TW201531569A - 雙股核酸分子與ｓ１核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途 - Google Patents

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Abstract

一種使用一雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途，其中該雙股核酸分子係經一螢光分子(fluorophore)及一螢光抑制物(quencher)標定且具至少一突變核苷酸，且其中該突變核苷酸係對應於該核酸修復酵素。

Description

雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途
本發明係關於一種使用一雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途，尤其關於使用一經一螢光分子(fluorophore)及一螢光抑制物(quencher)標定且具至少一突變核苷酸的雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途。
去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)或核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)突變是指細胞中DNA的或RNA鹼基發生改變而造成基因部分或完全失去活性。一般而言，造成核酸突變的因素可分為內源性損傷與外源性損傷，其中內源性損傷是例如由存在細胞內的活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)、或核苷酸鹼基之錯配(mismatch)所引起，外源性損傷則是由外部因素，例如紫外線、輻射線、化學物質(例如，烷化劑、去氨劑等)所引起。
核酸內源性損傷與外源性損傷皆會導致突變核苷酸的生成。突變核苷酸的例子包括，核苷酸鹼基氧化(oxidation)， 產成例如8-羥基鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)；核苷酸鹼基烷化(alkylation)，產成例如O6-甲基鳥嘌呤(O6-methylguanine)、N7-甲基鳥嘌呤(N7-methylguanine)、及/或N3-甲基腺嘌呤(N3-methyladenine)；核苷酸鹼基水解(hydrolysis)，發生去嘌呤(depurination)或去嘧啶(depyrimidination)；以及相鄰嘧啶之異常鍵結，產生例如嘧啶二聚體(pyrimidine dimer)等。此外，核苷酸鹼基錯配對亦會導致突變核苷酸生成，核苷酸鹼基錯配是指因核酸複製過程中新合成的核酸單股置入錯誤的核苷酸所導致，常見的核苷酸鹼基錯配包含例如在DNA進行複製時，腺苷酸自發性錯配了尿苷酸(deoxyuridine，U)，或經甲基化之胞嘧啶經去胺化所形成的尿嘧啶(uracil)，而產生dU：dA錯配。
一般情況下，生物體內的核酸修復酵素可在核酸發生損傷時清除受損的核苷酸，使基因序列恢復正常。核酸修復酵素依照其作用機轉，可分為例如核苷酸切除修復(nucleotide excision repair，NER)及鹼基切除修復(base excision repair BER)等。然而，隨著生物體逐漸老化或疾病發生，核酸修復酵素活性會降低，因而加速個體的老化現象及/或增加疾病的發生率。舉例言之，8-羥基鳥嘌呤糖苷酶(8-oxoguanine glycosylase，OGG1)為生物體內辨識8-羥基鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)之DNA氧化損傷位置的DNA修復酵素，研究顯示，若OGG1的活性下降，會使細胞修復8-oxoG的能力降低或喪失，從而增加個體罹患癌症(如肺癌、食道癌)的風險。此外，研究亦顯示OGG1於胚胎組織中表達量較高，顯示OGG1蛋白可保護胚胎DNA免受氧化損傷，與確保胚胎正常發育有極大關聯(核酸修復酵素活性下降 與疾病之關聯性可參見Dizdaroglu,M.Oxidatively induced DNA damage：mechanisms,repair and disease.Cancer Lett.Review.2012.：26-47；Karahalil,B.et al.,2002.Base excision repair capacity in mitochondria and nuclei：tissue-specific variation.Faseb J.14：1895-902；以及Paz-Elizur,T.et al.,2003.DNA repair activity for oxidative damage and risk of lung cancer.J Natl Cancer Inst.17：1312-9，該等文獻全文併於此處以供參考)。因此，若可檢測生物體內核酸修復酵素的活性，將可用於評估個體老化程度及/或疾病的發生率。
傳統用於檢測生物體之核酸修復酵素活性的方法為放射線膠體分析，其係先使用T4聚核苷酸激酶將放射線物質[γ-32P]標定於一含有核酸損傷位置之單股核酸的5’端，以管柱移除未結合的[γ-32P]，再將此核酸序列與未經[γ-32P]標定的互補股黏合成雙股核酸，與含有核酸修復酵素之檢體進行反應，再以酚/氯仿或乙醇沉澱核酸，以終止反應。接著，於90℃下反應5分鐘打開雙股核酸，再進行膠體電泳分析。因核酸上標定有[γ-32P]，故可依膠體上核酸大小辨別反應結果(此可參見Karahalil,B.et al.,2002.Base excision repair capacity in mitochondria and nuclei：tissue-specific variation.Faseb J.14：1895-902；以及Paz-Elizur,T.et al.,2003.DNA repair activity for oxidative damage and risk of lung cancer.J Natl Cancer Inst.17：1312-9，該等文獻全文並於此處以供參考)。然而，傳統放射線膠體分析方法存在檢測步驟繁複、費時、動態性結果不易得到以及必須使用放射線物質等缺點。
基於上述需求，本案發明人研發出一種利用雙股核酸分子與S1核酸酶以檢測核酸修復酵素活性的平台，其中該雙股核酸分子上係標定有螢光分子(fluorophore)及螢光抑制物(quencher)。本發明之檢測核酸修復酵素活性的平台，其具有穩定性高、操作步驟簡便、無須使用放射線物質、且可動態偵測核酸修復酵素活性等優點，可用於例如臨床疾病檢測或美容醫學領域，以評估疾病的發生率或個體老化程度。此外，本發明之檢測平台亦可用於評估酵素之km值。
本發明之一目的，在於提供一種使用一雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途，其中該雙股核酸分子係經一螢光分子(fluorophore)及一螢光抑制物(quencher)標定且具至少一突變核苷酸，且其中該突變核苷酸係對應於該核酸修復酵素。
本發明之另一目的，在於提供一種用於檢測核酸修復酵素活性的套組，其係包含：一第一部分，包含一雙股核酸分子，該雙股核酸分子係經一螢光分子及一螢光抑制物標定且具至少一突變核苷酸，其中該突變核苷酸係對應於該核酸修復酵素；以及一第二部分，包含S1核酸酶。
本發明之詳細技術內容及部分實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
第1圖為本發明使用雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的原理示意圖；第2A圖及第2B圖係顯示不同濃度之S1核酸酶與含有8-羥基鳥嘌呤之突變核苷酸的雙股DNA分子反應的螢光訊號曲線圖；第3圖係顯示不同pH值條件下OGG1與含有8-羥基鳥嘌呤之突變核苷酸的雙股DNA分子反應的螢光訊號曲線圖；第4圖係顯示使用含有8-羥基鳥嘌呤之突變核苷酸的雙股DNA分子作為基質所測定之OGG1之曼氏動力學曲線圖；第5圖係顯示使用含有尿苷酸之突變核苷酸的雙股DNA分子作為基質所測定之UDG之曼氏動力學曲線圖；以及第6圖係顯示使用含有8-羥基鳥嘌呤之突變核苷酸的雙股DNA分子以及S1核酸酶檢測蛋白質樣品之OGG1活性的直條圖。
以下將具體地描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「個體」係包括動物(例如哺乳動物)、植物、微生物。所謂「核酸」係包括去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)及核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)；所謂「雙股核酸」係包括任何結構中具有鹼基配對的核酸，包括例如雙股DNA、雙股RNA、以及由單股DNA或單股 RNA折疊形成的髮夾(hairpin)結構。
如上所述，生物體內的核酸隨時都因遭受ROS(即，氧化壓力)、紫外線、輻射線、及/或化學物質的影響而形成核酸損傷，或因核苷酸鹼基錯誤配對而造成例如尿苷酸錯配。一般情況下，當發生核酸損傷後，生物體內的核酸修復酵素會啟動修復功能，移除核酸損傷位置。因此，若生物體內的核酸修復酵素活性降低，將會造成核酸損傷無法正常修復，導致基因之核酸序列突變，加速老化程度或增加疾病的發生率。生物體內含有多種核酸修復酵素，不同核酸修復酵素各自具有不同基質(即，核酸修復酵素可修復之突變核苷酸的態樣)，可專一性修復特定核酸損傷態樣。常見的核酸修復酵素及與其對應的基質如下表1所示。
本案發明人研發出一種利用雙股核酸分子與S1核酸酶檢測核酸修復酵素活性的平台。第1圖顯示使用本發明之檢測 平台以檢測核酸修復酵素活性之原理的示意圖。如第1圖所例示之實施態樣，於根據本發明之檢測核酸修復酵素活性的平台中，係先設計一短片段之雙股核酸，該雙股核酸具有至少一個突變核苷酸(例如8-oxoG)，且該雙股核酸中之一股的一端點係經一螢光分子標定(例如6FAM(6-羧基螢光素，6-carboxyfluorescein))，且其對側端點係經一螢光抑制物(例如BHQ1(含氮的多環芳香烴，benzo(h)quinoline))標定，在雙股核酸未經切割的情況下，該螢光抑制物可抑制螢光分子之螢光訊號；將該經標定之雙股核酸與一含有核酸修復酵素(該核酸修復酵素的種類係對應於雙股核酸上的突變核苷酸種類；例如，可用於修復8-oxoG的OGG1)之待側樣品混合反應，使核酸修復酵素辨識並移除雙股核酸上的突變核苷酸，形成一缺口或鹼基鍵斷裂位置；接著，再利用S1核酸酶辨識並切割具缺口或具鹼基鍵斷裂位置之雙股核酸，使該螢光分子與該螢光抑制物分離而發出螢光訊號，藉由偵測螢光訊號的強度，可計算出核酸修復酵素的活性。
因此，本發明提供一種使用一雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途，其中該雙股核酸分子係經一螢光分子及一螢光抑制物標定且具至少一突變核苷酸，且其中該突變核苷酸係對應於該核酸修復酵素。舉例而言，當欲測定核酸修復酵素為OGG1(即，用於修復8-oxoG的DNA修復酵素)時，該雙股核酸分子應具有至少一8-oxoG之突變核苷酸；當欲測定之核酸修復酵素為UDG(即，用於修復尿苷酸的DNA修復酵素)時，該雙股核酸分子應具有至少一尿苷酸之突變核苷酸。
於本文中，「突變核苷酸」乙詞係指核苷酸鹼基異 常修飾、核苷酸鹼基水解、相鄰鹼基異常鍵結、核苷酸鹼基鍵斷裂、及/或核苷酸錯配。核苷酸鹼基異常修飾的例子包括但不限於，核苷酸鹼基氧化，產成例如8-羥基鳥嘌呤(8-oxoG)，以及核苷酸鹼基烷化，產成例如O6-甲基鳥嘌呤、N7-甲基鳥嘌呤、N3-甲基腺嘌呤等；核苷酸鹼基水解的例子包括但不限於，去嘌呤或去嘧啶；相鄰鹼基異常鍵結的例子包括但不限於，嘧啶二聚體；核苷酸錯配的例子包括但不限於，dU：dA錯配。
於本發明之用途中，所述核酸修復酵素的種類並無特殊限制，只要該核酸修復酵素可辨識核酸序列上的突變核苷酸即可。舉例言之，適用於本發明用途之核酸修復酵素的種類，包括但不限於例如APE 1、Endo III、Endo IV、Endo V、Endo VIII、Fpg、OGG1、NEIL1、T7 Endo I、T4 PDG、UDG、SMUG1、AAG等。根據本發明之部分實施態樣，該核酸修復酵素係OGG1及/或UDG。
根據本發明之用途，該雙股核酸分子之來源並無特殊限制，舉例言之，該雙股核酸分子可為人工合成的核酸分子或天然生物材料。此外，該雙股核酸分子係經至少一螢光分子及一螢光抑制物標定，且該螢光分子與該螢光抑制物較佳係分別標定於該雙股核酸分子中同一單股核酸的對側端或不同股核酸的對側端，以使該雙股核酸分子在未經S1核酸酶切割的狀況下，雙股核酸分子上標定的螢光抑制物可抑制螢光分子之螢光訊號。適用於本發明之螢光分子，包括但不限於6FAM(6-羧基螢光素，6-carboxy-fluorescein)、TET(四氯-6-羧基螢光素)、JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基螢光素)、及HEX(六氯-6-甲基螢光 素)等。適用於本發明之螢光抑制物，包括但不限於BHQ(含氮的多環芳香烴，benzo(h)quinoline)、AMRA(6-羧基四甲基若丹明)、DABCYL(4-(4-二烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。於本發明之一實施例中，係使用市售之Taq Man Probe系統將螢光分子6FAM標定於一雙股核酸分子中一單股核酸的5'端，且將螢光抑制物BHQ1標定於同一單股核酸的3'端。
此外，為使本發明所涉之雙股核酸分子在未經S1核酸酶切割的狀況下，雙股核酸分子上標定的螢光抑制物可抑制螢光分子之螢光訊號，該雙股核酸分子的長度較佳為約10至約200個鹼基對，更佳為約15至約50個鹼基對。於本發明之部分實施例中，該雙股核酸分子的長度為約20至約35個鹼基對。
在不背離本發明原理的情況下，可藉由任何合宜的步驟使用該雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性。舉例言之，根據本發明之一實施態樣，可採用如下步驟以檢測一核酸修復酵素的活性：(i)提供一雙股核酸分子，其係經一螢光分子及一螢光抑制物標定且具至少一突變核苷酸；(ii)混合該雙股核酸分子、S1核酸酶、以及一含有核酸修復酵素之待測樣本、以及一緩衝溶液，以獲得一混合溶液；以及(iii)偵測該混合溶液之螢光讀值，例如經由使用一即時定量聚合酶連鎖反應分析儀或螢光冷光偵測儀。
於上述(ii)混合該雙股核酸分子、S1核酸酶、以及一含有核酸修復酵素之待測樣本、以及一緩衝溶液的步驟中，為使核酸修復酵素可成功辨識突變核苷酸，且為避免S1核酸酶之非專一性反應，該雙股核酸分子與S1核酸酶的用量比較佳為每 100奈莫耳濃度的雙股核酸分子對應使用約0.25至約5活性單位之S1核酸酶，較佳為對應使用約0.5至約2.5活性單位之S1核酸酶。該含有核酸修復酵素之待測樣本可為，例如，取自一待測個體之血液、尿液、唾液、或組織等，且可視需要先以任何蛋白質萃取方法進行蛋白質萃取，以提高樣品中核酸修復酵素的濃度。於使用蛋白質作為待測樣本的情況下，蛋白質樣本的用量較佳為0.1奈莫耳濃度至20奈莫耳濃度，更佳為0.2奈莫耳濃度至5奈莫耳濃度。該緩衝溶液較佳係包含氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)、氯化鎂、及/或二硫蘇糖醇(dithiothreitol)，且緩衝溶液之pH值較佳為約6.0至約8.5。
此外，根據本發明之部分實施態樣，所涉之雙股核酸分子與S1核酸酶亦可用於檢測酵素之km值。舉例而言，可將一核酸修復酵素與不同濃度之本發明之雙股核酸分子(即，基質)混合反應，進行動力學曲線測試，計算每個反應的最大反應速度(Vmax)，繪製出米曼氏動力學曲線圖(Michaelis-Menten curveMichaells-Menten curve)，計算出1/2Vmax值並評估km值，以評估酵素與基質反應的親和力。
本發明另提供一種用於檢測核酸修復酵素活性的套組，其係包含：一第一部分，包含一雙股核酸分子，該雙股核酸分子係經一螢光分子及一螢光抑制物標定且具至少一突變核苷酸，其中該突變核苷酸係對應於該核酸修復酵素；以及一第二部分，包含S1核酸酶。該核酸修復酵素、雙股核酸分子、螢光分子、螢光抑制物、突變核苷酸、及S1核酸酶之性質、特點及較佳用量等，皆如前文所描述。
本發明套組可更包含一第三部分，該第三部分包含一緩衝溶液，該緩衝溶液較佳係包含氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)、氯化鎂、及/或二硫蘇糖醇(dithiothreitol)，其中，緩衝溶液之pH值較佳為約6.0至約8.5。此外，本發明套組可視需要另包含其他成分，只要該成分不會影響所欲之檢測即可。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
[實施例]
[製備實施例1]製備含有8-羥基鳥嘌呤之突變核苷酸的雙股核酸分子
合成一序列為5'-CATCGTTGTC[8-oxoG]CAGACCTGGTGGAT-3'(SEQ ID NO：1)的單股DNA(其中，[8-oxoG]代表8-羥基鳥嘌呤)，以及與SEQ ID NO：1互補之序列為5'-CGGTATCCACCAGGTCTGCGACAACGATGAAGCC-3'(SEQ ID NO：2)的單股DNA。以Taq Man Probe系統進行螢光標定，將螢光分子6FAM標定於SEQ ID NO：1之5'端，將螢光抑制物BHQ1標定於SEQ ID NO：1之3'端。接著，混合400奈莫耳濃度之經6FAM與BHQ1標定的SEQ ID NO：1以及800奈莫耳濃度之SEQ ID NO：2，置於PCR儀器(Eppendorf，德國)於以下溫度進行反應，以使該二單股DNA黏合為雙股DNA：95℃，5分鐘1循環；95℃，1分鐘(降5℃/每循環)7循環；60℃，30分鐘，1循環；60℃，1分鐘(降1℃/每循環)35循環， 以獲得經螢光分子及螢光抑制物標定且具有8-羥基鳥嘌呤之突變核苷酸的雙股DNA分子。
[製備實施例2]製備含有尿苷酸之突變核苷酸的雙股核酸分子
合成一序列為5'-AGTCAGTCGAGCUCATTCAGT-3'(SEQ ID NO：3)的單股DNA(其中，U代表尿苷酸)，以及與SEQ ID NO：3互補之序列為5'-ACTGACTGAATGAGCTCGACTGACT-3'(SEQ ID NO：4)的單股DNA。以Taq Man Probe系統進行螢光標定，將螢光分子6FAM標定於SEQ ID NO：3之5'端，將螢光抑制物BHQ1標定於SEQ ID NO：3之3'端。接著，混合400奈莫耳濃度之經6FAM與BHQ1標定的SEQ ID NO：3以及800奈莫耳濃度之SEQ ID NO：4，置於PCR儀器(Eppendorf，德國)於以下溫度進行反應，以使該二單股DNA黏合為雙股DNA：95℃，5分鐘1循環；95℃，1分鐘(降5℃/每循環)7循環；60℃，30分鐘，1循環；60℃，1分鐘(降1℃/每循環)35循環，以獲得經螢光分子及螢光抑制物標定且具有尿苷酸之突變核苷酸的雙股DNA分子。
[實施例1]檢測核酸修復酵素活性時所需之S1核酸酶用量
已知適量的S1核酸酶可切除單股核酸與有缺口或具鹼基鍵斷裂位置的雙股核酸，但若S1核酸酶添加量過高也可能導致切除雙股核酸。本實施例探討使用如製備實施例1所製備之雙股DNA分子於檢測核酸修復酵素活性時所需添加之S1核酸酶的合宜用量。取400奈莫耳濃度製備實施例1所製備之含有8-羥基 鳥嘌呤之突變核苷酸的雙股DNA分子，分別添加1活性單位(u)、2活性單位、10活性單位、20活性單位、或30活性單位之S1核酸酶，在添加有1活性單位OGG1或不含OGG1的情況下進行反應，以iQ5即時定量聚合酶連鎖反應分析儀(BioRad，美國)或MRX螢光冷光偵測儀(Eppendorf，德國)於定溫37℃環境下，每隔1分鐘偵測15秒的螢光讀值，共執行50個循環。結果顯示於第2A圖(不含OGG1)及第2B圖(含有OGG1)。
如第2A圖所示，在反應系統不含OGG1的情況下，濃度20活性單位以上的S1核酸酶會開始與雙股核酸反應；如第2B圖所示，在反應系統含有OGG1，且雙股核酸分子(即，受質)濃度為400奈莫耳濃度的情況下，大於1活性單位的S1核酸酶才足以與缺口核酸反應。由前述實驗結果可知，於使用如製備實施例1所製備之雙股DNA分子(即，雙股核酸分子)於檢測核酸修復酵素活性時，於雙股核酸分子濃度為400奈莫耳濃度的情況下，S1核酸酶的添加量較佳為1至20活性單位，更佳為2至10活性單位。亦即，雙股核酸分子與S1核酸酶的用量比較佳為每100奈莫耳濃度的雙股核酸分子對應使用0.25至5活性單位之S1核酸酶，較佳為對應使用0.5至2.5活性單位之S1核酸酶。
[實施例2]檢測核酸修復酵素活性之合宜pH值
本實施例探討使用如製備實施例1所製備之雙股DNA分子於檢測核酸修復酵素活性時，反應系統中pH值對於反應結果的影響。取400奈莫耳濃度製備實施例1所製備之含有8-羥基鳥嘌呤之突變核苷酸的雙股DNA分子，添加4活性單位之S1核酸酶，在添加有1活性單位OGG1或不含OGG1，且pH值 分別為pH 4.6或pH 7.9的情況下進行反應，以iQ5即時定量聚合酶連鎖反應分析儀(BioRad，美國)或MRX螢光冷光偵測儀(Eppendorf，德國)於定溫37℃環境下，每隔1分鐘偵測15秒的螢光讀值，共執行50個循環。結果顯示於第3圖。
如第3圖所示，在反應系統環境pH值為pH 4.6的情況下，不論有無添加OGG1皆有螢光反應值，顯示出現非專一性反應；而當反應系統環境pH值為pH 7.9時，僅在有添加OGG1的情況下，可偵測到螢光反應值。此實驗結果顯示pH 4.6會造成OGG1活性分析之非專一反應，反應較佳之pH值為7.9。
[實施例3]檢測OGG1修復酵素之km值
使用製備實施例1所製備之雙股DNA分子以檢測OGG1酵素之km值。取1活性單位之OGG1，分別與0奈莫耳濃度、200奈莫耳濃度、400奈莫耳濃度、600奈莫耳濃度、800奈莫耳濃度、或1000奈莫耳濃度製備實施例1所製備之雙股DNA分子(即，OGG1之基質)混合反應，進行動力學曲線測試，計算每個反應的最大反應速度，再以GraphPad Prism 5軟體繪製米曼氏動力學曲線圖，計算出1/2Vmax值並評估km值。結果如第4圖所示，OGG1之km值約為267.3奈莫耳濃度。本實施之實驗結果顯示，本發明經螢光分子及螢光抑制物標定且具有突變核苷酸的雙股核酸分子可用於檢測核酸修復酵素之km值，以評估酵素與基質反應的親和力。
[實施例4]檢測UDG修復酵素之km值
本實施例使用如製備實施例2所製備之雙股DNA分子檢測UDG酵素之km值。取1活性單位之UDG，分別與0奈莫 耳濃度、200奈莫耳濃度、400奈莫耳濃度、600奈莫耳濃度、800奈莫耳濃度、或1000奈莫耳濃度製備實施例2製備之雙股DNA分子(即，UDG之基質)混合反應，進行動力學曲線測試，計算每個反應的最大反應速度，再以GraphPad Prism 5軟體繪製米曼氏動力學曲線圖，計算出1/2Vmax值並評估km值。結果如第5圖所示，UDG之km值約為145.2奈莫耳濃度。本實施之實驗結果顯示，本發明經螢光分子及螢光抑制物標定且具有突變核苷酸的雙股核酸分子可用於檢測酵素之km值，以評估酵素與基質反應的親和力。
[實施例5]核酸修復酵素活性分析
(1)製備待測樣品
以一含抗凝劑(citrate-phosphate-dextrose-adenine，CPDA-1)之真空採血管，抽取隨機選取之人體血液約8毫升，以1：1之比例添加平衡溶液並均勻混合。將血液與Ficoll-Paque PLUS溶液(單核球細胞之分離液，GE，美國)以3：2.4公分之比例混合，先吸取Ficoll-Paque PLUS溶液至一50毫升離心管，小心沿管壁加入血液，於18℃下以400g離心40分鐘，去除上層溶液後，將下層淋巴球細胞吸取至新的離心管中，加入3倍體積平衡溶液並均勻混勻，於18℃下以100g離心10分鐘，去除上層液，加入6至8毫升平衡溶液，再重複離心去除上清液。接著，以磷酸緩衝液(PBS)清洗後去除上清液，加入5毫升緩衝液(包含155毫莫耳濃度NH4Cl、0.01莫耳濃度KHCO3、0.1毫莫耳濃度EDTA)，於室溫下離心4分鐘後去除上清液，再以0.4%台盼藍緩衝液(Trypan blue buffer，Sigma，美國)進行細胞染色，計 算細胞數後以50毫莫耳濃度Tris-HCl、1毫莫耳濃度EDTA、0.5毫莫耳濃度DTT、0.5毫莫耳濃度亞精胺(spermidine)、0.1毫莫耳濃度精四胺(spermine)、1%蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail)回溶細胞至20,000個細胞/毫升。接著，添加220毫莫耳濃度KCl，置於30℃下溶解30分鐘，以萃取淋巴細胞之蛋白質。
(2)OGG1酵素活性分析
於實驗組中，於冰上避光取8微克上述(1)所製備之含有OGG1之待測蛋白質樣品，加入10x緩衝液(含有500毫莫耳濃度NaCl、100毫莫耳濃度Tris-HCl、100毫莫耳濃度MgCl2、10毫莫耳濃度DTT，pH 7.9)、200奈莫耳濃度製備實施例1所合成之含有8-oxoG突變核苷酸的雙股DNA或不含突變核苷酸的雙股DNA、以及1活性單位之S1核酸酶(Promega，美國)；於控制組及對照組中，於冰上避光取不同濃度之OGG1(0活性單位(控制組)、1活性單位、或2活性單位)，加入10x緩衝液、200奈莫耳濃度製備實施例1所合成之含有8-oxoG突變核苷酸的雙股DNA或不含突變核苷酸的雙股DNA、以及1活性單位之S1核酸酶。接著，以iQ5即時定量聚合酶連鎖反應分析儀(BioRad，美國)或MRX螢光冷光偵測儀(Eppendorf，德國)於定溫37℃環境下，每隔1分鐘偵測15秒的螢光讀值，共執行40個循環。結果顯示於第6圖。
如第6圖所示，本發明之利用含有8-oxoG突變核苷酸的雙股DNA以及S1核酸酶的檢測方法，可用於檢測由淋巴細胞所萃取之蛋白質樣本中的OGG1酵素活性。其中，經由對照組 之數據可推算該本實施例中所測之蛋白質樣品中的OGG1酵素活性約為4.58活性單位。
以上實驗結果顯示，本發明之雙股核酸分子與S1核酸酶可用於檢測核酸修復酵素之活性，且可用於檢測酵素的km值。
上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後附申請專利範圍所界定者。
<110> 台灣糖業股份有限公司
<120> 雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途
<130> 04110TW
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 含有8-oxoG核苷酸之單股DNA
<220>
<221> 其他特徵(misc_feature)
<222> (11)..(11)
<223> n為8-oxoG
<400> 1
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 與SEQ ID NO：1互補之單股DNA
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 含有尿苷酸之單股DNA
<220>
<221> 其他特徵(misc_feature)
<222> (13)..(13)
<223> n為尿苷酸
<400> 3
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 與SEQ ID NO：3互補之單股DNA
<400> 4

Claims (20)

  1. 一種使用一雙股核酸分子與S1核酸酶於檢測核酸修復酵素活性的用途，其中該雙股核酸分子係經一螢光分子(fluorophore)及一螢光抑制物(quencher)標定且具至少一突變核苷酸，且其中該突變核苷酸係對應於該核酸修復酵素。
  2. 如請求項1之用途，其中該核酸修復酵素係選自以下群組：APE 1(AP內切酶1，AP Endonuclease 1)、Endo III(內切酶III，Endonuclease III)、Endo IV(內切酶IV，Endonuclease IV)、Endo V(內切酶V，Endonuclease V)、Endo VIII(內切酶VIII，Endonuclease VIII)、Fpg(甲醯基嘧啶DNA糖苷酶，formamido-pyrimidine-DNA glycosylase)、OGG1(8-羥基鳥嘌呤糖苷酶1，8-oxoguanine DNA glycosylase 1)、NEIL1(類內切酶VIII1，Endonuclease VIII-like 1)、T7 Endo I(T7內切酶I，T7 Endonuclease I)、T4 PDG(T4嘧啶二聚體DNA糖苷酶，T4 pyrimidine dimer DNA glycosylase)、UDG(尿嘧啶DNA醣苷酶，uracil DNA glycosylase)、SMUG1(單股選擇性單功能尿嘧啶DNA糖苷酶，Single-strand selective monofunctional uracil DNAglycosylase)、AAG(methylpurine DNA glycosylase，甲基化嘌呤DNA糖苷酶)、及前述之組合。
  3. 如請求項1之用途，其中該突變核苷酸為8-羥基鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)，且該核酸修復酵素為8-羥基鳥嘌 呤糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1，OGG1)。
  4. 如請求項1之用途，其中該突變核苷酸為尿苷酸(uridylic acid)，且核酸修復酵素為尿嘧啶DNA醣苷酶(uracil DNA glycosylase)。
  5. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該雙股核酸分子的長度為10至200個鹼基對。
  6. 如請求項5之用途，其中該雙股核酸分子的長度為15至50個鹼基對。
  7. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該螢光分子與該螢光抑制物係分別標定於該雙股核酸分子中同一單股核酸的對側端或不同股核酸的對側端。
  8. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該S1核酸酶的含量為1至20活性單位(unit)。
  9. 如請求項8之用途，其中該S1核酸酶的含量為2至10活性單位。
  10. 一種用於檢測核酸修復酵素活性的套組，其係包含：一第一部分，包含一雙股核酸分子，該雙股核酸分子係經一螢光分子(fluorophore)及一螢光抑制物(quencher)標定且具至少一突變核苷酸，其中該突變核苷酸係對應於該核酸修復酵素；一第二部分，包含S1核酸酶。
  11. 如請求項10之套組，其更包含一第三部分，該第三部分包含一緩衝溶液。
  12. 如請求項11之套組，其中該緩衝溶液係包含氯化鈉、三羥甲 基氨基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)、氯化鎂、二硫蘇糖醇(dithiothreitol)，且其pH值為約6.0至約8.5。
  13. 如請求項10至12中任一項之套組，其中該雙股核酸分子的長度為10至200個鹼基對。
  14. 如請求項13之套組，其中該雙股核酸分子的長度為15至50個鹼基對。
  15. 如請求項10至12中任一項之套組，其中該螢光分子與該螢光抑制物係分別標定於該雙股核酸分子中同一單股核酸的對側端或不同股核酸的對側端。
  16. 如請求項10至12中任一項之套組，其中該核酸修復酵素係選自以下群組：APE 1(AP內切酶1，AP Endonuclease 1)、Endo III(內切酶III，Endonuclease III)、Endo IV(內切酶IV，Endonuclease IV)、Endo V(內切酶V，Endonuclease V)、Endo VIII(內切酶VIII，Endonuclease VIII)、Fpg(甲醯基嘧啶DNA糖苷酶，formamido-pyrimidine-DNA glycosylase)、OGG1(8-羥基鳥嘌呤糖苷酶1，8-oxoguanine DNA glycosylase 1)、NEIL1(類內切酶VIII 1，Endonuclease VIII-like 1)、T7 Endo I(T7內切酶I，T7 Endonuclease I)、T4 PDG(T4嘧啶二聚體DNA糖苷酶，T4 pyrimidine dimer DNA glycosylase)、UDG(尿嘧啶DNA醣苷酶，uracil DNA glycosylase)、SMUG1(單股選擇性單功能尿嘧啶DNA糖苷酶，Single-strand selective monofunctional uracil DNA glycosylase)、AAG(methylpurine DNA glycosylase，甲基化嘌呤DNA糖苷酶)、及前述之組合。
  17. 如請求項10至12中任一項之套組，其中該突變核苷酸為8-羥基鳥嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)，且該套組係用於檢測8-羥基鳥嘌呤糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1，OGG1)之活性。
  18. 如請求項10至12中任一項之套組，其中該突變核苷酸為尿苷酸(uridylic acid)，且該套組係用於檢測尿嘧啶DNA醣苷酶(uracil DNA glycosylase，UDG)之活性。
  19. 如請求項10至12中任一項之套組，其中該雙股核酸分子與S1核酸酶的用量比較佳為每100奈莫耳濃度的雙股核酸分子對應使用約0.25至約5活性單位(unit)之S1核酸酶。
  20. 如請求項19之套組，其中該雙股核酸分子與S1核酸酶的用量比較佳為每100奈莫耳濃度的雙股核酸分子對應使用約0.5至約2.5活性單位(unit)之S1核酸酶。
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