CN102321644A - 一种水稻穗茎节长度控制基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种水稻穗茎节（倒一节）长度控制基因CSP1及其应用。具体涉及了一个控制水稻穗茎节长度基因的定位、克隆、功能验证和应用。所述的CSP1基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。CSP1对水稻的营养生长和穗的发育没有明显影响，主要控制水稻穗茎节的生长发育。利用基因工程技术有目的地调节该基因在水稻穗茎节中的表达量，可以调控水稻穗茎节的生长发育，解决杂交水稻制种过程中不育系的包穗问题，提高杂交稻种子的产量和质量，降低生产成本，减少因施用植物外源激素而造成的环境污染。因此，该基因具有十分重要的应用价值和广阔的应用前景。

Description

一种水稻穗茎节长度控制基因及其应用

技术领域   

本发明涉及植物基因工程领域。具体的说，涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻穗茎节长度控制基因CSP1 (Completely Sheathed Panicle 1)，并利用转基因互补实验验证了该基因的功能。同时，还涉及利用该基因调控水稻穗茎节的生长发育，解决杂交水稻制种过程中不育系的包穗，提高杂交稻产量和质量，降低杂交稻生产成本，并减少因施用植物外源激素而造成的环境污染。

背景技术   

水稻是我国主要粮食作物之一，全球约有40%人口以稻米作为主食。自上世纪60年代以来，世界人口急剧增长而耕地面积日益缩减，粮食安全问题已成为世界和平和发展的巨大挑战。高产一直是水稻育种的最主要目标。我国于1973年率先实现了杂交水稻的三系配套，使我国水稻的单产水平获得了第二次飞跃，为我国粮食的大幅度增产增收，解决我国13亿人口的温饱问题做出了巨大的贡献，被称为第二次绿色革命（张杰等，2006）。目前，我国杂交稻种植面积已达1733万hm²，占水稻种植面积的一半以上，每年需制种15万hm²左右（吴成等，2003；邓华凤等，2006）。然而，现在所应用的水稻籼型不育系均存在不同程度的包穗现象。在水稻生产中，无论是三系核质互作不育系或是两系光温敏核不育系，都存在一个共同的遗传障碍，即不育系抽穗不畅，亦称之为包穗。水稻包穗是穗颈节缩短，穗部约30％～60％的颖花被包裹在剑叶叶鞘中。水稻不育系的包穗一直是杂交稻生产中的一大难题，严重制约杂交稻种子的生产。生产上解决的办法是在不育系抽穗期采用剥苞、割叶或喷施赤霉酸（GA3）促使最上节间伸长，达到不育系稻穗全部伸出剑叶叶鞘而便于接受父本花粉，从而提高杂交制种产量。这极大地增加种子生产成本，同时喷施赤霉酸也加重了穗上发芽和稻粒黑粉病的发生，造成种子质量下降，并加剧了环境污染（李安祥等1995；Lu et al，1999）。因此，从遗传上消除不育系的包穗特性，一直是杂交稻育种的一个重要目标。

近年来，育种家通过培育携带最上节间伸长隐性突变基因eui1（elongated uppermost internode 1）和eui2的不育系，部分减轻了不育系包穗程度，但仍然没有彻底解决问题（申宗坦等，1987；Virmani，1988；梁康还等，1992a、1992b；何祖华和申宗坦，1994；杨仁崔等，2002）。Zhu（2003）和Zhu 等（2006）先后克隆了EUI2、EUI1基因。其中，EUI1基因是一个细胞色素P450家族成员，而EUI2基因与环氧化物酶有关。EUI1和EUI2的功能是使水稻的内源激素GA的合成减少。当其功能缺失时，会造成GA的积累，从而使水稻的穗颈节伸长。由于eui的最上节间异常伸长，在克服不育系包穗和提高恢复系传粉能力上可能具有重要的应用价值。因此，EUI基因的克隆为人们破解水稻包穗的难题提供了希望。美国学者Rutger等（1981）对EUI 基因的利用前景给予了极高的评价，认为EUI基因将是杂交水稻种子生产(制种)中的第四遗传要素 (相对于不育系、保持系和恢复系而言)。然而，实践证明，eui基因并不能完全解除水稻不育系的包穗现象。其原因是EUI1和EUI2的功能是使水稻的内源激素GA的合成减少。当其功能缺失时，会造成GA的积累，从而使水稻的穗颈节伸长。但水稻不育系最上节间中自身合成的GA含量低。 

因此，要解决水稻不育系的包穗问题，还应从促进不育系穗颈节的GA合成方面入手。为此，迫切需要发掘新的水稻包穗突变体，克隆水稻包穗基因，并深入研究包穗形成的原因。目前已发现了几个水稻包穗突变体shp1/2/5/6（sheathed panicle）和fsp（fully sheathed panicle），但对这些包穗突变体的研究还很少，未能对水稻穗颈节间伸长的根本原因进行深入研究(Kinoshita，1986；朱克明，2006；刘庄等，2006；王伟平等，2008)。  

本发明利用营养生长正常但穗茎节完全不伸长、穗部被剑叶叶鞘全部包裹、能正常结实的水稻新包穗突变体，通过图位克隆技术克隆了水稻的CSP1基因，该基因编码一个磷脂酰丝氨酸合成酶（phosphatidyl serine synthase, PSS），控制水稻穗茎节的伸长但不影响水稻的营养生长和穗的发育。磷脂酰丝氨酸合成酶属于磷脂酰二酯合成酶类，它以磷脂类物质为底物，催化其和水相中亲核供体发生转脂反应，是合成磷脂酰丝氨酸的工具酶。目前，在细菌、酵母、哺乳动物细胞和植物中均发现了具有功能的磷脂酰丝氨酸合成酶基因，但该酶在植物中的具体功能、特别是如何特异性决定水稻穗茎节的发育目前还是一个谜。因此，本发明为解决水稻不育系的包穗提供了新的途径。

发明内容  

本发明目的在于提供一种水稻穗茎节长度控制基因及其应用，该基因失活造成水稻穗茎节完全消失但对水稻茎杆的其它节以及营养生长和生殖发育没有明显影响。因此，通过调节该基因在水稻穗茎节中的表达，利用该基因的转基因植株改良水稻不育系的穗茎节伸出长度，用于培育不包穗或轻度包穗的水稻不育系。

本发明的水稻穗茎节长度控制基因CSP1基因具有如Seq ID No.1所示的DNA序列，也包括与Seq ID No.1所示的DNA序列至少有90%同源性的基因序列。本发明中的Seq ID No.2所编码的蛋白质为磷脂酰丝氨酸合成酶（ESPS，其中包括进行一个或几个氨基酸替换、插入或缺失所获得的功能类似物）。另外，也包括在Seq ID No.1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。 

本发明克隆的水稻CSP1基因的反转座子插入突变体CSP1表现为穗茎节完全消失，但水稻茎杆的其它节间长度、水稻的营养生长和生殖发育没有明显影响（见实施例1）。将正常功能的CSP1基因转化该突变体后，植株恢复正常表型（见实施例2）。 

本发明还提供一种用CSP1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了Seq ID No.1所示的序列基因或该基因类似的部分功能片段的载体，如图4所示的pCAMBIA1301-CSP1（见实施例2所示）。该载体还有一种含有以上表达载体的宿主细胞，该宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。 

实现本发明的具体技术步骤如下： 

    一．水稻雄蕊雌蕊化突变体CSP1的分离和遗传分析：

利用水稻品种明恢86（Oryza sativa ssp minghui86）的幼胚进行组织培养的后代植株中，本发明获得了一个水稻包穗突变体csp1，该突变体的营养生长、枝梗分化和颖花的数目基本正常，但在抽穗期突变体的穗部发生明显改变，表现为穗颈节完全退化、穗部被剑叶叶鞘全部包裹。通过突变杂合体植株自交及野生型植株正反交实验，证明csp1是一个符合单基因控制的遗传规律、如图1所示的隐性突变体。

二、水稻花器官发育的基因CSP1的图位克隆： 

1．CSP1的初步定位：

为了分离CSP1基因，本发明采用图位克隆的方法，首先创建了一个F₂定位群体，由csp1突变体为母本，选用秀水13为父本杂交获得的F₂中的csp1突变体组成。利用水稻RM系列微卫星标记对CSP1基因进行初步定位。定位结果如图2所示，CSP1基因初步定位在第1染色体短臂末端介于RM1282和RM84两个标记之间。

     2．CSP1基因的精细定位： 

通过对RM1282和RM84两个标记之间的BAC/PAC序列分析，开发出新的水稻SSR微卫星标记和InDel标记，将CSP1基因精细定位于如图3所示的PAC克隆P0494A10上的InDel2和SSR2之间约14Kb范围内，通过分析此区段开放阅读框（ORF）推测侯选基因。进一步通过比对突变体与野生型的基因组序列，确定候选基因。

3．CSP1基因的鉴定和功能分析： 

构建了一个如图4所示的互补实验载体。本发明通过转基因技术将互补载体转入csp1突变体后获得了如图5所示的表型恢复正常的转基因水稻，证明了本发明正确克隆了CSP1基因；氨基酸序列分析表明，CSP1编码一个磷脂酰丝氨酸合成酶。

本发明利用营养生长正常但穗茎节完全不伸长、穗部被剑叶叶鞘全部包裹、能正常结实的水稻新包穗突变体，通过图位克隆技术克隆了水稻的CSP1基因，该基因编码一个磷脂酰丝氨酸合成酶（phosphatidyl serine synthase, PSS），控制水稻穗茎节的伸长但不影响水稻的营养生长和穗的发育。磷脂酰丝氨酸合成酶属于磷脂酰二酯合成酶类，它以磷脂类物质为底物，催化其和水相中亲核供体发生转脂反应，是合成磷脂酰丝氨酸的工具酶。目前，在细菌、酵母、哺乳动物细胞和植物中均发现了具有功能的磷脂酰丝氨酸合成酶基因，但该酶在植物中的具体功能、尤其是如何特异性决定水稻穗茎节的发育目前还是一个谜。因此，本发明为解决水稻不育系的包穗提供了新的途径。 

水稻是我国乃至世界的主要粮食作物。水稻生产在我国国民经济中占有举足轻重的地位，是我国第一大栽培作物，约占我国粮食总产量的40%。目前主要是利用杂交水稻的杂种优势来培育高产水稻品种。我国杂交稻种植面积占水稻种植面积的一半以上，但所应用的水稻籼型不育系均存在一个共同的遗传障碍--包穗，严重的影响杂交水稻的制种产量和成本。生产上迫切需要培育长穗茎节的不育系的育种材料。基因工程技术使得应用CSP1基因调节水稻不育系穗茎节的长度成为可能。本发明获得的水稻全包穗突变体CSP1，是单基因隐性突变，符合孟得尔遗传规律。本发明通过图位克隆技术获得了CSP1基因，并通过功能互补实验鉴定了该基因的功能。氨基酸序列分析表明，该基因编码一个磷脂酰丝氨酸合成酶，其在阐明水稻穗茎节长度控制方面具有重要作用。因该基因主要控制水稻穗茎节的发育而对营养生长和生殖发育影响较小，可以利用基因工程技术调节它在水稻穗茎节中的表达量，可培育出长穗茎节的水稻不育系新种质，从而提高杂交制种质量、降低生产成本。因此，该基因具有非常重要的应用价值和广阔的应用前景。 

附图说明   

图1：水稻包穗突变体csp1与对应野生型的表型。

图1A：野生型明恢86与突变体csp1的植株表型。 

图1B：野生型明恢86与突变体csp1的最上节与穗部表型（白箭头：剑叶叶枕，黄箭头：穗颈节，红箭头：倒一节间）。 

图2：CSP1基因在水稻第1染色体上的初步定位图。 

图3：CSP1基因精细定位图。 

图4：pCAMBIA1301-CSP1载体图谱。 

图5：功能互补实验T₀代转基因水稻与csp1突变体的表型图。 

图5A：突变体csp1的植株表型。 

图5B：功能互补实验T₀代转基因水稻植株表型。 

具体实施方式

实施例1：水稻穗茎节长度控制基因CSP1的图位克隆 

1．水稻材料：

水稻（Oryza sativa L）突变体csp1，原始野生型材料为明恢86。该突变体为本发明者从明恢86的幼胚组织培养再生植株的后代中获得。

2．分析和定位群体： 

突变体csp1与野生型品种秀水13进行杂交，F₁代自交，得到F2群体，在抽穗期选出2720个csp1突变表型的植株作为定位群体。于抽穗期每株取1克左右的叶片，用来提取总DNA。

3．利用水稻微卫星标记（RM与SSR）和InDel标记定位CSP1基因： 

采用水稻微量法快速抽提水稻的总DNA。取大约0.3克水稻叶片，放入1.5ml离心管中经液氮快速冷冻，用小塑料研棒研成粉末后提取DNA，获得的DNA溶于100 ul超纯水中。每一个20 ul的反应体系中加入1 ul DNA样品。

在CSP1基因的初步定位实验中，利用DNA池的定位方法，选700个F2群体中的突变体个体用水稻RM系列微卫星进行分析。根据公布的水稻SSR遗传图谱，按照一定的遗传距离，均匀选取分布于各条染色体上的RM引物进行PCR扩增，然后在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离和硝酸银染色，检测PCR产物的多态性，将CSP1基因初步定位在水稻第1染色体短臂的RM1282和RM84两个标记之间。 

在精细定位CSP1基因时，对F2群体中的2720个突变体个体进行SSR标记和InDel标记的连锁分析。根据分子标记RM1282和RM84之间的BAC/PAC序列分析，利用已公布的水稻基因组序列， 设计了9对SSR引物和17对InDel引物用于精细定位CSP1基因，其中有3对SSR引物（命名为SSR1～SSR3）和5对InDel引物（命名为InDel1～InDel5）在两个亲本间有多态。用这8个有多态的标记（引物序列见表1）对F2群体中的2720个突变体个体进行了连锁分析。 

表1 用于精细定位CSP1基因的引物序列 

4．基因预测与比较分析

根据精细定位的结果，CSP1基因位于PAC克隆P0494A10上的两个标记InDel2和SSR2之间约14Kb范围内。根据Rice Automated Annotation System（http：//RiceGAAS.dna.affrc.go.jp）的预测，发现此区间只有2个ORF。其中一个ORF编码磷脂酰丝氨酸合成酶（phosphatidyl serine synthase），另一个ORF编码葡萄糖基转移酶（glycosyltransferase）。由于编码葡萄糖基转移酶基因的部分序列已位于CSP1基因所在的14kb序列区域以外，因此我们初步将其中的磷脂酰丝氨酸合成酶基因作为CSP1的侯选基因。进一步在侯选的磷脂酰丝氨酸合成酶基因内设计一对引物（上游引物： GAATTATCACCATGGAGGTCA；下游引物： GGGATACCAGGCTTTTCTTTC）进行PCR扩增和测序。结果表明野生型扩出1733 bp，而csp1突变体扩出7020 bp。序列分析结果显示， csp1突变体在此基因的第四外显子中插入了一个5287base的反转座子。 根据PAC克隆P0494A10序列的基因注释信息，此基因编码编码磷脂酰丝氨酸合成酶。

实施例2  遗传转化 

根据籼稻明恢86基因的序列，利用pCAMBIA1301载体构建了如图4所示的CSP1侯选基因的互补实验载体pCAMBIA1301-CSP1。载体构建的具体过程是：在候选的磷脂酰丝氨酸合成酶基因区和启动子区设计一对带有酶切位点的引物，利用高保真酶进行高保真PCR扩增并测序，挑选序列完全正确的克隆，经酶切和连接，构建成如图4所示的表达载体，再将其转入农杆菌中。该互补载体的DNA序列为7334bp，包括起始密码前1932bp和终止密码后455bp片段。扩增互补实验的DNA序列所用引物是(下划线部分为酶切位点与保护碱基)：

上游引物：5’ TCCCCCGGGTCAAGTGCCGCGTGAGGTGG

下游引物：5’ CGGGATCCCACACACCAGGTACCGTAGGGA

利用愈伤侵染法技术转化csp1突变体（明恢86）自交后代的幼胚（水稻开花10-15天左右）诱导的愈伤组织。幼胚诱导的愈伤组织经过2～3次的继代，挑选生长迅速、颜色鲜黄、表面光滑、质地致密、直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒作转化的受体。用含有双元质粒载体的农杆菌EHA105菌株浸染水稻愈伤，置25℃条件下暗培养3 天后，在含有30 mg/L Hygromycin的筛选培养基上培养15天，后再重复筛选培养一次； 30天后，将筛选出的愈伤组织转至含有50 mg/L Hygromycin的筛选培养基上继续筛选一周。将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基上于光照条件下培养，一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽和根，当芽长至2-3cm时，移至1/2MS培养基上，待幼苗在生根培养基上生长10天后，在水中炼苗三天，移至大田。对突变体幼胚转基因后的再生植株进行鉴定和连续的观察，转基因水稻营养生长正常，与野生型比较没有明显区别。如图5所示，与同一生长阶段的突变体比较，转基因水稻抽穗期穗部没有观察到包穗现象出现，说明该侯选的磷脂酰丝氨酸合成酶基因就是CSP1基因。

因CSP1基因对水稻的营养生长、花序和颖花发育影响较小，可以利用基因工程技术有目的地调节它在水稻穗茎节中的表达量，进而可培育出长穗茎节的水稻不育系新种质，从而可提高水稻的产量、提高杂交制种质量、降低生产成本，以及利用分子设计的方法调节该基因在水稻穗茎节中的表达，从而培育出不包穗的水稻三系和两系雄性不育系新种质。 

以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对与本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 

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<110> 福建农林大学

<120> 一种水稻穗茎节长度控制基因及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1278

<212> DNA

<213> 水稻 (Oryza sativa)

<400> 1

atggaggtcaatggtcatca caaaccaaga agagaatata atggccgaga gtgcaatggt 60

gtacaatcagtaaacaattt tggcgatatc gatccatgga cagcatgggc atacaaaccg 120

cgcacagtttcattgctact gatgggaaca tgctttttaa tttgggcaag tggtgctctt 180

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<210> 2

<211> 425

<212> PRT

<213> 水稻 (Oryza sativa)

<400> 2

Met Glu Val Asn Gly His His Lys Pro Arg Arg Glu Tyr Asn Gly Arg

1               5                   10                  15     

Glu Cys Asn Gly Val Gln Ser Val Asn Asn Phe Gly Asp Ile Asp Pro

            20                  25                  30         

Trp Thr Ala Trp Ala Tyr Lys Pro Arg Thr Val Ser Leu Leu Leu Met

        35                  40                  45             

Gly Thr Cys Phe Leu Ile Trp Ala Ser Gly Ala Leu Asp Pro Glu Arg

    50                  55                  60                 

Ser Phe Ser Val Asp Arg Val Ser Ser Val Lys Arg Gly Val Phe Ala

65                  70                  75                  80 

Met Ile Ala Val Phe Leu Ala Tyr Ser Phe Leu Gln Ala Pro Ser Thr

                85                  90                  95     

Val Leu Ile Arg Pro His Pro Ala Ile Trp Arg Leu Val His Gly Met

            100                 105                 110        

Ala Val Val Tyr Leu Val Ala Leu Thr Phe Leu Leu Phe Gln Thr Arg

        115                 120                 125            

Asp Asp Ala Arg Gln Phe Met Lys Tyr Leu His Pro Asp Leu Gly Val

    130                 135                 140                

Glu Leu Pro Glu Arg Ser Tyr Gly Thr Asp Cys Arg Ile Tyr Val Pro

145                 150                 155                 160

Asp His Pro Lys Ser Arg Phe Asn Asn Val Tyr Glu Ile Leu Phe Asp

                165                 170                 175    

Glu Phe Val Ile Ala His Ile Leu Gly Trp Trp Gly Lys Ala Ile Met

            180                 185                 190        

Ile Arg Asn Gln Pro Leu Leu Trp Val Leu Ser Ile Gly Phe Glu Leu

        195                 200                 205            

Met Glu Leu Thr Phe Arg His Met Leu Pro Asn Phe Asn Glu Cys Trp

    210                 215                 220                

Trp Asp Ser Ile Val Leu Asp Ile Leu Ile Cys Asn Trp Phe Gly Ile

225                 230                 235                 240

Trp Ala Gly Met Lys Thr Val Arg Tyr Phe Asp Gly Arg Thr Tyr Glu

                245                 250                 255    

Trp Val Gly Leu Ser Arg Gln Pro Asn Ile Ile Ser Lys Val Lys Arg

            260                 265                 270        

Thr Leu Gly Gln Phe Thr Pro Ala Gln Trp Asp Lys Asp Glu Trp Tyr

        275                 280                 285            

Pro Leu Leu Gly Pro Trp Arg Phe Ile Gln Val Leu Ser Leu Cys Ile

    290                 295                 300                

Val Ser Met Ile Val Glu Leu Asn Thr Phe Phe Leu Lys Phe Cys Leu

305                 310                 315                 320

Trp Ile Pro Pro Arg Ile Pro Leu Ile Val Tyr Arg Leu Val Leu Trp

                325                 330                 335    

Trp Leu Ile Ala Ile Pro Thr Ile Arg Glu Tyr Asn Thr Tyr Leu Gln

            340                 345                 350        

Asp Arg Lys Pro Val Lys Lys Val Gly Ser Phe Cys Trp Leu Ser Leu

        355                 360                 365            

Ala Ile Cys Ile Leu Glu Leu Leu Leu Cys Ile Lys Phe Gly His Gly

    370                 375                 380                

Leu Phe Pro Lys Ser Met Pro Ser Trp Leu Phe Ile Ala Trp Thr Thr

385                 390                 395                 400

Val Ala Ser Leu Leu Ile Met Phe Leu Leu Val Trp Thr Trp Lys Ile

                405                 410                 415    

Tyr Arg Thr Met Ile Arg Lys Arg Leu

            420                 425                

 

Claims (3)

1.CSP1基因在控制水稻穗茎节长度中的应用，其特征在于，所述的CSP1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1 所示。

2.CSP1基因在控制水稻穗茎节长度中的应用，其特征在于，所述的CSP1基因编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2 所示。

3.权利要求1或2 所述的基因在培育不包穗或轻度包穗的水稻不育系中的应用。

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