KR20220137652A

KR20220137652A - 청력 손실 치료를 위한 유전자 요법 시스템 및 관련 방법

Info

Publication number: KR20220137652A
Application number: KR1020227027228A
Authority: KR
Inventors: 힌리히 슈테커; 시저 제임스 아얄라
Original assignee: 레스큐 히어링 인크
Priority date: 2020-02-05
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2022-10-12
Also published as: CA3166104A1; WO2021158814A1; WO2021158814A9; IL295265A; EP4081232A4; BR112022015345A2; CN116096391A; JP2023513116A; EP4081232A1; AU2021216405A1

Abstract

본 개시내용은 TMPRSS3 유전자 또는 LOXHD1 유전자의 유전적 돌연변이로 인한 난청의 치료 및/또는 예방에 유용한 유전자 요법 시스템 및 관련 방법을 기술한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 TMPRSS3 유전자 또는 LOXHD1 유전자의 활성을 각각 회복시켜 청력 손실로 고통받고 있는 환자에서 유모 세포 생존을 촉진하고 청력을 회복시키기 위해 내이로의 TRMPSS3 또는 LOXHD1의 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 유전자 전달을 사용한다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 시스템 및 방법은 인공와우의 이식과 함께 유전적 돌연변이에 의해 유발된 청력 손실을 위한 유전자 요법(예를 들어, 분자 요법)의 조합을 이용할 수 있다.

Description

청력 손실 치료를 위한 유전자 요법 시스템 및 관련 방법

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 이는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 2021년 2월 4일자로 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 104042_403_Seq_Listing.txt이고, 크기는 18,277바이트이다.

기술 분야

본 개시내용의 다양한 실시형태는 일반적으로 청력 손실(hearing loss)의 치료 및/또는 예방에 유용한 유전자 요법 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 예시적인 실시형태는 환자의 청력 손실의 추가 저하를 예방하는 시스템 및 관련 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용에 교시된 실시형태는 TMPRSS3 유전자 또는 LOXHD1 유전자의 유전적 돌연변이에 의해 야기되는 난청(deafness)을 치료 및/또는 예방하는데 유용한 유전자 요법 시스템 및 관련 방법에 관한 것이다. 이러한 시스템 및 방법은 인공와우(cochlear implant)의 이식과 함께 유전적 돌연변이로 인한 청력 손실에 대한 유전자 요법(예를 들어, 분자 요법)의 조합을 이용할 수 있다.

청력 손실은 인간에서 가장 흔한 감각 결손이다. 2018년 세계보건기구(World Health Organization: WHO)가 발표한 청각 장애의 규모에 대한 추정에 따르면, 전 세계적으로 청각 장애를 앓고 있는 사람이 4억 6,600만명이다(4억 3,200만 명의 성인 및 3,400만명의 어린이). 청각 장애를 가진 사람의 수는 2030년까지 6억 3,000만명, 2050년까지 9억명 이상으로 증가할 것이다(10명 중 1명). 청각 장애를 가진 사람의 90% 이상(4억 2,000만명)이 전 세계 저소득 지역에 거주한다(문헌[WHO global estimates on prevalence of hearing loss, Prevention of Deafness WHO 2018]).

현재 청력 손실 또는 난청을 예방 또는 치료하기 위해 승인된 치료제는 없다. 청각 장애를 가진 사람들을 위한 현재의 치료 옵션은 인공와우이다. 인공와우 이식은 환자당 평생 비용이 1,000,000달러가 넘는 큰 관련 의료 비용이 드는 일반적인 절차이다(문헌[Mohr PE, et al. (2000). The societal costs of severe to profound hearing loss in the United States; IntJ Technol Assess Health Care; 16(4): 1120-35]).

인공와우에 대한 현재 수요는 공급을 초과한다. 제조되는 인공와우 유닛의 생산량은 연간 50,000 유닛이다. 현재 출생률과 신생아의 청각 장애 발생률 및 유병률에 기초하면, 각 환아에게 1개의 인공와우를 제공하기 위해서는 연간 134,000개의 인공와우가 필요하다. 양측(2) 인공와우가 필요한 환자가 포함된 경우에 이러한 수치는 증가한다.

인공와우의 평생 비용은 대부분의 사람들에게, 특히 청각 장애를 가진 대다수의 사람들이 거주하는 선진국 외부에 사는 사람들에게는 엄두도 못 낼 정도로 높다. 특히, 선진국 외부에 거주하는 사람들에게 인공와우에 대한 비용 효율적인 대안을 제공하기 위한 치료적 옵션이 필요하다.

언어 습득 전 난청(prelingual deafness)의 50%이 유전적, 즉 유전성(Hereditary)이다(문헌[Centers for Disease Control and Prevention-Genetics of Hearing Loss]). 유전성 청력 손실 및 난청은 전음성(conductive), 감각신경성(sensorineural) 또는 이들의 조합; 증후군성(syndromic)(외이 또는 다른 기관의 기형 또는 다른 기관계와 관련된 의학적 문제와 관련됨) 또는 비증후군성(외이의 눈에 보이는 이상 또는 임의의 관련 의학적 문제와 관련되지 않음); 및 언어 습득 전(언어 발달 전) 또는 언어 습득 후(postlingual)(언어 발달 후)(문헌[Richard JH Smith, MD, A Eliot Shearer, Michael S Hildebrand, PhD, and Guy Van Camp, PhD, Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview, GeneReviews Initial Posting: February 14, 1999; Last Revision: January 9, 2014])일 수 있다. 유전성 청력 손실의 70% 이상이 비증후군성이다. 비증후군성 난청에 대한 상이한 유전자 좌위는 DFN으로 명명된다(난청의 경우). 좌위는 유전 방식에 기초하여 명명된다: DFNA(상염색체 우성), DF B(상염색체 열성) 및 DFNX(X-연관). 위의 명명 뒤에 오는 숫자는 유전자 매핑 및/또는 발견의 순서를 반영한다. 일반 인구에서, 청력 손실의 유병률은 연령에 따라 증가한다. 이러한 변화는 유전과 환경의 영향 및 환경적 유발요인과 개체의 유전적 소인 간의 상호작용을 반영한다.

감각신경성 청력 손실(SNHL)은 인간에서 가장 흔한 신경퇴행성 질환이며, 현재 승인된 약리학적 중재가 없다. SNHL은 유전적 장애에 의해 유발될 뿐만 아니라 음향 외상(sound trauma) 및 이독성(ototoxicity)과 같은 손상을 통해 획득될 수 있다. 유전적 진단은 비증후군성 SNHL을 유발하는 적어도 100개의 유전자가 있음을 보여주었다. 유전학 및 유전자 요법 기법의 최근 발전은 유전자 요법을 통해 여러 열성 유형의 난청을 구제할 수 있음을 보여주었다(문헌[Akil et al., 2012; Askew et al., 2015]). 내이로의 장기 유전자 전달은 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)를 사용하여 달성되었다(문헌[Shu, Tao, Wang, et al., 2016]). 유전자 요법을 사용하여 난청 및 청력 손실을 해결하기 위한 최초의 인간 임상 시험(CGF166)은 2014년 6월에 시작되어 2019년 12월에 완료되었다. CGF166에 대한 주요 연구자는 Hinrich Staecker 박사였으며, 이 시험은 노바티스(Novartis)가 후원하였다(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02132130). 이 분야의 중계 연구를 위한 이상적인 질환 대상은 내이 내의 정의된 세포 그룹에 영향을 미치며 언어 발달 이후 출생 후에 발생하는 열성 유전적 청력 손실이다. 돌연변이의 유병률은 추가적인 고려사항이다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 청력 손실의 일반적인 열성 원인의 발생률을 주의 깊게 평가하고 유전자의 크기를 고려함으로써, 접근 가능하며 상당히 일반적인 환자 집단을 갖는 유전자 요법 프로그램을 개발하는 것이 가능하다. 예를 들어, 다른 돌연변이보다 덜 일반적이지만, TMPRSS3은 인공와우 이식을 정당화할 만큼 충분히 심각한 청력 손실의 상당히 흔한 원인이다. 또한, TMPRSS3에 돌연변이가 있는 환자는 다른 돌연변이가 있는 환자와 마찬가지로 인공와우 이식에 반응하지 않을 수 있다(문헌[Shearer et al., 2017]). 이는 TMPRSS3, 또는 LOXHD1과 같은 다른 유전자를 단독 치료제로 표적화하거나 또는 이러한 장애의 이식 결과를 개선하기 위해 다른 치료제 및/또는 인공와우 이식과 함께 표적화하는 기회를 제시한다. 표 1(문헌[Miyagawa, Nishio, & Usami, 2016]으로부터 개작됨)은 TMPRSS3의 돌연변이가 달팽이관 내 분포가 상당히 제한된 언어 습득 후 열성 청력 손실의 가장 흔한 원인일 수 있으며, 유전자의 크기로 인해 기존의 AAV 벡터에 구축될 수 있음을 보여준다.

인간 막관통 프로테이스, 세린 3(TMPRSS3; DFNB10, DFNB8, ECHOS1, TADG12; Acc: HGNC:11877로도 지칭됨)은 선천성(출생시 존재함) 및 아동기 발병 상염색체 열성 난청 둘 모두와의 연관성에 의해 확인되었다. TMPRSS3 유전자의 돌연변이는 상염색체 열성 비증후군성 청각 장애 유형 DFNB8 및 10과 관련이 있다. TMPRSS3은 세린 프로테이스를 코딩하는 1646개 염기쌍의 유전자이고, DFNA 8/10과 관련되며, 인공와우 이식을 받는 청력 손실이 있는 환자의 최대 1% 내지 5%를 구성할 수 있다 (문헌[Weegerink et al., 2011]). 이러한 유전자의 기능 손실은 돌연변이 부위에 따라 광범위한 청력 표현형을 초래하는 것으로 보인다. 선천성 및 성인 발병 진행성 청력 손실은 모두 이 유전자의 손실과 관련되어 있다.

DFNB8 청력 손실의 발병은 언어 습득 후(10세 내지 12세)인 반면, DFNB10 청력 손실의 발병은 언어 습득 전(선천성)이다. 이러한 표현형 차이는 유전자형 차이를 반영한다. DFNB8 유발 변이체는 스플라이스 부위 변이체로, 이는 비효율적인 스플라이싱이 언어 습득 전 난청을 예방하기에는 충분하지만 궁극적인 청력 손실을 예방하기에는 충분하지 않은 정상 단백질의 감소된 양과 관련되어 있음을 시사한다(문헌[Richard JH Smith, MD, et al. (2014). Genes Known to Cause Autosomal Recessive Nonsyndromic Hearing Impairment: Deafness and Hereditary Hearing Loss Overview; GeneReviews] 참조).

난청을 일으키는 것으로 알려진 염색체 21 상의 TMPRSS3 돌연변이가 표 2에 기재되어 있다.

리폭시게네이스 상동 도메인 1 유전자(LOXHD1; LH2D1, DFNB77, FLJ32670; OMIM: 613072; Acc:HGNC:26521로도 지칭됨)는 단백질을 원형질막으로 표적화하는데 관여하는 것으로 생각되는 PLAT(폴리시스틴/리폭시게네이스/알파-독소) 도메인으로 전적으로 구성된 고도로 보존된 단백질을 암호화한다. 마우스에서의 연구에 따르면 이 유전자는 내이의 기계 감각적 유모 세포(mechanosensory hair cell)에서 발현되며, 이 유전자의 돌연변이는 청각 결함을 유발하여 이 유전자가 정상 유모 세포 기능에 필수적임을 나타낸다. 난청을 구분하는 인간 집단에 대한 스크리닝은 상염색체-열성 비증후군성 청력 손실(ARNSHL)의 진행성 형태인 DFNB77을 유발하는 이 유전자의 돌연변이를 확인하였다. 대안적으로, 이 유전자에 대해 상이한 동형 단백질을 암호화하는 스플라이싱된 전사 변이체가 언급되어 있다.

LOXHD1의 임상적 특징:

상염색체 열성

청력 손실, 감각신경성, 양측성(낮은 주파수에서 경미한 청력 손실)

아슈케나지(Ashkenazi) 유대인 집단에서 7세 내지 10세에 인공와우 이식으로 이어지는 선천성 발병

이란계 동족 집단에서 7세 내지 8세에 발병하여 성인기 동안 중주파수 및 고주파수의 중등도 내지 중증 손실로의 진행

상염색체 열성 비증후군성 청력 손실- 77(DFNB77)이 염색체 18q21의 LOXHD1 유전자(613072)의 동형접합성 돌연변이에 의해 유발된다는 증거.

인시추 혼성화(in situ hybridization)는 배아 일(embryonic day) 13.5일 및 16일에 발달 중인 마우스 내이에서 Loxhd1 발현을 검출하였지만, 임의의 다른 조직에서는 검출하지 않았다. 출생 후 제4일에, 달팽이관 및 전정 유모 세포에서 발현이 검출되었으며, 핵 내에서 가장 높은 농도가 검출되었다. Loxhd1은 점차 세포질에 국부화되었고, 성체에서는 Loxhd1이 입체섬모(stereocilia)의 길이를 따라 유모 세포에서 발현되었다.

N-에틸-N-나이트로소우레아(ENU) 돌연변이유발 스크린을 사용하여, Grillet 등(2009)은 3주령에 청각 장애를 가지게 되고 8주령에 난청이 되는 '삼바(samba)' 마우스 계통을 개발하였다. 동형접합성 삼바 마우스는 다른 신경학적 또는 전정 이상 소견을 보이지 않았고, 이형접합성(heterozygous) 삼바 마우스는 완전히 정상으로 보였다. 입체섬모 발달은 동형접합성 삼바 마우스에서 영향을 받지 않았지만, 유모 세포 기능이 붕괴되고 유모 세포가 결국 퇴화되었다.

Grillet 등(2009)은 삼바가 PLAT 도메인 10의 베타-샌드위치 구조베타-샌드위치 구조를 불안정하게 만드는 마우스 Loxhd1 유전자의 돌연변이임을 발견하였다. 돌연변이는 mRNA 또는 단백질 안정성 또는 입체섬모의 길이를 따른 Loxhd1 단백질의 위치를 변경하지 않았다. 그러나, 출생 후 21일까지, 일부 유모 세포는 정단 세포 표면에 융합된 입체섬모 및 막 주름을 갖는 형태학적 결함을 나타내었다. 유모 세포 손실 및 나선 신경절 뉴런의 감소를 포함하여 출생 후 90일까지 심각한 퇴행성 변화가 명백하였다. Grillet 등(2009)은 나선 신경절 뉴런의 퇴화가 유모 세포의 기능 및 유지의 섭동(perturbation)에 2차적일 가능성이 있는 것으로 가정하였다.

청력 손실을 유발하는 것으로 알려진 염색체 18 상의 LOXHD1 돌연변이는 표 3에 기재되어 있다.

그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 공개 제2013/0095071호는 돌연변이된 타이로신 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하여 노화 관련 청력 손실을 회복시켜 세포자멸사 단백질(XIAP)의 X-연관 저해제를 내이의 정원창막(round window membrane)에 전달하는 유전자 요법 방법을 기술하고 있다. 그러나, 간행물은 본 명세서에 개시된 바와 같이 TMPRSS3 또는 LOXHD1 유전자의 유전적 돌연변이로 인한 청력 손실 또는 난청을 예방하거나 또는 이의 발병을 지연시키거나 또는 이를 회복시키기 위해 기능성 TMPRSS3 또는 LOXHD1을 암호화하는 핵산 서열의 전달을 상정하고 있지 않다.

추가적으로, 청력 장애에 대한 임상 유전자 요법을 개발하기 위한 최신 기술의 중요한 함정은 인간 청력 손실을 반영하는 동물 모델의 부족이다. 인간에서의 성인 발병을 포함하는 유전적 청력 손실에 대해 이용 가능한 많은 마우스 모델은 전달 연구를 복잡하게 만드는 선천성 청력 손실을 나타낸다. 청력의 발달 후 유전적 청력 손실이 발병하는 모델은 거의 없다. 신생아 마우스에 벡터를 전달하면 성인 마우스에 전달하는 것과는 상이한 형질감염 패턴이 초래된다(문헌[Shu, Tao, Li, et al., 2016]). 상이한 벡터 시스템 및 유전자 표적을 사용하여 청력의 구제(rescue)를 평가하는데 사용될 수 있는 신규한 동물 모델이 필요하다.

위의 관점에서, 인공와우 이식은 중증에서 심도(profound)에 이르는 청력 손실을 해결하기 위해 선택되는 하나의 일반적인 치료 방법이다. 인공와우는 극심한 청각 장애가 있거나 또는 심각한 난청이 있는 사람에게 소리 감각을 제공하는데 도움이 될 수 있는 소형의 복잡한 전자 장치이다. 임플란트는 귀 뒤에 위치하는 외부 부분과 피부 아래에 외과적으로 배치되는 두 번째 부분으로 구성된다.

인공와우 디자인 및 성능의 엄청난 발전이 수년에 걸쳐 이루어졌지만, 임플란트로 어음 결과(speech outcome)의 면에서 부족한 환자가 여전히 존재한다. 최근 연구에 따르면 난청을 유발하는 2가지 유전자 TMPRSS3 및 LoxHD1의 돌연변이도 인공와우 결과에 형편없는 결과를 보였다¹. 특히, TMPRSS3 돌연변이체 환자는 나선 신경절의 기능장애가 있다². 마우스 TMPRSS3 돌연변이체 모델의 평가 동안, 유모 세포가 초기에 퇴화되고 나선 신경절 세포의 퇴화가 곧 뒤따랐다는 것이 입증되었다³. 내이의 유모 세포에 대한 영구적인 손상은 감각신경성 청력 손실을 초래하여 대다수의 집단에서 의사소통의 어려움을 초래한다. 유모 세포는 음향 자극을 변환하는 수용체 세포이다. 손상된 유모 세포의 재생은 현재 보철(prosthetic device) 이외의 요법이 없는 상태의 치료를 위한 길을 제공할 것이다.

TMPRSS3 돌연변이가 있는 인간 환자의 평가 동안, 인공와우 기능이 연령에 따라 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 나선 신경절 세포의 지연된 퇴화가 또한 인간 집단에서도 발생함을 시사한다⁴. 전술한 내용은 인공와우만으로는 청력 손실을 치료하기에 충분하지 않을 수 있음을 시사한다.

따라서, 인공와우 이식과 함께 청력 손실에 대한 분자 요법(예를 들어, 유전자 요법)의 조합을 제공할 기회가 존재한다.

본 개시내용의 실시형태는 특히 청력 손실을 치료 및/또는 예방하는데 유용한 유전자 요법 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 중재(intervention) 시간에 따라 퇴행성 유모 세포 및/또는 퇴행성 나선 신경절 세포를 복구 및/또는 구제하기 위한 인공와우 이식과 조합 유전자 요법에 관한 것이다.

본 명세서에 기재된 실시형태 각각은 임의의 다른 개시된 실시형태와 관련하여 기재된 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 본 명세서에 기재되되, 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 또한, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 발현 벡터를 포함하는 청력 손실의 치료 또는 예방을 위한 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물이 본 명세서에 기재되되, 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, Anc80 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전으로부터 선택되는 아데노-관련 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 아데노-관련 바이러스 벡터는 AAV2, Anc80 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 초기 발생에서 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도하고 일생 동안 발현을 유지하는 임의의 유모 세포 프로모터, 예를 들어, TMPRSS3 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스/닭 베타-액틴(CBA) 프로모터, Myo7a 프로모터 또는 Pou4f3 프로모터로부터 선택된다.

서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 갖는 세포가 본 명세서에 기재되되, 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell)이다.

유효량의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 청력 손실의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 청력 손실을 치료 또는 예방하는 방법이 본 명세서에 기재되되, 핵산 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 Anc80 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전으로부터 선택되는 아데노-관련 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 아데노-관련 바이러스 벡터는 AAV2, Anc80 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 초기 발생에서 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도하고 일생 동안 발현을 유지하는 임의의 유모 세포 프로모터, 예를 들어, TMPRSS3 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스/닭 베타-액틴(CBA) 프로모터, Myo7a 프로모터 또는 Pou4f3 프로모터로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는, 예를 들어, 주사에 의해 대상체의 내이에 투여된다. 일부 실시형태에서, 전달 방법은 인공와우 절개술(cochleostomy), 정원창막, 반고리관 절개술(canalostomy) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다(문헌[Erin E. Leary Swan, et al. (2008) Inner Ear Drug Delivery for Auditory Applications. Adv Drug Deliv Rev. 60(15): 1583-1599] 참조). 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 내림프낭(endolymphatic sac)을 통해 와우관(scala media)으로 전달된다(문헌[Colletti V, et al. (2010) Evidence of gadolinium distribution from the endolymphatic sac to the endolymphatic compartments of the human inner ear. Audiol Neurootol. 15(6):353-63; Marco Mandala, MD, et al. (2010) Induced endolymphatic flow from the endolymphatic sac to the cochlea in Meniere’s disease. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 143, 673-679; Yamasoba T, et al. (1999) Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10(5):769-74]). 일부 실시형태에서, 대상체는 청력 손실과 관련된 하나 이상의 유전적 위험 인자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 유전적 위험 인자 중 하나는 TMPRSS3 유전자의 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, TMPRSS3 유전자의 돌연변이는 청력 손실을 유발하는 것으로 알려진 임의의 하나 이상의 TMPRSS3 돌연변이로부터 선택된다(예를 들어, 표 2 참조). 일부 실시형태에서, 유전적 위험 인자 중 하나는 LOXHD1 유전자의 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, LOXHD1 유전자의 돌연변이는 청력 손실을 유발하는 것으로 알려진 임의의 하나 이상의 LOXHD1 돌연변이로부터 선택된다(예를 들어, 표 3 참조). 일부 실시형태에서, 대상체는 청력 손실의 임의의 임상적 지표를 나타내지 않는다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 발현 벡터는 다른 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터 및/또는 청력 손실을 치료하기 위한 하나 이상의 다른 활성 약제학적 작용제와의 병용 요법으로 투여된다. 예를 들어, 병용 요법은 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 제1 발현 벡터 및 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 제2 발현 벡터를 포함할 수 있되, 두 발현 벡터는 청력 손실을 치료하기 위한 병용 요법의 일부로서 대상체에게 투여된다.

청력 손실을 유발하는 것으로 알려진 임의의 하나 이상의 TMPRSS3 돌연변이로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 인간 TMPRSS3 유전자를 갖는 형질전환 마우스가 본 명세서에 기재된다(예를 들어, 표 2 참조). 청력 손실을 유발하는 것으로 알려진 임의의 하나 이상의 LOXHD1 돌연변이로부터 선택되는 돌연변이를 갖는 인간 LOXHD1 유전자를 갖는 형질전환 마우스가 본 명세서에 기재된다(예를 들어, 표 3 참조).

전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 모두 단지 예시적이고 설명적인 것이며, 청구된 바와 같은 본 발명을 제한하지 않는다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

본 명세서에 포함되고 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 개시내용의 예시적인 실시형태를 예시하며, 상세한 설명과 함께 본 개시내용의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 야생형 인간 TMPRSS3(GenBank 등록 번호 BC074847.2)을 암호화하는 cDNA 서열을 보여준다.
도 2는 도 1의 cDNA에 의해 암호화되는 야생형 인간 TMPRSS3 아미노산 서열을 보여준다.
도 3은 야생형 인간 LOXHDI(GenBank 등록 번호 AK057232.1)을 암호화하는 cDNA 서열을 보여준다.
도 4는 도 3의 cDNA에 의해 암호화되는 야생형 인간 LOXHDI 아미노산 서열을 보여준다.
도 5는 성체 마우스 달팽이관의 TMPRSS3 면역조직화학을 보여준다.
도 6은 본 개시내용의 양태에 따른 예시적인 인공와우 및 인간 내부의 상응하는 해부학을 보여준다.
도 7은 "ORI"에서 시작하고 시작(initial) "AAV2 ITR" 벡터, "CMV 인핸서", "CMV 프로모터", "h-TMPRSS3", "bGH 폴리(A) 신호 및 클로징(closing) "AAV2 ITR" 벡터를 포함하는 예시적인 TMPRSS3 플라스미드 맵을 보여준다.
도 8은 청각 뇌간 반응(Auditory Brainstem Response: ABR) 테스트를 통해 유전자 요법 치료를 받은 질환 모델 마우스(처리) 대 치료를 받지 않은 질환 모델 마우스(미처리)의 청력 회복을 그래프로 비교함으로써 개념의 입증을 도시한다.
도 9는 변조 이음향방사(Distortion Product Otoacoustic Emissions: DPOAE) 테스트를 통해 유전자 요법 치료를 받은 질환 모델 마우스(처리) 대 치료를 받지 않은 질환 모델 마우스(미처리)의 청력 회복을 그래프로 비교함으로써 개념의 입증을 도시한다.
도 10은 WAVEI 진폭 테스트를 통해 유전자 요법 치료를 받은 질환 모델 마우스(처리) 대 치료를 받지 않은 질환 모델 마우스(미처리)의 청각 신경 기능 회복을 그래프로 비교함으로써 개념의 입증을 그래프로 도시한다.
도 11은 본 명세서에 교시된 유전자 요법 중 하나 이상을 전달하기 위한 예시적인 약물 전달 부위로서 인간 귀 내의 정원창막(RWM)의 위치를 도시한다.

본 개시내용의 원리가 특정 응용에 대한 예시적인 실시형태를 참조하여 본 명세서에 기재되지만, 개시내용이 이에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가지고 있으며 본 명세서에 제공된 교시에 접근할 수 있는 자는 추가적인 수정, 응용, 실시형태 및 균등물의 대체가 모두 본 명세서에 기재된 실시형태의 범위 내에 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 전술한 설명에 의해 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다.

본 개시내용은 유전적 돌연변이에 의해 유발되는 난청을 치료 및/또는 예방하는데 유용한 유전자 요법 시스템 및 관련 방법에 관한 것이다. 난청을 유발하도록 돌연변이될 수 있는 두 유전자의 예는 TMPRSS3 유전자 또는 LoxHD1 유전자이다. 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 인공와우의 이식과 함께 유전적 돌연변이에 의해 유발된 청력 손실에 대한 유전자 요법(예를 들어, 분자 요법)의 조합을 이용할 수 있다. 시스템 및 방법은 TMPRSS3 유전자 또는 LoxHD1 유전자에 의해 유발되는 유전자 돌연변이의 관점에서 볼 때, 난청 또는 청력 손실을 유발하는 것으로 밝혀진 복구를 위해 다른 유전자 돌연변이가 표적화될 수 있음을 이해할 수 있다.

본 개시내용의 목적을 위해, "유전자 요법"의 다음 정의가 사용될 수 있다. 유전자 요법은 유전적 질환을 치료하기 위해 DNA가 환자에게 도입되는 것을 지칭할 수 있다. 새로운 DNA는 일반적으로 기존의 유전자에서 질환-유발 돌연변이의 영향을 교정하는 제 기능을 하는 유전자(functioning gene)를 포함한다. 실험적 또는 치료적 목적을 위한 유전자 전달은 유전 정보를 표적 세포로 이동시키는 벡터 또는 벡터 시스템에 의존한다. 벡터 또는 벡터 시스템은 유전자 전달 반응의 효율성, 특이성, 숙주 반응, 약리학 및 지속성의 주요 결정 요인으로 간주된다. 현재, 유전자 전달을 달성하는 가장 효율적이고 효과적인 방법은 복제-결함이 있는 바이러스를 기반으로 하는 벡터 또는 벡터 시스템을 사용하는 것이다(PCT 공개 WO 2015/054653; Methods of Predicting Ancestral Virus Sequences and Uses Thereof).

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 임상 결과의 바람직한 변화를 목표로 하는 다양한 활동을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는"은 본 명세서에 기재된 바와 같이 청력 손실의 하나 이상의 임상적 지표 또는 증상에서 검출 가능한 개선을 달성하는 것을 목표로 하거나 또는 이를 달성하는 임의의 활동을 포함한다.

LOXHD1 유전자(예를 들어, 유전적 진단 테스트에서 검출됨)는 아직 청력 손실의 임상적 지표 또는 증상을 나타내지 않으므로 치료적 중재가 시작될 수 있는 창(window)을 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 청력의 점진적인 퇴행 기간 동안 치료적 중재를 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 이러한 기간 전에 개시될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 청력 손실을 치료하는 방법은 청력 손실의 발병 또는 청력 손실의 임상적 지표 또는 증상의 진행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "청력 손실"은 소리를 듣는 능력의 감소를 설명하기 위해 사용되며, 난청 및 소리를 듣는 능력이 전혀 없음을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 위의 "치료" 설명에 기재된 바와 같은 하나 이상의 바람직한 임상 결과를 달성하거나 이의 달성에 기여하기에 충분한 본 명세서에 기재된 바와 같은 활성제의 양을 지칭한다. 임의의 개별적인 경우에 적절한 "유효한" 양은 용량 증량 연구와 같은 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "활성제"는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용되도록 의도되고, 예를 들어, 청력 손실을 치료할 목적으로 생물학적으로 활성인 것으로 의도되는 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 AAV 벡터)를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 활성제 또는 2종 이상의 활성제의 조합 및 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 부형제 등과 같은 약제학적 전달에 사용하기에 적합한 1종 이상의 기타 성분을 포함하는 조성물을 지칭한다.

본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "대상체" 또는 "환자"는 인간, 비인간 영장류, 설치류(예컨대, 래트, 마우스 및 기니피그) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 포유류를 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터" 또는 "벡터들"이 사용될 수 있다. "벡터"는 목적하는 유전자를 세포에 전달할 수 있지만 세포를 장악하거나 손상시킬 수 없는 바이러스를 지칭할 수 있다. 현재까지, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헬퍼 의존성 아데노바이러스 및 렌티바이러스 모두가 달팽이관 유전자 전달을 위해 테스트되었다. 이들 중, 가장 가능성이 높은 것으로 입증된 것은 아데노 관련 바이러스(AAV)이며: 이는 복제되지 않고, 이식유전자를 내이로 효과적으로 전달할 수 있으며, 이독성을 일으키지 않는다. 특히, AAV는 유모 세포-특이적 돌연변이로 인한 유전적 결함을 교정하려는 경우 중요한 특징인 내부 유모 세포를 효과적으로 형질감염시킬 수 있다. 현재까지, 수많은 다양한 AAV 하위유형이 달팽이관 유전자 전달에 성공적으로 사용되었으며, 코르티(Corti) 기관에 대한 손상이 거의 없는 것으로 나타났다. AAV 혈청형 1, 2, 5, 6 및 8을 연구하는 최근 보고서는 유모 세포, 지지 세포, 청각 신경 및 나선 인대에서 성공적인 유전자 발현을 보여주었고, 유모 세포가 가장 효과적으로 형질도입되었음을 보여주었다(문헌[Lawrence R. Lustig, MD and Omar Akil, PhD (2012) Cochlear Gene Therapy. Curr Opin Neurol. 25(1): 57-60]).

내이에 투여될 수 있는 AAV 벡터의 예는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 출원 제2013/0095071호에 추가로 기술되어 있다.

현재 청력 손실 또는 난청을 예방 또는 치료하기 위해 승인된 치료제는 없다. 청각 장애가 있는 사람들을 위한 현재 치료 옵션은 인공와우이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 청력 손실의 일반적인 열성 원인의 발생률을 모두 신중하게 평가하고 유전자의 크기를 고려함으로써, 일반적인 환자 집단에 접근할 수 있는 조합 치료 요법 시스템을 개발하는 것이 가능하다.

인공와우는 유모 세포의 기능을 우회하고 나선 신경절 세포를 직접 자극함으로써 기능한다. 유모 세포는 모든 척추동물의 귀에 있는 청각 시스템과 전정 시스템의 감각 수용체이다. 기계적 형질도입(mechanotransduction)을 통해, 유모 세포는 주위 환경의 움직임을 감지한다. 그러나, 이러한 세포는 하나 이상의 유전자(예를 들어, TMPRSS3, LoxHD1 등)의 돌연변이로 인해 소정의 동물(예를 들어, 인간)에서 쇠퇴할 수 있다. 나선(달팽이관) 신경절은 달팽이관에서 뇌로 음성의 형태(representation of sound)를 보내 청력의 감각을 제공하는 신경 세포의 그룹이다. 나선 신경절 뉴런의 세포체는 달팽이관의 원주형 중심축인 와우축(modiolus)에서 발견된다. 따라서, 인공와우가 최적의 기능을 발휘하려면 나선 신경절의 기능이 필수적이다. 그러나, 앞서 기재된 바와 같이, 이러한 나선 신경절 세포는 청각 장애 또는 청력 손실을 초래할 수 있는 유전적 돌연변이에 취약할 수 있다. 언급한 바와 같이, 유모 세포도 또한 청력 손실 또는 손상을 초래할 수 있는 유전적 돌연변이에 취약할 수 있다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 바이러스 벡터를 통한 TMPRSS3 유전자(또는 임의의 다른 적합한 유전자)의 천연 카피의 전달은 사용되는 벡터 및 프로모터에 따라 유모 세포 및/또는 나선 신경절 세포를 치료하는데 사용될 수 있다. 유모 세포 및/또는 나선 신경절 세포의 쇠퇴 수준에 따라.

중재 시간에 따라, TMPRSS3은 퇴행성 유모 세포 및/또는 퇴행성 나선 신경절 세포를 구제할 가능성이 있다. 경험한 청력 손실의 정도로 인해 인공와우 이식을 받는 환자의 경우, TMPRSS3 유전자 요법은 나선 신경절 기능을 보존하고 추가의 퇴행을 방지하여 기저 세포 기질에 따라 최적으로 기능하도록 함으로써 임플란트 기능을 향상시킬 수 있다.

TMPRSS3은 인공와우 이식을 정당하게 하는 만큼 충분히 심각한 청력 손실의 상당히 일반적인 원인이다. 또한, TMPRSS3의 돌연변이가 있는 환자는 다른 돌연변이가 있는 환자와 마찬가지로 인공와우 이식에 반응하지 않을 수 있다(문헌[Shearer et al., 2017]). 이는 TMPRSS3, 또는 LOXHD1과 같은 다른 유전자를 단독 치료제로 표적화하거나 또는 이러한 장애에 대한 이식 결과를 개선하기 위해 다른 치료제 및/또는 인공와우 이식과 함께 표적화할 수 있는 기회를 제시한다. TMPRSS3의 돌연변이는 달팽이관 내 분포가 상당히 제한된 언어 습득 후 열성 청력 손실의 가장 흔한 원인일 수 있으며, 유전자의 크기로 인해 기존의 AAV 벡터에 구축될 수 있음이 문서화되어 있다.

그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 공개 제2013/0095071호는 세포자멸사 단백질(XIAP)의 X-연관 저해제를 내이의 정원창막에 전달하기 위해 돌연변이된 타이로신 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하여 노화 관련 청력 손실을 회복시키는 유전자 요법 방법을 기술하고 있다. 그러나, 간행물은 본 명세서에 개시된 바와 같이 TMPRSS3 또는 LOXHD1 유전자의 유전적 돌연변이로 인한 청력 손실 또는 난청을 예방하거나 또는 이의 발병을 지연시키거나 또는 이를 회복시키기 위해 기능성 TMPRSS3 또는 LOXHD1을 암호화하는 핵산 서열의 전달을 상정하지 않는다.

예시적인 실시형태에서 그리고 본 명세서에 교시된 바와 같이, 치료적 치료는 도 11에 도시된 바와 같이 인공와우의 카테터 또는 포트를 사용하여 내이의 정원창막(RMW)을 통해 전달될 수 있다.

예시적인 실시형태에서, 인간 내이 내의 정원창막(RMW)은 잠재적인 약물 전달 부위의 역할을 할 수 있다. 도 11은 https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Blausen_0328_EarAnatomy.png에서 이용할 수 있는 인간 귀의 해부학 이미지의 주석이 달린 버전이다. 문헌[Blausen.com staff (2014). "Medical gallery of Blausen Medical 2014". WikiJournal of Medicine 1 (2)] 참조.

위에 언급한 바와 같이, 현재 청력 손실 또는 난청을 예방 또는 치료하기 위한 승인된 치료적 치료법은 없으며, 이러한 치료법을 테스트하기 위한 유용한 전임상 동물 모델이 부족하다. 따라서, 본 개시내용은 돌연변이된 TMPRSS3 또는 LOXHD1 유전자의 활성을 회복시키고, 유모 세포 생존을 촉진하고, 청력 손실 또는 난청을 앓고 있는 환자의 청력을 회복시키기 위해 TMPRSS3 또는 LOXHD1의 내이로의 바이러스 벡터 유전자 전달을 위한 시스템 및 방법, 및 이러한 조성물 및 방법을 테스트하기 위한 세포-기반 및 동물-기반 모델과 함께 치료법을 인공와우 이식과 조합하는 것을 기술하고 있다.

TMPRSS3(DFNA8/10)의 돌연변이와 관련된 청력 손실은 다양한 상이한 표현형으로 존재할 수 있다. 선천성 심도 청력 손실뿐만 아니라 성인 발병 진행성 청력 손실도 기술되어 있다(문헌[Weegerink et al., 2011]). 현재, Tmprss3 기능장애의 메커니즘은 알려져 있지 않다. 지금까지 출생 시 청력 손실이 발병하고 약간 늦은 시점이지만 청력 및 마우스의 성숙 이전에 청력 손실이 발병한 두 마우스 모델이 개발되었다. Fasquelle 등은 Tmprss3에서 단백질-절단 넌센스 돌연변이를 운반하는 에틸-나이트로소우레아-유도성 돌연변이체 마우스를 생성하였다. 이는 출생 후 제12일, 청력이 성숙해지는 시기에 유모 세포의 손실 및 청력의 퇴행을 보여주었다. 추가적으로 낭상 유모 세포가 영향을 받았으며, 나선 신경절 세포의 지연된 퇴행이 주목을 받았다(문헌[Fasquelle et al., 2011]). 마우스 모델에서 나선 신경절의 퇴행이 코르티 기관의 퇴행과 관련이 있는지 또는 나선 신경절에서 Tmprss3의 기능장애로 인한 것인지 여부는 명확하지 않다. 많은 연구에서 마우스 내이 내의 Tmprrss3의 분포를 평가하였으며, 유모 세포 및 나선 신경절 세포에서 Tmprss3의 존재를 대체로 입증하였다(문헌[Fan, Zhu, Li, Ji, & Wang, 2014; Fasquelle et al., 2011]).

마우스 Tmprss3의 발현은 항체 항-TMPRSS3(1:100, ab167160, 에이빔(Abeam), 매사추세츠주 켐브리지 소재)을 사용하여 1개월령 C57BI5 마우스에서 평가되었다. 표지는 내부 및 외부 유모 세포, 맥관선조(stria vascularis)에서 그리고 나선 신경절 세포의 약 50%에서 나타났다(도 5). 이는 TMPRSS3 기능의 손실이 추가적으로 선조 기능의 손실을 초래할 수 있음을 시사하지만, Fasquelle 마우스 모델에서는 와우내전위(endocochlear potential)의 변화가 나타나지 않았다(문헌[Fasquelle et al., 2011]).

TMPRSS3 유전자형-표현형 연구는 심도 선천성에서 성인 발병 진행성 청력 손실에 이르는 광범위한 다양한 형태의 청력 손실을 보여준다(문헌[Chung et al., 2014; Gao et al., 2017; Weegerink et al., 2011]). 연구는 TMPRSS3 돌연변이로 인한 청력 손실이 성인 인공와우 이식을 받는 환자의 2% 내지 5%를 차지할 수 있음을 시사한다(문헌[Jolly et al., 2012; Miyagawa, Nishio, & Usami, 2016; Sloan-Fleggen et al., 2016]). 이러한 돌연변이가 있는 많은 환자들은 상당량의 잔청(residual hearing)을 가지고 있다. 이는 치료될 수 있는 세포의 기질이 있기 때문에 잠재적인 구제 요법을 위한 매력적인 표적이 될 것이다. 이러한 돌연변이가 있는 환자의 인공와우 이식 성공에 대한 몇 가지 연구가 있다. TMPRSS3의 손실에 의해 유발된 적어도 일부 형태의 청력 손실은 다른 형태의 유전적 난청보다 인공와우 이식과 잘 맞지 않을 수 있다(문헌[Shearer et al., 2017]). 이는 이 유전자가 유모 세포 및 나선 신경절 세포의 최대 50%에서 모두 발현된다는 사실과 잠재적으로 관련이 있다(도 5 참조). 전달을 위한 벡터 시스템을 선택할 때 이러한 불일치가 고려되어야 한다. 벡터는 강한 유모 세포 향성(tropism) 및 조합된 유모 세포와 나선 신경절 향성으로 테스트될 것이다. 신생아 및 성인 내이 전달을 비교할 때 벡터 향성의 차이도 또한 관찰되었다(문헌[Shu, Tao, Li, et al., 2016; Shu, Tao, Wang, et al., 2016a]). 대상 임상 집단은 성숙한 청각 시스템을 가진 인간이기 때문에, 질환 진행(실시예 1 참조) 및 성인 달팽이관에 대한 구제 요법의 모델 전달(실시예 2 참조) 모두에 대한 모델로 사용될 수 있는 청력이 성숙된 후 청력 손실이 발병할 수 있는 마우스 모델이 본 명세서에 기재된다.

따라서, 본 개시내용의 목적은 인공와우 이식과 함께 위에 기재된 조합 유전자 요법 기법을 사용할 수 있는 기회를 제공하는 것이다.

예시적인 실시형태

예시적인 실시형태에 따르면, 본 명세서에 교시된 유전자 요법 기법은 인공와우 이식과 함께 전달될 수 있다. 예시적인 실시형태에서 그리고 부록의 도 1을 참고하여, 인공와우는 다음을 포함할 수 있다: 1) 환경으로부터 소리를 수신할 수 있는 마이크로폰(microphone); 2) 마이크로폰에 의해 포착된 소리를 선택하고 배열할 수 있는 어음 처리기(speech processor); 3) 어음 처리기로부터 신호를 수신하고 이를 전기 자극으로 전환하도록 구성될 수 있는 송신기(transmitter) 및 수용기/자극기(receiver/stimulator); 및 4) 자극기로부터 자극을 수집하고 이를 청각 신경의 상이한 영역으로 보내는 전극 그룹인 전극 어레이(electrode array). 예시적인 실시형태에서, 인공와우는 극심한 청각 장애가 있거나 또는 심각한 난청이 있는 사람에게 소리의 감각을 제공하는데 도움이 될 수 있는 소형의 복잡한 전자 장치이다. 임플란트는 귀 뒤에 위치하는 외부 부분과 피부 아래에 외과적으로 배치되는 두 번째 부분으로 구성된다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 본 명세서에 교시된 요법에 대해 자격이 있을 수 있는 환자는 (1) 인공와우의 현재 사용자 또는 (2) 인공와우의 후보일 수 있지만 현재 사용자는 아닌, 즉, 새로운 인공와우 설치와 함께 유전자 요법 치료를 원하는 새로운 인공와우 사용자(둘 모두 동시에 수행)일 수 있다.

인공와우는 건강한 내이(또는 달팽이관)의 기능을 모방하도록 설계하였다. 이들은 내이 내부의 손상된 감각 유모 세포의 기능을 대체하여 보청기가 제공할 수 있는 것보다 더 깨끗한 소리를 제공하도록 돕는다. 사람이 청력 손실을 경험하거나 또는 심각한 청력 장애가 있는 경우, 사람이 청각 신경을 통해 외부 정보를 받아들일 수 있도록 인공와우가 이식될 수 있다. 사람의 내이에 있는 유모 세포가 손상된 것을 의미하는 감각신경성 청력 손실 동안, 손상된 유모 세포는 더 이상 소리를 청각 신경으로 보낼 수 없다. 위에서 언급한 바와 같이, 인공와우는 내이의 이러한 손상된 유모 세포를 우회하거나 또는 건너뛰어 정보를 청각 신경에 직접 전달한다. 연구에 따르면 소정의 유전자는 출생시 또는 나중에 언젠가는 이러한 유모 세포(및/또는 나선 신경절)를 조기에 손상시키거나 또는 쇠퇴시키는 돌연변이에 취약하다는 것이 밝혀졌다. 위에 기재된 바와 같이, 연구에 따르면 난청을 유발하는 두 유전자인 TMPRSS3 및 LoxHD1의 돌연변이가 인공와우 결과에서 좋지 않은 결과를 초래할 수 있다는 것이 입증되었다¹. 특히, 전형적인 TMPRSS3 돌연변이체 환자는 나선 신경절 및 유모 세포 중 하나 또는 둘 모두에 기능장애가 있을 수 있다. 마우스 TMPRSS3 돌연변이체 모델의 평가 동안, 유모 세포가 초기에 퇴행되고 곧 나선 신경절 세포의 퇴행이 뒤따른다는 것이 입증되었다³. TMPRSS3 돌연변이가 있는 인간 환자의 평가 동안, 인공와우 기능은 연령에 따라 감소한다는 것이 추가로 입증되었으며, 이는 나선 신경절 세포의 지연된 퇴행이 인간 집단에서도 발생함을 시사한다⁴.

앞서 언급한 바와 같이, TMPRSS3의 돌연변이가 있는 환자는 다른 돌연변이가 있는 환자와 마찬가지로 인공와우 이식에 반응하지 않을 수 있다(문헌[Shearer et al., 2017]). 이는 이러한 장애에 대한 이식 결과를 개선하기 위해 인공와우 이식과 함께 이러한 손상된 유모 세포 및/또는 나선 신경절 세포를 복구하기 위한 유전자 요법 기법을 사용하여 TMPRSS3, 또는 LOXHD1과 같은 다른 유전자를 표적화할 기회를 제시한다. 즉, 인공와우 이식은 결함이 있는 유모 세포를 우회하고 나선 신경절 세포를 직접 자극하는데 사용될 수 있으며, 이식과 함께 유전자 요법을 사용하여 자연적 원인 및/또는 유전적 결함을 통해 파괴된 손상된 유모 세포 및/또는 나선 신경절 세포를 고칠 수 있다. 임의의 상업적으로 이용 가능한 인공와우가 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법에 의해 이용될 수 있음을 이해할 수 있다.

어떤 경우에는 유전적 장애가 출생시 결함이 있는 유모 세포 및/또는 나선 신경절을 유발할 수 있음을 이해할 수 있다. 그러나, 일부 어린이에서는, 부분 또는 전체 청력 손실을 초래할 수 있는 유전적 돌연변이가 인생의 후기 단계(예를 들어, 청소년기, 성인기 등)에 나타날 수 있다.

본 개시내용의 양태는 내이의 이러한 유전적으로 결함이 있는 세포(예를 들어, 유모 세포, 나선 신경절 등)의 치료 및/또는 복구를 위한 유전자 요법(예를 들어, TMPRSS3, LoxHD1 등)에 대한 예시적인 실시형태를 포괄한다. 도 7은 본 명세서에 교시된 양태에 따른 유전자 요법에 이용될 수 있는 TMPRSS3 벡터 작제물에 대한 예시적인 플라스미드 맵을 도시한다. 플라스미드 맵은 5,667bp의 "AAV-cDNA 6-hTMPRSS3"을 예시한다. "AAV-cDNA 6-hTMPRSS3" 플라스미드를 사용한 유전자 요법과 함께 인공와우 이식은 본 개시내용에 규정된 하나 이상의 목적을 달성하기 위해 이용될 수 있다.

예를 들어, 도 2에 도시된 "AAV-cDNA 6-hTMPRSS3"은 TMPRSS3 유전자의 돌연변이를 유전적으로 치료하거나 또는 복구하는데 사용될 수 있다. 그렇게 함으로써 그리고 유전자 요법의 중재 시기에 따라, 변형된 TMPRSS3 유전자는 돌연변이 및 결함 유전자로 인한 손상된 유모 세포 및/또는 나선 신경절을 복구할 수 있다.

예시적인 실시형태에서, 도 7의 플라스미드 맵은 "ORI"에서 시작하여 시작 "AAV2 ITR" 벡터, "CMV 인핸서", "CMV 프로모터", "h- TMPRSS3", "bGH 폴리(A) 신호 및 클로징 "AAV2 ITR" 벡터를 포함한다. 선택적으로, 추가적인 치료적 작제물 "AmpR 프로모터"가 사용될 수 있다. 본 개시내용의 양태에 따라 목적들을 달성하기 위해 다른 벡터들이 이용될 수 있음을 이해할 수 있다.

개념의 입증

마우스 모델: CBA/J 백그라운드의 TRMPSS 마우스 모델을 생성하였다. 이러한 모델은 CBA/J 계통과 교배했을 때 돌연변이 계통을 확립하였다. 돌연변이는 넉인(knock in) 모델 점 돌연변이였다. 돌연변이는 c.916G>A(p.Ala306Thr) 동형접합성 돌연변이였다.

TMPRSS3 c.916G>A(p.Ala306Thr)는 중국인, 독일인, 네덜란드인 및 한국인 청각 장애인 환자의 열 가구 이상의 가족에서 확인되었으며, 이는 이러한 돌연변이가 많은 민족에서 DFNB8/DFNB10 표현형에 대한 주요 기여 인자임을 나타낸다(문헌[Weegerink et al., 2011; J. Lee et al., 2013; J. Chung et al., 2014; M. Elbracht et al., 2007; Gao X et al., 2017]).

ABR 테스트에 대한 일반 설명: ABR 테스트는 청각 기능을 측정한다. X-축(수평(Florizontal))은 킬로헤르츠(kh)로 표시되는 주파수(음도(Pitch))를 나열한다. X-축의 왼쪽에 있는 숫자는 낮은 음도이고(베이스 음과 같음), 오른쪽으로 이동하면 숫자 또는 음도가 더 높아진다(플루트 음과 같음). Y-축(수직(Vertical)은 청력 또는 음량(데시벨 또는 db로 표시)의 "역치(Threshold)", 즉, 마우스가 들을 때까지 볼륨을 높여야 하는 정도를 나타낸다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 청각 뇌 반응(ABR) 테스트를 사용하여 돌연변이체(미처리) 마우스 및 돌연변이체 실험(처리) 마우스에 대한 상이한 주파수에서 청력 역치를 측정하였다. 처리되지 않은 그룹(10)에는 2마리의 마우스가 있었고, 처리된 그룹(12)에는 2마리의 마우스가 있었다. 처리된 마우스(12)는 반대쪽 내이에 1㎕(마이크로리터)의 AAV-TMPRSS3(유전자 요법 치료)을 주사하였다. 1개월(주사 후 시간) 후, 처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스 모두의 청력을 ABR을 사용하여 테스트하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 처리된 마우스(12)에 대한 청력 역치는 대조군(미처리) 마우스(10)에 대한 청력 역치보다 훨씬 낮았다. 해석 - 처리된 마우스(12)는 처리되지 않은 마우스(10)보다 모든 주파수를 더 빨리(더 낮은 볼륨에서) 듣는다.

DPOAE 테스트에 대한 일반 설명: DPOAE는 외부 유모 세포(outer hair cell: OHC) 기능의 척도이다. OHC는 들어오는 소리의 볼륨을 제어한다(즉 귀의 볼륨 제어 노브(volume control knob)). 도 9에서, X축과 Y축은 도 8에서와 같다. X-축은 주파수 또는 음도이고, Y-축은 듣는 데 필요한 역치 또는 볼륨이다.

도 9를 보면, 변조 이음향방사(DPOAE)를 이용한 유사한 개선을 보여준다. DPOAE 역치는 15개월령의 처리되지 않은 마우스(10)에서는 상승한 반면, 처리된 마우스(12) DPOAE 역치는 정상 수준으로 회복되었다. 해석 - 처리된 마우스(12)는 처리되지 않은 마우스(10)보다 소리를 듣기 위해 더 적은 볼륨이 필요하였다. 데이터는 처리된 마우스(12)의 OHC가 정상 기능으로 돌아가고 있음을 보여준다.

WAVE1 테스트의 일반 설명: WAVE 1 테스트는 ABR 테스트에 의해 제공되는 추가적인 측정이다. Wave 1 진폭은 나선 신경절 세포에서 수많은 청각 신경 섬유의 동시적 발화(synchronous firing)를 포함한 신경 활동을 측정한다. (수평) X-축은 소리 자극(클릭)에 대한 반응 시간을 밀리초 단위로 측정한다. Y-축(수직)은 밀리볼트(mv)로 표시되는 소리 자극에 대한 청각 신경 반응의 "진폭" 또는 강도/민감도를 나타낸다.

도 8을 참조하면, 밀리초로 측정된 시간의 함수로서 밀리볼트로 측정된 음향 자극의 결과로서 청각 유발 전위가 나타나 있다. 음향 자극은 32㎑에서 80dB의 음압 수준(sound pressure level: SPL)이었다. 신경 반응은 첫 번째 파동(14)과 세 번째 파동(16)이 일반적으로 가장 중요한 것으로 간주되는 파동의 주기를 생성한다. 이 실험에서, WAVE1 진폭은 처리된 마우스(12)와 처리되지 않은 마우스의 동형접합성(10) 및 야생형(18) 모두에서 측정하였다. 처리된 마우스(12)의 WAVE1 진폭은 처리되지 않은 마우스(10 및 18)의 진폭보다 상당히 컸다. 해석 - 처리된 마우스(12) 신경 세포는 처리되지 않은 마우스(10, 18)보다 더 큰 강도 및 민감도로 "발화"한다.

참고문헌

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1419 <210> 2 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Glu Asn Asp Pro Pro Ala Val Glu Ala Pro Phe Ser Phe Arg 1 5 10 15 Ser Leu Phe Gly Leu Asp Asp Leu Lys Ile Ser Pro Val Ala Pro Asp 20 25 30 Ala Asp Ala Val Ala Ala Gln Ile Leu Ser Leu Leu Pro Leu Lys Phe 35 40 45 Phe Pro Ile Ile Val Ile Gly Ile Ile Ala Leu Ile Leu Ala Leu Ala 50 55 60 Ile Gly Leu Gly Ile His Phe Asp Cys Ser Gly Lys Tyr Arg Cys Arg 65 70 75 80 Ser Ser Phe Lys Cys Ile Glu Leu Ile Ala Arg Cys Asp Gly Val Ser 85 90 95 Asp Cys Lys Asp Gly Glu Asp Glu Tyr Arg Cys Val Arg Val Gly Gly 100 105 110 Gln Asn Ala Val Leu Gln Val Phe Thr Ala Ala Ser Trp Lys Thr Met 115 120 125 Cys Ser Asp Asp Trp Lys Gly His Tyr Ala Asn Val Ala Cys Ala Gln 130 135 140 Leu Gly Phe Pro Ser Tyr Val Ser Ser Asp Asn Leu Arg Val Ser Ser 145 150 155 160 Leu Glu Gly Gln Phe Arg Glu Glu Phe Val Ser Ile Asp His Leu Leu 165 170 175 Pro Asp Asp Lys Val Thr Ala Leu His His Ser Val Tyr Val Arg Glu 180 185 190 Gly Cys Ala Ser Gly His Val Val Thr Leu Gln Cys Thr Ala Cys Gly 195 200 205 His Arg Arg Gly Tyr Ser Ser Arg Ile Val Gly Gly Asn Met Ser Leu 210 215 220 Leu Ser Gln Trp Pro Trp Gln Ala Ser Leu Gln Phe Gln Gly Tyr His 225 230 235 240 Leu Cys Gly Gly Ser Val Ile Thr Pro Leu Trp Ile Ile Thr Ala Ala 245 250 255 His Cys Val Tyr Asp Leu Tyr Leu Pro Lys Ser Trp Thr Ile Gln Val 260 265 270 Gly Leu Val Ser Leu Leu Asp Asn Pro Ala Pro Ser His Leu Val Glu 275 280 285 Lys Ile Val Tyr His Ser Lys Tyr Lys Pro Lys Arg Leu Gly Asn Asp 290 295 300 Ile Ala Leu Met Lys Leu Ala Gly Pro Leu Thr Phe Asn Glu Met Ile 305 310 315 320 Gln Pro Val Cys Leu Pro Asn Ser Glu Glu Asn Phe Pro Asp Gly Lys 325 330 335 Val Cys Trp Thr Ser Gly Trp Gly Ala Thr Glu Asp Gly Ala Gly Asp 340 345 350 Ala Ser Pro Val Leu Asn His Ala Ala Val Pro Leu Ile Ser Asn Lys 355 360 365 Ile Cys Asn His Arg Asp Val Tyr Gly Gly Ile Ile Ser Pro Ser Met 370 375 380 Leu Cys Ala Gly Tyr Leu Thr Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp 385 390 395 400 Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Gln Glu 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Ala Phe Arg Lys Gly Thr Thr Asp Thr Phe Glu Phe Asp Ser 945 950 955 960 Ile Tyr Leu Gly Asp Ile Ala Ser Leu Cys Val Gly His Leu Ala Arg 965 970 975 Glu Asp Arg Phe Ile Pro Lys Arg Glu Leu Ala Trp His Val Lys Thr 980 985 990 Ile Thr Ile Thr Glu Met Glu Tyr Gly Asn Val Tyr Phe Phe Asn Cys 995 1000 1005 Asp Cys Leu Ile Pro Leu Lys Arg Lys Arg Lys Tyr Phe Lys Val 1010 1015 1020 Phe Glu Val Thr Lys Thr Thr Glu Ser Phe Ala Ser Lys Val Gln 1025 1030 1035 Ser Leu Val Pro Val Lys Tyr Glu Val Ile Val Thr Thr Gly Tyr 1040 1045 1050 Glu Pro Gly Ala Gly Thr Asp Ala Asn Val Phe Val Thr Ile Phe 1055 1060 1065 Gly Ala Asn Gly Asp Thr Gly Lys Arg Glu Leu Lys Gln Lys Met 1070 1075 1080 Arg Asn Leu Phe Glu Arg Gly Ser Thr Asp Arg Phe Phe Leu Glu 1085 1090 1095 Thr Leu Glu Leu Val Val Thr Arg Leu Gly Leu Ala Ala Glu Cys 1100 1105 1110 Gly

Claims

청력 손실을 치료하기 위한 시스템으로서,
인공와우(cochlear implant); 및
유전자 치료 작제물
을 포함하되, 상기 유전자 치료 작제물은 h-TMPRSS3에 대한 발현 벡터를 포함하는, 시스템.
제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 시작 벡터, 인핸서, 프로모터, bGH 폴리(A) 신호 및 클로징 벡터(closing vector)를 추가로 포함하는, 시스템.
제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전인, 시스템.
제3항에 있어서, 상기 제2항의 상기 발현 벡터, 상기 아데노-관련 바이러스 벡터는 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, Anc80 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 TMPRSS3 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스/닭 베타-액틴(CBA) 프로모터 및 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템.
제1항에 있어서, 상기 인핸서는 TMPRSS3 인핸서 및 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시스템.
제1항에 있어서, 상기 인공와우는
소리를 수신하도록 구성된 마이크로폰(microphone);
상기 마이크로폰에 의해 포착된 소리를 선택 및/또는 배열하도록 구성된 어음 처리기(speech processor);
상기 어음 처리기로부터 신호를 수신하고 이를 전기 자극으로 전환하도록 구성되는 송신기(transmitter) 및 수용기/자극기(receiver/stimulator); 및
전극
을 포함하는, 시스템.
청력 손실을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물은 시작 벡터, 인핸서, 프로모터, bGH 폴리(A) 신호 및 클로징 벡터를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 약제학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전인, 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 아데노-관련 바이러스 벡터는 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, Anc80 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 프로모터는 TMPRSS3 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스/닭 베타-액틴(CBA) 프로모터 및 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 인핸서는 TMPRSS3 인핸서 및 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
형질감염된 세포로서, 청력 손실의 치료 또는 예방을 위해 시작 벡터, 인핸서, 프로모터, bGH 폴리(A) 신호 및 클로징 벡터를 포함하는 상기 발현 벡터를 발현하는, 세포.
제13항에 있어서, 상기 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전인, 세포.
제14항에 있어서, 상기 아데노-관련 바이러스 벡터는 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, Anc80 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
제13항에 있어서, 상기 프로모터는 TMPRSS3 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스/닭 베타-액틴(CBA) 프로모터 및 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
제13항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인, 세포.
제17항에 있어서, 상기 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포인, 세포.
청력 손실의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 청력 손실을 치료 또는 예방하는 방법으로서,
시작 벡터, 인핸서, 프로모터, bGH 폴리(A) 신호 및 클로징 벡터를 포함하는 유효량의 발현 벡터를 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및
인공와우를 상기 대상체에게 이식하는 단계
를 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 발현 벡터의 투여는 상기 인공와우 이식 전에 수행되는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 발현 벡터의 투여는 상기 인공와우 이식 후에 수행되는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 발현 벡터의 투여 및 인공와우 이식은 동시에 수행되는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 발현 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전인, 방법.
제23항에 있어서, 상기 아데노-관련 바이러스 벡터는 AAV2, AAV2/Anc80, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, Anc80 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형의 합성 버전으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 프로모터는 TMPRSS3 프로모터, Myo7a 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스/닭 베타-액틴(CBA) 프로모터 및 Pou4f3 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 발현 벡터는 상기 대상체의 내이에 주사에 의해 투여되는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 주사 방법은 인공와우 개창술(cochleostomy), 정원창막(round window membrane), 내림프낭(endolymphatic sac), 와우관(scala media), 반고리관 절개술(canalostomy), 내림프낭을 통한 와우관 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 대상체는 청력 손실과 관련된 하나 이상의 유전적 위험 인자를 갖는, 방법.
제28항에 있어서, 상기 유전적 위험 인자 중 하나는 TMPRSS3 유전자의 돌연변이 또는 LOXHD1 유전자의 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제28항에 있어서, 상기 대상체는 청력 손실의 임의의 임상적 지표를 나타내지 않는, 방법.