지 약 125ug/ml, 약 80ug/ml 내지 약 125ug/ml, 약 90ug/ml 내지 약 125ug/ml, 약 100ug/ml 내지 약 125 ug/ml, 약 110 ug/ml 내지 약 125ug/ml, 약 80ug/ml 내지 약 100ug/ml, 약 65ug/ml 내지 약 85ug/ml, 약 70ug/ml 내지 약 80ug/ml일 수 있다. 한 구현예에서, 상기 배양 내 G418의 농도는 75 μg/ml이다.
상기 선택에 활용되는 배지는 상기 랫트 배아줄기세포가 다분화능을 유지하도록 한다. 이와 같은 배지는 본원의 다른 곳에서 상세히 다뤄진다.
선택 프로토콜은 상기 선택 표지를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 랫트 ES 세포의 게놈에 도입한 후 언제라도 시작될 수 있다. 특정 구현예에서, 선택 프로토콜은 랫트 ES 세포로의 선택 표지의 도입 후, 10, 15, 20, 24, 30, 35, 40, 50, 60 시간 또는 그 이상의 시간이 지나 시작된다. 한 구현예에서, 선택 프로토콜은 상기 선택 표지를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입 후 약 2일이 지나 시작된다.
G418을 활용하는 비제한적인 선택 프로토콜은 다음과 같다. 2일(선택 표지를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입 이틀 후), 상기 랫트 ES 세포의 집단은 2i 배지 및 75 μg/ml의 G418에서 배양된다. 3일, 상기 랫트 ES 세포의 집단은 G418 없이 2i 배지에서 배양된다. 4일, 상기 랫트 ES 세포의 집단은 2i 배지 및 75 μg/ml의 G418에서 배양된다. 5일, 상기 랫트 ES 세포의 집단은 G418 없이 2i 배지에서 배양된다. 6일, 상기 랫트 ES 세포의 집단은 2i 배지 및 75 μg/ml의 G418에서 배양된다. 7일, 상기 랫트 ES 세포의 집단은 G418 없이 2i 배지에서 배양된다. 8일, 상기 랫트 ES 세포의 집단은 2i 배지 및 75 μg/ml의 G418에서 배양된다. 9일, 상기 랫트 ES 세포의 집단은 G418 없이 2i 배지에서 배양된다. 10일, 상기 랫트 ES 세포의 집단은 2i 배지 및 75 μg/ml의 G418에서 배양된다. 11일, 상기 랫트 ES 세포의 집단은 G418 없이 2i 배지에서 배양된다. 12일, 확장 및 검사를 위해 콜로니가 선택된다.
상기 선택 표지를 갖는 랫트 ES 세포의 선택 후, 상기 콜로니가 확장될 수 있다. 특정 구현예에서, 확장 기간은 상기 세포의 다분화능을 유지하는 배양 조건 하에, 약 1, 2, 3, 4, 5일 이상일 수 있다. 하나의 비제한적 구현예에 있어서, 선택된 콜로니가 3일 동안 확장된다. 추가 구현예에서, 활용된 배지는 2i 배지이다. 각각의 클론이 이어서 전달되어 추가로 확장될 수 있다.
하나 이상의 적중된 유전자 변형을 갖는 랫트 ES 세포 및 세포주는 다음 특성들 중 하나 이상을 가질 수 있다:
(a) 적중된 유전자 변형 후 생식선 역량을 갖는다(상기 랫트 ES 세포가 랫트 숙주 배아에 이식되면, 상기 랫트 ES 세포주의 게놈 내 적중된 유전자 변형가 후손에 전이됨을 뜻한다);
(b) 체외에서 다분화능을 갖는다;
(c) 체외에서 전분화능을 갖는다;
(d) 체외에서 배양되면, 배양보조 세포층에 느슨하게 접착된다;
(e) 체외에서 배양되면, 체외에서 배양보조 세포층에 플레이팅된 경우, 구형 콜로니를 형성한다;
(f) 유전자 변형되어 백혈병 억제제 인자(LIF)를 발현하지 않는 배양보조 세포층을 포함하는 조건 하에 체외에서 배양될 때(상기 배지는 충분한 농도의 LIF를 포함한다), 다분화능을 유지한다;
(g) 배양보조 세포층을 포함하는 조건 하에 체외에서 배양될 때(상기 배지는 마우스 LIF 또는 이것의 활성 변종 또는 절편을 포함한다), 다분화능을 유지한다;
(h) 다음을 특징으로 하는 분자 서명을 포함한다
i) 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터류린 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합을 포함하는 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현;
ii) 부착연접 관련 단백질(Ajap1), 클라우딘 5(Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9(Arhgef9), 칼슘/칼모둘린 의존단백질 인산화효소 IV(Camk4), 에프린-A1(Efna1), EPH 수용체 A4(Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5(Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1(Igfbpl1), 인터류린 36 베타(Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파(Il28ra), 좌우 결정 인자 1(Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파(Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2(Lpar2), 신경펜트락신 수용체(Ntm), 단백질 티로신 탈인산가수분해효소 비-수용체 유형 18(Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2(Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1(Fank1), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 포크머리 상자 E1(갑상선 전사 인자 2)(Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서(enhancer-of-split)(Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1(Lef1), Sal-유사 3(Drosophila)(Sall3), SATB 호메오박스 1(Satb1), miR-632, 또는 이들의 조합을 포함하는 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상의 발현;
iii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 14에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
iv) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 14에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
v) 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현;;
vi) 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현;
vii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
viii) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 13에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현의 최소한 20배 증가;
ix) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 12에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 하나 이상의 발현의 최소한 20배 감소; 및/또는
x) F1H4 마우스 ES 세포와 비교하여, 표 12에 제시된 랫트 ES 세포-특이적 유전자 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 발현의 최소한 20배 감소;
xi) 항목 (i)-(x)의 랫트 ES 세포-특이적 유전자의 발현의 모든 조합;
xii) 상기 나열된 다분화능 표지 중 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 대해, 표 15에 표시된 다분화능 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 다분화능 순위열 참조;
xiii) 상기 나열된 중배엽 표지 중 최소한 2, 3 또는 4개에 대해, 표 15에 표시된 중배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 중배엽 순위열 참조;
xiv) 상기 나열된 내배엽 표지 중 최소한 2, 3, 4, 5 또는 6개에 대해, 표 15에 표시된 내배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 내배엽 순위열 참조;
xv) 상기 나열된 신경 표지 중 최소한 2 및 3개에 대해, 표 15에 표시된 신경 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 신경 순위열 참조;
xvi) 상기 나열된 영양외배엽 표지에 대해, 표 15에 표시된 영양외배엽 표지의 상대적 발현 수준. 상대적 발현 수준은 표 15의 영양외배엽 순위열;
xvii) 표 15에 제시된 다분화능 표지, 중배엽 표지, 내배엽 표지, 신경 표지 및/또는 영양외배엽 표지 중 하나 이상(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,2 4, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 모든 상대적 발현 수준;
xviii) 표 15에 제시된 표지들 각각의 상대적 발현 수준;
xix) 항목 xii-xiix에 제시된 표지들의 모든 조합; 및/또는
xx) 항목 i-xiix에 제시된 표지들의 모든 조합.
(i) F0 랫트 생산 능력을 갖는다;
(j) 계대배양되어 미분화 상태를 유지할 수 있다;
(k) 정상적 랫트 세포와 동일한 수의 염색체를 갖는다;
(l) 근거리분비 LIF 신호발송을 요구하지 않으며 체외에서 다분화능을 유지한다; 및/또는
(m) 자기 재생 능력을 갖는다(다분화능을 유지하면서 무한대로 분열함을 뜻한다).
iii. 발현 카세트
용어 "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열", "핵산 서열" 및 "핵산 절편"은 본원에서 서로 바꿔서 사용된다. 이와 같은 용어는 뉴클레오티드 서열 등을 아우른다. 폴리뉴클레오티드는 단일- 또는 이중-가닥으로, 임의로 합성, 비천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유한 RNA 또는 DNA의 중합체일 수 있다. DNA의 중합체 형태의 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 또는 이들의 혼합물 중 하나 이상의 절편으로 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 리보뉴클레오티드는 천연유래 분자 및 합성 유사체 모두를, 그리고 이들의 모든 조합을 포함한다. 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드는 또한, 비제한적으로, 단일가닥 형태, 이중 가닥 형태, 헤어핀, 줄기-및-루프 구조 등을 비롯하여 모든 형태의 서열을 아우른다.
추가로 재조합 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 용어 "재조합 폴리뉴클레오티드" 및 "재조합 DNA 구성체"는 본원에서 바꿔가며 사용된다. 재조합 구성체는 핵산 서열들의 인공 또는 이종 조합, 예컨대 자연에서는 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열들의 조합을 포함한다. 다른 구현예에서, 재조합 구성체는 서로 다른 공급원에서 유도된 조절 서열과 코딩 서열, 또는 동일한 공급원에서 유도되었으나, 자연에서 발견되는 것과는 다른 방식으로 배열된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 구성체는 그 자체로 사용되거나, 또는 벡터와 연계하여 사용될 수 있다. 벡터가 사용되는 경우, 벡터의 선택은 당해기술의 숙련가에게 알려진 바와 같이, 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용되는 방법에 따라 달라진다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 숙주 세포를 성공적으로 형질전환하고, 선택하고, 증식시키는 데 요구되며, 본원에 제공된 모든 단리된 핵산 절편을 포함하는 유전 요소들. 검사는 무엇보다도, DNA의 Southern 분석, mRNA 발현의 Northern 분석, 단백질 발현의 면역 블로팅법 분석 또는 표현형 분석에 의해 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 성분들 중 하나 이상이 랫트 세포에서의 발현을 위한 발현 카세트에 제공될 수 있다. 상기 카세트는 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 5' 및 3' 조절 서열을 포함할 수 있다. "작동 가능하게 연결된"이란 둘 이상의 요소들 사이의 기능적 연결을 의미한다. 예를 들어, 관심대상인 폴리뉴클레오티드와 조절 서열(즉, 프로모터) 사이의 작동 가능한 연결은 관심대상인 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 기능적 연결이다. 작동 가능하게 연결된 요소들은 근접하거나 또는 근접하지 않을 수 있다. 두 개의 단백질 코딩 영역의 결합을 명시하기 위해 사용될때," 작동 가능하게 연결된"이란 코딩 영역이 동일한 판독 프레임에 존재함을 의미한다. 또 다른 경우에는, 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 적절한 전사 조절을 보유하기 위해, 조절 서열(예컨대, 프로모터, 인핸서, 사이렌서(silencer) 서열, 등)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 카세트는 부가적으로 관심대상인 최소한 하나의 부가적 폴리뉴클레오티드를 함유하여, 이것을 상기 랫트 ES 세포에 공동 도입할 수 있다. 선택적으로, 관심대상인 상기의 부가적 폴리뉴클레오티드은 다수의 발현 카세트에 제공될 수 있다. 이와 같은 발현 카세트에, 조절 영역의 전사 조절 하에 있게 될 재조합 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위해, 다수의 제한 위치 및/또는 재조합 위치가 제공된다. 상기 발현 카세트는 부가적으로 선택 표지 유전자를 함유할 수 있다.
상기 발현 카세트는 전사의 5'-3' 방향으로, 관심대상인 포유류 세포 또는 숙주 세포에서 기능적인 전사 및 번역 개시 영역(즉, a 프로모터), 본원에 제공된 재조합 폴리뉴클레오티드 및 전사 및 번역 종결 영역(즉, 종결 영역)을 포함할 수 있다. 조절 영역(즉, 프로모터, 전사 조절 영역 및 번역 종결 영역) 및/또는 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주 세포의 또는 서로의 본연의 것/유사체일 수 있다. 선택적으로, 상기 조절 영역 및/또는 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주 세포의, 또는 서로의 이종일 수 있다. 예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 상기 폴리뉴클레오티드가 유도된 종과 다른 종에서 유래된 것이고, 만약 동일/유사한 종에서 유래된 것일 경우, 하나 또는 둘 다는 그들의 원래 형태 및/또는 게놈 유전자자리에서 실질적으로 변이되거나, 또는 상기 프로모터는 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드용 본연의 프로모터가 아니다. 선택적으로, 상기 조절 영역 및/또는 본원에 제공된 재조합 폴리뉴클레오티드는 전적으로 합성된 것일 수 있다.
상기 종결 영역은 전사 개시 영역과 함께 본연의 것일 수도 있고, 작동가능하게 연결된 재조합 폴리뉴클레오티드와 함께 본연의 것일 수도 있고, 상기 숙주 세포와 함께 본연의 것일 수도 있고, 또는 또 다른 공급원(즉, 외래종 또는 이종)에서 상기 프로모터, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드, 상기 숙주 세포 또는 이들의 모든 조합으로 유도된 것일 수도 있다.
발현 카세트를 준비할 때, 적절한 방향으로 DNA 서열을 배치시킬 수 있게, 상기의 다양한 DNA 절편이 조작될 수 있다. 이와 같은 목적을 위해, 어댑터 또는 링커가 DNA 절편들을 연결하는 데 활용될 수도 있고, 또는 기타 조작이 개입되어 편리한 제한 위치, 불필요한 DNA의 제거, 제한 위치의 제거 등을 가능하게 할 수도 있다. 이를 위해, 체외 돌연변이 유발, 프라이머 복구, 제한, 어닐링, 재치환, 예컨대, 전이 및 염기전환이 수반될 수 있다.
수많은 프로모터들이 본원에 제공되는 발현 카세트에 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 원하는 결과를 바탕으로 선택될 수 있다. 서로 다른 응용이 상기 발현 카세트에서 서로 다른 포로코터의 사용에 의해 향상되어 관심대상인 폴리뉴클레오티드의 발현의 타이밍, 발생위치 및/또는 수준을 조절할 수 있음이 이해된다. 이와 같은 발현 구성체는 또한, 바람직한 경우, 프로모터 조절 영역(예컨대, 유도가능한, 구성적인, 환경 측면 또는 발달 측면에서 조절되는, 세포- 또는 조직 -특이적/선택적 발현을 제공하는 것), 전사 개시 위치, 리보솜 결합 위치, RNA 처리 신호, 전사 종결 위치 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수도 있다.
iv. F0
랫트
배아 및 적중된 유전자 변형을 갖는 F1 후대 생성
본원에 제공되는 다양한 방법 및 조성물이 유전자 변형된 랫트를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같은 방법은 일반적으로 (a) 본원에 개시된 단리된 랫트 ES 세포의 게놈에 적중된 유전자 변형을 도입하여 유전자 변형을 갖는 랫트 ES 세포를 형성하는 단계; (b) 상기 유전자 변형을 갖는 유전자 변형된 랫트 ES 세포 중 최소한 하나를 랫트 숙주 배아에 이식하여 F0 배아를 생산하는 단계; (c) 상기 F0 배아를 대리모에 이식하는 단계; (d) 상기 F0 배아를 출산 시기까지 대리모가 품고 있게 하는 단계; 및 (e) 유전자 변형을 갖는 F0 랫트를 확인하는 단계를 포함한다.
상기 유전자 변형을 갖는 상기 유전자 변형된 랫트 ES 세포는 동일한 랫트 변종에서 유래되거나 또는 상이한 랫트 변종에서 유래되는 랫트 숙주 배아에 이식될 수 있다. 예를 들어, 유전자 변형된 DA 랫트 ES 세포는 DA 랫트 숙주 배아에 이식될 수도 있고, 또는 SD 숙주 배아, ACI 숙주 배아 또는 기타 이종 랫트 숙주 배아에 이식될 수도 있다. 이와 유사하게, 유전자 변형된 ACI 랫트 ES 세포는 ACI 랫트 숙주 배아에 도입될 수도 있고, 또는 SD 숙주 배아, DA 숙주 배아 또는 기타 이종 랫트 숙주 배아에 도입될 수도 있다. 이와 마찬가지로, 상기 대리모는 상기 유전자 변형된 랫트 세포 및/또는 상기 랫트 숙주 배아와 동일한 랫트 변종에서 유래될 수도 있고, 상기 대리모는 상기 유전자 변형된 랫트 세포 및/또는 상기 랫트 숙주 배아와 상이한 랫트 변종에서 유래될 수도 있다. 하나의 비제한적 구현예에 있어서, 상기 유전자 변형된 랫트 세포는 DA 변종에서 유래되고, 상기 숙주 랫트 배아는 SD 숙주 배아에서 유래되고, 상기 대리모는 DA 변종에서 유래된다. 또 다른 비제한적 구현예에 있어서, 상기 유전자 변형된 랫트 세포는 ACI 변종에서 유래되고, 상기 숙주 랫트 배아는 SD 변종에서 유래되고, 상기 대리모는 DA 변종에서 유래된다.
또 다른 추가 구현예에서, 상기 키메라 랫트(F0)가 사육되어 상기 적중된 유전자 변형에 대해 이형접합적인 F1 후대를 생산할 수 있다. 또한, 상기 F1 후대의 수컷 랫트를 F1 후대의 암컷 랫트와 교배시켜 상기 유전자 변형에 대해 동형접합적인 F2 후대를 획득할 수 있다.
본원에 제공되는 방법 및 조성물은 유전자 변형을 갖는 F0 F0 랫트 중 최소한 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 그 이상이 상기 유전자 변형을 F1 후대에 전이할 수 있게 허용한다.
일부 구현예에서, 상기 적중된 유전자 변형을 갖는 상기 랫트 ES 세포는 상응하는 생명체에서 유래된 전-상실기 배아, 예컨대. 8-세포 단계 마우스 배아에 도입된다. 예컨대, US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754 및 US 2008-0078000 A1(이들 모두 본원에 그 전체가 참조로 편입되었음) 참조. 다른 구현예에서, 상기 공여 랫트 ES 세포는 상기 숙주 배아의 4 세포 단계, 8 세포 단계에서 이식될 수 있다.
상기의 유전자 변형된 랫트 ES 세포를 포함하는 랫트 배아는 배반포 단계까지 배양된 후, 대리모에 이식되어 F0을 생산한다. 유전자 변형된 게놈 유전자자리를 품은 랫트는 본원에 기술된 바와 같이 대립형질 유전자(MOA) 분석의 변형을 통해 확인될 수 있다. 유전자 변형된 랫트 ES 세포에서 유도된 수득된 F0 생성이 야생형 랫트와 이종 교배하여 F1 생성 후손을 획득한다. 특정 프라이머 및/또는 프로브와의 유전형 이후, 유전자 변형된 게놈 유전자자리에 이형접합적인 F1 랫트는 서로 이종 교배하여 유전자 변형된 게놈 유전자 자리에 동형접합적인 랫트를 생산한다.
본원에 제공되는 랫트 ES 세포 중 어느 하나를 포함하는 최소한 하나의 이종 줄기 세포를 갖는 내부 세포 질량을 포함하는 F0 랫트 배아가 추가로 제공된다. 다른 구현예에서, 랫트 F0 배아의 후대가 제공되는데, F0 후대의 최소한 50%, 60%, 70%이상이 본원에 개시된 바와 같은 유전자 변형된 랫트 ES 세포에서 유도된다.
한 측면에서, 랫트 ES 세포를 제조하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 상실기 랫트 배아, 배반포기 랫트 배아, 또는 상실기 배아 및 배반포기 배아 사이의 발단 달계에 위치한 랫트 배아에서 랫트 세포를 유도하는 단계; 및 다분화능 및/또는 전분화능을 유지하기에 충분한 조건 하에 상기 랫트 배아에서 랫트 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 다분화능 및/또는 전분화능을 유지하기에 충분한 조건은 2i 배지를 포함한다.
한 측면에서, 유전자 변형된 랫트를 제조하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 관심 대상의 핵산 서열로 랫트 ES 세포 게놈을 변이시켜 변이된 랫트 ES 세포를 형성하고, 상기 변이된 랫트 ES 세포를 공여 랫트 ES 세포로 활용하여, 상기 랫트 공여 ES 세포를 랫트 숙주 배아와 혼합하고, 상기 공여 ES 세포와 랫트 숙주 배아를 배양하여, 상기 배양된 숙주 배아를 활용하여 유전자 변형된 랫트를 제조하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 유전자 변형된 랫트 F1 후대를 제조하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 관심 대상의 핵산 서열로 랫트 ES 세포 게놈을 변이시켜 변이된 랫트 ES 세포를 형성하고, 상기 변이된 랫트 ES 세포를 공여 랫트 ES 세포로 활용하여, 상기 랫트 공여 ES 세포를 랫트 숙주 배아와 혼합하고, 상기 공여 ES 세포와 랫트 숙주배아를 배양하여, 상기 배양된 숙주 배아를 활용하여 유전자 변형된 랫트를 제조하는 단계를 포함하고, 상기 후대는 약 3%, 약 10%이상 또는 약 63%이상이 유전자 변형된 공여 랫트 ES 세포에서 유도된다.
한 구현예에서, 상기 배양된 숙주 배아는 랫트 대리모에 이식되어, 대리모에 착상된다.
한 측면에서, 유전자 변형을 랫트 다분화능 세포에서 랫트 후대로 높은 빈도로 전이하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 박테리아 인공 염색체 상에서 핵산 서열로 다분화능 랫트 세포를 유전자 변형시켜 유전자 변형된 랫트 다분화능 세포를 형성하고, 상기 유전자 변형된 랫트 다분화능 세포를 랫트 숙주 배아와 함께 랫트 대리모에서 활용하여 상기 유전자 변형을 포함하는 후대를 생성하고, 임의로 상기 후대를 교배시키는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 랫트 ES 세포를 제조하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 동결된 8-세포 단계 배아를 배반포 단계로 배양하고, 배양된 배반포에서 랫트 세포를 유도하고, 다분화능 및/또는 전분화능을 유지하기에 충분한 조건 하에 상기 랫트 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
V. 변종, 절편 및 서열 동일성
개시된 LIF 폴리펩티드, 특히 마우스 LIF 폴리펩티드의 활성 변종 및 절편이 본원에 제공된다. "변종"은 실질적으로 유사한 서열을 가리킨다. 본원에 사용되는 "변종 폴리펩티드"는 본연의 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 종단에서 하나 이상의 아미노산의 결실(소위 절단); 상기 본연의 단백질의 하나 이상의 내부 위치에서 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 첨가; 또는 본연의 단백질의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 상기의 본연의 단백질에서 유도된 폴리펩티드를 뜻하는 것이다. 변종 폴리펩티드는 계속해서 본연의 폴리펩티드의 바람직한 생물학적 확성을 보유한다. 즉, 랫트 및/또는 마우스 배아줄기세포의 분화를 억제하고, 줄기 세포 자기 재생에 기여한다. 본원에 개시된 폴리펩티드의 변종(즉 서열식별 번호: 1 또는 SwissProt 승인번호. P09056)은 전형적으로 기준 서열과 최소한 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%이상의 서열 동일성을 갖는다.
용어 "절편"은 명시된 수의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산의 일부분을 가리킨다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드의 절편은 전장 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하면서, 랫트 및/또는 마우스 배아줄기세포의 분화를 억제하고 줄기 세포 자기 재생에 기여할 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩티드 서열의 절편(즉 서열식별 번호: 1 또는 SwissProt 승인 번호. P09056)은 인접한 아미노산을 최소한 10, 15, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 개 포함하거나 또는 전장 단백질에 존재하는 아미노산의 총 개수만큼 포함할 수 있다.
두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서, 본원에서 사용되는 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교창에서 최대 상응도에 따라 배열될 때, 동일한 두 개의 서열에서의 잔기들을 가리킨다. 서열 동일성의 퍼센트가 단백질과 관련하여 사용되면, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예컨대, 전하량 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 그럼으로써 상기 분자의 기능성 특성을 변형시키지 않는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. 서열들이 보존적 치환에서 다를 경우, 서열 동일성의 퍼센트는 상기 치환의 보존적 속성에 대한 보정을 위해 상향 조정될 수 있다. 이와 같은 보존적 치환에 의해 달라지는 서열들은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 이야기된다. 이와 같은 조정을 하기 위한 수단들이 당해기술의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 보존적 치환을 완전한 불일치라기보다 부분적 불일치로 점수를 매김으로써, 서열 동일성의 퍼센트를 증가시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산이 주어질 경우, 1점이고, 비-보존적 치환이 주어진 경우, 0점이며, 보존적 치환이 주어진 경우, 0점에서 1점 사이다. 보존적 치환의 점수 매기기는 예컨대, 프로그램 PC/유전자(Intelligenetics, Mountain View, California)에서 구현되는 바와 같이 계산된다.
본원에서 사용되는 "서열 동일성의 퍼센트"는 비교 창에서 최적의 상태로 배열된 두 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하는데, 두 서열의 최적의 배열에 있어서, 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교할 때, 비교 창에서 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 첨가 또는 결실(즉, 간극)을 포함할 수 있다. 상기 퍼센트는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 수를 판단하여 일치되는 위치의 수를 획득하고, 일치되는 위치의 수를 비교 창에서의 위치의 총합으로 나누고, 이어서 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 획득하는 방식으로 계산된다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 제공된 서열 동일성/유사성 값은 다음의 매개변수를 사용하여 GAP Version 10을 사용함으로써 획득된 값을 가리킨다: GAP 가중치 50 및 길이 가중치 3을 사용하는 뉴클레오티드 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성 및 nwsgapdna.cmp 점수 행렬; GAP 가중치 8 및 길이 가중치 2를 사용하는 아미노산 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성, 및 BLOSUM62 점수 행렬; 또는 이들과 동등한 모든 프로그램. "동등한 프로그램"이란 문제의 두 서열에 대해, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 일치 및, GAP Version 10에 의해 생성된 상응하는 배열과 비교 시, 동일한 서열 동일성을 갖는 배열을 생성하는 모든 서열 비교 프로그램을 의미한다.
다음 실시예들은 비제한적인 방식으로 설명을 위해 제공된다.
실시예
실시예
1:
랫트
ES
세포 유도.
rESC 특징화. 도 1에 나타난 바와 같이, rESC는 접시에서 정기적으로 자리를 이탈하여 부유하는 조밀한 구형 콜로니로 성장한다(클로즈업, 도 4). . B, C, F, G: rESC 는 Oct-4(도 2a) 및 Sox2(도 2b)를 포함하는 다분화능 표지를 발현하고, 높은 수치의 알칼리성 인산가수분해효소(도 3, 왼쪽 패널)를 발현한다. 세포주 DA.2B에 대한 핵형은 42X,Y(도 3, 오른쪽 패널)이다. rESC는 종종 사배체가 되며; 따라서 세포주는 중기 염색체 전개의 개수를 셈으로써, 사전검사를 받고; 가장 정상적인 개체수를 갖는 세포주가 이어서 공식적으로 핵형분석되었다.
구입한 과배란처리된 암컷에서 ACI 배반포를 획득하고; DA 모세포를 구입한 동결된 8-세포 배아에서 배양하였다. 산성 타이로드액으로 투명대를 제거하고, 배반포를 유사분열 시 비활성화된 MEF 상에 플레이팅하였다. 파생물을 집어내어 표준 방법을 사용하여 확장시켰다. 모든 배반포를 플레이팅하고, 2i 배지를 사용하여 배양 및 확장시켰다 (Li 등 (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts, Cell 135:1299-1310 본원에 참조로 편입됨).
실시예
2:
랫트
생산
배반포 주입 및 생식선을 통한 rESC 게놈의 전이에 의해 키메라 랫트를 생산하였다. 모체 ACI.G1 rESC를 사용한 배반포 미량주입법에 의해 생산된 키메라를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 별표(*)가 붙은 ACI/SD 키메라의 후손인 F1 아구티 알비노 한배 새끼들을 도 6에 나타내었다.
모체 rESC의 생식선 전이. 알비노 SD 배반포로의 미량주입법에 의해 다분화능에 대해 세 정배수체 rESC 세포주를 평가하였다. rESC 기여를 나타내는 아구티 코트 색으로 키메라를 확인하였다. 각각의 세포주의 경우, 다수의 키메라가 사기 rESC 게놈을 F1 후손에 전이하였다(표 4).
실시예
3:
rESC
적중:
랫트
Rosa 26 유전자자리.
rRosa26 유전자자리는 마우스에서와 마찬가지로, 동일한 이격간격으로, Setd5 및 Thumpd3 유전자 사이에 놓인다. rRosa 26 유전자자리(도 7, 패널 B)는 mRosa 26 유전자자리(도 7, 패널 A)와 다르다. mRosa26 전사물은 2 또는 3개의 엑손으로 구성된다. 상기 랫트 유전자자리는 제2 엑손 1(Ex1b)을 포함하고, 또한 상동 엑손에 마우스 엑손1(Ex1a)을 포함한다. 제3 엑손을 랫트에서 확인되지 않았다. rRosa26 대립형질 유전자의 적중을 도 7, 패널 C에 묘사했는데, 각각 5kb의 상동 염기서열을 DA rESC에서 유래된 게놈 DNA를 사용하는 PCR에 의해 복제하였다. 상기 적중된 대립형질 유전자는 rRosa26 인트론에서 117bp 결실을 대체하는 SA-lacZ-hUb-neo 카세트를 함유한다.
rRosa 26 유전자자리에서의 적중 효율을 결정하였다(표 5). 선형화된 벡터를 DA 또는 ACI rESC로 전기천공하고, 형질전환된 콜로니를 표준 기법을 사용하여, 2i 배지 + G418에서 배양하였다. 개별 콜로니를 선택하고
대립형질 유전자 손실(LOA)분석 (Valenzuela, D. 등 (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21:652-660, 본원에 참조로 편입됨)을 사용하여 검사하였다.
적중된 Rosa26 rESC를 사용한 키메라 생산 및 생식선 전이 재확인된 적중된 rRosa26 블론을 SD 배반포에 미량주입하고, 이어서 표준 기법을 사용하여, 가상임신 DS 수용체 암컷에 옮겼다. 코트 색으로 키메라를 확인하고; 수컷F0 키메라를 SD 암컷과 교배시켰다. 생식선(아구티) F1 새끼가 적중된 Rosa26 대립형질 유전자의 존재에 대해 유전자형화되었고; 22마리 아구티 새끼 중 9마리가 Rosa26 유전자자리에서 이형접합적으로 유전자형화되었다(표 6).
실시예
3:
랫트
배아줄기세포의 유도.
과배란
프로토콜,
랫트
0일: 임신 말 혈청으로 주입: IP, 20 U(0.4 ml).
1일: 작용 없음
2일:(46시간 후): hCG 주입, IP, 50 U(1 ml).
- - 단일 암컷 교미 세팅.
3일: 플러그(plugs) 검사. 암컷에 플러그를 시행했다. 이것은 0.5일이다.
6일(e3.5): 암컷을 안락사 시키고 배아를 씻어 내렸다.
ES
세포 유도 프로토콜(
과배란
)
0일:
1) 암컷 랫트를 CO2로 안락사시킴.
2) 70% 에탄올을 적신 면봉으로 배를 닦고; 가위를 사용하여 복부 체벽을 열어 내장을 노출시켰다.
3) 난관과 자궁각을 절제하고, 이들을 따뜻한 N2B27 배지가 담긴 조직 배양 접시에 담았다. 가능한 한 많은 피를 세척해 낸 뒤, N2B27이 담긴 새 접시에 옮겼다.
4) 1 ml 주사기와 뭉뚝한 27g 바늘을 사용하여, 자궁각 및 난관을 통해 배지를 흘려 내려서 배반포를 상기 배지로 밀어냈다.
5) 마우스 피펫으로 상기 배반포를 수집하여 KSOM + 2i(1mMPD0325901, 3 mM CHIR99021)이 담긴 배아 배양 접시에 옮겨 담았다. KSOM은 Millipore가 제조한 배지이다. 카탈로그 번호는 MR-106-D이다.
6) 37°; 7.5% CO2에서 밤새 배양하였다.
ES
세포 유도 프로토콜(동결된 배아)
0일:
1) 동결된 8-세포 배아(구입)을 M2 배지에서 해빙하였다. 실온에서 10분 동안 배양하였다.
2) KSOM + 2i에 옮겨 담고, 밤새 배양하였다.
ES
세포 유도 프로토콜(양쪽 모두 동일)
1일:
1) 공동이 생긴 배아를 2i 배지에 옮겨, 밤새 배양하였다.
2) 공동이 생기지 않은 배아를 KSOM +2i에서 계속 배양하였다.
2일:
1) 남아 있는 모든 배아를 2i 배지에 옮겼다(공동이 생겼든 생기지 않았든 상관없이).
2) 밤새 배양하였다; 초기 배아를 2i 배지에서 계속 배양하였다.
3일:
1) 배아를 30~60초 동안 산성 타이로드액에 옮겨 투명대를 제거하였다.
2) 배아를 3회 2i 배지로 세척하여 산성 타이로드액을 제거하였다.
3) 96-웰 배양보조 플레이트 중 개별적인 웰에 각 배아를 넣었다(각 웰은 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)의 단일층을 함유한다).
4) 2i 배지에서 밤새 배양하였다.
4일 - 5일:
1) 파생물(비정질 미분화 질량의 세포)의 존재 여부에 대해 플레이팅된 배아를 모니터링하였다. 파생물은 플레이팅된 배아 크기가 대략 2배가 되었을 때, 옮길 준비가 된 것이다.
2) 매일: 마이크로피펫으로 사용된 배지를 제거하고 신선한 2i 배지로 교체하였다.
3) 파생물을 새로운 배양보조 웰에 옮겨 담았다:
a. 사용된 배지를 제거하고, 웰을 PBS로 조심스럽게 세척하였다.
b. PBS를 제거하고, 30 μl 0.05% 트립신을 첨가하였다; 10분 동안 배양하였다.
c. 30μl 2i + 10% FBS를 첨가하여 트립신 반응을 중단시켰다.
d. 마이크로피켓으로 조심스럽게 상기 세포를 분해하고 상기 웰의 내용물 전부를 24-웰 배양보조 플레이트에 있는 새 웰에 옮겨 담았다. 이것은 계대배양 1(P1)이었다.
e. 2i 배지에서 밤새 배양하였다.
5일~8일:(시기는 각각의 세포주가 얼마나 빨리 확장하는지에 따라 달라진다)
1) 매일 배지를 바꿔주고(2i 배지) ESC 형태의 콜로니의 존재를 모니터링하였다.
2) 콜로니가 나타나면 콜로니가 50% 이상 세포군집에 도달할 때까지 배양하였다.
3) 이전처럼 콜로니를 트립신화하고 계대배양하였다; 6-웰 접시에 있는, 배양보조 상에, 각 세포주를 각 1웰에 플레이팅하였다. 이것은 계대배양 2(P2)였다.
진행중:
1) 대략 50% 세포군집에 도달할 때까지 각각의 세포주를 계속 공급 및 모니터링하였다.
2) 이전과 마찬가지로 세포를 트립신화하였다.
3) 2i + 10% FBS로 트립신 반응을 중단시키고; 원심 분리(5', 1200 rpm, Beckman-Coulter 테이블탑 원심분리기)로 세포를 펠릿화하였다.
4) 상등액을 흡입하여 상기 세포를 400 ml 동결 배지(70% 2i, 20% FBS, 10% DMSO)에 조심스럽게 재현탁하였다.
5) 상기 세포를 2개의 유리병에 나눠 담고 -80°에서 동결하였다. 이것은 계대배양 3(P3)였다.
6) 장기 보관을 위해, 상기 유리병을 질소 N2 보관하였다.
상기 2i 배지를 표 7에서와 같이 제조하였다.
| 시약 | 공급처 | 농도 |
| DMEM/F12 기본 배지 | Invitrogen/Life Technologies | 1x |
| 신경기본 배지 | Invitrogen/Life Technologies | 1x |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Invitrogen/Life Technologies | 1% |
| L-글루타민 | Invitrogen/Life Technologies | 4 mM |
| 2-메르캅토에탄올 | Invitrogen/Life Technologies | 0.1 mM |
| N2 보충제 | Invitrogen/Life Technologies | 1x |
| B27 보충제 | Invitrogen/Life Technologies | 1x |
| LIF | Millipore | 100 U/ml |
| PD0325901 (MEK 억제제). | Stemgent | 1 uM |
| CHIR99021 (GSK 억제제). | Stemgent | 3 uM |
재료: 임신 말 혈청 성선자극호르몬(PMSG)
인간 임신 소변 융모성 생식선 자극호르몬(HCG)
암컷 랫트(5~12주령)
수컷 랫트(12 주령 내지 8개월령), 우리당 한 마리
주사기/주사바늘
6시부터 18시까지 빛이 들어오는 동물실
절차:
1일: 8:00-10:00 AM
암컷에게 20 IU PMSG(0.4 ml) 복강내 주입
사용되지 않은 PMSG 폐기.
3일: 8:00-10:00 AM(PMSG 주입 48 시간 후)
암컷에게 50 IU HCG(1 ml) 복강내 주입
교배 우리에 수컷 한 마리당 암컷 한 마리 넣음
사용되지 않은 HCG 폐기.
4일: 8:00-10:00 AM(HCG 주입 24시간 후)
암컷의 플러그 여부 확인.
호르몬 공급처
PMSG: Sigma #G-4877 (1000 IU). 50 IU/ml의 최종 [ ]로 PBS에 재현탁. 1 ml 분취액 내에 -20°에서 보관.
HCG: Sigma #CG-5 (5000 IU). 50 IU/ml의 최종 [ ]로 PBS에 재현탁. 1 ml 분취액 내에 -20°에서 보관.
실시예
4:
랫트
배아줄기세포주의
핵형분석
본원에서 생성한 상기 랫트 ES 세포주를 핵형분석하여, 그 결과를 표 8~표 11에 요약하여 표시하였다.
표 8
표 9
표 10
표 11
실시예
5:
랫트
배아줄기세포로의 벡터의 전기 천공
1. 전기천공하기 24~48시간 전에 랫트 ES 세포를 계대배양하였다.
2. 전기천공하기 24시간 전에 배지를 RVG2i + ROCKi(10μM Y-27632)로 교체하였다.
3. 트립신화 30분 전에 배지를 교체하였다.
4. 전기천공될 DNA 를 분취하였다.
5. DNA가 실온으로 따뜻해지도록 10분 이상 동안 두었다.
6. DNA를 5분 동안 62°C에서 분취하였다. DNA를 얼음 위에 두었다.
7. 트립신화된 세포:
a. 부유하는 콜로니를 수집하였다. 플레이트를 세척하여 가능한 한 많은 부유물을 수집하였다.
b. 콜로니를 펠릿화하였다: 750 rpm으로 3분 동안.
c. 펠릿을 1회 5~10ml의 PBS로 세척한 후, 다시 회전시커거나 다시 펠릿화하였다.
d. 상등액을 흡입하여 500λ 트립신, 0.05% + 1% 닭 혈청을 첨가하였다.
i. 한 수조에 110 cm 이상의 콜로니 플레이트를 모으지 않았다. 트립산화 동안 상기 수조의 바닥에 너무 많은 콜로니가 쌓이면, 이들은 덩어리를 형성하고, 상기 세포의 대부분이 상실될 수 있다.
e. 37°에서 4분 동안. 수회 콜로니를 피펫팅하여 덩어리가 되는 것을 최소화하였다.
f. 단계 1-2 X를 반복하였다: 37°에서 4분 동안.
g. 500λ RVG2i + 10% FBS로 트립신 반응을 중단시켰다.
8. 세포를 펠릿화하였다: 1200 rpm으로 5분 동안.
9. 세포를 10 ml PBS에 재현탁하였다. 두 개의 20λ 분취액을 세어 총 세포 개수를 결정하였다.
10. 세포를 펠릿화하였다(5'/1200rpm); 총 세포 개수 및 총 재현탁 부피를 계산하여 올바른 세포 농도(적중 #/75 μl EP 완충용액)를 달성하였다.
11. 최소 부피의 EP 완충용액에 재현탁하고; 총 부피를 측정하고, EP 완충용액으로 목표 부피로 조절하였다. 전기천공 완충용액은 Millipore에서 판매한다. 상기 카탈로그 번호는 ES-003-D이다. Valenzuela 등(2003) Nature Biotechnology 21:652-659(본원에 참조로 편입됨) 참조.
12. 75λ 세포를 50λ DNA에 첨가; 125λ 세포/DNA 용액을 BTX 48-웰 큐벳의 하나의 웰에 옮김
a. 동일한 컬럼의 빈 웰들을 125l EP 완충용액으로 채웠다.
13. BTX 전기 천공기에서 상기 큐벳을 1회 흔들었다:
a. 세팅: 400V; ; 100 F (세팅은 다양할 수 있다)
14. 큐벳을 15분 동안 얼음 위에 두어 회수하였다.
15. 세포를 5 ml RVG2i + 10M ROCKi로 옮겨 담았다.
16. 15 cm 플레이트에 20 ml RVG2i + 10M ROCKi을 첨가하였다. 플레이트는 2x neoR MEFs(또는 프로젝트에 의존적인 기타 MEFs)를 갖는다. neoR 선택가능 표지는 Beck 등(1982) Gene, 19:327-36 또는 US Patent No, 7,205,148 또는 6,596,541(각각은 본원에 참조로 편입됨)의 네오마이신 인산전달 효소(neo) 유전자 이다.
17. 37°에서 배양하였다. 48시간 후 선택을 시작한다.
사용한 ROCK 억제제는 Y-27632였다.
실시예
6:
랫트
배아줄기세포에서의 적중된 유전자 변형의 선택.
1. 전기천공 24~48시간 전에 세포를 계대배양하였다.
2. 배지를 전기천공 24시간 전에 RVG2i + ROCKi (10μM Y-27632)로 교체하였다.
3. 트립신화 30분 전에 배지를 교체하였다.
4. 전기천공될 DNA 를 분취하였다.
5. 10분 이상 동안 DNA가 실온으로 데워지도록 방치하였다.
6. DNA를 5분 동안 62°C에서 분취하였다. DNA를 얼음 위에 두었다.
7. 트립신화된 세포:
h. 부유하는 콜로니를 수집하였다. 플레이트를 세척하여 가능한 한 많은 부유물을 수집하였다.
i. 콜로니를 펠릿화하였다: 750 rpm으로 3분 동안.
j. 펠릿을 1회 5~10ml의 PBS로 세척한 후, 다시 회전시커거나 다시 펠릿화하였다.
k. 상등액을 흡입하여 500λ 트립신, 0.05% + 1% 닭 혈청을 첨가하였다.
i. 한 수조에 110 cm 이상의 콜로니 플레이트를 모으지 않았다. 트립산화 동안 상기 수조의 바닥에 너무 많은 콜로니가 쌓이면, 이들은 덩어리를 혀성하고, 상기 세포의 대부분이 상실될 수 있다.
l. 37°에서 4분 동안. 콜로니를 여러 차례 피펫팅하여 덩어리지는 것을 최소화하였다.
m. 1-2 X를 반복하였다: 37°에서 4분 동안.
n. 500λ RVG2i + 10% FBS로 트립신 반응을 중단시켰다.
8. 세포를 펠릿화하였다: 1200 rpm으로 5분 동안.
9. 세포를 10 μl PBS에 재현탁하였다. 두 개의 20λ 분취액을 세어 총 세포 개수를 결정하였다.
10. 세포를 펠릿화하였다(5'/1200rpm); 총 세포 개수 및 총 재현탁 부피를 계산하여 올바른 세포 농도(적중 #/75 μl EP 완충용액)를 달성하였다.
11. 최소한의 부피의 EP 완충용액에 재현탁하고; 총 부피를 측정하여 EP 완충용액으로 표적 부피로 조절하였다.
12. 75λ 세포를 50λ DNA에 첨가하고; 125λ 세포/DNA 용액을 BTX 48-웰 큐벳의 한 웰에 옮겨 담았다.
a. 동일한 컬럼의 비어 있는 웰에 125λ EP 완충용액을 채웠다.
13. BTX 전기 천공기에서 상기 큐벳을 1회 흔들었다:
a. 세팅: 400V; 400V; ; 100 μF (세팅을 다양할 수있다)
14. 큐벳을 15분 동안 얼음 위에 두어 회수하였다.
15. 세포를 5 ml RVG2i + 10μM ROCKi로 옮겨 담았다.
16. 15 cm 플레이트에 20 ml RVG2i + 10μM ROCKi을 첨가하였다. 플레이트는 2x neoR MEFs(또는 프로젝트에 의존하는 기타 MEFs)를 가졌다.
17. 37°에서 배양하였다. 48시간 후, 선택을 시작하였다.
18. G418 선택 프로토콜은 다음과 같았다:
a. 2일( EP하고 이틀 후): 세포를 2i 배지 + G418, 75 μg/ml에서 배양하였다.
b. 3일: 세포를 G418 없이 2i 배지에서 배양하였다.
c. 4일: 2i 배지 + G418, 75 μg/ml에서 세포를 배양하였다.
d. 5일: 세포를 G418 없이 2i 배지에서 배양하였다.
e. 6일: 세포를 2i 배지 + G418, 75 μg/ml에서 배양하였다.
f. 7일: 세포를 G418 없이 2i 배지에서 배양하였다.
g. 8일: 세포를 2i 배지 + G418, 75 μg/ml에서 배양하였다.
h. 9일: 세포를 G418 없이 2i 배지에서 배양하였다.
i. 10일: 세포를 2i 배지 + G418, 75 μg/ml에서 배양하였다.
j. 11일: 세포를 G418 없이 2i 배지에서 배양하였다.
k. 12일: 콜로니를 선택하여 검사를 위해 확장시켰다. 각 콜로니를 0.05% 트립신 + 1% 닭 혈청에서 10분 동안 분해하고, 이어서 96-웰 배양보조 플레이트의 하나의 웰에 플레이팅하였다.
19. 2i 배지에서 3일 동안 콜로니를 확장하였다.
20. 클론을 새로운 96-웰 배양보조 플레이트에 1:1 계대배양하였다.
21. 2i 배지에서 클론을 3일 동안 확장시켰다.
22. 각각의 클론에 대해, 트립신에서 콜로니를 분해하였다. 각 클론의 2/3를 동결하고 -80°에서 보관하였다; 남은 1/3을 라미닌 플레이트(10 μg/ml 라미닌으로 코팅한 96-웰플레이트)에 플레이팅하였다.
23. 상기 라미닌 플레이트가 세포군집이 되면, 클론의 유전형화를 위해 검사 실험실로 보냈다.
실시예
7.
랫트
배아줄기세포의 분자 서명
표 13에 나열된 유전자를 마우스 ES 세포의 상응하는 유전자보다 20배 더 높은 수준으로 랫트 ES 세포에서 발현하였다. 표 12에 나열된 유전자를 마우스 ES 세포의 상응하는 유전자보다 20배 낮은 수준으로 랫트 ES 세포에서 발현하였다.
표 12 및 표 13의 마이크로어레이 데이터를 다음과 같은 방식으로 생성하였다.랫트 ES 세포(ACI.G2 및 DA.2B) 및 마우스 ES 세포(F1H4)를 세포군집이 될때 까지, 계대배양 3회 동안 2i 배지에서 배양하였다. F1H4 세포를 배양보조의 부재 하에, 젤라틴-코팅된 플레이트에서 배양하였다. F1H4 마우스 ES 세포를 129S6/SvEvTac 및 C57BL/6NTac 이형접합적 배아(예컨대, US Pat. No. 7,294,754 and Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela,D.M.(2007), 본원에 전체가 참조로 편입됨)에서 유도하였다.
샘플 준비를 위해 다음 프로토콜을 사용하였다:
재료에는 트리졸 Reagnetp; RNA 용균 완충용액(Zymo Kit); 및 1.5 mL Eppendorf 시험관이 포함된다.
1.5mL Eppendorf 시험관에 샘플 ID를 표지하였다. 플레이트에서 성장한 세포를 37C PBS에서 헹구었다. PBS를 제거하고, 트리졸 300 ul를 첨가하였다. 스크레이퍼를 사용하여 트리졸에서 세포를 절단하였다. 용균된 세포를 1.5mL Epperdorf 시험관에서 트리졸 내에 수집하였다. 현탁상에서 성장한 세포의 경우, 상기 세포를 37C PBS에서 헹구었다. 상기 세포를 1.5mL 시험관에 수집하고, 상기 세포를 스핀다운하고, PBS를 제거하고 트리졸 300 ul를 첨가하였다. 상기 세포를 위아래로 피펫팅하여 세포를 절단하였다. 101 내지 105 세포를 가진 FACS에 대한 시료를 분리하고, 상기 부피를 100uL미만으로 농축시켰다. RNA 용균 완충용액의 4 부피를 첨가하여 피펫팅으로 혼합하였다. 예를 들어, RNA 용균 완충용액 320uL을 샘플 80uL에 첨가하였다. 샘플을-20°C에 보관하였다.
RNA-Seq를 사용하여 마우스 및 랫트 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 서열 판독치(Sequencing reads)를 Tophat에 의해 마우스 및 랫트 기준 게놈에 매핑하고, 마우스 및 랫트 유전자에 대한 RPKM(매핑된 백만 절편 당 엑손 킬로베이스 당 절편)를 계산하였다. 유전자 부호를 기반한 상동 유전자를 선택하고, 이어서 t-검정을 사용하여 마우스와 랫트 사이의 유전자 발현 수준을 비교하였다.
miR-632는 랫트 ESCs에서 가장 높은 수준으로 발현된 상위 10위에 속하고, 이들은 마우스 ES 세포에서 발현되지 않았다. 따라서 이들 유전자에 대한 비교 데이터가 존재하지 않는다. 기타 유전자와 비교한 발현 수준 및 배아 발달에서 이들의 잘 알려진 기능을 기반으로, miR-632의 발현을 랫트 ES 세포에 대한 표지로 활용하였다.
표 12. 나열된 유전자를 마우스 ES 세포의 상응하는 유전자보다 20배 낮은 수준으로 랫트 ES 세포에서 발현하였다.
표 13. 나열된 유전자를 마우스 ES 세포의 상응 유전자보다 20배 높은 수준으로 래트 ES 세포에서 발현하였다.
표 14. 마우스 ES 세포의 상응하는 유전자보다 20배 더 높은 수준으로 래트 ES 세포에서 발현되는 표 13의 유전자 하위세트.
랫트 ES 세포에 대한 다분화능 표지/유전자를 활용하는 추가적인 분자 서명이 개발되어 왔다. 표 15는 RNA 프로파일링 데이터로부터 유전자 목록과 각 항목의 발현 순위를 제공한다. mRNA를 랫트 ES 세포에서 단리하여, 다양한 다분화능 표지의 발현 수준을 서로 상대적으로 비교하였다. 목록화된 "다분화능 유전자"는 기타 집단이 (대체로 마우스에서, 그러나 랫트에서도 역시) ES 세포의 표지로 사용하는 유전자이다. 중배엽 내배엽 및 신경이 유사하게 정의된다. "순위"란 우리 실험에서의 발현을 가리킨다. 순위가 높을수록 발현 정도가 높은 것이다(가장 높은 순위는 1). 예를 들어, Oct4의 순위는 13인데, 이것은 분석된 모든 유전자 중에서, 12개 유전자를 제외한 다른 모든 유전자보다 더 높은 수준으로 발현되었음을 뜻한다. 본 실험의 배경은 30 미만의 모든 발현값이었다; 6107 유전자는 30이상의 발현값을 갖는다.
표 15. 다분화능, 중배엽, 내배엽, 신경 및 영양외배엽 표지/유전자를 활용하는 랫트 ES 세포분자 서명.
본 명세서에 언급된 모든 출판물 및 특허 출원은 본 발명이 속한 당해기술의 숙련가의 수준을 시사한다. 모든 출판물과 특허 출원은, 개별 출판물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 편입되었음이 시사되는 것같 같은 수준으로, 본원에 참조로 편입되었다. 모든 구현예의 문맥에서 달리 명백해진 것이 아니라면, 본 발명의 단계 또는 특징은 그 밖의 다른 모든 것들과 조합하여 사용될 수 있다. 범위에 대한 언급은 범위 내의 모든 정수, 범위 내의 하위 범위를 포함한다. 다수의 범위에 대한 언급은 이와 같은 범위들의 합성수를 포함한다.
<110> Lee, Jeffrey D.
Auerbach, Wojtek
Heslin, David
Frendewey, David
Lai, Ka-Man Venus
Valenzuela, David M.
<120> Genetic Modification of Rats
<130> 057766/441914
<150> US 61/767,093
<151> 2013-02-20
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 203
<212> PRT
<213> Mus Musculus
<400> 1
Met Lys Val Leu Ala Ala Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
His Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn
20 25 30
Ala Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Gly Asn Leu Met Asn Gln
35 40 45
Ile Lys Asn Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe
50 55 60
Ile Ser Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Val Glu
65 70 75 80
Lys Leu Cys Ala Pro Asn Met Thr Asp Phe Pro Ser Phe His Gly Asn
85 90 95
Gly Thr Glu Lys Thr Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Met Val Ala Tyr
100 105 110
Leu Ser Ala Ser Leu Thr Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Val Leu Asn
115 120 125
Pro Thr Ala Val Ser Leu Gln Val Lys Leu Asn Ala Thr Ile Asp Val
130 135 140
Met Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Asn Lys Tyr
145 150 155 160
Arg Val Gly His Val Asp Val Pro Pro Val Pro Asp His Ser Asp Lys
165 170 175
Glu Ala Phe Gln Arg Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Thr Tyr
180 185 190
Lys Gln Val Ile Ser Val Val Val Gln Ala Phe
195 200
Claims (128)
- 적중된 유전자 변형 랫트 배아줄기(ES) 세포를 제조하는 방법으로서,
(a) 백혈병 억제 인자(LIF)를 발현하도록 변형되지 않은 배양보조 세포층 및 50 U/ml 내지 150 U/ml LIF, 및 MEK 억제제 및 GSK3 억제제로 구성된 억제제의 조합을 포함하는 배지를 포함하는 조건 하에서 랫트 ES 세포의 집단을 배양하는 단계; 및
(b) 적중된 유전자 변형을 포함하도록 랫트 ES 세포를 변형시키는 단계로서, 랫트 ES 세포는 적중된 유전자 변형을 생식선을 통해 전이할 수 있는 단계
를 포함하는 방법. - 제1 항에 있어서, 단계 (a)에서 랫트 ES 세포의 집단을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로서,
(i) 백혈병 억제 인자(LIF)를 발현하도록 변형되지 않은 제1 배양보조 세포층 및 상실기 또는 배반포기 랫트 배아를 체외에서 배양하는 단계로서,
상실기 또는 배반포기 랫트 배아의 투명대가 제거되었고,
배양 조건들이 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하고
50 U/ml 내지 150 U/ml LIF, 및 MEK 억제제 및 GSK3 억제제로 구성된 억제제의 조합을 포함하는 배지를 포함하는 단계;
(ii) (i)로부터 얻어진 비정질 미분화 질량의 랫트 ES 세포의 파생물을, LIF를 발현하도록 변형되지 않은 제2 배양보조 세포층을 포함하는 체외 배양 웰에 전달하는 단계; 및
(iii) 50 U/ml 내지 150 U/ml LIF, 및 MEK 억제제 및 GSK3 억제제로 구성된 억제제의 조합을 포함하는 배지를 포함하는 조건 하에서 파생물을 배양하는 단계
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1 항에 있어서,
(c) 단계 (b)의 최소한 하나의 변형된 랫트 ES 세포를 랫트 숙주 배아에 도입하여 F0 배아를 생산하는 단계;
(d) F0 배아를 대리모에 이식시키고;
(e) F0 배아를 출산 시까지 대리모가 품고 있게 하고; 및
(f) 적중된 유전자 변형을 갖는 F0 랫트를 확인하는 단계
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제2 항에 있어서,
(c) 단계 (b)의 최소한 하나의 변형된 랫트 ES 세포를 랫트 숙주 배아에 도입하여 F0 배아를 생산하는 단계;
(d) F0 배아를 대리모에 이식시키고;
(e) F0 배아를 출산 시까지 대리모가 품고 있게 하고; 및
(f) 적중된 유전자 변형을 갖는 F0 랫트를 확인하는 단계
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제3 항 또는 제4 항에 있어서, 랫트 숙주 배아에 도입된 변형된 랫트 ES 세포는 랫트 숙주 배아와 동일한 랫트 변종에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3 항 또는 제4 항에 있어서, 랫트 숙주 배아에 도입된 변형된 랫트 ES 세포는 랫트 숙주 배아와 상이한 랫트 변종에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
- 유전자 변형된 랫트를 제조하는 방법으로서,
(a) 50 U/mL 내지 150 U/mL LIF, 및 MEK 억제자 PD0325901 및 GSK3 억제자 CHIR99021로 구성된 억제자의 조합을 포함하는 배지와 함께, 백혈병 억제 인자(LIF)를 발현하도록 변형되지 않은 배양보조 세포층 상에서 단리된 랫트 ES 세포를 배양하여 얻어진 랫트 ES 세포의 집단을 포함하는 랫트 ES 세포주를 제공하는 단계로서, 랫트 ES 세포 집단은
c-Myc의 발현이 결핍되고;
배양에서 구형, 자유-부유 콜로니를 형성하고;
배수체이고;
생식선 역량인 단계;
(b) 적중된 변형을 포함하는 랫트 ES 세포 클론을 획득하는 단계로서, 획득하는 단계는
(i) 적중된 유전자 변형을 포함하도록 랫트 ES 세포 집단을 변형시키는 단계; 및
(ii) 적중된 유전자 변형을 포함하는 랫트 ES 세포 클론을 단일 클로닝 단계에서 확인하는 단계
로 구성되는 단계;
(c) 랫트 ES 세포 클론을 랫트 숙주에 도입하는 단계로서, 랫트 ES 세포 클론은 랫트 숙주 배아와 상이한 랫트 균주로부터 유래되는 단계; 및
(d) 랫트 ES 세포 클론을 포함한 랫트 숙주 배아를 대리모가 품고 있게 하는 단계로서, 대리모는 적중된 유전자 변형을 포함하는 F0 후대를 생산하고, 적중된 유전자 변형은 생식선을 통해 전이되는 단계
를 포함하는 방법. - 제7 항에 있어서, 제공 단계 (a)는
(i) 백혈병 억제 인자(LIF)를 발현하도록 변형되지 않은 제1 배양보조 세포층 및 상실기 또는 배반포기 랫트 배아를 체외에서 배양하는 단계로서,
상실기 또는 배반포기 랫트 배아의 투명대가 제거되었고,
배양 조건들이 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하고
50 U/ml 내지 150 U/ml LIF, 및 MEK 억제제 PD0325901 및 GSK3 억제제 CHIR99021로 구성된 억제제의 조합을 포함하는 배지를 포함하는 단계;
(ii) 비정질 미분화 질량의 랫트 ES 세포의 파생물을, LIF를 발현하도록 변형되지 않은 제2 배양보조 세포층을 포함하는 체외 배양 웰에 전달하는 단계; 및
(iii) 50 U/ml 내지 150 U/ml LIF, 및 MEK 억제제 PD0325901 및 GSK3 억제제 CHIR99021로 구성된 억제제의 조합을 포함하는 배지를 포함하는 조건 하에서 파생물을 배양하는 단계로서, 이로써 랫트 ES 세포의 다분화능을 유지하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제3 항에 있어서, (g) 수컷 F0 랫트를 야생형 암컷 랫트와 교배시켜 적중된 유전자 변형에 대해 이형접합적인 F1 후대를 생산하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3 항에 있어서, (h) F1 후대 중 수컷 랫트를 F1 후대 중 암컷 랫트와 교배시켜 적중된 유전자 변형에 대해 동형접합적인 F2 후대를 획득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4 항에 있어서, (g) 수컷 F0 랫트를 야생형 암컷 랫트와 교배시켜 적중된 유전자 변형에 대해 이형접합적인 F1 후대를 생산하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4 항에 있어서, (h) F1 후대 중 수컷 랫트를 F1 후대 중 암컷 랫트와 교배시켜 적중된 유전자 변형에 대해 동형접합적인 F2 후대를 획득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 적중된 유전자 변형을 가진 F0 랫트의 최소한 3%는 적중된 유전자 변형을 F1 후대에 전이하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13 항에 있어서, 적중된 유전자 변형을 가진 F0 랫트의 최소한 10%는 적중된 유전자 변형을 F1 후대에 전이하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14 항에 있어서, 적중된 유전자 변형을 가진 F0 랫트의 최소한 60%는 적중된 유전자 변형을 F1 후대에 전이하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 랫트 ES 세포는
(I) c-Myc의 발현이 결핍되고;
(II) 정상적인 핵형을 갖고; 또는
(III) 배양에서 구형, 자유-부유 콜로니를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 랫트 ES 세포는
(I) c-Myc의 발현이 결핍되고;
(II) 정상적인 핵형을 갖고; 및
(III) 배양에서 구형, 자유-부유 콜로니를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서,
(I) 랫트 ES 세포는 ACI 랫트에서 유래되거나 흑색 아구티 (DA) 랫트에서 유래되고;
(II) 랫트 ES 세포는 과배란 처리된 랫트의 상실기 또는 배반포기 배아에서 유래되고; 또는
(III) 랫트 ES 세포는 ACI 랫트에서 유래되거나 흑색 아구티 (DA) 랫트에서 유래되며, 랫트 ES 세포는 과배란 처리된 랫트의 상실기 또는 배반포기 배아에서 유래되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 적중된 유전자 변형은 삽입, 결실, 녹아웃, 녹인, 점 돌연변이 및 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형시키는 단계는 둘 이상의 적중된 변형을 포함하도록 랫트 ES 세포를 변형시키는 단계를 포함하고, 랫트 ES 세포는 둘 이상의 적중된 유전자 변형을 생식선을 통해 전이할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 랫트 ES 세포는 수컷 (XY) 랫트 ES 세포 또는 암컷 (XX) 랫트 ES 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 랫트 ES 세포는 다음 특징들 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
(I) 랫트 ES 세포는 Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, 및 Utf1에서 선택되는 최소한 하나의 다분화능 표지를 발현하고;
(II) 랫트 ES 세포는 c-Myc, Ecat1 및 Rexo1에서 선택되는 하나 이상의 다분화능 표지를 발현하지 않고;
(III) 랫트 ES 세포는 Brachyury 및 Bmpr2에서 선택되는 하나 이상의 중배엽 표지를 발현하지 않고;
(IV) 랫트 ES 세포는 Gata6, Sox17, 및 Sox7에서 선택되는 하나 이상의 내배엽 표지를 발현하지 않고;
(V) 랫트 ES 세포는 Nestin 및 Pax6에서 선택되는 하나 이상의 신경 표지를 발현하지 않고;
(VI) 랫트 ES 세포는 Oct-4, Sox2, 및 알칼리성 인산가수분해효소에서 선택되는 하나 이상의 다분화능 표지를 발현하고;
(VII) 랫트 ES 세포는 부착연접 관련 단백질 1 (Ajap1), 클라우딘 5 (Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9 (Arhgef9), 칼슘/칼모듈린 의존 단백질 인산화효소 IV (Camk4), 에프린-A1 (Efna1), EPH 수용체 A4 (Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5 (Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1 (Igfbpl1), 인터루킨 36 베타 (Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파 (Il28ra), 좌우 결정 인자 1 (Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파 (Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2 (Lpar2), 신경 펜트락신 수용체 (Ntm), 단백질 티로신 인산가수분해효소 비-수용체 유형 18 (Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2 (Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1 (Fank1), 포크머리 상자 E1 (갑상선 전사 인자 2) (Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서 (Hey2), 포크머리 상자 E1 (갑상선 전사 인자 2) (Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서 (Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1 1 (Lef1), Sal-유사 3 (Drosophila) (Sall3), SATB 호메오박스 1 (Satb1), 및 miR-632에서 선택되는 하나 이상의 랫트 ESC-특이적 유전자를 발현한다. - 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 배지는 75 U/mL 내지 125 U/mL LIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23 항에 있어서, 배지는 90 U/mL 내지 110 U/mL LIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24 항에 있어서, 배지는 100 U/mL LIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양보조 세포는 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs)의 단일층을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 LIF는 마우스 LIF이거나 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서,
MEK 억제제는 PD0325901,
GSK3 억제제는 CHIR99021, 또는
MEK 억제제는 PD0325901이고, GSK3 억제제는 CHIR99021인 것을 특징으로 하는 방법. - 제28 항에 있어서, MEK 억제제는 0.8 μM 내지 1.2 μM의 농도의 PD0325901이고, GSK3 억제제는 2.5 μM 내지 3 μM 또는 3 μM 내지 3.5 μM의 농도의 CHIR99021인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항에 있어서, MEK 억제제의 농도는 1 μM 이고, GSK3 억제제의 농도는 3 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29 항에 있어서, 배지 중의 LIF의 농도는 100 U/mL이고, MEK 억제제는 1 μM의 농도의 PD0325901이고, GSK3 억제제는 3 μM의 농도의 CHIR99021인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 배지는 DMEM/F12 기본 배지 및 신경 기본 배지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 배지는 1x DMEM/F12 기본 배지; 1x 신경 기본 배지; 1% 페니실린/스트렙토마이신; 4 mM L-글루타민; 0.1 mM 2-메르캅토에탄올; 1x N2 보충제; 1x B27 보충제; 100 U/mL LIF; 1 μM PD0325901; 및 3μM CHIR99021을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는 1차례 이상의 전기천공을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 적중된 유전자 변형은 상동 재조합 이벤트를 통해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 적중된 유전자 변형은 삽입 폴리뉴클레오티드의 측면에 위치한 업스트림 및 다운스트림 상동 염기서열(homology arm)을 포함하는 적중 벡터를 활용하여 생성되고, 상기 상동 염기서열은 적중된 게놈 유전자자리 내부의 게놈 영역에 상응하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 적중된 유전자 변형은 적중된 게놈 유전자자리에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유발하는 뉴클레아제 제제를 사용하여 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37 항에 있어서, 뉴클레아제 제제는 전사 활성자-유사 효능기 뉴클레아제 (TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, 또는 CRISPR/Cas 시스템인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 단계는
(i) 랫트 ES 세포에 랫트 ES 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 표지를 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; 및
(ii) 제1 및 제2 배지로 바꿔가면서, 체외에서 랫트 ES 세포를 배양하는 단계로서, 제1 배지는 제1 시기 동안 선택 제제의 유효량을 포함하고, 제2 배지는 선택 제제를 포함하지 않고, 체외 배양 조건은 다분화능을 유지하고, 이로써 게놈에 안정적으로 편입된 이종 폴리뉴클레오티드를 가진 랫트 ES 세포를 선택하기에 충분한 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제39 항에 있어서, 제1 및 제2 배지는 24시간마다 교체되고, 선택 표지는 항생제에 내성을 보이는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제40 항에 있어서, 선택 표지는 네오마이신 인산전달 효소 (neor), 하이그로마이신 B 인산전달 효소 (hygr), 퓨로마이신-N-아세틸전달효소 (puror), 및 블라스티시딘 S 탈아미노효소 (bsrr) 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제40 항에 있어서, 항생제는 G418인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제39 항에 있어서, 선택 표지는 다음 특징들 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
(I) 선택 표지는 비약독화된 선택 표지 유전자를 포함하고;
(II) 선택 표지는 야생형 선택 표지와 비교하여 증가된 활성을 갖고;
(III) 랫트 ES 세포는 게놈에 안정적으로 편입된 선택 표지의 다수의 복제본을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1 항 내지 제4 항 및 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 하나 이상의 랫트 ES 세포의 집단.
- 랫트 ES 세포을 배양하고 이들의 다분화능을 유지하게 하는 체외 배양 시스템으로서,
(a) 백혈병 억제 인자 (LIF)를 발현하도록 변형되지 않은 배양보조 세포층;
(b) 50 U/mL 내지 150 U/mL LIF, 및 MEK 억제제 및 GSK3 억제제로 구성된 억제제의 조합을 포함하는 배지; 및
(c) 적중된 유전자 변형을 포함하는 하나 이상의 랫트 ES 세포의 집단으로서, 랫트 ES 세포는 적중된 유전자 변형을 생식선을 통해 전이할 수 있는 체외 배양 시스템. - 제45 항에 있어서, 배지는 75 U/mL 내지 125 U/mL LIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제46 항에 있어서,
배지는 90 U/mL 내지 110 U/mL LIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템. - 제47 항에 있어서, 배지는 100 U/mL LIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양보조 세포층은 유사분열 시 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포 (MEFs)의 단일층을 포함하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중의 LIF는 마우스 LIF이거나 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서,
MEK 억제제는 PD0325901,
GSK3 억제제는 CHIR99021, 또는
MEK 억제제는 PD0325901이고, GSK3 억제제는 CHIR99021인 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템. - 제51 항에 있어서, MEK 억제제는 0.8 μM 내지 1.2 μM의 농도의 PD0325901이고, GSK3 억제제는 2.5 μM 내지 3 μM 또는 3 μM 내지 3.5 μM의 농도의 CHIR99021인 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제52 항에 있어서, MEK 억제제의 농도는 1 μM이고, GSK3 억제제의 농도는 3 μM인 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제52 항에 있어서, 배지 중의 LIF의 농도는 100 U/mL이고, MEK 억제제는 1 μM의 농도의 PD0325901이고, GSK3 억제제는 3μM의 농도의 CHIR99021인 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 배지는 DMEM/F12 기본 배지 및 신경 기본 배지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 배지는 1x DMEM/F12 기본 배지; 1x 신경 기본 배지; 1% 페니실린/스트렙토마이신; 4 mM L-글루타민; 0.1 mM 2-메르캅토에탄올; 1x N2 보충제; 1x B27 보충제; 100 U/mL LIF; 1 μM PD0325901; 및 3μM CHIR99021을 포함하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 적중된 유전자 변형은 삽입, 결실, 녹아웃, 녹인, 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제57 항에 있어서, 랫트 ES 세포는 랫트 ES 세포에서 활성인 프로모터에 작동 가능하게 연결된 선택 표지를 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 선택 표지는 다음 특징들 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템:
(I) 선택 표지는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 비약독화된 선택 표지 유전자를 포함하고;
(II) 선택 표지는 야생형 선택 표지와 비교하여 증가된 활성을 갖고;
(III) 랫트 ES 세포는 게놈에 안정적으로 편입된 선택 표지의 다수의 복제본을 포함한다. - 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 랫트 ES 세포는
(I) c-Myc의 발현이 결핍되고;
(II) 정상적인 핵형을 갖고; 또는
(III) 배양에서 구형, 자유-부유 콜로니를 형성하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템. - 제59 항에 있어서, 랫트 ES 세포는
(I) c-Myc의 발현이 결핍되고;
(II) 정상적인 핵형을 갖고; 및
(III) 배양에서 구형, 자유-부유 콜로니를 형성하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템. - 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서,
(I) 랫트 ES 세포는 ACI 랫트에서 유래되거나 흑색 아구티 (DA) 랫트에서 유래되고;
(II) 랫트 ES 세포는 상실기 또는 배반포기 배아로부터 유래되고; 또는
(III) 랫트 ES 세포는 ACI 랫트에서 유래되거나 흑색 아구티 (DA) 랫트에서 유래되며, 랫트 ES 세포는 상실기 또는 배반포기 배아에서 유래되는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템. - 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 랫트 ES 세포는 수컷 (XY) 랫트 ES 세포 또는 암컷 (XX) 랫트 ES 세포인 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템.
- 제45 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 랫트 ES 세포는 다음 특징들 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템:
(I) 랫트 ES 세포는 Dnmt3L, Eras, Err-베타, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF 수용체, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, 및 Utf1에서 선택되는 최소한 하나의 다분화능 표지를 발현하고;
(II) 랫트 ES 세포는 c-Myc, Ecat1 및 Rexo1에서 선택되는 하나 이상의 다분화능 표지를 발현하지 않고;
(III) 랫트 ES 세포는 Brachyury 및 Bmpr2에서 선택되는 하나 이상의 중배엽 표지를 발현하지 않고;
(IV) 랫트 ES 세포는 Gata6, Sox17, 및 Sox7에서 선택되는 하나 이상의 내배엽 표지를 발현하지 않고;
(V) 랫트 ES 세포는 Nestin 및 Pax6에서 선택되는 하나 이상의 신경 표지를 발현하지 않고;
(VI) 랫트 ES 세포는 Oct-4, Sox2, 및 알칼리성 인산가수분해효소에서 선택되는 하나 이상의 다분화능 표지를 발현하고; 및
(VII) 랫트 ES 세포는 부착연접 관련 단백질 1 (Ajap1), 클라우딘 5 (Cldn5), Cdc42 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 9 (Arhgef9), 칼슘/칼모듈린 의존 단백질 인산화효소 IV (Camk4), 에프린-A1 (Efna1), EPH 수용체 A4 (Epha4), 간극 연접 단백질 베타 5 (Gjb5), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-유사 1 (Igfbpl1), 인터루킨 36 베타 (Il1f8), 인터루킨 28 수용체, 알파 (Il28ra), 좌우 결정 인자 1 (Lefty1), 백혈병 억제 인자 수용체 알파 (Lifr), 리소포스파티드산 수용체 2 (Lpar2), 신경 펜트락신 수용체 (Ntm), 단백질 티로신 인산가수분해효소 비-수용체 유형 18 (Ptpn18), 꼬리형 호메오박스 2 (Cdx2), 피브로넥틴 유형 III 및 안키린 반복 도메인 1 (Fank1), 포크머리 상자 E1 (갑상선 전사 인자 2) (Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서 (Hey2), 포크머리 상자 E1 (갑상선 전사 인자 2) (Foxe1), YRPW 모티프 2 관련 털/분할 인핸서 (Hey2), 림프구성 인핸서-결합 인자 1 1 (Lef1), Sal-유사 3 (Drosophila) (Sall3), SATB 호메오박스 1 (Satb1), 및 miR-632에서 선택되는 하나 이상의 랫트 ESC-특이적 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 체외 배양 시스템. - 삭제
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| ES2966625T3 (es) | 2019-04-04 | 2024-04-23 | Regeneron Pharma | Roedores que comprenden un locus del factor de coagulación 12 humanizado |
| CA3137761A1 (en) | 2019-06-04 | 2020-12-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use |
| US20220330532A1 (en) | 2019-06-05 | 2022-10-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a limited lambda light chain repertoire expressed from the kappa locus and uses thereof |
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| US20210079394A1 (en) | 2019-09-13 | 2021-03-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles |
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| EP4341386A2 (en) * | 2021-05-18 | 2024-03-27 | University of Southern California | Methods for the expansion of human granulocytemacrophage progenitors and applications thereof |
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| WO2023235725A2 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease |
| US20230417899A1 (en) | 2022-06-27 | 2023-12-28 | Oshkosh Corporation | Position tracking for a lift device |
| US20240102045A1 (en) | 2022-07-19 | 2024-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same |
| WO2024026488A2 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus |
| US20240130341A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997030151A1 (en) | 1996-02-16 | 1997-08-21 | The University Of Edinburgh | Cytokine expressed by dia/lif-deficient embryonic stem cells for the inhibition of differentiation |
| US20110041197A1 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Promoter-Regulated Differentiation-Dependent Self-Deleting Cassette |
| US20120272349A1 (en) | 2009-12-01 | 2012-10-25 | Ds Pharma Biomedical Co., Ltd. | Method for constructing chimeric rat using rat embryonic stem cells |
Family Cites Families (71)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT87133B (pt) | 1987-04-02 | 1992-07-31 | Amrad Corp Ltd | Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif |
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US5384253A (en) | 1990-12-28 | 1995-01-24 | Dekalb Genetics Corporation | Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes |
| AU2515992A (en) | 1991-08-20 | 1993-03-16 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
| US5702932A (en) | 1992-07-20 | 1997-12-30 | University Of Florida | Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA |
| AU7677894A (en) * | 1993-08-30 | 1995-03-22 | Northwestern University | Rat pluripotent embryonic stem cells and method of obtaining and using same |
| US5656610A (en) | 1994-06-21 | 1997-08-12 | University Of Southern California | Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue |
| US5736524A (en) | 1994-11-14 | 1998-04-07 | Merck & Co.,. Inc. | Polynucleotide tuberculosis vaccine |
| US5780448A (en) | 1995-11-07 | 1998-07-14 | Ottawa Civic Hospital Loeb Research | DNA-based vaccination of fish |
| US5945100A (en) | 1996-07-31 | 1999-08-31 | Fbp Corporation | Tumor delivery vehicles |
| US5981274A (en) | 1996-09-18 | 1999-11-09 | Tyrrell; D. Lorne J. | Recombinant hepatitis virus vectors |
| US6136566A (en) | 1996-10-04 | 2000-10-24 | Lexicon Graphics Incorporated | Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same |
| US5994624A (en) | 1997-10-20 | 1999-11-30 | Cotton Incorporated | In planta method for the production of transgenic plants |
| JP2002533130A (ja) | 1998-12-31 | 2002-10-08 | ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ | Ｈｉｖ共受容体を発現するトランスジェニック齧歯類動物および齧歯類細胞株 |
| US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
| US20030104526A1 (en) | 1999-03-24 | 2003-06-05 | Qiang Liu | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| CA2431308C (en) | 2000-12-07 | 2010-04-13 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| US7947469B2 (en) | 2001-01-22 | 2011-05-24 | Gendaq, Ltd. | Modulation of HIV infection |
| AU2002243645A1 (en) | 2001-01-22 | 2002-07-30 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for dna binding and gene regulation in plants |
| ES2432118T3 (es) * | 2001-02-14 | 2013-11-29 | Abt Holding Company | Células madre adultas multipotentes, fuentes de estas, métodos para obtenerlas y mantenerlas, métodos de diferenciación de estas, métodos de uso de estas y células derivadas de estas |
| JP4968498B2 (ja) | 2002-01-23 | 2012-07-04 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発 |
| AU2003215869B2 (en) | 2002-03-15 | 2008-04-24 | Cellectis | Hybrid and single chain meganucleases and use thereof |
| US20030232410A1 (en) | 2002-03-21 | 2003-12-18 | Monika Liljedahl | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
| AU2003298574B2 (en) | 2002-09-05 | 2008-04-24 | California Institute Of Technology | Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting |
| WO2004031346A2 (en) | 2002-09-06 | 2004-04-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins |
| US7344886B2 (en) * | 2002-11-29 | 2008-03-18 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Neomycin-phosphotransferase-genes and methods for the selection of recombinant cells producing high levels of a desired gene product |
| US7205148B2 (en) | 2003-06-11 | 2007-04-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genome mutation by intron insertion into an embryonic stem cell genome |
| US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
| US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| KR101386690B1 (ko) * | 2004-03-04 | 2014-04-22 | 도쿠리츠교세이호진 고쿠리츠간켄큐센터 | 래트 배아 줄기 세포 |
| EP1591521A1 (en) | 2004-04-30 | 2005-11-02 | Cellectis | I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof |
| WO2006028723A1 (en) | 2004-09-03 | 2006-03-16 | Moraga Biotechnology Inc. | Non-embryonic totipotent blastomer-like stem cells and methods therefor |
| CA2579677A1 (en) | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
| PT2767161T (pt) | 2004-10-19 | 2018-04-20 | Regeneron Pharma | Método para gerar um animal homozigótico para uma modificação genética |
| CA2600033C (en) | 2005-03-15 | 2015-06-02 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
| WO2006097784A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
| US9074180B2 (en) | 2006-03-30 | 2015-07-07 | The University Court Of The University Of Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors, and uses thereof |
| GB0615327D0 (en) | 2006-03-30 | 2006-09-13 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof |
| AU2007235496B2 (en) | 2006-03-31 | 2013-11-21 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies |
| DK2415872T3 (en) | 2006-12-14 | 2016-08-22 | Dow Agrosciences Llc | Optimized non-canonical zinc finger proteins |
| US7771967B2 (en) | 2006-12-22 | 2010-08-10 | The J. David Gladstone Institutes | Nucleic acid encoding apolipoprotein E-I3 |
| EP3156494B8 (en) | 2008-12-04 | 2018-09-19 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Genome editing in rats using zinc-finger nucleases |
| EP3312269A1 (en) | 2008-12-17 | 2018-04-25 | The Scripps Research Institute | Generation and maintenance of stem cells |
| EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
| US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
| CA2755192C (en) | 2009-03-20 | 2018-09-11 | Sangamo Biosciences, Inc. | Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins |
| EP2421980A2 (en) | 2009-04-23 | 2012-02-29 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cancer |
| US8772008B2 (en) | 2009-05-18 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for increasing nuclease activity |
| US8558055B2 (en) | 2009-07-24 | 2013-10-15 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat comprising a cytokine gene disruption and exhibiting a greater susceptibility to a cytokine-mediated autoimmune and/or inflammatory disease |
| US20120178647A1 (en) | 2009-08-03 | 2012-07-12 | The General Hospital Corporation | Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly |
| AU2010327998B2 (en) | 2009-12-10 | 2015-11-12 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | TAL effector-mediated DNA modification |
| JP2011152111A (ja) * | 2010-01-28 | 2011-08-11 | Univ Of Fukui | 多能性幹細胞培養用培地 |
| CA2798988C (en) | 2010-05-17 | 2020-03-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof |
| WO2012129198A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for obesity and diabetes |
| US9834786B2 (en) | 2012-04-25 | 2017-12-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors |
| MX362866B (es) | 2012-05-25 | 2019-02-20 | Univ California | Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn. |
| AU2013359212B2 (en) | 2012-12-12 | 2017-01-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| KR20150095861A (ko) | 2012-12-17 | 2015-08-21 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | Rna-가이드된 인간 게놈 조작 |
| SG11201505968WA (en) | 2013-02-20 | 2015-08-28 | Regeneron Pharma | Genetic modification of rats |
| SG11201508028QA (en) | 2013-04-16 | 2015-10-29 | Regeneron Pharma | Targeted modification of rat genome |
| TW201542816A (zh) | 2013-09-18 | 2015-11-16 | Kymab Ltd | 方法、細胞與生物體 |
| CN105980568B (zh) | 2013-12-11 | 2019-12-03 | 瑞泽恩制药公司 | 用于靶向修饰基因组的方法和组合物 |
| CA2932478A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing |
| AU2015218576B2 (en) | 2014-02-24 | 2020-02-27 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration |
| CA2950173C (en) | 2014-06-06 | 2023-10-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for modifying a targeted locus |
| RU2771532C2 (ru) | 2014-06-26 | 2022-05-05 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Способы и композиции для нацеленных генетических модификаций и способы их применения |
| CN113444747A (zh) | 2014-11-21 | 2021-09-28 | 瑞泽恩制药公司 | 使用成对向导rna进行靶向遗传修饰的方法和组合物 |
-
2014
- 2014-02-20 SG SG11201505968WA patent/SG11201505968WA/en unknown
- 2014-02-20 WO PCT/US2014/017452 patent/WO2014130706A1/en active Application Filing
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- 2014-02-20 CN CN201480021152.8A patent/CN105121631B/zh active Active
- 2014-02-20 ES ES14754746T patent/ES2758477T3/es active Active
- 2014-02-20 ES ES19178517T patent/ES2904803T3/es active Active
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- 2014-02-20 RU RU2015139350A patent/RU2690352C2/ru active
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- 2014-02-20 SG SG10201706741VA patent/SG10201706741VA/en unknown
- 2014-02-20 EP EP14754746.7A patent/EP2958990B1/en active Active
- 2014-02-20 EP EP19178517.9A patent/EP3561050B1/en active Active
- 2014-02-20 CN CN201910220141.7A patent/CN109913495B/zh active Active
- 2014-02-20 KR KR1020157025505A patent/KR102209979B1/ko active IP Right Grant
- 2014-02-20 MX MX2015010841A patent/MX2015010841A/es active IP Right Grant
- 2014-02-20 AU AU2014218931A patent/AU2014218931C1/en active Active
- 2014-02-20 CA CA2900992A patent/CA2900992C/en active Active
-
2015
- 2015-08-02 IL IL240286A patent/IL240286A0/en active IP Right Grant
- 2015-08-20 MX MX2019015525A patent/MX2019015525A/es unknown
- 2015-10-30 US US14/928,134 patent/US20160108360A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-03-07 HK HK16102592.0A patent/HK1214627A1/zh unknown
- 2016-08-19 US US15/242,025 patent/US10329582B2/en active Active
-
2019
- 2019-01-31 JP JP2019015597A patent/JP6758440B2/ja active Active
- 2019-05-02 US US16/401,539 patent/US10894965B2/en active Active
-
2020
- 2020-12-10 US US17/117,661 patent/US20210130846A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997030151A1 (en) | 1996-02-16 | 1997-08-21 | The University Of Edinburgh | Cytokine expressed by dia/lif-deficient embryonic stem cells for the inhibition of differentiation |
| US20110041197A1 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Promoter-Regulated Differentiation-Dependent Self-Deleting Cassette |
| US20120272349A1 (en) | 2009-12-01 | 2012-10-25 | Ds Pharma Biomedical Co., Ltd. | Method for constructing chimeric rat using rat embryonic stem cells |
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| RU2774076C2 (ru) | Генетическая модификация крыс | |
| NZ711775B2 (en) | Genetic modification of rats | |
| NZ713343B2 (en) | Targeted modification of rat genome |
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