CN101168732A - 一种生产长春花生物碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产长春花生物碱的方法。该方法，包括下述步骤：1)将长春花的外殖体进行脱分化培养得到长春花愈伤组织并经过继代培养获得疏松快速生长的细胞系；2)将步骤1)所获得的长春花愈伤组织细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中诱导培养得到多倍体细胞系，然后进行扩增培养获得大量长春花多倍体细胞；3)将步骤2)得到的长春花多倍体细胞接种于合成培养基中培养得到富含长春花次生代谢产物的细胞。本发明的方法用长春花细胞培养生产长春质碱，可稳定的实现长春质碱的工业化生产，并且其生产成本较低，培养周期短，不受自然环境以及气候的影响，可以实现周年生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产长春花生物碱的方法。
背景技术
长春花(periwinkle)拉丁名为(Catharanthus roseus(L)G.Don)是夹竹桃科中生物碱含量较为丰富的一属。长春花生物碱主要有：Aspicospermatan型如文多灵(Vindoline)等、Ibogan型如长春质碱(Catharanthine)等、Corynanthean型如阿玛碱(Ajmalicine)和蛇根碱(Serpentine)等和Bisindoles型如长春碱(Vinblastine)和长春新碱(Vincristine)等。
五十年代中期，一些学者在研究长春花植物降血糖作用时分别发现长春花植物的提取物还具有降低白血球的作用。1958年，加拿大Noble和Beer等共同分离了这一活性成分，命名为Vinblastine(长春花碱)，并制备了其硫酸盐。
随后美国Lily公司证明了长春花粗生物碱可治疗急性淋巴白血病；长春新碱(Vincristine)具有抗癌作用；并开发了长春花碱和长春新碱，应用于临床。长春花碱在临床上主要用做治疗何杰金氏病以及绒毛膜癌，对乳腺癌效果也较好，长春新碱主要用于治疗儿童急性淋巴白血病和髓白血病，它们同时具有光谱抗癌活性。药理学家证明长春碱和长春新碱的抗癌机理是其与微管蛋白结合，阻滞微管蛋白聚合形成微管和诱导微管解聚，因而使细胞停止在细胞分裂中期而死亡。
目前，长春花碱和长春新碱仍主要从长春花植物中提取，长春花是这些生物碱的唯一来源植物。由于这两种生物碱在植物体内含量很低，分别为十万分之几和百万分之几，且无法用化学合成的方法生产，长春花碱和长春新碱的产量远远不能满足市场的需求，导致市场价格据高不下，实际应用受到很大限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产长春花生物碱的方法。
本发明所提供的生产长春花生物碱的方法，包括下述步骤：
1)将长春花的外殖体进行脱分化培养得到长春花愈伤组织，经过继代培养获得疏松快速生长的细胞系；
2)将步骤1)所获得的长春花愈伤组织细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中诱导培养得到多倍体细胞系，然后进行扩增培养获得大量长春花多倍体细胞；
3)将步骤2)得到的长春花多倍体细胞接种于合成培养基中培养得到富含长春花次生代谢产物的细胞；
所述合成培养基为在基本培养基的基础上中添加1.0-5.0mg/L萘乙酸、30-60g/L蔗糖、10-50mg/L色氨酸、50-200mg/L谷氨酰胺、1.0-3.0mg/L辅酶A、2.1-8.4mg/L萘普生、0.15-0.30mg/L阿司匹林、1.0-5.0mg/L布诺芬得到的培养基。
所述方法中，所述脱分化培养用培养基为基本培养基中添加吲哚乙酸1.0-5.0mg/L，细胞分裂素1.0-5.0mg/L，20-40g/L蔗糖，5.0-7.0g/L琼脂，pH调整为5.5-6.0得到的培养基。
所述方法中，所述长春花外植体为长春花的幼茎、节间或叶片；所述脱分化培养是在18-25℃，光照强度为1000-3000Lux，每日10-16小时照光条件下进行培养3-4周。
所述方法中，所述步骤1)中，所述继代培养用培养基为在基本培养基的基础上添加20-60g/L蔗糖，1.0-5.0mg/L植物细胞生长素NAA和1.0-5.0mg/L植物细胞分裂素6-BA的培养基。
所述方法中，所述继代培养的条件均可为20-25℃，避光条件下培养。
所述方法中，所述步骤2)中，所述秋水仙碱的浓度为10-40mg/L；所述诱导培养是在20-30℃，黑暗条件下，80-120rpm的摇床培养3-7天获得的多倍体细胞群。
所述方法中，所述步骤2)中，还包括在扩增培养前将所述多倍体细胞进行继代驯化培养3代以上。
所述步骤2)中，所述扩增培养基为基本培养基的基础上添加了1.0-5.0mg/L的NAA，1.0-5.0mg/L的6-BA，质量百分含量为2-6％的蔗糖的培养基。
所述方法中，所述基本培养基均为MS培养基。
所述扩增培养是在20-25℃，避光条件下培养3-4周；
所述步骤3)中，所述长春花多倍体细胞的接种质量百分含量为10-30％；
所述步骤3)中，所述合成培养是在20-25℃，避光，80-120rpm/分转速的摇床上振荡培养3-7天；
所述方法中，还包括将所述富含长春花生物碱的细胞用溶剂萃取获得长春花生物碱；所述溶剂为甲醇和/或乙酸乙酯。
本发明的方法合理地解决了长春花细胞生长与长春质碱合成的相互矛盾，可以在3周内获得300g/L新鲜细胞，并利用活细胞作为微反应器，采取代谢调控技术快速促进长春质碱的合成，可以在3-7天内将长春质碱的含量提高到细胞干重的1％以上。本发明的方法用长春花细胞培养生产长春质碱，可稳定的实现长春质碱的工业化生产，并且其生产成本较低，培养周期短，不受自然环境以及气候的影响，可以实现周年生产。
具体实施方式
实施例1、利用长春花离体细胞大规模培养生产长春花生物碱
1、长春花愈伤组织的获得
将长春花的幼茎作为外植体，用70％的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15％次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作台中将幼茎切成2毫米长的茎断，接种到脱分化培养基中，在20001x，12-16小时照光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放在步骤2所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快，质地松软，生长量稳定的细胞系。
脱分化培养基的配制：在MS培养基中，添加吲哚乙酸1.0mg/L，细胞分裂素6-BA1.0mg/L，20g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼脂，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。
2、长春花愈伤组织块的继代驯化培养
将步骤1所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次以上的继代培养，培养条件为20℃室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；
继代驯化培养基的配制：在MS培养基的基础上添加1.0mg/L的植物细胞生长素NAA，1.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA，20g/L蔗糖、6.5g/L琼脂，经115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板继代驯化培养基。
3、长春花多倍体细胞的诱导
在MS培养基中加入10mg/L秋水仙碱(Sigma，C3915)，做成液体诱导培养基，步骤2获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该诱导培养基内，在20℃，避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。
将上述多倍体细胞系接种在下述扩增培养基上，在25℃，黑暗条件下，培养4周后，细胞量可以扩增到5倍以上。
扩增培养基：在MS培养基的基础上，添加蔗糖20g/L，α-萘乙酸(NAA)1.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成扩增培养基。
4、长春花次生代谢产物的合成
将步骤3所述扩增培养的长春花多倍体细胞接种到下述合成培养基内，在25℃，避光条件，100转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养5天，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用。
合成培养基：添加蔗糖40g/L，α-萘乙酸(NAA)1.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L，再添加组合前体(添加色氨酸10mg/L、谷氨酰氨50mg/L)和组合代谢调控物质(添加萘乙酸1.0mg/L、辅酶A 1.0mg/L、萘普生2.1mg/L、阿司匹林0.15mg/L和布诺芬1.0mg/L)，用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基。
在合成培养结束后，收获长春花细胞，冷冻干燥至恒重，充分研磨，再经溶剂甲醇萃取和减压浓缩获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得长春花次生代谢产物长春质碱等化合物，用HPLC进行检测表明细胞的长春质碱含量占细胞干重的1.5％。
实施例2、利用长春花离体细胞大规模培养生产长春花生物碱
1、长春花愈伤组织的获得
将长春花的节间作为外植体，用70％的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15％次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作台中将节间切成2毫米长的茎断接种到脱分化培养基中，在20001x，12-16小时照光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放在步骤2所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快，质地松软，生长量稳定的细胞系。
脱分化培养基的配制：在MS培养基中，添加吲哚乙酸2.0mg/L，细胞分裂素6-BA2.0mg/L，30g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼脂，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。
2、长春花愈伤组织块的继代驯化培养
将步骤1所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次以上的继代培养，培养条件为20℃室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；
继代培养基的配制：在MS培养基的基础上添加2.0mg/L的植物细胞生长素NAA，2.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA，30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂，经115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基。
3、长春花多倍体细胞的诱导
在MS培养基中加入20mg/L秋水仙碱(Sigma，C3915)，做成液体诱导培养基，步骤2获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该诱导培养基内，在20℃，避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。
将上述多倍体细胞系接种在下述扩增培养基上，在25℃，黑暗条件下，培养4周后，细胞量可以扩增到5倍以上。
扩增培养基：在MS培养基的基础上，添加蔗糖30g/L，α-萘乙酸(NAA)2.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)2.0mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成扩增培养基。
4、长春花次生代谢产物的合成
将步骤3所述扩增培养的长春花多倍体细胞接种到下述合成培养基内，在25℃，避光条件，100转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养5天，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用。
合成培养基：添加蔗糖40g/L，α-萘乙酸(NAA)2.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)2.0mg/L，再添加组合前体(添加色氨酸20mg/L、谷氨酰氨75mg/L)和组合代谢调控物质(添加萘乙酸2.0mg/L、辅酶A 1.5mg/L、萘普生4.2mg/L、阿司匹林0.175mg/L和布诺芬2.0mg/L)，用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基。
在合成培养结束后，收获长春花细胞，冷冻干燥至恒重，充分研磨，再经溶剂甲醇萃取和减压浓缩获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得长春花次生代谢产物长春质碱等化合物，用HPLC进行检测表明细胞的长春质碱含量占细胞干重的1.5％以上。
实施例3、利用长春花离体细胞大规模培养生产长春花生物碱
1、长春花愈伤组织的获得
将长春花的叶片作为外植体，用70％的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15％次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作台中将叶片延叶脉切成0.5厘米见方的小块接种到脱分化培养基中，在20001x，12-16小时照光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放在步骤2所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快，质地松软，生长量稳定的细胞系。
脱分化培养基的配制：在MS培养基中，添加吲哚乙酸3.0mg/L，细胞分裂素6-BA3.0mg/L，40g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼脂，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。
2、长春花愈伤组织块的继代驯化培养
将步骤1所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次以上的继代培养，培养条件为20℃室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；
继代培养基的配制：在MS培养基的基础上添加3.0mg/L的植物细胞生长素NAA，3.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA，40g/L蔗糖、6.5g/L琼脂，经115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板继代驯化培养基。
3、长春花多倍体细胞的诱导
在MS培养基中加入30mg/L秋水仙碱(Sigma，C3915)，做成液体诱导培养基，步骤2获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该诱导培养基内，在20℃，避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。
将上述多倍体细胞系接种在下述扩增培养基上，在25℃，黑暗条件下，培养4周后，细胞量可以扩增到5倍以上。
扩增培养基：在MS培养基的基础上，添加蔗糖40g/L，α-萘乙酸(NAA)3.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)3.0mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成扩增培养基。
4、长春花次生代谢产物的合成
将步骤3所述扩增培养的长春花多倍体细胞接种到下述合成培养基内，在25℃，避光条件，100转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养5天，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用。
合成培养基：添加蔗糖40g/L，α-萘乙酸(NAA)3.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)3.0mg/L，再添加组合前体(添加色氨酸30mg/L、谷氨酰氨100mg/L)和组合代谢调控物质(添加萘乙酸3.0mg/L、辅酶A 2.0mg/L、萘普生6.3mg/L、阿司匹林0.20mg/L和布诺芬3.0mg/L)，用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基。
在合成培养结束后，收获长春花细胞，冷冻干燥至恒重，充分研磨，再经溶剂甲醇萃取和减压浓缩获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得长春花次生代谢产物长春质碱等化合物，用HPLC进行检测表明细胞的长春质碱含量占细胞干重的1.6％。
实施例4、利用长春花离体细胞大规模培养生产长春花生物碱
1、长春花愈伤组织的获得
将长春花的叶片作为外植体，用70％的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15％次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作台中将叶片延叶脉切成0.5厘米见方的小块接种到脱分化培养基中，在20001x，12-16小时照光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放在步骤2所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快，质地松软，生长量稳定地细胞系。
脱分化培养基的配制：在MS培养基中，添加吲哚乙酸4.0mg/L，细胞分裂素6-BA4.0mg/L，45g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼脂，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。
2、长春花愈伤组织块的继代驯化培养
将步骤1所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次以上的继代培养，培养条件为20℃室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；
继代培养基的配制：在MS培养基的基础上添加4.0mg/L的植物细胞生长素NAA，4.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA，50g/L蔗糖、6.5g/L琼脂，经115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基。
3、长春花多倍体细胞的诱导
在MS培养基中加入35mg/L秋水仙碱(Sigma，C3915)，做成液体合成培养基，步骤2获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该合成培养基内，在20℃，避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。
将上述多倍体细胞系接种在下述扩增培养基上，在25℃，黑暗条件下，培养4周后，细胞量可以扩增到5倍以上。
扩增培养基：在MS培养基的基础上，添加蔗糖50g/L，α-萘乙酸(NAA)4.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)4.0mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成扩增培养基。
4、长春花次生代谢产物的合成
将步骤3所述扩增培养的长春花多倍体细胞接种到下述合成培养基内，在25℃，避光条件，100转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养5天，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用。
合成培养基：添加蔗糖50g/L，α-萘乙酸(NAA)4.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)4.0mg/L，再添加组合前体(添加色氨酸40mg/L、谷氨酰氨175mg/L)和组合代谢调控物质(添加萘乙酸4.0mg/L、辅酶A 2.5mg/L、萘普生7.6mg/L、阿司匹林0.20mg/L和布诺芬4.0mg/L)，用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基。
在合成培养结束后，收获长春花细胞，冷冻干燥至恒重，充分研磨，再经溶剂甲醇萃取和减压浓缩获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得长春花次生代谢产物长春质碱等化合物，用HPLC进行检测表明细胞的长春质碱含量占细胞干重的1.7％。
实施例5、利用长春花离体细胞大规模培养生产长春花生物碱
1、长春花愈伤组织的获得
将长春花的幼茎作为外植体，用70％的乙醇表面杀菌30-50秒后投放到5-15％次氯酸钠溶液中二次杀菌10-20分钟，然后用无菌水冲洗三次，取出后在超净工作台中将幼茎切成2毫米长的茎断，接种到脱分化培养基中，在20001x，12-16小时照光，25度左右室温下培养3-4周，即可获得白色愈伤组织。再将愈伤组织放在步骤2所述继代驯化培养基中继代培养3次以上，同时筛选得到生长速度快，质地松软，生长量稳定地细胞系。
脱分化培养基的配制：在MS培养基中，添加吲哚乙酸5.0mg/L，细胞分裂素6-BA5.0mg/L，50g/L蔗糖，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，再添加6.5g/L琼脂，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面脱分化培养基。
2、长春花愈伤组织块的继代驯化培养
将步骤1所述诱导形成的愈伤组织细胞系接种在下述继代培养基中进行3次以上的继代培养，培养条件为20℃室温，避光条件，培养周期为3周。在继代培养过程中，筛选出结构疏松以及生长速度较快的愈伤组织进行继代培养；
继代培养基的配制：在MS培养基的基础上添加5.0mg/L的植物细胞生长素NAA，5.0mg/L的植物细胞分裂素6-BA，60g/L蔗糖、6.5g/L琼脂，经115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基。
3、长春花多倍体细胞的诱导
在MS培养基中加入40mg/L秋水仙碱(Sigma，C3915)，做成液体诱导培养基，步骤2获得的结构疏松生长速度较快的愈伤组织接种在该诱导培养基内，在20℃，避光，100rpm/分转速的摇床上振荡培养7天。收集细胞后再接种在无秋水仙碱的继代培养基中，反复驯化培养三次以上，通过生物积累量测定筛选到生长速度更快(生长速度超过5倍接种细胞量/培养周期)的多倍体细胞系；经细胞醋酸洋红或银染色后通过显微检测表明，该细胞系为混合多倍体细胞系。
将上述多倍体细胞系接种在下述扩增培养基上，在25℃，黑暗条件下，培养4周后，细胞量可以扩增到5倍以上。
扩增培养基：在MS培养基的基础上，添加蔗糖60g/L，α-萘乙酸(NAA)5.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)5.0mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成扩增培养基。
4、长春花次生代谢产物的合成
将步骤3所述扩增培养的长春花多倍体细胞接种到下述合成培养基内，在25℃，避光条件，100转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养5天，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用。
合成培养基：添加蔗糖40g/L，α-萘乙酸(NAA)5.0mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)5.0mg/L，再添加组合前体(添加色氨酸50mg/L、谷氨酰氨200mg/L)和组合代谢调控物质(添加萘乙酸50mg/L、辅酶A 3.0mg/L、萘普生8.4mg/L、阿司匹林0.30mg/L和布诺芬5.0mg/L)，用酸或碱将pH值调整到5.8，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基。
在合成培养结束后，收获长春花细胞，冷冻干燥至恒重，充分研磨，再经溶剂甲醇萃取和减压浓缩获得粗提物，再加入二倍体积的乙酸乙酯，用硫酸调pH值为8.0后，迅速摇荡，萃取生物碱三次，减压蒸干后获得长春花次生代谢产物长春质碱等化合物，用HPLC进行检测表明细胞的长春质碱含量占细胞干重的1.7％。
Claims (10)
1.一种生产长春花生物碱的方法，包括下述步骤：
1)将长春花的外殖体进行脱分化培养得到长春花愈伤组织并经过继代培养获得疏松快速生长的细胞系；
2)将步骤1)所获得的长春花愈伤组织细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中诱导培养得到多倍体细胞系，然后进行扩增培养获得大量长春花多倍体细胞；
3)将步骤2)得到的长春花多倍体细胞接种于合成培养基中培养得到富含长春花次生代谢产物的细胞；
所述合成培养基为基本培养基中添加1.0-5mg/L萘乙酸、30-60g/L蔗糖、10-50mg/L色氨酸、50-200mg/L谷氨酰胺、1-3mg/L辅酶A、2.1-8.4mg/L萘普生、0.15-0.30mg/L阿司匹林、1-5mg/L布诺芬得到的培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述脱分化培养用培养基为在基本培养基的基础上添加吲哚乙酸1.0-5.0mg/L，细胞分裂素1.0-5.0mg/L，20-40g/L蔗糖的培养基；所述步骤2)中，所述秋水仙碱的浓度为10-40mg/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述继代培养用培养基为基本培养基中添加20-60g/L蔗糖，1.0-5mg/L植物细胞生长素和1.0-5mg/L植物细胞分裂素的培养基；所述继代培养为继代3代以上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述长春花的外植体为长春花的幼茎、节间或叶片；所述脱分化培养为在18-25℃，光照强度为1000-3000Lux，每日10-16小时照光条件下进行培养3-4周；所述扩增培养用培养基为基本培养基的基础上添加了1.0-5mg/L的NAA，1.0-5mg/L的6-BA，质量百分含量为2-6％的蔗糖而得到的培养基。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于：所述基本培养基为MS培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，还包括在扩增培养前将所述多倍体细胞进行继代驯化培养3代以上。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述诱导培养是在20-30℃，避光，80-120rpm/分转速的摇床上振荡培养3-7天；所述扩增培养是在20-25℃，避光条件下培养3-4周；所述步骤3)中，所述长春花多倍体细胞是在25-30℃，黑暗条件下，80-120rpm的摇床或大型生物反应器培养3-7天得到富含长春花生物碱的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述继代培养的条件为20-25℃，避光条件下培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将所述富含长春花生物碱的细胞用溶剂萃取获得长春花生物碱；所述溶剂为甲醇和/或乙酸乙酯。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述长春花生物碱为长春质碱。
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