JP2023513116A - 難聴の治療のための遺伝子療法システム及び関連する方法 - Google Patents

難聴の治療のための遺伝子療法システム及び関連する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされた聴覚喪失を治療及び／または予防するのに有用な遺伝子療法システム及び関連する方法について記載する。本明細書に開示される組成物及び方法は、内耳へのＴＲＭＰＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター遺伝子送達を用いてそれぞれＴＭＰＲＳＳ３遺伝子またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の活性を回復させ、有毛細胞生存を促進し、難聴を患っている患者における聴覚を回復させる。本明細書に開示されるように、システム及び方法は、遺伝子変異によって引き起こされる難聴のための遺伝子療法（例えば、分子療法薬）と蝸牛移植片の移植との組合せを利用し得る。

Description

発明の詳細な説明
［技術分野］
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含み、参照によりその全体を援用する。上記ＡＳＣＩＩコピーは２０２１年２月４日に作成されたものであり、名前が１０４０４２＿４０３＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズが１８，２７７バイトである。
［背景技術］
本開示の様々な実施形態は総じて、難聴の治療及び／または予防に有用な遺伝子療法システム及び方法に関する。本明細書に記載される例示的実施形態は、患者の難聴における将来の悪化を予防するためのシステム及び関連する方法に関する。より具体的には、本開示において教示される実施形態は、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされた聴覚喪失を治療及び／または予防するのに有用な遺伝子療法システム及び関連する方法に関する。これらのシステム及び方法は、遺伝子変異によって引き起こされた難聴のための遺伝子療法（例えば、分子療法薬）と蝸牛移植片の移植との組合せを利用し得る。
難聴は、ヒトにおいて最もよくある感覚障害である。Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）によって発表された、身体障害性難聴の度合いに関する２０１８年の推定によると、身体障害性難聴と共に生きている人は世界中で４億６６００万人いる（４億３２００万人の成人及び３４００万人の子供）。身体障害性難聴を有する人の数は、２０３０年までには６億３０００万人に、そして２０５０年までには９億人超（１０人に１人）に膨らむであろう。身体障害性難聴を有する人の９０％超（４億２０００万人）は、世界の低所得層にいる（難聴有病率についてのＷＨＯ世界的推算、２０１８年ＷＨＯ難聴予防科）。
現在、難聴または聴覚喪失を予防または治療するための承認済みの療法剤はない。身体障害性難聴を有する人々のための現行の治療選択肢は蝸牛移植片である。蝸牛移植は、患者１人あたり＄１，０００，０００を上回る生涯的費用という大きな関連医療費を伴う一般的手法である。（Ｍｏｈｒ ＰＥ，ｅｔ ａｌ．
（２０００）．Ｔｈｅ ｓｏｃｉｅｔａｌ ｃｏｓｔｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｔｏ ｐｒｏｆｏｕｎｄ ｈｅａｒｉｎｇ ｌｏｓｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ；ＩｎｔＪ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ａｓｓｅｓｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ；１６（４）：１１２０－３５）。
蝸牛移植片に対する現在の需要は供給を上回っている。製造される蝸牛移植片単位の生産速度は毎年５０，０００ユニットである。現在の出生率、ならびに新生児における身体障害性難聴の発症率及び有病率に基づけば、各罹患児に１個の蝸牛移植片を提供するためには毎年１３４，０００個の蝸牛移植片が必要になる。両側（２個）の蝸牛移植片を必要とする患者を含めるとこの数は増える。
蝸牛移植片の生涯的費用は、ほとんどの人々にとっては、特に身体障害性難聴を有する人々の大多数がいる先進国外で暮らす人々にとっては高額である。蝸牛移植片に取って代わる費用対効果の高い代替手段を特に先進国外で暮らす人々に提供するための治療選択肢が必要とされている。
言語習得期前聴覚喪失の５０％超は遺伝学的なもの、すなわち遺伝性のものである（疾患予防管理センター－難聴の遺伝学）。遺伝性難聴及び聴覚喪失は、伝音性、感覚神経性または両者の組合せ；症候性（外耳もしくは他の器官の奇形に関連するもの、または他の器官システムが関与する医学的問題に関連するもの）、または非症候性（外耳の視認可能な異常または何らかの関係する医学的問題に関連しないもの）；及び言語習得期前（言語発達前）または言語習得期後（言語発達後）（Ｒｉｃｈａｒｄ ＪＨ Ｓｍｉｔｈ，ＭＤ，Ａ Ｅｌｉｏｔ Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，ＰｈＤ，ａｎｄ Ｇｕｙ Ｖａｎ Ｃａｍｐ，ＰｈＤ，Ｄｅａｆｎｅｓｓ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｐｏｓｔｉｎｇ：Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４，１９９９；Ｌａｓｔ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ：Ｊａｎｕａｒｙ ９，２０１４）であり得る。遺伝性難聴の７０％超は非症候性である。非症候性聴覚喪失に関する種々の遺伝子座は、（聴覚喪失を表して）ＤＦＮと呼称される。座位は遺伝様式に基づいて命名される：ＤＦＮＡ（常染色体優性）、ＤＦ Ｂ（常染色体劣性）及びＤＦＮＸ（Ｘ連鎖性）。上記名称に続く番号は遺伝子マッピング及び／または発見の順番を反映している。一般集団において難聴の有病率は年齢とともに上昇する。この変化は、遺伝学及び環境の影響、ならびに環境要因と個人の遺伝学的素因との相互作用を反映している。
感覚神経性難聴（ＳＮＨＬ）は、ヒトにおいて最もよくある神経変性疾患であり、現在、承認済みの薬理学的介入はない。ＳＮＨＬは、遺伝学的障害によって引き起こされ得、外傷、例えば音響外傷及び耳毒性が原因となって罹患し得る。遺伝学的診断は、非症候性ＳＮＨＬを引き起こす少なくとも１００個の遺伝子があることを示した。遺伝学及び遺伝子療法技術における近年の進歩は、遺伝子療法によって複数の劣性型の聴覚喪失の救済が可能であることを示した（Ａｋｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ａｓｋｅｗ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。アデノ随伴ウイルスベクターを使用して内耳への長期的な遺伝子送達が成し遂げられた（Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１６）。遺伝子療法を用いて聴覚喪失及び難聴に取り組む最初のヒト臨床試験は、２０１４年６月から始まって２０１９年１２月に終了した（ＣＧＦ１６６）であった。ＣＧＦ１６６の治験責任者はＨｉｎｒｉｃｈ Ｓｔａｅｃｋｅｒ博士であり、治験のスポンサーはＮｏｖａｒｉｓであった。（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２１３２１３０）。この分野におけるトランスレーショナルリサーチのための理想的な疾患標的は、内耳内の画定された細胞群を冒し、出生後の発話発達後に起こる、劣性遺伝難聴である。変異率はさらなる検討事項である。
本明細書に記載されるように、難聴の共通劣性原因の発生率を入念に評価するとともに遺伝子のサイズを考慮することによって、利用可能な相当な共通患者集団を有する遺伝子療法プログラムを開発することが可能である。例えば、ＴＭＰＲＳＳ３は、他の変異ほどには共通していないとはいえ、蝸牛移植の正当な理由となるのに十分重篤な難聴の相当な共通原因である。加えて、ＴＭＰＲＳＳ３に変異を有する患者は、他の変異を有する患者と同様に蝸牛移植が奏効しないことがある（Ｓｈｅａｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これは、独立型の療法薬として、あるいは他の治療剤及び／または蝸牛移植と組み合わせてＴＭＰＲＳＳ３または他の遺伝子、例えばＬＯＸＨＤ１を標的にしてこの障害の移植片転帰を改善する契機を提供する。表１（（Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｎｉｓｈｉｏ，＆Ｕｓａｍｉ，２０１６）からの改作）は、ＴＭＰＲＳＳ３における変異が、蝸牛内に相当限局された分布を有する言語習得期後劣性難聴の最共通原因であり得、遺伝子のサイズゆえに既存のＡＡＶベクターの中に組み込まれ得ることを示している。
Figure 2023513116000002
表１：１７６名の成人蝸牛移植片患者における種々の変異の発生率。
ヒト膜貫通型セリンプロテアーゼ３（ＴＭＰＲＳＳ３；別名ＤＦＮＢ１０、ＤＦＮＢ８、ＥＣＨＯＳ１、ＴＡＤＧ１２；受託番号ＨＧＮＣ：１１８７７）は、先天性の（出生時に存在している）及び小児期発症性の常染色体劣性聴覚喪失の両方との関連によって同定された。ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子における変異は、常染色体劣性非症候性聴覚障害型のＤＦＮＢ８及び１０に関連している。ＴＭＰＲＳＳ３は、セリンプロテアーゼをコードする１６４６塩基対の遺伝子であり、ＤＦＮＡ８／１０と関連付いており、蝸牛移植を受けている難聴の患者の１～５％以下を占め得る（Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。この遺伝子の機能喪失は、変異の部位に応じて広範な聴覚表現型をもたらすようである。先天性及び成人期発症進行性難聴はどちらもこの遺伝子の喪失に関連していた。
ＤＦＮＢ８難聴の発症は言語習得期後（１０～１２歳）である一方、ＤＦＮＢ１０難聴の発症は言語習得期前（先天性）である。この表現型の違いは遺伝子型の違いを反映している。ＤＦＮＢ８に起因する多様体はスプライス部位多様体であり、非効率的なスプライシングが、言語習得期前聴覚喪失を防ぐには十分であるが最終的な難聴を防ぐには不十分である正常タンパク質の量の減少と関連付いていることを示唆している（Ｒｉｃｈａｒｄ ＪＨ Ｓｍｉｔｈ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｅｓ Ｋｎｏｗｎ ｔｏ Ｃａｕｓｅ Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ：Ｄｅａｆｎｅｓｓ ａｎｄ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ；ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ参照）。
難聴を引き起こすことが知られている２１番染色体上のＴＭＰＲＳＳ３変異を表２に記載する。
Figure 2023513116000003
Figure 2023513116000004
リポキシゲナーゼ相同性ドメイン１遺伝子（ＬＯＸＨＤ１；別名ＬＨ２Ｄ１、ＤＦＮＢ７７、ＦＬＪ３２６７０、ＯＭＩＭ：６１３０７２；受託番号ＨＧＮＣ：２６５２１）は、タンパク質を形質膜に指向することに関与すると考えられているＰＬＡＴ（ポリシスチン／リポキシゲナーゼ／アルファ毒素）ドメインのみからなる高度に保存されたタンパク質をコードする。マウスでの研究は、この遺伝子が内耳内の機械的感覚性有毛細胞に発現し、この遺伝子における変異が聴力欠損を招くことを示しており、この遺伝子が正常有毛細胞機能に必須であることを示唆している。聴覚喪失を分別する人類のスクリーニングによって、常染色体劣性非症候性難聴（ＡＲＮＳＨＬ）の進行性形態であるＤＦＮＢ７７を引き起こすこの遺伝子における変異が特定された。この遺伝子について、異なるアイソフォームをコードする別様にスプライスされた転写産物多様体が認められた。
ＬＯＸＨＤ１の臨床的特徴
・常染色体劣性
・感覚神経性両側性難聴（低周波数ではより軽度の難聴）
・アシュケナージ系ユダヤ人家族において７～１０歳で蝸牛移植片使用につながる先天性発症
・イラン系血縁家族において７～８歳までに発症し、成人期中に中～高周波数について中等度～重度の喪失に進行すること
常染色体劣性非症候性難聴７７（ＤＦＮＢ７７）が１８番染色体ｑ２１上のＬＯＸＨＤ１遺伝子（６１３０７２）におけるホモ接合型変異によって引き起こされることの証拠。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、胎仔日数１３．５日目及び１６日目の発達途中のマウス内耳においてＬｏｘｈｄ１の発現が検出されたが、その他の組織では検出されなかった。出生後４日目に蝸牛及び前庭有毛細胞において発現が検出され、濃度は核において最も高かった。Ｌｏｘｈｄ１は徐々に細胞質へと局在化してゆき、成体期にはＬｏｘｈｄ１は聴毛の長さに沿って有毛細胞に発現した。
Ｇｒｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）は、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮＵ）変異誘発スクリーニングを用いて、３週齢までに聴覚障害になり８週齢までにろうになる「ｓａｍｂａ」マウス系統を開発した。ホモ接合型ｓａｍｂａマウスは他の神経学的または前庭異常を何ら示さず、ヘテロ接合型ｓａｍｂａマウスは完全に正常と見受けられた。ホモ接合体型ｓａｍｂａマウスでは、聴毛発達は影響を受けなかったが、有毛細胞機能は撹乱を受け、最終的に有毛細胞が変性した。
Ｇｒｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）は、ｓａｍｂａが、ＰＬＡＴドメイン１０のベータサンドイッチ構造を不安定化させるマウスＬｏｘｈｄ１遺伝子における変異であることを見出した。変異は、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の安定性、または聴毛の長さに沿ったＬｏｘｈｄ１タンパク質の局在化を変化させなかった。しかしながら、出生後２１日目にいくつかの有毛細胞は頂端細胞膜において、聴毛の癒合及び膜の乱れを伴う形態学的欠陥を示した。出生後９０日目までには、有毛細胞喪失及びラセン神経節ニューロンの減少を含めた重大な変性変化が明白となった。Ｇｒｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）は、ラセン神経節ニューロンの変性が有毛細胞の機能及び維持における撹乱に続発するものである可能性が高いという仮説を立てた。
難聴を引き起こすことが知られている１８番染色体上のＬＯＸＨＤ１変異を表３に記載する。
Figure 2023513116000005
Figure 2023513116000006
米国出願公開第２０１３／００９５０７１号は、参照によりその全体が本明細書に援用されるが、アポトーシスタンパク質のＸ連鎖阻害剤（ＸＩＡＰ）を内耳の正円窓膜に送達するために変異型チロシンアデノ随伴ウイルスベクターを使用して加齢性難聴から回復させる遺伝子療法について記載している。しかしながら、当該刊行物は、ＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされる難聴または聴覚喪失を予防する、またはその発症を遅らせる、またはそれから回復させるための、本明細書に開示されるような機能性ＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１をコードする核酸配列の送達を企図していない。
加えて、聴力障害を治すための臨床的遺伝子療法を開発する上での当技術分野の現状での重大な落とし穴は、ヒト難聴を反映する動物モデルがないということである。ヒトにおいて成人期に発症する遺伝学的難聴のために利用できるマウスモデルの多くは先天性の難聴を呈し、送達研究を複雑なものにしている。聴覚の発達後に遺伝学的難聴を発症するモデルはほとんどない。新生仔マウスにおけるベクターの送達は、成体マウスの場合に比べて異なるトランスフェクションパターンをもたらす（Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１６）。異なるベクターシステム及び遺伝子標的を使用して救済を評価するために使用され得る新規動物モデルが必要とされている。
上記に鑑み、蝸牛移植は、重度から最重度までに及ぶ難聴に取り組むための治療選択肢の１つの一般的方法である。蝸牛移植片は、最重度のろうまたは重度の聴きづらさを有する人に音の感覚を提供するのに役立ち得る小さく複雑な電子デバイスである。移植片は、耳の後方に位置する外側部分、及び外科的に皮下に配置された第２部分からなる。
数年を経て蝸牛移植片のデザイン及び性能には極めて大きな進歩が起こったが、移植片による発話転帰に関して上手くいっていない患者が未だにいる。近年の研究は、聴覚喪失を引き起こす２つの遺伝子ＴＭＰＲＳＳ３及びＬｏｘＨＤ１における変異も蝸牛移植片結果において好ましくない転帰を有していることを実証した１。具体的には、ＴＭＰＲＳＳ３変異患者はラセン神経節の機能不全を有する２。マウスＴＭＰＲＳＳ３変異モデルを評価する中で、最初に有毛細胞が変性し、そのすぐ後にラセン神経節細胞が変性したことが実証された３。内耳の有毛細胞に対する永久的損傷は感覚神経性難聴をきたして集団の大部分において意思疎通困難を招く。有毛細胞は、音響刺激を変換する受容体細胞である。損傷有毛細胞の再生は、人工器官装置以外の療法を現在有していない症状を治療するための道を提供するであろう。
ＴＭＰＲＳＳ３変異を有するヒト患者を評価する中で、蝸牛移植片機能が年齢とともに低下することが実証されたが、このことは、ヒト集団において遅れてラセン神経節細胞の変性も起こることを示唆している４。上記は、難聴に対抗するには蝸牛移植片単独では不十分であり得ることを示唆している。
したがって、蝸牛移植と組み合わせた難聴のための分子療法薬（例えば遺伝子療法）の併用を提供する契機が存在する。
［発明の概要］
本開示の実施形態は、数ある中でも、難聴を治療及び／または予防するのに有用な遺伝子療法システム及び方法に関する。本明細書に開示されるシステム及び方法は、変性しつつある有毛細胞及び／または変性しつつあるラセン神経節細胞を介入の時期に応じて修復及び／または救済するための、蝸牛移植との併用遺伝子療法に関する。
本明細書に開示される実施形態の各々は、他の本開示の実施形態のいずれかに関連して記載される特徴の１つ以上を含み得る。
本明細書に開示されるのは、発現ベクターであって、配列番号１もしくは配列番号２の核酸配列、または配列番号１もしくは配列番号２の核酸との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、当該核酸配列がプロモーターに機能的に連結されている、当該発現ベクターである。さらに本明細書に開示されるのは、難聴を治療または予防する方法に使用するための医薬組成物であって、配列番号１もしくは配列番号２の核酸配列、または配列番号１もしくは配列番号２の核酸との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を有する発現ベクターを含み、当該核酸配列がプロモーターに機能的に連結されている、当該医薬組成物である。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１または配列番号２の核酸配列との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、ヘルパー依存アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、Ａｎｃ８０、またはアデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態から選択されるアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、Ａｎｃ８０、またはアデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、機能可能に連結された核酸の発現を発達初期において促し、生涯全体を通して発現を維持する、任意の有毛細胞プロモーター、例えば、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーターから選択される。
本明細書に開示されるのは、細胞であって、配列番号１もしくは配列番号２の核酸配列、または配列番号１もしくは配列番号２の核酸との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む発現ベクターを有し、当該核酸配列がプロモーターに機能的に連結されている、当該細胞である。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１または配列番号２の核酸配列との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞である。
本明細書に開示されるのは、難聴を治療または予防する方法であって、配列番号１もしくは配列番号２の核酸配列、または配列番号１もしくは配列番号２の核酸との少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む有効量の発現ベクターを、それを必要とする対象に投与することを含み、当該核酸配列がプロモーターに機能的に連結されている、当該方法である。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１または配列番号２の核酸配列との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、ヘルパー依存アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡｎｃ８０、またはアデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態から選択されるアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、Ａｎｃ８０、またはアデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、機能可能に連結された核酸配列の発現を発達初期において促し、生涯全体を通して発現を維持する、任意の有毛細胞プロモーター、例えば、ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、またはＰｏｕ４ｆ３プロモーターから選択される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、対象の内耳の中に、例えば注射によって投与される。いくつかの実施形態では、送達方法は、蝸牛切開術、正円窓膜、半規管開窓術またはその任意の組合せから選択される（Ｅｒｉｎ Ｅ．Ｌｅａｒｙ Ｓｗａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｉｎｎｅｒ Ｅａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ Ａｕｄｉｔｏｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６０（１５）：１５８３－１５９９参照）。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、内リンパ嚢経由で中階の中に送達される（Ｃｏｌｌｅｔｔｉ Ｖ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｎｅｒ ｅａｒ．Ａｕｄｉｏｌ Ｎｅｕｒｏｏｔｏｌ．１５（６）：３５３－６３、Ｍａｒｃｏ Ｍａｎｄａｌａ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｆｌｏｗ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｃｈｌｅａ ｉｎ Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ－Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ．１４３，６７３－６７９、Ｙａｍａｓｏｂａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｎｎｅｒ ｅａｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｓａｃ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（５）：７６９－７４）。いくつかの実施形態では、対象は、難聴に関連する１つ以上の遺伝学的リスク因子を有する。いくつかの実施形態では、遺伝学的リスク因子の１つは、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子における変異である。いくつかの実施形態では、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子における変異は、難聴を引き起こすことが知られている任意の１つ以上のＴＭＰＲＳＳ３変異から選択される（例えば表２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、遺伝学的リスク因子の１つは、ＬＯＸＨＤ１遺伝子における変異である。いくつかの実施形態では、ＬＯＸＨＤ１遺伝子における変異は、難聴を引き起こすことが知られている任意の１つ以上のＬＯＸＨＤ１変異から選択される（例えば表３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、対象は難聴の臨床指標を何ら呈しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターは、他の核酸配列を含む１つ以上の発現ベクター及び／または難聴を治療するための１つ以上の他の医薬品原薬との併用療法として投与される。例えば、併用療法は、配列番号１の核酸配列を有する第１発現ベクター、及び配列番号２の核酸配列を有する第２発現ベクターを含み得、両発現ベクターは、難聴を治療するための併用療法の一部として対象に投与される。
本明細書に開示されるのは、難聴を引き起こすことが知られている任意の１つ以上のＴＭＰＲＳＳ３変異から選択される変異を有するヒトＴＭＰＲＳＳ３遺伝子を有する遺伝子導入マウスである（例えば表２を参照されたい）。本明細書に開示されるのは、難聴を引き起こすことが知られている任意の１つ以上のＬＯＸＨＤ１変異から選択される変異を有するヒトＬＯＸＨＤ１遺伝子を有する遺伝子導入マウスである（例えば表３を参照されたい）。
上記の全体的記載及び以下の詳細な説明がどちらも例示的及び説明的なものであるにすぎず、特許請求される本発明を限定するものでないことは、理解され得る。
添付図は、本明細書に組み込まれてその一部をなしているが、本開示の例示的実施形態を例示しており、記載と一緒に本開示の原理を説明する役割を果たす。
野生型ヒトＴＭＰＲＳＳ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０７４８４７．２）をコードするｃＤＮＡ配列を示す。 図１中のｃＤＮＡにコードされる野生型ヒトＴＭＰＲＳＳ３アミノ酸配列を示す。 野生型ヒトＬＯＸＨＤＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ０５７２３２．１）をコードするｃＤＮＡ配列を示す。 図３中のｃＤＮＡにコードされる野生型ヒトＬＯＸＨＤＩアミノ酸配列を示す。 成体マウス蝸牛におけるＴＭＰＲＳＳ３免疫組織化学を示す。 本開示の一態様による例示的な蝸牛移植片及び対応する人体内部の解剖学的構造を示す。 「ＯＲＩ」から始まって開始「ＡＡＶ２ ＩＴＲ」ベクター、「ＣＭＶエンハンサー」、「ＣＭＶプロモーター」、「ｈ－ＴＭＰＲＳＳ３」、「ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル」及び閉鎖「ＡＡＶ２ ＩＴＲ」ベクターを含む、例示的なＴＭＰＲＳＳ３プラスミドマップを示す。 聴性脳幹反応（ＡＢＲ）検査を手段として、遺伝子療法処置を受けている（処置）疾患モデルマウスの聴力回復を、処置を受けていない（未処置）疾患モデルマウスに対してグラフで比較することによる概念実証を示す。 歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）検査を手段として、遺伝子療法処置を受けている（処置）疾患モデルマウスの聴力回復を、処置を受けていない（未処置）疾患モデルマウスに対してグラフで比較することによる概念実証を示す。 ＷＡＶＥ１振幅検査を手段として、遺伝子療法処置を受けている（処置）疾患モデルマウスの聴性神経機能回復を、処置を受けていない（未処置）疾患モデルマウスに対してグラフで比較することによる概念実証を示す。 本明細書に教示される遺伝子療法の１つ以上を送達するための例示的な薬物送達部位としてのヒト耳内での正円窓膜（ＲＷＭ）の位置を示す。
特定用途のための例示的実施形態を参照して本開示の原理が記本明細書に載されているが、本開示がそれに限定されないことは理解されるべきである。当技術分野における通常の技量、及び本明細書に提供される教示内容の利用能力を有する者であれば、さらなる改変形態、用途、実施形態、及び均等物の置換が全て、本明細書に記載される実施形態の範囲に入ることを認識するであろう。したがって、本発明は、上記の記載によって限定されるとみなされるべきでない。
本開示は、遺伝子変異によって引き起こされる聴覚喪失を治療及び／または予防するのに有用な遺伝子療法システム及び関連する方法に関する。変異して聴覚喪失を引き起こす可能性がある２つの遺伝子の例は、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子またはＬｏｘＨＤ１遺伝子である。本明細書に記載のシステム及び方法は、遺伝子変異によって引き起こされる難聴のための遺伝子療法（例えば分子療法薬）と蝸牛移植片の移植との組合せを利用し得る。システム及び方法が、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子かＬｏｘＨＤ１遺伝子かのどちらかによって引き起こされる遺伝子変異を考慮したものであるにもかかわらず、聴覚喪失または難聴を引き起こすことが見出された他の遺伝子変異を修復の標的としていてもよいことは、認識され得る。
本開示の目的のために、以下の「遺伝子療法」の定義が用いられ得る。遺伝子療法は、ＤＮＡを患者に導入して遺伝学的疾患を治療する場合を意味し得る。新規なＤＮＡは大抵、既存の遺伝子における疾患原因変異の作用を補正する機能性遺伝子を含有する。遺伝子移入は、実験目的または治療目的のどちらのためであろうと、遺伝情報を標的細胞まで往来させるベクターまたはベクターシステムに依存している。ベクターまたはベクターシステムは、遺伝子移入反応の効率、特異性、宿主応答、薬理学及び長続きの主要決定因子とみなされている。現在、遺伝子移入を成し遂げる上で最も効率的で効果的な方法は、複製能欠損型にされたウイルスに基づくベクターまたはベクターシステムを使用することである（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０５４６５３；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）。
本明細書中で使用する場合、「治療する」、「治療すること」及び「治療」という用語は、臨床転帰における望ましい変化を狙いとした様々な活動を包含する。例えば、本明細書中で使用される「治療する」という用語には、本明細書に記載される難聴の１つ以上の臨床指標または症候において検出可能な改善をもたらすことを狙いとした、またはそれをもたらす、任意の活動が包含される。
ＬＯＸＨＤ１遺伝子（例えば、遺伝子診断検査で検出されるもの）は、しかし、難聴の臨床指標または症候を呈さず、それゆえ、治療的介入が開始され得る機会が得られる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、聴力が徐々に逆行する期間の間の治療的介入のための方法を提供する。本発明の方法は、そのような期間よりも前に開始され得る。本発明によって提供される、難聴を治療する方法には、難聴の発症、または難聴の臨床指標もしくは症候の進行を予防するまたは遅らせる方法が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「難聴」という用語は、音を聴く能力の低下を表して使用され、聴覚喪失、及び音を聴く能力の完全な欠如を含む。
「有効量」または「治療的有効量」という用語は、本明細書中で使用される場合、１つ以上の望ましい臨床転帰、例えば上記「治療」の記載に説明されているものをもたらすに足る、またはもたらす一助となるに足る、本明細書に記載の活性薬剤の量を指す。任意の個々の事例での適切な「有効」量は、当技術分野で知られている標準的な技術、例えば用量漸増試験を用いて決定され得る。本明細書中で使用される「活性薬剤」という用語は、本明細書に記載の組成物及び方法に使用されることを意図した、及び例えば難聴を治療する目的のために生物学的に活性であることを意図した分子（例えば、本明細書に記載のＡＡＶベクター）を指す。
本明細書中で使用される「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載の少なくとも１つの活性薬剤または２つ以上の活性薬剤の組合せ、及び薬学的送達に使用するのに適した１つ以上の他の成分、例えば、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、賦形剤などを含む、組成物を指す。
本明細書中で互換的に使用される「対象」または「患者」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物（例えば、ラット、マウス及びモルモット）などを含むがこれらに限定されない哺乳類を包含する。本発明のいくつかの実施形態では、対象はヒトである。
本明細書中で使用する場合、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」または「ベクター（ｖｅｃｔｏｒｓ）」という用語が使用され得る。「ベクター」は、所望の遺伝子を細胞内に移すことができるが、細胞を乗っ取るかまたは細胞に害を及ぼすことはできない、ウイルスを指し得る。今日までに、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、レトロウイルス、ヘルパー依存アデノウイルス及びレンチウイルスはどれも、蝸牛遺伝子送達のために試験されたことがある。これらのうちで最も高い将来性を示したのはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であった：それは、非複製性であり、内耳内に導入遺伝子を効率的に移入させ得、耳毒性を生じさせない。詳しくは、ＡＡＶは内有毛細胞に効果的にトランスフェクトし得るが、これは、有毛細胞に特異的な変異に起因する遺伝学的欠陥を補正することを望む場合には必須な特徴である。現在までに複数の異なるＡＡＶ亜型が蝸牛遺伝子送達のために使用されて成功を収めてきたが、このことは、コルチ器に対する損傷がたとえあったとしてもほとんどないことを実証している。ＡＡＶ血清型１、２、５、６及び８を研究する近年の報告は、有毛細胞、支持細胞、聴神経及びラセン靱帯における遺伝子発現に成功したことを実証し、有毛細胞が最も効果的に形質導入された（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｒ．Ｌｕｓｔｉｇ，ＭＤ ａｎｄ Ｏｍａｒ Ａｋｉｌ，ＰｈＤ（２０１２）Ｃｏｃｈｌｅａｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２５（１）：５７－６０）。内耳に投与され得るＡＡＶベクターの例は、さらには米国特許出願第２０１３／００９５０７１号に記載されており、参照によりその全体を本明細書に援用する。
現在、難聴または聴覚喪失を予防または治療するための承認済みの療法剤はない。身体障害性難聴を有する人々のための現行の治療選択肢は蝸牛移植片である。本明細書に記載されるように、難聴の共通劣性原因の発生率を入念に評価するとともに遺伝子のサイズを考慮することによって、共通患者集団にとって利用可能となり得る併用治療療法システムを開発することが可能である。
蝸牛移植片は、有毛細胞の機能を迂回することによって機能し、ラセン神経節細胞を直接刺激する。有毛細胞は、全ての脊椎動物の耳内の聴覚系及び前庭系の両方の感覚受容体である。メカノトランスダクションによって有毛細胞はその環境での動きを検出する。しかしながら、これらの細胞は、特定の動物（例えばヒト）において、１つ以上の遺伝子（例えば、ＴＭＰＲＳＳ３、ＬｏｘＨＤ１など）における変異のために劣化し得る。ラセン（蝸牛）神経節は、音の代表を蝸牛から脳へ送ることによって聴覚を提供する神経細胞の群である。ラセン神経節ニューロンの細胞体は、蝸牛内の円錐形状の中心軸である蝸牛軸において見つかる。したがって、機能性ラセン神経節を有することは、蝸牛移植片機能を最適に有する上で不可欠である。しかしながら、先に記載されるとおり、これらのラセン神経節は、聴覚障害または難聴を招く遺伝子変異を受けやすい可能性がある。有毛細胞も、言及したとおり、同様に難聴または聴覚障害を招き得る遺伝子変異を受けやすい可能性がある。
本開示の一態様によれば、ウイルスベクターによるＴＭＰＲＳＳ３遺伝子（または他の任意の好適な遺伝子）の天然のコピーの送達は、使用するベクター及びプロモーターに応じて有毛細胞及び／またはラセン神経節細胞のいずれかを治療するために用いられ得る。有毛細胞及び／またはラセン神経節細胞の劣化のレベルに応じて
ＴＭＰＲＳＳ３は、変性しつつある有毛細胞及び／または変性しつつあるラセン神経節細胞を介入の時期に応じて救済する潜在能力を有する。被っている難聴の度合いゆえに蝸牛移植を受けている患者に関して、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子療法は、ラセン神経節機能を保つこと及びさらなる変性を防止することによって移植片機能を強化し得、それによって、下地に細胞基質を有することを前提として移植片が最適に機能することを可能にし得る。
ＴＭＰＲＳＳ３は、蝸牛移植の正当な理由となるのに十分重篤な難聴の相当な共通原因である。加えて、ＴＭＰＲＳＳ３に変異を有する患者は、他の変異を有する患者と同様に蝸牛移植が奏効しないことがある（Ｓｈｅａｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これは、独立型の療法薬として、あるいは他の治療剤及び／または蝸牛移植と組み合わせてＴＭＰＲＳＳ３または他の遺伝子、例えばＬＯＸＨＤ１を標的にしてこの障害の移植片転帰を改善する契機を提供する。ＴＭＰＲＳＳ３における変異が、蝸牛内に相当限局された分布を有する言語習得期後劣性難聴の最共通原因であり得、遺伝子のサイズゆえに既存のＡＡＶベクターの中に組み込まれ得ることが示された。
米国出願公開第２０１３／００９５０７１号は、参照によりその全体が本明細書に援用されるが、アポトーシスタンパク質のＸ連鎖阻害剤（ＸＩＡＰ）を内耳の正円窓膜に送達するために変異型チロシンアデノ随伴ウイルスベクターを使用して加齢性難聴から回復させる遺伝子療法について記載している。しかしながら、当該刊行物は、ＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされる難聴または聴覚喪失を予防する、またはその発症を遅らせる、またはそれから回復させるための、本明細書に開示されるような機能性ＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１をコードする核酸配列の送達を企図していない。
例示的実施形態では、及び本明細書において教示されるように、治療処置は、図１１に描かれているようにカテーテルまたは蝸牛移植片のポートを使用して内耳の正円窓膜（ＲＭＷ）を介して送達され得る。例示的実施形態では、ヒト内耳内の正円窓膜（ＲＭＷ）は、潜在的な薬物送達部位としての役割を果たす。図１１は、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｍｍｏｎｓ．ｗｉｋｉｍｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｆｉｌｅ：Ｂｌａｕｓｅｎ＿０３２８＿ＥａｒＡｎａｔｏｍｙ．ｐｎｇから入手できるヒト耳の解剖学的構造の画像の注釈付き形態である。Ｂｌａｕｓｅｎ．ｃｏｍ ｓｔａｆｆ（２０１４）．“Ｍｅｄｉｃａｌ ｇａｌｌｅｒｙ ｏｆ Ｂｌａｕｓｅｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ２０１４”．ＷｉｋｉＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １（２）を参照されたい。
上に言及されるように、現在、難聴または聴覚喪失を予防または治療するための承認済みの治療処置はなく、そのような治療を試験するための有用な前臨床動物モデルは存在しない。本開示は、それゆえ、変異型ＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１遺伝子の活性を回復させ、有毛細胞生存を促進し、難聴または聴覚喪失に罹患している患者の聴力を回復させるための、内耳内へのＴＭＰＲＳＳ３またはＬＯＸＨＤ１のウイルスベクター遺伝子送達のためのシステム及び方法、ならびにそのような組成物及び方法を試験するための細胞系及び動物系モデルについて記載すると同時に、蝸牛移植との併用治療についても記載する。
ＴＭＰＲＳＳ３（ＤＦＮＡ８／１０）における変異に関係する難聴は、様々な異なる表現型で顕在化し得る。先天性の最重度難聴、及び成人期発症進行性難聴の両方について記載がなされている（Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。現在のところ、Ｔｍｐｒｓｓ３機能不全に陥る機序は分かっていない。難聴が出生時から始まるものと、より少し後の時点であるがなおも聴覚及びマウスの成熟前に難聴を発症する別のものとの２つのマウスモデルが開発された。Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．は、Ｔｍｐｒｓｓ３におけるタンパク質切断性ナンセンス変異を保有するエチル－ニトロソウレア誘導変異マウスを生み出した。これは、有毛細胞の欠如、及び聴覚成熟時期に近い出生後１２日目での聴覚退行を示した。加えて、球形嚢有毛細胞が影響を受け、遅れてラセン神経節細胞の変性が認められた（Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ラセン神経節の変性がコルチ器の変性に関係しているのかそれともラセン神経節におけるＴｍｐｒｓｓ３の機能不全に関係しているのかについては、マウスモデルからは不明である。複数の研究がマウス内耳におけるＴｍｐｒｒｓｓ３の分布を評価し、有毛細胞及びラセン神経節細胞におけるＴｍｐｒｓｓ３の存在を概して示している（Ｆａｎ，Ｚｈｕ，Ｌｉ，Ｊｉ，＆Ｗａｎｇ，２０１４、Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。１ヶ月齢のＣ５７ＢＩ５マウスにおいて、抗体である抗ＴＭＰＲＳＳ３（１：１００、ａｂ１６７１６０，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用してマウスＴｍｐｒｓｓ３の発現が評価された。標識付けは、内及び外有毛細胞、血管条、ならびにラセン神経節細胞の約５０％において認められた（図５）。これは、Ｆｓｑｕｅｌｌｅマウスモデルにおいて蝸牛内電位には変化が認められなかったが、ＴＭＰＲＳＳ３機能の喪失がさらには血管条機能の喪失をもたらすことを示唆している（Ｆａｓｑｕｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子型－表現型研究は、最重度先天性難聴から成人期発症進行性難聴にまで及ぶ多種多様な形態の難聴を明らかにした（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。研究は、ＴＭＰＲＳＳ３変異に起因する難聴が、成人期蝸牛移植を受けている患者の２～５％を占め得ることを示唆している（Ｊｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｎｉｓｈｉｏ，＆Ｕｓａｍｉ，２０１６、Ｓｌｏａｎ－Ｈｅｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの変異を有する患者の多くは、残存する聴力の量がかなりある。これは、治療され得る細胞の基質が存在するであろうことから、それを潜在的な救済療法のための魅力的な標的にするであろう。この変異を有する患者における蝸牛移植の成功に関するいくつかの相異なる研究が存在する。ＴＭＰＲＳＳ３の喪失によって引き起こされる難聴の少なくともいくつかの形態は、遺伝学的聴覚喪失の他の形態と比較して蝸牛移植が同様には上手くいかないことがある（Ｓｈｅａｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。このことは、この遺伝子が有毛細胞とラセン神経節細胞の５０％以下との両方に発現するという事実に関係している可能性がある（図５参照）。送達のためのベクターシステムを選択する際はこれらの相違を考慮する必要がある。有毛細胞への強い向性、及び有毛細胞とラセン神経節とへの向性に関してベクターを試験することになる。ベクター向性の差異は、胎児と成体とで内耳送達を比較した場合にも認められた（Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓｈｕ，Ｔａｏ，Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ）。標的となる臨床集団は、成熟した聴覚系を有するヒトであることから、本開示では、疾患進行（実施例１参照）と成体蝸牛への救済療法のモデル送達（実施例２参照）との両方のためのモデルとして使用され得る、聴覚成熟後に難聴を発症するマウスモデルを開示する。
したがって、本開示の目的は、上記の遺伝子療法技術と蝸牛移植との併用を用いる機会を提供することである。
例示的実施形態
例示的実施形態によれば、本明細書に教示される遺伝子療法技術は、蝸牛移植と組み合わせて送達され得る。例示的実施形態において、及び添付の図１を参照して、蝸牛移植片は、１）環境から音を受信し得るマイクロホン、２）マイクロホンによって拾い上げられた音を選択及び配列し得る音声処理装置、３）音声処理装置からの信号を受信してそれを電気インパルスに変換するように構成され得る伝達装置及び受信機／刺激装置、ならびに４）刺激装置からのインパルスを集電してそれを聴神経の異なる領域に送る電極の群である電極アレイを含み得る。例示的実施形態において、蝸牛移植片は、最重度のろうまたは重度の聴きづらさを有する人に音の感覚を提供するのに役立ち得る小さく複雑な電子デバイスであり得る。移植片は、耳の後方に位置する外側部分、及び外科的に皮下に配置された第２部分からなる。
本開示の態様によれば、本明細書に教示される療法に対して適格となり得る患者は、（１）蝸牛移植片の現在のユーザーか、（２）現在のユーザーではないが蝸牛移植片に対する候補者、すなわち新たな蝸牛移植片の設置と一緒に遺伝子療法処置を望む（両者が同時に行われる）新規蝸牛移植片ユーザーかのどちらかであり得る。
蝸牛移植片は、健常な内耳（または蝸牛）の機能を模倣するように設計される。それは内耳の内部の損傷感覚有毛細胞の機能に取って代わって、補聴器が提供し得る音よりも明瞭な音を提供するのに役立つ。人が難聴を被っているかまたは聴覚が著しく損なわれている場合、人がその聴神経を介して外部情報を取り込むのを可能にすべく蝸牛移植片が移植され得る。感覚神経性難聴の間、つまり人の内耳内の有毛細胞が損傷を受けている間、損傷有毛細胞はもはやその聴神経に音を送ることができない。上記に暗に示されるように、蝸牛移植片は内耳内のこれらの損傷有毛細胞を迂回または省略して聴神経に情報を直接送達する。特定の遺伝子は、出生時、または人の生涯においてよりいくらか遅い時期に、これらの有毛細胞（及び／またはラセン神経節）を早い段階で損傷するかまたは劣化させる変異を受けやすいことが研究で示された。上に記載されるように、聴覚喪失を引き起こす２つの遺伝子ＴＭＰＲＳＳ３及びＬｏｘＨＤ１における変異は蝸牛移植片結果において好ましくない転帰を有する場合があることが研究で実証された１。具体的には、典型的なＴＭＰＲＳＳ３変異患者は、そのラセン神経節及び有毛細胞のどちらかまたは両方において機能不全を有し得る。マウスＴＭＰＲＳＳ３変異モデルを評価する中で、最初に有毛細胞が変性し、そのすぐ後にラセン神経節細胞が変性したことが実証された３。さらには、ＴＭＰＲＳＳ３変異を有するヒト患者を評価する中で、蝸牛移植片機能が年齢とともに低下することが実証されたが、このことは、ヒト集団において遅れてラセン神経節細胞の変性も起こることを示唆している４。
先に述べたとおり、ＴＭＰＲＳＳ３における変異を有する患者は、他の変異を有する患者と同様に蝸牛移植が奏効しないことがある（Ｓｈｅａｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これは、蝸牛移植と組み合わせて、これらの損傷有毛細胞及び／またはラセン神経節細胞を修復するための遺伝子療法技術を用いてＴＭＰＲＳＳ３または他の遺伝子、例えばＬＯＸＨＤ１を標的としてこの障害の移植片転帰を改善する契機を提供する。換言すると、蝸牛移植片は、欠陥のある有毛細胞を迂回してラセン神経節細胞を直接刺激するために使用され得、遺伝子療法は、移植片と組み合わせて、自然原因及び／または遺伝学的欠陥のいずれかによって破壊された損傷有毛細胞及び／またはラセン神経節細胞を元の状態に戻すために用いられ得る。任意の市販の移植片が本明細書に記載のシステム及び方法によって利用され得ることは認識され得る。
ある場合には遺伝学的障害が出生時の欠陥を有する有毛細胞及び／またはラセン神経節の原因になり得ることは、認識され得る。しかしながら、数名の小児では、部分的または完全な難聴を招き得る遺伝子変異が生涯の後期（例えば、青年期、成人期など）において生じることがある。
本開示の態様は、内耳のこれらの遺伝学的欠陥細胞（例えば、有毛細胞、ラセン神経節など）の治療及び／または修復のための遺伝子療法（例えば、ＴＭＰＲＳＳ３、ＬｏｘＨＤ１など）に関する例示的実施形態を包含する。図７は、本明細書に教示される態様に係る遺伝子療法に利用され得るＴＭＰＲＳＳ３ベクター構築物のための例示的なプラスミドマップを描いたものである。プラスミドマップは、５，６６７ｂｐの「ＡＡＶ－ｃＤＮＡ ６－ｈＴＭＰＲＳＳ３」を示している。蝸牛移植は、「ＡＡＶ－ｃＤＮＡ ６－ｈＴＭＰＲＳＳ３」プラスミドを使用する遺伝子療法と共に、本開示において定められた目的の１つ以上を果たすために利用され得る。
例えば、図２として描かれる「ＡＡＶ－ｃＤＮＡ ６－ｈＴＭＰＲＳＳ３」は、ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子の変異を遺伝学的に治療または修復するために使用され得る。その際、及び遺伝子療法の介入の時期に応じて、改変されたＴＭＰＲＳＳ３遺伝子は、変異した欠陥のある遺伝子を原因とする損傷有毛細胞及び／またはラセン神経節を修復し得る。
例示的実施形態において、図７のプラスミドマップは、「ＯＲＩ」から始まり、開始「ＡＡＶ２ ＩＴＲ」ベクター、「ＣＭＶエンハンサー」、「ＣＭＶプロモーター」、「ｈ－ＴＭＰＲＳＳ３」、「ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル、及び閉鎖「ＡＡＶ２ ＩＴＲ」ベクターを含んでいる。任意選択的に、付加的な治療構築物「ＡｍｐＲプロモーター」を使用してもよい。本開示の態様に係る目的を果たすために他のベクターを利用してもよいことは認識され得る。
概念実証
マウスモデル：ＣＢＡ／Ｊの背景を有するＴＲＭＰＳＳマウスモデルを生み出した。これらのモデルは、ＣＢＡ／Ｊ系統と交配した場合に変異系統を樹立した。変異はノックインモデル点変異であった。変異は、ｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）ホモ接合型変異であった。
ＴＭＰＲＳＳ３ ｃ．９１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ３０６Ｔｈｒ）は、中国、ドイツ、オランダ及び韓国のろう患者からの１０個よりも多い系統群において同定され、この変異が多くの民族集団においてＤＦＮＢ８／ＤＦＮＢ１０表現型の主因であることが示唆された（Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｊ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｊ．Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｍ．Ｅｌｂｒａｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｇａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
ＡＢＲ検査についての平易な説明：ＡＢＲ検査は聴機能を測定するものである。Ｘ軸（水平軸）には、キロヘルツ（ｋｈ）で表される周波数（音程）が並んでいる。Ｘ軸の左寄りの数字は（ベース音のような）低い音程であり、右へ向かうにつれて数または音程が（フルートの音色のように）高くなっていく。Ｙ軸（垂直軸）は、（デシベルまたはｄｂで表される）聴覚または音の大きさの「閾値」を表し、つまり、音量をどこまで上げればマウスに聞こえるかを表す。
図８に示すように、聴性脳反応（ＡＢＲ）検査を利用して（未処置）変異マウス及び（処置）変異実験マウスについて様々な周波数での聴覚閾値を測定した。未処置群（１０）のマウスは２匹であり、処置群（１２）のマウスは２匹であった。処置マウス（１２）の対側内耳に１ｕＬ（マイクロリットル）のＡＡＶ－ＴＭＰＲＳＳ３（遺伝子療法処置）を注射した。１ヶ月後（注射後時間）、ＡＢＲを用いて処置及び未処置マウスの聴覚を検査した。図６に示すように、処置マウス（１２）の聴覚閾値は対照（未処置）マウス（１０）の聴覚閾値に比べてはるかに低かった。解釈－未処置マウス１０と比較して処置マウス（１２）は全ての周波数がより早く（より低い音量で）聞こえる。
ＤＰＯＡＥ検査の平易な説明：ＤＰＯＡＥは外有毛細胞（ＯＨＣ）機能の尺度である。ＯＨＣは、入ってくる音の音量（すなわち、耳の音量制御つまみ）を制御する。図９中のＸ及びＹは図８と同じである。Ｘ軸は周波数または音程であり、Ｙ軸は、聞こえるために必要とされる閾値または音量である。
図９を参照して、歪成分音響放射検査（ＤＰＯＡＥ）を利用した同様の改善を示す。ＤＰＯＡＥ閾値は１５ヶ月齢の未処置マウス（１０）において上昇した一方、処置マウス（１２）ではＤＰＯＡＥ閾値は正常レベルに回復した。解釈－未処置マウス（１０）と比較して処置マウス（１２）は、音が聞こえるのに必要とされる音量がより小さかった。データは、処置マウス（１２）のＯＨＣが正常機能に戻りつつあることを示している。
第１波検査の平易な説明：第１波検査は、ＡＢＲ検査によって提供されるさらなる測定である。第１波振幅は、ラセン神経節細胞における幾多の聴神経線維の同期発火を含めた神経活動の尺度になる。（水平）Ｘ軸は、音刺激（クリック音）に対するミリ秒単位の応答時間の尺度である。Ｙ軸（垂直）は、音刺激に対する聴神経の応答の「振幅」または強度／感度をミリボルト（ｍｖ）単位で表したものを示す。
図８を参照して、ミリボルト単位で測定された、音響刺激の結果としての聴性誘発電位を、ミリ秒単位で測定された時間の関数として示す。音響刺激は、３２ｋＨｚで８０ｄＢの音圧レベル（ＳＰＬ）にあった。神経応答は波の周期を生成するが、中でも第１波１４及び第３波１６は通例最も大きいとみなされる。この実験では、処置マウス（１２）ならびに、ホモ接合型（１０）及び野生型（１８）の両方の未処置マウスにおいて第１波振幅を測定した。処置マウス（１２）の第１波振幅は、未処置マウス（１０及び１８）の振幅に比べて著しく大きかった。解釈－処置マウス（１２）神経細胞は、未処置マウス（１０、１８）と比較してより大きな強度及び感度で「発火している」。
特定用途のための例示的実施形態を参照して本開示の原理が本明細書に記載されているが、本開示がそれに限定されないことは理解されるべきである。当技術分野における通常の技能、及び本明細書に提供される教示内容の利用能力を有する者であれば、さらなる改変形態、用途、実施形態、及び均等物の置換が全て、本明細書に記載される実施形態の範囲に入ることを認識するであろう。したがって、本発明は、上記の記載によって限定されるとみなされるべきでない。
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１０．（Ｗｅｅｇｅｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｊ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｊ．Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｍ．Ｅｌｂｒａｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｇａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

Claims (30)

  1. 難聴を治療するシステムであって、
    蝸牛移植片、及び
    遺伝子療法薬構築物
    を含み、前記遺伝子療法薬構築物がｈ－ＴＭＰＲＳＳ３のための発現ベクターを含む、前記システム。
  2. 前記発現ベクターが、開始ベクター、エンハンサー、プロモーター、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル、及び閉鎖ベクターをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記発現ベクターが、
    アデノ随伴ウイルスベクター、または
    アデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態
    である、請求項１に記載のシステム。
  4. 請求項２に記載の前記発現ベクターに関して前記アデノ随伴ウイルスベクターが、
    ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、Ａｎｃ８０、またはアデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態
    からなる群から選択される、請求項３に記載のシステム。
  5. 前記プロモーターが、
    ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、及びＰｏｕ４ｆ３プロモーター
    からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
  6. 前記エンハンサーが、
    ＴＭＰＲＳＳ３エンハンサー及びヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）エンハンサー
    からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
  7. 前記蝸牛移植片が、
    マイクロホン
    を含み、前記マイクロホンが、音を受信するように構成されたものであり、
    音声処理装置
    を含み、前記音声処理装置が、前記マイクロホンによって受信された音を選択及び／または配列するように構成されたものであり、
    伝達装置及び受信機／刺激装置
    を含み、前記伝達装置及び前記受信機／刺激装置が、前記音声処理装置からの信号を受信してそれを電気インパルスに変換するように構成されたものであり、さらに
    電極
    を含む、請求項１に記載のシステム。
  8. 難聴を治療または予防する方法に使用するための医薬組成物であって、
    開始ベクター、
    エンハンサー、
    プロモーター、
    ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル、及び
    閉鎖ベクター
    を含む発現ベクターを含む、前記組成物。
  9. 前記発現ベクターが、
    アデノ随伴ウイルスベクター、または
    アデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態
    である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、
    ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、Ａｎｃ８０、またはアデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態
    からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記プロモーターが、
    ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、及びＰｏｕ４ｆ３プロモーター
    からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
  12. 前記エンハンサーが、
    ＴＭＰＲＳＳ３エンハンサー及びヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）エンハンサー
    からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
  13. 難聴の治療または予防のための、発現によってトランスフェクトされた細胞であって、
    前記発現ベクターが、開始ベクター、エンハンサー、プロモーター、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル、及び閉鎖ベクターを含むものである、前記細胞。
  14. 前記発現ベクターが、
    アデノ随伴ウイルスベクター、または
    アデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態
    である、請求項１３に記載の細胞。
  15. 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、
    ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、Ａｎｃ８０、またはアデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態
    からなる群から選択される、請求項１４に記載の細胞。
  16. 前記プロモーターが、
    ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、及びＰｏｕ４ｆ３プロモーター
    からなる群から選択される、請求項１３に記載の細胞。
  17. 前記細胞が幹細胞である、請求項１３に記載の細胞。
  18. 前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１７に記載の細胞。
  19. 難聴の治療または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、
    開始ベクター、エンハンサー、プロモーター、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル及び閉鎖ベクターを含む有効量の発現ベクターを前記対象に投与するステップ、ならびに
    蝸牛移植片を前記対象に移植するステップ
    を含む、前記方法。
  20. 前記発現ベクターの前記投与が、前記蝸牛移植片の前記移植の前に実施される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記発現ベクターの前記投与が、前記蝸牛移植片の前記移植の後に実施される、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記発現ベクターの前記投与、及び前記蝸牛移植が同時発生的に実施される、請求項１９に記載の方法。
  23. 前記発現ベクターが、
    アデノ随伴ウイルスベクター、または
    アデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態
    である、
    請求項１９に記載の方法。
  24. 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、
    ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、Ａｎｃ８０、またはアデノ随伴ウイルスベクター血清型の人工形態
    からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記プロモーターが、
    ＴＭＰＲＳＳ３プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、及びＰｏｕ４ｆ３プロモーター
    からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  26. 前記発現ベクターが、前記対象の内耳の中への注射によって投与される、請求項１９に記載の方法。
  27. 前記注射方法が、
    蝸牛切開術、正円窓膜、内リンパ嚢、中階、半規管開窓術、内リンパ嚢経由の中階、またはその任意の組合せ
    からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記対象が、難聴に関連する１つ以上の遺伝学的リスク因子を有する、請求項１９に記載の方法。
  29. 前記遺伝学的リスク因子の１つが、
    ＴＭＰＲＳＳ３遺伝子における変異、またはＬＯＸＨＤ１遺伝子における変異
    からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記対象が難聴の臨床指標を何ら呈しない、請求項２８に記載の方法。
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