CN104479025A - 一种组织型纤溶酶原激活剂的构建、表达纯化及功能鉴定 - Google Patents

Abstract

一种重组组织型纤溶酶原激活剂，即r-tPA，重组质粒的构建及其原核上清表达及纯化方法，它涉及组织型纤溶酶原激活剂重组质粒的构建、原核表达及纯化技术；本发明在含有人tPA全长基因质粒基础上在N端引入能去除载体上标签的3C序列，C端引入提高靶向性的RGDS序列，以PQE30为载体构建PQE30-rt-PA重组质粒，再通过自诱导方法诱导表达，采用超声法破菌处理后，用Ni²⁺亲和层析柱纯化r-tPA蛋白，然后用再用PreScission蛋白酶切除融合蛋白上的3C短肽，从而去除His-Tag标签，再用分子筛进一步纯化，得到高纯度的r-tPA蛋白；其用于制备具有特异性溶解血栓的溶栓药物。

Description

一种组织型纤溶酶原激活剂的构建、表达纯化及功能鉴定

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及人组织型纤溶酶原激活剂的重组构建及通过原核大肠杆菌自诱导方法得到可溶性上清表达及其纯化技术，还涉及该蛋白功能的鉴定。

背景技术

冠心病已经成为全球性致死与严重致残的最主要原因之一。心肌梗死是冠心病最为严重的类型,目前心肌梗死的治疗主要强调尽快开通栓塞的血管，恢复心肌的血流灌注，以挽救濒死心肌，防止梗死面积扩大或缩小心肌缺血范围，保护和维持心脏功能。但却也存在溶栓后出现颅内出血等并发症，所以提高溶栓药物的特异性和靶向性，使药物选择性地作用于血栓部位，减少药物的副作用和临床并发症，成为当前溶栓药物一个亟待解决的问题。

组织型纤溶酶原激活剂(tPA)由主要由血管内皮细胞合成和释放，由527个氨基酸组成，其在激活纤溶酶原(Pg)生成纤溶酶(Pm)时不受血循环中a1-纤溶酶抑制物(a1-PI)及纤维蛋白结合的a1-PI的作用，与血中纤维蛋白原亲和力较低，选择性地与血栓的纤维蛋白有较高效的亲和力，因此不增加全身纤溶亢进，发挥一定的特异性溶栓作用，临床上还用于脑卒中的治疗。但仍然由于组织特异性不够完善，导致严重的出血副反应，使颅内出血率增加了十倍，同时患者死亡率超过50％，而使临床应用受限。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser，RGDS)肽为血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)受体配基，其中最主要的是精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)肽。新鲜血栓中血小板表面有大量激活的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体，而RGD短肽序列能被血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体上RGD结合位点识别，从而与激活的血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体特异结合，具有对血栓部位血小板的趋向性,而且RGD序列只能与血栓部位活化的血小板结合，而对循环血小板没有影响。

尽管tPA是优秀的溶栓药物，但也存在靶向性不强，易造成颅内出血等副作用，且现行的多数tPA的制造以包涵体表达然后复性，使生产过程麻烦，提高了生产成本。

发明内容

本发明目的在于提供一种对活化血小板有靶向性的新型重组组织型纤溶酶原激活剂，并提供一种新的原核上清表达重组组织型纤溶酶原激活剂及其突变体蛋白及纯化的方法。

本发明提供了一种新的重组组织型纤溶酶原激活剂His-3C-tPA-RGDS，其分子结构为在人t-PA全长基因序列的氨基端(N端)引入3C酶切序列，能切除载体上的HIS标签，在羧基端(C端)引入2个能够特异性识别活化的血小板的RGDS序列。

本发明进一步包括含有上述操作的重组组织型纤溶酶原激活剂与表达载体的连接，该重组质粒能够大量表达上清His-3C-tPA-RGDS蛋白质。

本发明还进一步包括一种诱导该重组组织型纤溶酶原激活剂及其突变体原核可溶性表达的诱导方法及培养基配方。该诱导方法和培养基解决了重组组织型纤溶酶原激活剂及其突变体原核细菌表达为包涵体表达的问题。

该发明还包括一种重组组织型纤溶酶原激活剂及其突变体的纯化方法，该方法包含一种重组His-3C-tPA-RGDS融合蛋白质，其分子结构为：在人t-PA全长基因序列的氨基端，即N端，引入3C短肽序列，在羧基端，即C端，引入2个RGDS靶向序列。该3C氨基酸序列翻译出来的蛋白质，可以被特异性的PreScission蛋白酶酶切，从而切除该重组组织型纤溶酶原激活剂的His-Tag标签，得到符合生物制药和临床用药的蛋白。

本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明对于现有的表达纯化方法而言，其能够大量可溶性表达tPA，解决了包涵体表达问题，本发明同时还成功切除了tPA上的His-Tag标签，得到了不带标签的高纯度的tPA，RDGS能够有效的提高现有tPA的靶向性不强的缺陷，符合临床靶向用药的要求。

附图说明

图1重组组织型纤溶酶原激活剂突变体的构建示意图

图21％琼脂糖凝胶电泳显示结果

图3SDS-PAGE电泳分析结果

图4SDS-PAGE电泳分析结果

图5tPA-RGDS溶栓活性鉴定测试比较图

具体实施方式

以下结合实施例具体对本发明进行具体说明。

实施例1重组组织型纤溶酶原激活剂基因的构建

重组组织型纤溶酶原激活剂突变体的构建示意图见图1，核苷酸和氨基酸的序列分别见序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

1.构建EST-tPA质粒(含有人tPA基因全长的质粒)：

SEQ ID NO.3(核苷酸序列共1584个碱基)：

SEQ ID NO.4(氨基酸序列共527个碱基)：

2.重组rt-PA-m的获得：

设计引物：

上游引物为：5’-GGATCCATGTCTTACCAAGTGATCTGCAGAGAT-3’，BamHI切割GGATCC，后接起始密码子ATG，下划波浪线部分：CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC为3C酶基因序列，后接原始tPA的氮端起始序列。

下游引物为：5’-AAGCTTTTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCA-3’，HindⅢ切割AAGCTT，后接终止密码子反向互补序列TTA，下划波浪线斜体部分为2个RDGS的反向互补序列，余为原始tPA碳端反向互补序列。

引物采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化方式(Polyacrylamide GelElectrophoresis，PAGE)，采用Oligo化学合成，在Dr.Oligo-192合成仪中合成。具体为采用亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体的可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass，CPG)上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团二甲氧基三苯甲基(Dimethoxytrityl，DMT)，获得游离的5'-羟基；

第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过PAGE手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，用PAGE检测和质谱检测，以确保引物的合成质量，测定OD260为1.85，干粉状保存。

以EST-tPA基因组DNA为模板，PCR扩增EST-tPA基因，反应条件为：94℃预变性5min,94℃变性50s、53℃退火50s、72℃延伸50s，共循环30次，72℃后延伸10min,4℃保存。用1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色法检测1635bp的扩增片段。用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。

3.表达质粒PQE30-His-3C-tPA-RGDS的获得

将纯化后PCR产物及用内切酶BamH I和HindⅢ双酶切后载体PQE30，用T4连接酶连接，条件为16℃，20小时。获得重组表达质粒PQE30-His-3C-tPA-RGDS。双酶切的重组质粒进行初步鉴定，再经过DNA测序确定。测序证明3C-tPA-RGDS序列完全符合预先设计。其测序结果为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。检测方法：将连接产物进行核苷酸序列测定，将测序结果即SEQID NO.1与SEQ ID NO.3通过DNAssist软件对比。

测序检测方法与结果：

将连接产物采用Sanger末端终止法和ABI3730测序仪测序，测序仪自行翻译得到DNA序列，具体为：

1.获得待测DNA片段的单链模板：一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与噬菌体M13DNA进行重组，然后将其导入大肠杆菌进行增殖，M13噬菌体一般以单链DNA形式透出细胞再感染新的细菌，故此可获得单链DNA模板。

2.合成寡核苷酸引物：利用DNA合成仪合成一段与待测DNA片段的3'-端互补的寡核苷酸引物。

3.模板-引物杂交：将待测单链DNA模板与寡核苷酸引物混合，并进行保温处理，使引物与DNA单链模板的3'-端进行杂交。

4.互补链的延长和终止：将上述杂交混合液分为四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四种三磷酸碱基脱氧核苷酸，一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸(如α-32P-dATP)。此外还需分别加入一种双脱氧核糖核酸(ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP)。然后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到四组分别以A、G、C、T、终止的长短不一的互补链的混合物。

5.电泳分离：将四组含有长短不等的反应混合物在同一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离开。

6.放射自显影：将电泳凝胶进行放射自显影，即可得到放射自显图谱，通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列顺序。

测序结果为SEQ ID NO.1，通过DNAssist软件与SEQ ID NO.3比对，结果为：(sequence 0为SEQ ID NO.1，sequence 1为SEQ ID NO.3)通过比对发现sequence0比sequence 1在N端多了3C短肽的碱基序列，在C端多了2个RGDS反向互补序列，而中间碱基序列没有突变与缺失:如下表1。

表1 SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.3对比

1％琼脂糖凝胶电泳显示结果见图2：1泳道为DNA Marker；2泳道为目的片段约1635bp；3泳道目的片段大小为3461bp为PQE30载体双酶切后，泳道4上有1635bp片段插入，为5096bp，为重组质粒PQE30-His-3C-tPA-RGDS；泳道6为重组质粒PQE30--His-3C-tPA-RGDS双酶切。电泳结果显示和DNA测序结果显示获得正确的重组质粒。

实施例2表达质粒在大肠杆菌中的自诱导上清表达及纯化His-3C-tPA-RGDS蛋白

1.表达菌的转化

具体方法如下：取1支－80℃储存的50ul的BL21(DE3)感受态细胞在冰上解冻15min；把10μl的连接产物(His-3C-tPA-RGDS)加入到BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置15min；42℃热休克1min，迅速置于冰上，冰浴15min；加入100μl无抗性LB液体培养基，37℃低转速(160rpm)复苏45min；后划线接种于氨苄抗性LB平板上，37℃温箱孵育8-16小时培养。

将测序正确的阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌(市售，New EnglandBiolabs(NEB)公司货号：C2527H)株，划线接种于氨苄抗性LB平板上，37℃温箱孵育8-16小时培养。

2.自诱导方法表达His-3C-tPA-RGDS蛋白质

挑取单个菌落接种于含氨苄抗性的LB21/PQE30--His-3C-tPA-RGDS培养基1mL中，37℃培养8-16小时，摇床转速为220转/分。然后取0.1L隔夜培养的BL21(DE3)菌(市售，New England Biolabs(NEB)公司货号：C2527H)，接种于自由诱导培养基放大培养(0.2L)，于37℃培养，24小时，摇床转速为220转/分。

其中:自由诱导培养基配方及条件如下：

胰蛋白胨：10-14g/L；

酵母抽提物：15-25g/L；

乳糖：1-8g/L；

葡萄糖：0.05-0.5g/L；

100％甘油：2-10mL/L；

双蒸水：配平；

高压蒸汽灭菌；

37℃，24小时，转速220转/分；

3.表达细菌的分离与破碎

低温(4℃)离心收集经过自诱导诱导的大肠杆菌BL21/PQE30--His-3C-tPA-RGDS，弃上清；然后用缓冲液A(20mmol/L Tris-HCl pH8.0,500mmol/L NaCl)重悬菌体；然后用超声波冰浴破碎(振幅29％，时间20min)菌体；然后高速(4℃、12,000r/min、30min)离心低温离心分离菌体破碎液。

4.重组蛋白质的纯化

取离心上清液，用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化。亲和层析柱先用缓冲液A预平衡，然后将离心上清与Ni2+-NTA亲和层析柱孵育结合后缓慢流下；然后用缓冲液B(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH8.0，20mmol/L咪唑)和缓冲液C(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH8.0，50mmol/L咪唑)洗脱杂蛋白质，然后在Ni²⁺-NTA亲和层析柱加入浓度为1mg/mL的PreScission蛋白酶1ml，低温层析柱上酶切16-20小时；然后用缓冲液B洗脱，收集洗脱液，最后用分子筛Superdex200纯化，收集目的洗脱峰。纯化结果用SDS-PAGE电泳进行分析。

分析结果见图3：M为marker；1，2，3泳道分别为破菌液，上清液，穿透液，4，5泳道分别是用缓冲液B、缓冲液C洗脱的杂蛋白：6泳道表示带HIS的rtPA-RGDS融合蛋白。结果显示自诱导表达PQE30--His-3C-tPA-RGDS可以得到大量可溶性上清表达的tPA融合蛋白质；结果见图4：1泳道为marker1；2泳道为经PreScission蛋白酶切除融合蛋白上的HIS标签及分子筛纯化后，rt-PA分子量为70Kda，其纯度可达90％。

实施例3tPA-RGDS溶栓活性鉴定

纤维蛋白平板制备；称取1g琼脂糖，加入到100mL Tris-HCl缓冲液(成分：50mM Tris-HCl,pH7.5,100mM NaCl)，在115℃×10min条件下高压蒸气灭菌，取30ml琼脂液体配置平板，待溶化琼脂液体降温到37-42℃时，依次向其中加入25mg/mL纤维蛋白原母液1000μL、1000mM CaCl₂母液300uL、6.0IU/mL纤溶酶原母液500μL，之后37℃保温摇匀30sec，再加入100U/ml凝血酶母液30μL，37℃保温摇匀约60－80sec即可见混浊产生；立即倾倒入平板，2min后将稍微凝固的平板置于4℃冰箱约10-20min后方可使用。)用打孔器打孔，直径3mm。将融合蛋白及尿激酶标准品稀释后加入各孔,37℃孵箱过夜。测量比较平板上透明圈直径大小。根据尿激酶标准品及融合蛋白透明圈直径的大小，计算样品的溶栓活性。

具体方法为：用BCA试剂盒测定各蛋白样品含量；用游标卡尺测量透明圈相互垂直的两直径(单位毫米),透明圈直径d(d＝横径+竖径/2)的对数为纵坐标(y),以尿激酶标准品稀释度活性的对数为横坐标,作标准曲线。带入回归方程Y＝aX+b中，求取a，b，取待测定的rtPA-RGDS融合蛋白样品依上述方法检测,将测得数据代入标准曲线方程,求出相应的单位活性(IU/mL),再用蛋白溶栓活性除以蛋白样品浓度计算出各样品比活性(IU/mg)。

tPA-RGDS溶栓活性鉴定测试比较见图5：1,2分别为:尿激酶标准品(2.61mg/mL)10μL,20μL；3,4分别为:酶切后的rt-PA(0.98mg/mL)10μL,20μL；5为样品稀释缓冲液20μL；经过酶切纯化得到的rtPA-RGDS融合蛋白，与尿激酶标准品比较，溶栓比活性约为2.5×105IU/㎎。

Claims (7)

1.一种重组组织型纤溶酶原激活剂，其分子结构为：在人t-PA全长基因序列的氨基端，即N端，引入3C短肽序列，在羧基端，即C端，引入2个RGDS靶向序列。

2.根据权利要求1所述的重组组织型纤溶酶原激活剂，其特征在于，所述3C端肽序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组组织型纤溶酶原激活剂，其特征在于，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1-3之一所述的重组组织型纤溶酶原激活剂的自诱导上清表达方法，其步骤如下：

1)表达菌的转化

取1支－80℃储存的50ul的BL21(DE3)感受态细胞在冰上解冻15min；把10μl的连接产物(His-3C-tPA-RGDS)加入到BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置15min；42℃热休克1min，迅速置于冰上，冰浴15min；加入100μl无抗性LB液体培养基，37℃低转速(160rpm)复苏45min；后划线接种于氨苄抗性LB平板上，37℃温箱孵育8-16小时培养；将测序正确的阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株，划线接种于氨苄抗性LB平板上，37℃温箱孵育8-16小时培养；

2)自诱导方法表达His-3C-tPA-RGDS蛋白质

挑取单个菌落接种于含氨苄抗性的LB21/PQE30--His-3C-tPA-RGDS培养基1mL中，37℃培养8-16小时，摇床转速为220转/分；然后取0.1L隔夜培养的BL21(DE3)菌，接种于自由诱导培养基放大培养(0.2L)，于37℃培养，24小时，摇床转速为220转/分；

3)表达细菌的分离与破碎

低温(4℃)离心收集经过自诱导诱导的大肠杆菌BL21/PQE30--His-3C-tPA-RGDS，弃上清；然后用缓冲液A(20mmol/L Tris-HClpH8.0,500mmol/L NaCl)重悬菌体；然后用超声波冰浴破碎(振幅29％，时间20min)菌体；然后高速(4℃、12,000r/min、30min)离心低温离心分离菌体破碎液。

5.根据权利要求4所述的重组组织型纤溶酶原激活剂的自诱导上清表达方法，其特征在于步骤2)中的自由诱导培养基的制备为：胰蛋白胨：10-14g/L，酵母抽提物：15-25g/L，乳糖：1-8g/L，葡萄糖：0.05-0.5g/L，100％甘油：2-10mL/L，双蒸水配平；高压蒸汽灭菌37℃，24小时，转速220转/分。

6.一种重组组织型纤溶酶原激活剂的药物组合物，含活性成分重组组织型纤溶酶原激活剂，还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

7.如权利要求1-3之一所述的重组组织型纤溶酶原激活剂在制备用于预防和治疗需要快速溶解血栓相关的疾病的药物中的用途。