CN114303949A - 一种超甜玉米的转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和转基因技术领域，具体涉及一种超甜玉米的转化方法。本发明通过对热激幼胚、侵染培养基和休息培养基配方等参数优化，使超甜玉米自交系Qun01X01从无法转化提升到转化效率达到10.77％。利用本发明提供的方法，可以实现以超甜玉米自交系为受体的高效遗传转化，从而直接培育具有特定性状的转基因超甜玉米材料和品种。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和转基因技术领域，具体涉及一种超甜玉米的转化方法。
背景技术
超甜玉米属甜质玉米(Zea mays L.Sacchara sturt)，除了具有玉米的粮食属性外，还享有蔬菜、水果玉米之称，已经成为当今世界重要的栽培作物，鲜苞及其制品是美、日、西欧以及东南亚一些国家和地区的重要消费食品之一。我国的超甜玉米种植面积和产量均具世界首位，华南地区是我国超甜玉米主产区，是广东省的特色和优势作物。
遗传转化是培育转基因玉米品种的基本技术体系。尽管超甜玉米已经公开了相关的遗传转化方法(CN 1763207 B)，然而很多是通过基因枪方式实现的。农杆菌介导的转化方法在整合、拷贝数、遗传稳定性等方面还是具有优势。然而基因型是限制农杆菌介导法玉米转化效率的重要因素。同样的转化方法在不同基因型玉米(即不同的受体玉米品种)上表现出的转化效率有着天壤之别。超甜玉米作为一种特殊的玉米种质，需要根据具体的受体材料开发对应的转化方法。
超甜玉米自交系Qun01X01是广东省农业科学院作物研究所利用甜玉米杂交种群体混合授粉，再通过低温筛选、一环系选育、连续自交、穗行选育等一系列过程选育而成(品种权号CNA20160271.0)，植株表现持绿性高、籽粒黄色、籽粒较大、色泽光亮，甜度高、果皮薄、配合力较高。以该自交系为父本培育的粤甜28号为广东省主导品种，是目前应用最广泛的超甜玉米品种。然而该自交系品种还没有成熟高效的农杆菌介导的转化方法，这为以该自交系品种为受体，通过转基因技术进一步改良超甜玉米的特定性状带来了障碍。
为解决上述问题，本发明对热激幼胚、侵染培养基和休息培养基配方等参数进行优化，将Qun01X01受体从无法转化提升到转化效率达到10.77％。利用本发明提供的方法，可以实现以玉米自交系Qun01X01为受体的高效遗传转化，从而直接培育具有特定性状的转基因Qun01X01超甜玉米材料和品种。
发明内容
本发明的目的是提供一种超甜玉米自交系Qun01X01的转化方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种休息培养基，其特征在于，配方如下：
2×MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L。
本发明还提供了上述休息培养基在玉米遗传转化中的应用。
在一些实施方案中，上述的玉米为自交系Qun01X01。
本发明还提供了一种超甜玉米的遗传转化方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将含有草丁膦抗性基因的EHA105农杆菌菌株在活化培养基上划线，28℃黑暗培养24h；
2)将玉米自交系授粉后6-15天，玉米幼胚长至0.5-2.0mm时从玉米穗上剥取获得的幼胚浸入悬浮培养基，悬浮浸泡10-30min，完成幼胚收集后移走液体，热激5min，再加入携带含有草丁膦抗性基因的EHA105农杆菌的侵染培养基中侵染5min；
3)将幼胚移至共培养基上，23℃黑暗培养24-96h；
4)将幼胚移至休息培养基上，28℃黑暗培养1-2周；
5)将幼胚移至选择培养基上培养，选择培养基中含草丁膦诱导抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养3周，分化形成再生小苗；
6)再生小苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米；
其中，所用到的培养基配方如上所述。包括如下培养基：
农杆菌活化培养基：D-葡萄糖20g/L+MES 19.5g/L+NaH2PO4 0.06g/L+NH4Cl 1g/L+MgSO4·7H2O 0.3g/L+KCl 0.15g/L+CaCl2·2H2O 0.0132g/L+FeSO4·7H2O 0.0025g/L+琼脂15g/L；和
悬浮培养基：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L；和
侵染培养基：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L+乙酰丁香酮200mM+半胱氨酸200mg/L；和
共培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+L-半胱氨酸200mg/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+乙酰丁香酮200mM；和
休息培养基，配方如上所述；和
选择培养基：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L+草丁膦40mg/L；和
分化培养基：MS+蔗糖20g/L+6-BA0.1mg/L+KT 1mg/L+特美汀200mg/L；和
生根培养基：MS+蔗糖20g/L+MES 0.5g/L+IBA0.2mg/L。
在一些实施方案中，上述步骤2)中所述的玉米自交系为Qun01X01。
本发明的优点及有益效果如下：本发明对热激幼胚、侵染培养基和休息培养基配方等参数进行优化，将Qun01X01受体从无法转化提升到转化效率达到10.77％。利用本发明提供的方法，可以实现以玉米自交系Qun01X01为受体的高效遗传转化，从而直接培育具有特定性状的转基因Qun01X01超甜玉米材料和品种。
附图说明
图1载体图谱
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:alaboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
实施例1 Qun01X01转化效率初步测试
Qun01X01是一个超甜玉米自交系材料，本发明首先依据专利CN 104745622B公开的方法，测试Qun01X01自交系的转化效率，所用到的载体携带抗草丁膦的bar基因(SEQ IDNO.1所示)和GFP报告基因(SEQ ID NO.2所示)，载体图见图1。
结果显示，几个转化批次均没有获得阳性植株，没有转化成功。需要对转化体系的各参数进行优化。
实施例2对热激时间的优化
在侵染阶段，对幼胚的热激，可以极大提高转化效率。CN103114106B专利中也提到，玉米幼胚用45℃热激5min，可以提高农杆菌的侵染效率。本发明尝试使用热激的方法处理幼胚，热激温度设置为46℃，分别处理3min和5min。其他操作与CN 104745622 B公开的内容保持一致。结果显示，热激处理3min效果最好，可以使得转化效率达到3.3％(表1)。
表1热激处理对转化效率(％)的影响
由于不进行热激处理时，Qun01X01无法转化，会影响其他参数评估效果的准确性。因此在之后的参数测试和优化过程中，统一对幼胚进行3min的热激处理。
实施例3对侵染培养基的优化
半胱氨酸是一种抗氧化剂，可以使玉米幼胚细胞在农杆菌侵染后不容易发生细胞程序化死亡，在共培养基中添加150-300mg/L的半胱氨酸能够增加农杆菌的侵染效率(耿婉莹.ZmSec14p基因的玉米遗传转化及体细胞胚胎发生遗传研究[D].吉林大学，2020；CN103114106B)。低浓度的半胱氨酸作用有限，但高浓度半胱氨酸又会影响幼胚生长，本发明设置了不添加、添加50mg/L、添加200mg/L、添加400mg/L半胱氨酸4种处理，测试对Qun01X01转化效率的影响。经过试验，发现在侵染培养基中而不是共培养基中添加200mg/L的半胱氨酸最有利于提高Qun01X01的转化效率(表2)。
表2浸染培养基中添加半胱氨酸对Qun01X01转化效率(％)的影响
实施例4对休息培养基的优化
休息培养是在农杆菌侵染幼胚后提升幼胚状态，并进入筛选阶段的关键时期。休息培养基的改变能够进一步提升玉米的整体转化效率。
本发明为了进一步提升Qun01X01的转化效率，在本实施例中将休息培养基中的MS盐进行了加倍，重新配制了新的休息培养基，配方如下：2×MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L。
其余的培养基配方和操作步骤按照上述已经优化的参数执行。实验测试结果显示，使用改良后的休息培养基几个转化批次的平均转化效率可以达到10.77％(详见表3)，这相比对照(使用未改良的休息培养基)的转化效率4.73％又进一步有了极显著的提升。
表3体系进一步优化后Qun01X01的转化效率
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.休息培养基，其特征在于，配方如下：
2×MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L。
2.权利要求1所述的休息培养基在玉米遗传转化中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的玉米为自交系Qun01X01。
4.一种超甜玉米的遗传转化方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将含有草丁膦抗性基因的EHA105农杆菌菌株在活化培养基上划线，28℃黑暗培养24h；
2)将玉米自交系授粉后6-15天，玉米幼胚长至0.5-2.0mm时从玉米穗上剥取获得的幼胚浸入悬浮培养基，悬浮浸泡10-30min，完成幼胚收集后移走液体，热激3min，再加入携带含有草丁膦抗性基因的EHA105农杆菌的侵染培养基中侵染5min，期间向农杆菌侵染液中吹打空气；
3)将幼胚移至共培养基上，23℃黑暗培养24-96h；
4)将幼胚移至休息培养基上，26-34℃黑暗培养1-2周；
5)将幼胚移至选择培养基上培养，选择培养基中含草丁膦诱导抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养3周，分化形成再生小苗；
6)再生小苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米；
其中，所用到的培养基配方如下：
农杆菌活化培养基：D-葡萄糖20g/L+MES 19.5g/L+NaH2PO4 0.06g/L+NH4Cl 1g/L+MgSO4·7H2O 0.3g/L+KCl 0.15g/L+CaCl2·2H2O 0.0132g/L+FeSO4·7H2O 0.0025g/L+琼脂15g/L；和
悬浮培养基：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L；和
侵染培养基：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L-脯氨酸0.115g/L+乙酰丁香酮200mM+半胱氨酸200mg/L；和
共培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+L-半胱氨酸200mg/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+乙酰丁香酮200mM；和
休息培养基，配方如权利要求1所述；和
选择培养基：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4-D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L+草丁膦40mg/L；和
分化培养基：MS+蔗糖20g/L+6-BA 0.1mg/L+KT 1mg/L+特美汀200mg/L；和
生根培养基：MS+蔗糖20g/L+MES 0.5g/L+IBA 0.2mg/L。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的玉米自交系为Qun01X01。
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