CN104845949A - RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用。本发明所述RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.12所示。本发明的融合蛋白通过以下制备方法获得：采用重叠延伸PCR法获得目的基因融合片段；将目的基因融合片段插入表达载体中，构建重组表达质粒；构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，在大肠杆菌中进行高效表达；融合蛋白的分离纯化。与现有的同类产品比较，本发明的融合蛋白不仅具有高效的溶栓抗凝活性，而且兼备低的免疫原性。与此同时，本发明的融合蛋白还克服了现有的一些RGD-重组葡激酶活性下降和不溶性表达的缺点。

Description

RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用。

背景技术

天然葡激酶(staphylokinase,SAK)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种胞外蛋白质，由136个氨基酸残基组成，分子量为15.5KD。葡激酶与内生组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,tPA)、尿激酶(urokinase,UK)同为第三代溶栓制剂，为临床心肌梗死溶栓治疗的一线用药，但其溶栓机制与其余两者不同：本身没有蛋白酶活性，是一种“间接型”的纤溶酶原激活剂，通过与纤溶酶原(plasminogen，Flg)按1：1的比例特异性结合生成无活性的SAK-Flg复合物，在血栓表面痕量纤溶酶(plasmin，Flm)的作用下进一步转化成有活性的SAK-Flm复合物，催化另一分子纤溶酶原形成纤溶酶,从而激活纤溶系统。与tPA、UK相比，SAK具有更高的纤溶活性和纤维蛋白专一性，且不会引起全身纤溶亢进，溶栓后出血并发症少。另外，SAK对陈旧性血栓和富含血小板的血栓溶解作用突出，且对外周动静脉血栓均有良好溶栓效果。然而SAK作为一种葡萄球菌来源的异体蛋白，免疫原性是限制其临床使用的主要原因之一，大部分患者用药后2周，机体会产生高滴度的IgG中和抗体，且这些抗体水平至少可以维持7周，严重影响了SAK的重复使用。同时，大量研究表明，使用葡激酶溶栓治疗血管开通后仍有一定的再梗塞率，这可能与活化后血小板聚集反应所介导的动脉血栓再次形成有关，因此，通过抗血小板聚集来降低葡激酶溶栓治疗后的再梗塞率将会是一种行之有效的策略。

人α微球蛋白(α1M)最早是从人尿中分离出来的一种糖蛋白，属于脂质运载蛋白超家族，分子量为26KD。α1M以单体或与IgA形成复合物的形式广泛分布于血浆与组织外液中，参与免疫抑制反应，能抑制抗原诱导的人外周血淋巴细胞的重新分配，对机体内的保护性免疫调节有着重要作用。

RGD序列即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列，内源性RGD序列存在于多种粘附蛋白中，发挥着多种生物学功能。含RGD序列的物质均可竞争性地抑制Flg和GPⅡb/Ⅲa受体的结合，而活化的GPⅡb/Ⅲa受体只存在于血栓部位，可见RGD序列有血栓靶向性，可以最直接、最完全地抑制活化血小板聚集，从而抑制血栓的形成。

现有的一些RGD-重组葡激酶要么存在活性下降的问题，要么存在不溶性表达的缺点。

而且，现有技术中缺少在具有高效的溶栓抗凝活性同时，兼备低的免疫原性，低再梗塞率，高溶栓靶向性的溶栓制剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用。本发明的融合蛋白与现有的同类产品比较，不仅具有高效的溶栓抗凝活性，而且兼备低的免疫原性。与此同时，本发明的融合蛋白还克服了现有的一些RGD-重组葡激酶活性下降和不溶性表达的缺点。

本发明一方面提供了一种融合蛋白，为RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白。

所述融合蛋白中，重组葡激酶(rSAK)的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，具体为：SFSSITNEVSASSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKK。

为提高葡激酶(SAK)的表达效率，本发明将野生型葡激酶基因进行了优化，在保持蛋白质序列不变的情况下，优化部分可能影响翻译、表达过程的密码子碱基序列，使其成为大肠杆菌的偏爱密码子或最佳密码子。同时，为了提高可溶性，将野生型SAK氨基端的18个疏水残基(ELMLKRSLLFLTVLLLLF)截断。优化后的重组葡激酶(rSAK)全长基因序列如SEQID NO.1所示，具体为：

TCATTCTCCTCCATTACCAACGAAGTCTCCGCCTCCTCAAGTTTCGATAAAGGCAAATACAAAAAAGGTGATGACGCCTCCTATTTCGAACCGACCGGCCCGTACCTGATGGTTAACGTCACGGGCGTGGACAGCAAGGGTAATGAACTGCTGTCTCCGCATTATGTTGAATTTCCGATTAAACCGGGTACCACGCTGACCAAAGAAAAAATCGAATATTACGTCGAATGGGCACTGGATGCGACGGCCTACAAAGAATTCCGTGTGGTTGAACTGGATCCGTCTGCTAAAATCGAAGTTACCTACTACGACAAAAACAAGAAAAAAGAAGAAACCAAATCATTTCCGATCACGGAAAAAGGCTTCGTCGTGCCGGATCTGTCGGAACACATTAAAAACCCGGGCTTCAACCTGATTACGAAAGTGGTCATCGAAAAGAAA。

所述融合蛋白中，RGD的基因序列为CAG GGG CCC。

所述融合蛋白中，RGD和重组葡激酶之间可选择地含有连接肽三个残基(序列为GSG)。

较佳的，RGD连接于重组葡激酶的N端。

所述融合蛋白中，人α微球蛋白(α1M)的氨基酸序列包含165个氨基酸(其中氨基端 的29个疏水残基MRSLGALLLLLSACLAVSAGPVPTPPDNI和羧基端的15个疏水残基CVPGEQEPEPILIPR去掉。所述人α微球蛋白(α1M)的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，具体为：

QVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQE。

进一步的，所述人α微球蛋白(α1M)连接于重组葡激酶的C端。

本发明的融合蛋白，RGD和人α微球蛋白(α1M)直接分别连接于重组葡激酶(rSAK)的N短和C端，对重组葡激酶(rSAK)本身氨基酸结构的改变很小，很好地保持了重组葡激酶的溶栓活性。同时，有利于融合蛋白的细胞内折叠，实现可溶性表达，具有很好的抗凝活性。

进一步的，所述RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.12所示，具体为：

RGDSSFSSITNEVSASSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKKGSGQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQE。

本发明第二方面提供了一种多核苷酸，其编码所述融合蛋白。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

编码所述融合蛋白的多核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；优选采用重叠延伸PCR法。

在本案的较佳实施例中，所述融合蛋白，其核苷酸编码序列如SEQID NO.9所示，具体为：CGAGGGGATTCGTCATTCTCCTCCATTACCAACGAAGTCTCCGCCTCCTCAAGTTTCGATAAAGGCAAATACAAAAAAGGTGATGACGCCTCCTATTTCGAACCGACCGGCCCGTACCTGATGGTTAACGTCACGGGCGTGGACAGCAAGGGTAATGAACTGCTGTCTCCGCATTATGTTGAATTTCCGATTAAACCGGGTACCACGCTGACCAAAGAAAAAATCGAATATTACGTC GAATGGGCACTGGATGCGACGGCCTACAAAGAATTCCGTGTGGTTGAACTGGATCCGTCTGCTAAAATCGAAGTTACCTACTACGACAAAAACAAGAAAAAAGAAGAAACCAAATCATTTCCGATCACGGAAAAAGGCTTCGTCGTGCCGGATCTGTCGGAACACATTAAAAACCCGGGCTTCAACCTGATTACGAAAGTGGTCATCGAAAAGAAAGGGTCGGGGCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAA。

其对应的蛋白氨基酸序列如SEQID NO.12所示，具体为：

RGDSSFSSITNEVSASSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKKGSGQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQE。

本发明第三方面提供了一种表达载体，其含有所述多核苷酸。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。

较佳的，所述载体为原核载体或穿梭质粒，如原核载体PGEX6P-1质粒等。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其被所述载体所转化。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌、李斯特细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS.293细胞、或Bowes黑 素瘤细胞的动物细胞等。

其中，特别优选大肠杆菌，如(E.coli)DH5α等。

本发明第五方面公开了所述融合蛋白的制备方法，包括下列步骤：

1)采用重叠延伸PCR法获得目的基因融合片段；

2)将目的基因融合片段插入表达载体中，构建重组表达质粒；

3)构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，在大肠杆菌中进行高效表达；

4)融合蛋白的分离纯化。

较佳的，步骤1)中，所述目的基因融合片段的基因序列如SEQID NO.9所示，具体为：

CGAGGGGATTCGTCATTCTCCTCCATTACCAACGAAGTCTCCGCCTCCTCAAGTTTCGATAAAGGCAAATACAAAAAAGGTGATGACGCCTCCTATTTCGAACCGACCGGCCCGTACCTGATGGTTAACGTCACGGGCGTGGACAGCAAGGGTAATGAACTGCTGTCTCCGCATTATGTTGAATTTCCGATTAAACCGGGTACCACGCTGACCAAAGAAAAAATCGAATATTACGTCGAATGGGCACTGGATGCGACGGCCTACAAAGAATTCCGTGTGGTTGAACTGGATCCGTCTGCTAAAATCGAAGTTACCTACTACGACAAAAACAAGAAAAAAGAAGAAACCAAATCATTTCCGATCACGGAAAAAGGCTTCGTCGTGCCGGATCTGTCGGAACACATTAAAAACCCGGGCTTCAACCTGATTACGAAAGTGGTCATCGAAAAGAAAGGGTCGGGGCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAA。

较佳的，步骤2)中，所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系列载体和国内外广泛使用的PBV220载体，优选带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PGEX6P-1。

较佳的，步骤3)中的大肠杆菌可以是适合原核系统表达的配套大肠杆菌，当使用PET类载体，宿主菌优选E.coli BL21(DE3)系列，当使用PBV220载体时宿主菌可选择多种商业上提 供的大肠杆菌，优选E.coli DH5α。

更佳的，步骤3)中，构建的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株，经IPTG诱导目的蛋白表达。

较佳的，步骤4)中，分离纯化方法为：在经Ni+亲和层析柱纯化过程中用3C蛋白酶切除His-GST标签后，再利用DEAE离子交换柱、分子筛(Superdex 75)进行分离纯化。

本发明第六方面，提供了所述的融合蛋白或其编码基因在制备抗凝、溶栓药物中的用途。

本发明第七方面，提供了一种低免疫原性靶向抗凝、溶栓药物组合物，含有有效剂量的可溶性的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白或其编码基因及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。

本发明所提供的药物组合物可以多种剂型存在，如用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式，及肺部给药制剂及其他非肠道给药的组合物。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药用组合物还可以加入香味剂、甜味剂等。

如上所述的融合蛋白的药物制剂可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以经静脉注射或者口、鼻、皮肤、肺吸入等途径给药。上述药物的优选周剂量为0.1-5 mg/kg体重，优选的疗程为10至30天。一次性给药，或分次给药。无论采用何种给药方法，个体人的最佳剂量应根据具体的治疗而定。

本发明的有益效果为：

(1)本发明首次获得了可溶性的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白，以重组葡激酶(rSAK)为对照，采用纤维蛋白溶圈法进行重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的溶栓活性测定，通过血小板聚集试验进行抗凝活性测定。结果表明，该融合蛋白溶栓活性与重组葡激酶相当，其纤溶活性与尿激酶标准品相当；与相应浓度的重组葡激酶(rSAK)相比，具有显著抑制ADP激活血小板聚集的作用，抗血小板聚集作用较野生型葡激酶明显增强。

(2)融合蛋白在大肠杆菌上清中高效表达,SDS-PAGE蛋白电泳显示其相对分子质量约36KD，在溶液中以单聚体形式存在，有利于降低其免疫原性。在临床治疗血栓过程中，部分病人需要多次给药，结果发现容易诱发人体的免疫反应，导致去抗体的形成，影响了具有蛋白质水解活性的SAK-PLm复合物的形成，最终导致SAK失去了溶解血栓的功能。二聚体存 在多个抗原表位，与SAK的免疫原性相关，如果能够减少SAK二聚体的形成或许能够降低其抗原性。因此，如何在保障其活性的前提下减轻SAK在临床给药过程中的免疫应答将是今后面临的主要科学问题。为进一步通过基于SAK三维结构的分子改造来降低其免疫原性并获得可望用于临床的SAK制剂提供了良好的研究基础。

(3)本发明的融合蛋白与现有的同类产品比较，不仅具有高效的溶栓抗凝活性，而且兼备低的免疫原性。与此同时，本发明的融合蛋白还克服了现有的一些RGD-重组葡激酶活性下降和不溶性表达的缺点。

附图说明

图1：重叠延伸PCR产物电泳图，M：DNA marker 2000；1：重叠延伸PCR产物。

图2：重组质粒双酶切鉴定电泳图，M：DNA marker 3000；1、2、3：重组质粒双酶切(Sal I、Not I)。

图3：融合蛋白的表达与纯化，M：蛋白Marker；1：未加入诱导剂IPTG的表达菌(对照)；2：加入IPTG诱导的表达菌；3：超声破菌液上清；4：Ni+亲和层析柱纯化后His-GST融合蛋白；5：3C蛋白酶切除His-GST标签后的目的融合蛋白；6：经DEAE纯化后的目的融合蛋白；7：经分子筛纯化后的目的融合蛋白。

图4：DEAE交换柱纯化图。

图5：分子筛纯化图，(A)Superdex 75的洗脱图；(B)Superdex 75的标定结果：albumin bovine V(66.2 kD)，chicken egg albumin(44.2 kD)，hymotrypsinogen A(24.5kD)和lysozyme(14.4 kD)。

图6：目的蛋白纤溶活性效果图，1，2分别为尿激酶标准品10μl，20μl；3，4分别为重组葡激酶10μl，20μl；5，6分别为带His-GST标签的融合蛋白10μl，20μl；7，8分别为切除标签后的目的融合蛋白10μl，20μl；9，10分别为样品稀释缓冲液10μl，20μl。

图7：抗血小板聚集活性效果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1重组葡激酶的表达及纯化

重组葡激酶(rSAK)的表达及纯化方法，具体详见重庆医科大学学报2012年第37卷第3期《重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定》，杨可，杨震，汪德强，雷寒，周建中。

亦即，主要构建方法如下：

利用基因合成技术，优化合成rSAK全长基因序列，在保持蛋白质序列不变的情况下，优化部分可能影响翻译、表达过程的密码子碱基序列，使其成为大肠杆菌的偏爱密码子或最佳密码子，以pET-28a为载体，诱导优化后的基因序列在感受态E.coli BL21中表达并通过Ni-NAT柱纯化。

所述rSAK全长基因序列如SEQID NO.1所示，具体为：

TCATTCTCCTCCATTACCAACGAAGTCTCCGCCTCCTCAAGTTTCGATAAAGGCAAATACAAAAAAGGTGATGACGCCTCCTATTTCGAACCGACCGGCCCGTACCTGATGGTTAACGTCACGGGCGTGGACAGCAAGGGTAATGAACTGCTGTCTCCGCATTATGTTGAATTTCCGATTAAACCGGGTACCACGCTGACCAAAGAAAAAATCGAATATTACGTCGAATGGGCACT GGATGCGACGGCCTACAAAGAATTCCGTGTGGTTGAACTGGATCCGTCTGCTAAAATCGAAGTTACCTACTACGACAAAAACAAGAAAAAAGAAGAAACCAAATCATTTCCGATCACGGAAAAAGGCTTCGTCGTGCCGGATCTGTCGGAACACATTAAAAACCCGGGCTTCAACCTGATTACGAAAGTGGTCATCGAAAAGAAA。

所得重组葡激酶(rSAK)的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，具体为：

SFSSITNEVSASSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKK。

实施例2人α微球蛋白融合蛋白的表达及纯化

人α微球蛋白(α1M)的表达及纯化方法，具体详见Zhang Y,Gao Z,Zhang Z,et al.Cloning,purification,crystallization and preliminary X-ray sstudies of humanα1-microglobulin[J].Acta Crystallogr Sect F Stryc Biol Cryst Commun,2012,68(pt 6):692-694。

所述人α微球蛋白(α1M)的基因序列如SEQID NO.3所示，具体为：

CAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAA。

所得人α微球蛋白(α1M)的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，具体为：

QVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQE。

实施例3 RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的质粒构建

1.1材料

重组葡激酶(rSAK)由实施例1构建，人α微球蛋白截短体(α1M)由实施例2构建，质粒载体PEGX6P-1由Novagen公司购买获得。大肠杆菌DH5α、BL21，3C蛋白酶，限制性内切酶NotI、SalI，T4 DNA连接酶，高保真rTaq酶，dNTP，质粒纯化试剂盒，DNA Marker，分子量蛋白Marker等均购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自Promega公司。凝血酶,纤溶酶原,纤维蛋白原,尿激酶标准品等均购自中国食品药品检定院。其余试剂均为国产分析纯。

1.2仪器

水浴箱，温箱，金属浴连接仪，PCR仪，凝胶成像仪，超声破碎仪，梯度杯，蛋白浓度检测仪，GST亲和层析柱，DEAE离子交换柱，分子筛(Superdex 75)等均系GE公司产品。其余试剂均为国产分析纯。

1.3方法

1.3.1采用重叠延伸PCR法获得目的基因融合片段RGD-rSAK-α1M

以重组葡激酶(rSAK)、人α微球蛋白(α1M)分别进行PCR扩增得两个片段，凝胶回收后以这两个片段为模版进行重叠延伸PCR，获得目的基因融合片段RGD-rSAK-α1M。重叠延伸PCR引物如表1所示。

表1

SAK-F，重叠引物Overlap-R分别为rSAK正反向引物，其中SAK-F中加入了RGD序列(粗体部分)，SAK-F下划线斜体字部分为限制性内切酶Sal I酶切位点；重叠引物Overlap-F与a1M-R为a1M正反向引物，重叠引物中斜体部分为与重组葡激酶(rSAK)C端同源的18个碱基序列，a1M-R中下划线斜体字部分为限制性内切酶Not I酶切位点，重叠引物Overlap-F与a1M-R反向互补。为了SAK与a1M的功能结构域的折叠不互相影响，重叠延伸引物(Overlap  F和Overlap-R)引入了GSG连接序列(Linker sequence，波浪线部分)。

用引物SAK-F，Overlap-R对重组葡激酶(rSAK)模版PCR扩增，反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸55s，进行30个循环。

同时用重叠引物Overlap-F与a1M-R对人α微球蛋白(α1M)模板PCR扩增，反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸55s，进行30个循环。

对上述两组PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在300mm紫外光灯下检测DNA条带，目视下切除所需目地片段进行胶回收，照相存档。

将胶回收产物纯化后以1：1的比例混合后退火作为模版，SAK-F与a1M-R为正反向引物，PCR扩增，反应条件同a1M-R基因扩增，即：94℃预变性10min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸55s，进行30个循环。将所得重叠延伸PCR产物送本实验室测序，所述重叠延伸PCR产物RGD-rSAK-α1M的序列如SEQID NO.9所示，具体为：

CGAGGGGATTCGTCATTCTCCTCCATTACCAACGAAGTCTCCGCCTCCTCAAGTTTCGATAAAGGCAAATACAAAAAAGGTGATGACGCCTCCTATTTCGAACCGACCGGCCCGTACCTGATGGTTAACGTCACGGGCGTGGACAGCAAGGGTAATGAACTGCTGTCTCCGCATTATGTTGAATTTCCGATTAAACCGGGTACCACGCTGACCAAAGAAAAAATCGAATATTACGTCGAATGGGCACTGGATGCGACGGCCTACAAAGAATTCCGTGTGGTTGAACTGGATCCGTCTGCTAAAATCGAAGTTACCTACTACGACAAAAACAAGAAAAAAGAAGAAACCAAATCATTTCCGATCACGGAAAAAGGCTTCGTCGTGCCGGATCTGTCGGAACACATTAAAAACCCGGGCTTCAACCTGATTACGAAAGTGGTCATCGAAAAGAAAGGGTCGGGGCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAA。

琼脂糖凝胶电泳鉴定重叠延伸PCR产物，电泳结果显示：在1000bp左右出现单一特异性条带(图1)，与预期结果一致。

1.3.2表达质粒的构建将测序正确的重叠延伸PCR产物与PGEX6P-1质粒在37℃水浴条件下同时对Not I、Sal I位点进行双酶切，3h后用T4DNA连接酶连接PGEX6P-1载体和目的基因(重叠延伸PCR产物),16℃金属浴过夜。

1.3.3转化克隆菌将所得表达质粒转化大肠杆菌(E.coli)DH5α，接种于氨苄抗性LB平板上，37℃温箱孵育过夜。

1.3.4筛选阳性转化菌种及双酶切鉴定从平板上挑取多个单个菌落，分别接种于5ml氨苄抗性LB培养基中，置于振荡培养箱中(37℃，200r/min)培养，至OD600约0.2时取出，以菌液为模版进行PCR反应，PCR反应的引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物为：SAK-F:5'-ACTAGTCGACTCCGAGGGGATTCGTCATTCTCCTCCATTACC-3'(SEQID NO.10)；反向引物为a1M-R：5'-ATAGAGCTCTTATTCCTGCTCCCCAGGGACACATTC-3'(SEQID NO.11)。PCR反应的条件为：94℃预变性10min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸55s，进行30个循环。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增结果，从而筛选阳性单克隆菌。再将阳性结果的菌液继续过夜培养至OD600约3.0时提取质粒，操作步骤遵照试剂盒说明书。将提取的质粒进行Not I、Sal I双酶切(37℃水浴3-4h)，琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切结果，如图2所示，可见载体PGEX6P-1片段与重叠延伸PCR产物RGD-rSAK-a1M片段(1000bp)。测序结果显示克隆序列完全正确。

实施例4 RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的表达与纯化

1.3.5转化表达菌将双酶切鉴定阳性的质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21，接种于氨苄抗性的LB平板上，37℃温箱孵育过夜。

1.3.6目的融合蛋白的诱导表达从平板上挑取多个单个菌落，分别接种于氨苄抗性LB培养基中，置于振荡培养箱中(37℃，200r/min)培养，至OD600约0.4-0.6时，加入IPTG(终浓度为0.2mmol/L)后放入摇床诱导目的融合蛋白表达(18℃低温诱导20h)。

1.3.7融合蛋白的酶切和目的融合蛋白的上清分离离心(4℃4000r/min)收集菌体，加入PBS(0.1mmol/L PH 7.4)、NaCl(300mmol/L)搅拌均匀，冰浴中超声破菌仪破菌至菌液清亮。破菌后离心(4℃12000r/min)收集上清液，SDS-PAGE蛋白电泳验证结果，如图3中3所示，SDS-PAGE显示在分子量约58kDa处有明显上清表达蛋白质，与目的融合蛋白的分子量一致，表明目的融合蛋白以上清可溶性蛋白表达。

1.3.8 His-GST融合蛋白的酶切和目的融合蛋白的纯化收将所收集的上清液，以7s/滴低速过镍柱，留取穿透液。将Ni2+亲和层析柱的穿透液在冰浴中孵育，然后用100mmol/L，PH7.4 PBS 缓冲液缓慢冲洗10柱体积洗脱杂蛋白，然后用预先准备的3C蛋白酶(1mg/ml)低温过夜柱上酶切(酶切缓冲液：50mmol/L Tris-Hcl，150mmol/L Nacl，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT,PH7.0)，然后用100mmol/L，PH7.4 PBS洗脱收集洗脱液，洗脱产物用SDS-PAGE电泳分析，如图3中5所示，洗脱液蛋白在相对分子量(M r)约36kDa处出现单一条带，与预期大小一致，为RGD-rSAK-a1M融合蛋白质，如图3中5所示。

1.3.9 RGD-rSAK-a1M融合蛋白质的阴离子交换纯化(DEAE)用缓冲液(20mmol/L Tris-Hcl,pH8.0)预平衡DEAE柱，洗脱液流经DEAE柱，用缓冲液(20mmol/L Tris-Hcl,pH8.0)洗脱至基线后，用NaCl进行梯度洗脱(0-500 mmol/L)。收集洗脱液，如图4所示，在50mM NaCl浓度时候有一明显的洗脱峰。SDS-PAGE电泳显示，该洗脱峰的分子量约为36kDa,纯度约为70％，与目的融合蛋白质RGD-rSAK-a1M的分子量一致(图3中6所示)。

1.3.10 RGD-rSAK-a1M融合蛋白质的分子筛纯化将DEAE所得的所有含目的融合蛋白的洗脱液超滤至1ml。将浓缩样品过分子筛(Superdex 75)进一步纯化缓冲液(20mmol/L Tris-HClPH8.0，200mmol/L NaCl，流速为1ml/min)，在67ml处有明显的洗脱峰。根据标准蛋白质对分子筛的标定(log WM＝-0.0154 Ve+5.58606(Ve为洗脱体积))，计算表明RGD-rSAK-a1M融合蛋白在溶液中的分子量约为36kDa左右，提示RGD-rSAK-a1M融合蛋白在溶液中是以单聚体形式存在,临床治疗血栓过程中，能够降低所得融合蛋白的免疫原性。电脑记录洗脱峰，选取洗脱峰尖处(如图5所示)对应的蛋白依次取样，SDS-PAGE电泳显示，目的蛋白质纯度大于95％(图3中7所示)，表明经过亲和层析、离子交换层析和分子筛纯化，能够获得高纯度的RGD-rSAK-a1M融合蛋白质，能够满足进一步实验的需要。

1.3.11 RGD-rSAK-a1M融合蛋白质的保存

将相应的目的蛋白样品用等体积超滤缓冲液(5mmol/L,PH8.0 Tris-HCl,50mmol/L Nacl)进行超滤浓缩至浓度达1mg/ml，分装后置于-80℃保存。

所得目的融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.12所示，具体为：

RGDSSFSSITNEVSASSSFDKGKYKKGDDASYFEPTGPYLMVNVTGVDSKGNELLSPHYVEFPIKPGTTLTKEKIEYYVEWALDATAYKEFRVVELDPSAKIEVTYYDKNKKKEETKSFPITEKGFVVPDLSEHIKNPGFNLITKVVIEKKGSGQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQE。

实施例5重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的溶栓活性鉴定

采用纤维平板溶圈法对所得重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白进行溶栓活性鉴定：设计尿激酶标准品为参考，稀释后其活性约10×10⁴IU/mg，测量各蛋白样品产生的融圈直径d(d＝横径+竖径/2)，带入回归方程计算各自的溶圈活性。

具体的，将0.35g琼脂粉加入到30ml 50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液中，微波炉加热至完全融化。室温下冷却至约40℃依次加入350μL纤维蛋白原、170μL纤溶酶、50μL氯化钙及10μL凝血酶。轻轻摇匀只浑浊产生后立即倒入平板，放4℃冰箱冷却20min，用打孔器打加样孔，将融合蛋白及尿激酶标准品稀释至一定比例后分别加入各孔，置于潮湿铝盒中37℃孵箱过夜。所得目的蛋白的溶栓效果图如图6所示，测量比较平板上透明圈直径大小，同时采用尿激酶标准品做一标准曲线，计算各种样品的溶栓活性，结果如表2所示。

表2 目的蛋白比活性对比表

上述实验结果表明重组葡激酶与尿激酶标准溶栓活性相当，且在rSAK融合RGD和a1M没有明显降低葡激酶的纤溶活性。

实施例7血小板聚集抑制试验

取20ml用枸橼酸钠(3.8％浓度0.1体积)处理的新鲜人血液1000r/min离心10min，取上清即富血小板血浆(PRP)300ul加入20ul待测样品于37℃温育5min，再加入致聚剂ADP至终浓度为10umol/L，用血小板聚集仪于490nm波长处测透射率，根据光透射率的增加来检测血小板的聚集率。结果如图7所示，重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白(RGD-rSAK-a1M)与相应浓度的重组葡激酶(rSAK)相比，具有显著抑制ADP激活血小板聚集的作用，与单独使用相应浓度的RGD无明显差异，同时表明其抗血小板聚集活性具有一定的剂量效应依赖关系。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种 如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (11)

1.一种融合蛋白，为RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，重组葡激酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，人α微球蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，RGD连接于重组葡激酶的N端，人α微球蛋白连接于重组葡激酶的C端。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.12所示。

6.一种多核苷酸，其编码权利要求1-5任一权利要求所述融合蛋白。

7.一种表达载体，其含有权利要求6所述多核苷酸。

8.一种宿主细胞，其被权要求7所述载体转化。

9.一种如权利要求1-5任一权利要求所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)采用重叠延伸PCR法获得目的基因融合片段；

2)将目的基因融合片段插入表达载体中，构建重组表达质粒；

3)构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，在大肠杆菌中进行高效表达；

4)融合蛋白的分离纯化。

10.如权利要求1-5任一权利要求所述融合蛋白或其编码基因在制备抗凝、溶栓药物中的用途。

11.一种低免疫原性靶向抗凝、溶栓药物组合物，含有有效剂量的如权利要求1-5任一权利要求所述融合蛋白或其编码基因及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。