CN109468264A - 一种栀子苷的生产方法 - Google Patents

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Abstract

栀子中含多余种生物活性物质，国内外公认的栀子有效成分为环烯醚萜类物质，其中含量最高的为栀子苷，又称为京尼平苷。由于栀子是栀子果实是栀子苷的唯一天然获得来源，栀子苷的获取完全依赖于栀子果实，通过植物细胞工程筛选产栀子细胞进行规模化培养是解决栀子来源短缺的有效途径之一。目前还未见有通过细胞培养生产栀子苷的报道。本发明有效的解决了栀子细胞生长与栀子苷含量下降之间的矛盾，可以在短期内以内获得富含栀子苷的新鲜细胞，培养所得细胞的栀子苷含量是种子细胞中栀子苷含量的数倍，且不受自然条件的影响和限制。

Description

一种栀子苷的生产方法
技术领域
本发明是生物技术领域，特别涉及一种采用植物细胞培养技术生产栀子苷的方法。
背景技术
栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasmi-noides Ellis的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒、消肿止痛等作用，栀子苷是栀子的次生代谢产物，其化学结构为环烯醚萜的葡萄糖苷。栀子中含40余种生物活性物质，主要为环烯醚萜类和挥发油类，而国内外公认的栀子有效成分为环烯醚萜类物质，其中含量最高的为栀子苷，又称为京尼平苷，其苷元为京尼平。
朱文佩等以不同成熟度的栀子果实为样品，采用高效液相色谱法测定，为确定最适采收期奠定基础，结果表明不同成熟度果实样品的栀子苷含量随成熟度提高而下降。这与何国振等报道的不同成熟期栀子果实中栀子苷含量变化结果一致；吴小燕等研究表明栀皮和栀仁中主要活性成分的分布是有一定特征规律的，其中环烯醚萜苷类的代表性成分栀子苷富集于栀仁(种子)中。
由于栀子是栀子果实是栀子苷的唯一天然获得来源，栀子苷的获取完全依赖于栀子果实，而栀子苷的含量与栀子果实成熟度呈负相关，因此通过天然途径获取栀子苷成本较高，而且产量不稳定。
通过植物细胞工程筛选产栀子细胞进行规模化培养是解决栀子来源短缺的有效途径之一。早在1989年，日本科学家就进行了栀子组织培养生产次生代谢产物的研究，而国内对栀子愈伤组织获得初生代谢产物和次生代谢产物的研究起步较晚。在获取初生代谢产物方面，石若夫等筛选出适宜栀子多糖合成的悬浮细胞株及培养条件。在获取次生代谢产物方面，钟青萍等筛选出适宜栀子愈伤组织生长和栀子黄色素产生的培养基。陈书安等为解决藏红花资源短缺问题，研究了栀子愈伤组织的诱导，筛选出藏红花素含量高、生长快速且不易褐化的栀子愈伤组织细胞系，为解决藏红花素资源短缺等问题提供了种子资源。目前还未见有通过细胞培养生产栀子苷的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产栀子苷的方法，解约目前栀子苷生产来源对气候依赖强的问题。包括下述步骤：
1、诱导栀子仁愈伤组织 8月中旬选择未成熟的新鲜栀子果实拨开取其种子并消毒，通过无菌操作将消毒处理的种子拨去种皮，并用解剖刀将脱皮的栀子仁按横切面切成两半，脱分化暗培养7-10天；
2、获得快速生长细胞系 从步骤1)获得的愈伤组织中筛选浅黄绿色、质地松脆的愈伤组织进行3次以上继代培养，获得快速稳定生长细胞系；
3、诱导多倍体细胞 将步骤2)获得的快速生长细胞系在添加秋水仙碱的MS液体培养基内，诱导培养得到多倍体细胞系；
4、多倍体细胞扩增 将步骤3)得到的多倍体细胞系接种在无秋水仙碱的MS固体培养基中，行扩增培养获得大量栀子多倍体细胞；
5、栀子苷合成培养 将步骤4)得到的多倍体细胞接种在合成培养基中培养得到富集栀子苷的细胞；
所述步骤1)中脱分化培养用的培养基为在MS培养基的基础上添加0.5mg/L的2,4-D、0.25mg/L6-BA，1.0-3.0mg/L的辅酶A、30-40mg/L的蔗糖得到的培养基；
所述步骤2)中继代培养用的培养基为在MS培养基的基础上添加1.0-3.0mg/L的NAA和2.0-4.0mg/L6-BA得到的培养基；
所述步骤3)诱导培养多倍体细胞系时所添加秋水仙碱的浓度为5-10mg/L，培养方式为置于100rpm/分转速的摇床中暗培养7-10天；
进一步的，所述步骤3)诱导培养多倍体细胞系时，添加秋水仙碱的同时还另添加0.5-2mg/L二甲基亚砜，培养方式为置于100rpm/分转速的摇床中暗培养3-7天；
所述步骤4)扩增培养所用的培养基为在MS培养基的基础上添加1.0-3.0mg/L6-BA，0.3-0.5mg/L的NAA和30mg/的蔗糖；
所述步骤5)合成培养所用的培养基在MS液体培养基中添加苯丙氨酸400mg/L，酪氨酸350mg/L，5-氮杂胞苷30-60uM，蔗糖30-60g/L，pH调整到5.5-6.6；
进一步的，接种量以质量百分比计，优选为5-10％；
进一步的，步骤5)所用的合成培养条件为25-30℃、100rpm/分转速的摇床中振荡暗培养5-10天。
本发明的有益效果在于，通过对栀子果中富含栀子苷的种仁细胞进行离体加倍，获得了多倍体栀子细胞，进而对多倍体细胞进行代谢调控，获得了大量富含栀子苷的细胞，解决了栀子细胞生长与栀子苷含量下降之间的矛盾，可以在1个月以内获得40-50g/L富含栀子苷的新鲜细胞，培养所得细胞的栀子苷含量是种子细胞中栀子苷含量的2-4倍，且不受自然条件的影响和限制。
说明书附图
图1是栀子仁培养获得1周后获得的含快速生长细胞系的愈伤组织；
图2是栀子仁愈伤组织经秋水仙素处理后获得的含多倍体细胞的愈伤组织；
图3是本发明的技术路线图。
具体实施方式
为了更好理解本发明，通过如下实施例进一步说明，但并不是对本发明的限定。
实施例1：利用栀子仁离体细胞培养富含栀子苷的组织
1、诱导栀子仁愈伤组织
8月中旬到9月上旬收获来自四川等六个不同产地的全青栀子果实，用自来水冲洗栀子种子表面的色素,直至色素冲洗干净,经滤纸吸干,加入70％酒精浸30s,在2％活性氯的次氯酸钠溶液中消毒15min,经无菌水洗涤5次,最后用无菌滤纸吸干球茎表面水分。在超净工作台上,通过无菌操作将消毒处理的栀子种子拨去种皮并用解剖刀将脱皮的种子按横切面切成两半，25℃左右室温下脱分化暗培养7天。
脱分化使用的培养基配制：在MS培养基中添加0.5mg/L的2,4-D、0.25mg/L6-BA，1.5mg/L的辅酶A、30mg/L的蔗糖。
愈伤组织诱导率在95％以上。
2、获得快速生长细胞系
从步骤1)获得的栀子仁愈伤组织中筛选白色或浅黄绿色、质地松脆的愈伤组织，将其用镊子分成米粒大小的颗粒，放入继代培养基进行3次继代培养，每次培养时间10天，愈伤组织颗粒由米粒大小扩增到黄豆粒大小，培养条件为25℃室温下暗培养，获得快速稳定生长细胞系。
继代培养用培养基的配制：在MS培养基的基础上添加1.0mg/L的NAA和2.0mg/L6-BA得到的培养基。
3、获得多倍体细胞
将步骤2)获得的快速生长细胞系接种在添加5mg/L秋水仙碱和0.5mg/L二甲基亚砜的MS液体培养基内，诱导培养得到多倍体细胞系；
培养方式为置于为25℃室温下、100rpm/分转速的摇床中暗培养7天。
经流式细胞仪检测，获得多倍体细胞占细胞总数的47.8-75.4％，说明愈伤组织为嵌合体。
4、多倍体细胞扩增
收集步骤3)得到的多倍体细胞，接种在无秋水仙碱的MS固体培养基中，扩增培养4周，获得大量栀子多倍体细胞；
扩增培养所用的培养基为在MS培养基的基础上添加1.0mg/L6-BA，0.3mg/L的NAA和30mg/的蔗糖，培养方式为固体培养基上静置培养。
5、栀子苷合成培养
步骤4)得到的多倍体细胞接种在合成培养基内，接种量为5％；
步骤5)合成培养所用的培养基在MS液体培养基中添加苯丙氨酸400mg/L，酪氨酸350mg/L，5-氮杂胞苷30uM，蔗糖30g/L，pH调整到6.0；
所用的合成培养条件为25-30℃、100rpm/分转速的摇床中振荡暗培养10天，过滤收集愈伤组织，冷冻干燥后在超低温条件下保存。
经测量，愈伤组织的重量为培养前栀子仁重量的12-15倍。
实施例2利用富含栀子苷的植物组织分离提取栀子苷
栀子愈伤组织中栀子苷含量测定，高效液相色谱(HPLC)测定愈伤组织中栀子苷的含量，与山栀子果中栀子苷的含量和栀子种仁中栀子苷的含量相比，都有显著提升。
下表是不同样本干重中，栀子苷含量的比较。
据文献记录，国内不同产地山栀子仁的栀子苷含量范围在1.17％～7.06％之间,实验证明通过本方法适用于各种栀子组织的培养，可以快速获得栀子苷。
栀子来源 种仁中栀子苷含量(％) 愈伤组织栀子苷含量(％)
云南 8.43 22.35
四川 10.32 38.68
湖北 12.16 30.52
湖南 9.33 28.54
重庆 6.52 19.5
江西 15.6 35.7

Claims (8)

1.一种栀子苷的生产方法，包括如下步骤：
(A)取未成熟的新鲜栀子果实拨开取其种子并消毒，通过无菌操作将消毒处理的种子拨去种皮，并用解剖刀将脱皮的栀子仁按横切面切成两半，脱分化暗培养7-10天；
(B)将愈伤组织中筛选浅黄绿色、质地松脆的愈伤组织进行3次以上继代培养，获得快速稳定生长细胞系；
(C)将快速生长细胞系在添加秋水仙碱的MS液体培养基内，诱导培养得到多倍体细胞系；
(D)将多倍体细胞系接种在无秋水仙碱的MS固体培养基中，行扩增培养获得大量栀子多倍体细胞；
(E)将多倍体细胞接种在合成培养基中培养得到富集栀子苷的细胞；
在此以(A)-(F)来表示这些步骤的先后次序。
2.按照权利要求1所述的方法，其中步骤(A)所述脱分化培养使用的培养基为MS培养基的基础上添加0.5mg/L的2,4-D、0.25mg/L6-BA，1.0-3.0mg/L的辅酶A、30-40mg/L的蔗糖得到。
3.按照权利要求2所述的方法，其中步骤(B)所述继代培养用的培养基为MS培养基的基础上添加1.0-3.0mg/L的NAA和2.0-4.0mg/L6-BA。
4.按照权利要求3所述的方法，其中步骤(C)在诱导培养多倍体细胞系时所添加秋水仙碱的浓度为5-10mg/L，培养方式为置于100rpm/分转速的摇床中暗培养7-10天。
5.按照权利要求3所述的方法，其中步骤(C)在诱导培养多倍体细胞系时，添加秋水仙碱的同时还另添加0.5-2mg/L二甲基亚砜，培养方式为置于100rpm/分转速的摇床中暗培养3-7天。
6.按照权利要求4或5所述的方法，其中步骤(D)扩增培养所用的培养基为在MS培养基的基础上添加1.0-3.0mg/L6-BA，0.3-0.5mg/L的NAA和30mg/的蔗糖。
7.按照权利要求6所述的方法，其中步骤(E)合成培养所用的培养基在MS液体培养基中添加苯丙氨酸400mg/L，酪氨酸350mg/L，5-氮杂胞苷30-60uM，蔗糖30-60g/L，pH调整到5.5-6.6。
8.按照权利要求6所述的方法，其中步骤(E)设定的合成培养条件为25-30℃、100rpm/分转速的摇床中振荡暗培养5-10天。
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