CN1332023C - 通过体胚发生途径建立草地早熟禾高效再生体系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以草地早熟禾成熟种子为材料建立其再生体系的方法，主要步骤包括：将无菌种子播于无菌芽床诱导萌发后再诱导产生愈伤组织，经继代培养、胚性愈伤组织诱导培养及植株再生诱导培养获得高频再生植株。培养过程中除植株再生是在含噻重氮苯基脲TDZ的1/2MS培养基上进行的外，其它培养阶段均在含2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和噻重氮苯基脲TDZ(或激动素KT)不同浓度配比的MSM培养基培养。间接诱导愈伤组织可明显提高愈伤组织的诱导率；继代培养过程添加Cu2+，利于改善愈伤组织的生长质量，提高胚性愈伤组织的诱导率，低浓度TDZ、培养基大量元素及蔗糖用量利于提高愈伤组织植物再生能力。

Description

通过体胚发生途径建立草地早熟禾高效再生体系的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过体胚发生途径建立草地早熟禾高效再生体系的方法，属于生物技术和现代农业生物技术领域。
背景技术：
草地早熟禾(P.pratensis L.)为禾本科(Gramineae)早熟禾属(Poa L.)植物，原产欧亚大陆、中亚西亚地区，由于其具有繁殖能力强、再生性好、抗寒、绿期长等特点，是北温带利用最为广泛的优质冷季型草坪草，在我国被广泛应用于园林绿化中，是中国北方城市的首选草坪草。但其明显的不足是抗旱性及耐盐性差，耐高低温能力不强。长期以来，育种工作者一直到致力于这些方面的遗传改良，而草地早熟禾的兼性无融合生殖特性严重限制了传统育种方法对对其进行遗传改良的优势。利用遗传工程可成功地避开传统育种方法的缺陷，并能充分利用草地早熟禾无融合生殖的特性，对其进行性状改良，是培育耐逆性强的草地早熟禾新品种的一条重要途径。
但草地早熟禾遗传转化体系的建立存在很大难度，其主要原因是草地早熟禾的组织培养再生体系尚不完善，再生率偏低，不能满足利用基因工程进行遗传转化的需要。为提高其再生率，国内外许多学者对影响草地早熟禾再生的影响因素进行了研究。Van der Valk等(1989年)对15个早熟禾品种的成熟胚再生性能进行了研究，认为基因型对植株再生影响较大，Jeffrey等(1995年)试验了12个草地早熟禾品种，认为Baron品种成熟种子诱导出的愈伤组织再生能力最强，其再生频率为46％。已报道的研究中，用于诱导愈伤组织的外植体类型主要有成熟胚、幼胚、幼穗、胚芽鞘、茎节、茎尖以及叶片等。Manton(1982)、McDonnel等(1984)、Conges(1984)以及Boyd&Dale(1987)先后报道了草地早熟禾成熟种胚和幼胚的组织培养特性，认为草地早熟禾成熟胚诱导所得愈伤组织的植株再生能力低，最高仅为6％。Griffin&Dibble(1995年)和Hodges(1999)同样利用其成熟种子为外植体建立了植株再生体系，最高诱导率达46％，Wu&Jampates报道了以茎尖为外植体建立了再生体系，但再生率很低。Ke和Lee(1996年)利用胚芽鞘、叶片和茎节为外植体也获得了再生植株，再生率分别为32％、2％、12％。Van等(1989年)用幼穗为外植体高频诱导出了再生植株，再生率达79％，朱根发等(1994年)用幼穗也建立了较高频率的再生体系，再生率为76.92％。但由于草地早熟禾幼穗期较短，取材受季节限制，而成熟种子取材不受季节限制，且易于保存。因此，目前多集中以其成熟种子为外植体，研究进一步完善草地早熟禾再生体系的方法与技术。遗憾的是，迄今为止，以成熟胚为外植体建立高频稳定的再生体系仍不理想。
发明内容：
针对现有技术的不足，本发明以草地早熟禾成熟种子为外植体，利用间接诱导法，将愈伤组织诱导率提高到95％以上，获得的愈伤组织经继代培养及体细胞胚诱导培养后转入植株再生培养基获得了高频稳定的再生体系，为进一步利用基因工程对其进行遗传改良奠定了技术平台。
本发明通过离体培养草地早熟禾成熟种子，建立了再生体系，所获得的再生植株性状均一、稳定，易于遗传工程操作。
本发明所述方法包括四个培养阶段：(1)外植体培养诱导愈伤组织(2)愈伤组织继代培养(3)愈伤组织诱导体细胞胚(4)体细胞胚再生植株，其中(1)(2)为黑暗培养，(3)为200～400勒克斯的弱光培养，光照时间为16h/d，(4)为2000～3000勒克斯的光培养，光照时间为16h/d，整个培养过程，培养温度为20℃～30℃，每培养20天换新鲜培养基。
本发明通过上述四个阶段的培养从草地早熟禾成熟胚外植体诱导出愈伤组织，并从愈伤组织进一步诱导出体细胞胚，通过体细胞胚再生途径得到了再生植株。
本发明所述的间接诱导愈伤组织的方法，其特征是将草地早熟禾种子灭菌后，接种子无菌芽床先进行萌芽诱导，待种子开始萌芽或萌动时，将其转入无菌环境，接种到诱导培养基中黑暗条件下诱导愈伤组织。
本发明各阶段的培养基为第(1)阶段的基本培养基是MS培养基、N6培养基、NB培养基、CC培养基或MSM培养基其中之一，第(2)(3)阶段的基本培养基为MSM，第(4)阶段的基本培养基为1/2MS。四个阶段所用激素为2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、6-苄基氨基腺嘌呤6-BA、噻重氮苯基脲TDZ和激动素KT的组合中选择出的任何一种、两种或三种，在第(1)阶段，愈伤组织的采用间接诱导，在第(2)培养基中还添加Cu2+，第(4)阶段采用的基本培养基为大量元素用量减半的MS培养基，蔗糖为15g/L。
选优为：第(1)(2)(3)三个阶段适合的基本培养基为MSM培养基，第(1)阶段的培养基中所用外源激素及其浓度为：2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～4.0mg/L，噻重氮苯基脲TDZ 0.05mg/L，在第(2)阶段的培养基中所用外源激素及其浓度为：2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 2.0～3.0mg/L与两种促进细胞分裂生长的噻重氮苯基脲TDZ0.02～0.3mg/L或激动素KT0.05～1.0mg/L二者其中之一，在第(3)阶段的培养基中所用外源激素及其浓度为：2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D0.05～0.5mg/L，噻重氮苯基脲TDZ0.01～0.2mg/L，在第(4)阶段的培养基为不使用激素的MS培养基，其大量元素减半，蔗糖用量减至15g/L。其中，在第(2)阶段，继代培养2次，并在培养基中添加了硫酸铜CuSO4 0.4～1.0mg/L，继代培养过程，适量培养TDZ浓度或KT浓度，有助于改善愈伤组织的生长质量，Cu2+对提高体细胞胚诱导率有明显促进作用。
本发明所述的方法具体步骤包括：(1)将草地早熟禾种子用稀释后的洗涤剂洗涤，用流动的自来水充分冲洗后，移入无菌环境用70～75％乙醇和0.1％升汞组合灭菌，再用无菌水冲洗3～5次后，接种于无菌芽床进行萌芽诱导，(2)待种子开始萌芽或萌动时，将其转入无菌环境，对芽体切割后接种到诱导培养基中，黑暗条件下诱导愈伤组织，诱导培养基为添加2.0～4.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培养基；(3)诱导得到的愈伤组织接种于添加2.0～3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.02～0.3mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.5～0.9mg/LCuSO4的培养基，进行两次继代培养，继代周期20天，大部分愈伤组织体积明显增大，其形态结构及色译也发生明显变化，具备胚性愈伤组织的特征；(3)选择胚性愈伤组织接种于添加0.1～1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.05～0.2mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ的培养基；弱光培养，光照强度为200～400勒克斯，(5)诱导得到的体细胞胚接种于仅添加噻重氮苯基脲TDZ0.05～0.3mg/L的培养基，见光培养，光照强度为2000～3000勒克斯。整个培养过程，培养温度为20℃～30℃，每培养20天换一次新鲜培养基。如该方法所述，愈伤组织诱导率达95％以上，植株再生率达80％。
获得的再生植株经炼苗后，用自来水洗净根系上残留的培养基，移栽到蛭石∶泥土为1∶1的基质中遮强光培养1周，移到试验田，其成活率达100％。
附图说明：
图1.草地早熟禾愈伤组织的间接诱导
图2.胚性愈伤组织的诱导
图3.愈伤组织的分化
图4.组培苗的再生
具体实施方式：
在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例1：
培养皿内铺三层滤纸并用0.2％KNO3润湿，将草地早熟禾品种‘优异’(Merit)成熟种子播在该滤纸上，7℃处理7天，进行春化处理。
将经春化处理的种子用稀释后的洗涤剂洗涤，用流动的自来水充分冲洗后，移入无菌环境用75％乙醇灭菌60s后，用0.1％升汞灭菌10min后，再用无菌水冲洗4～6次后，接种于无菌芽床进行萌芽诱导，培养7天后，种子开始萌芽或萌动。
将萌发的和开始萌动的种子转入无菌环境，接种到诱导培养基中，黑暗条件下诱导愈伤组织，诱导培养基为添加2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培养基；暗培养20天调查愈伤组织的诱导率达98.33％。
诱导得到的愈伤组织接种于添加2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.25mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.8mg/LCuSO4的培养基，进行两次继代培养，继代周期20天，大部分愈伤组织体积明显增大，其形态结构及色译也发生明显变化，具备胚性愈伤组织的特征。选择胚性愈伤组织接种于添加0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.05mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ的培养基；在光照强度为400勒克斯的弱光条件下培养40天，产生大量结构疏松、色译鲜黄的硬质颗粒愈伤组织，将其接种于仅添加噻重氮苯基脲TDZ0.1mg/L的1/2MS培养基，见光培养，光照强度为2000～3000勒克斯。整个培养过程，培养温度为25±1℃，每培养20天换一次新鲜培养基。植株再生率达80％。
获得的再生植株经炼苗后，用自来水洗净根系上残留的培养基，移栽到蛭石∶泥土为1∶1的基质中遮强光培养1周，移到试验田，其成活率达100％。
实施例2：
培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于诱导培养基为添加2.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培养基；继代培养基中添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.2mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.6mg/LCuSO4；胚性愈伤组织诱导培养基中添加0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.08mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生诱导培养基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.2mg/L的1/2培养基。所得愈伤组织的诱导率达96.67％，植株再生率为78.3％。
实施例3：
培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于诱导培养基为添加3.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培养基；继代培养基中添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.125mg/L噻重氮苯基脲TDZ；胚性愈伤组织诱导培养基中添加0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生诱导培养基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.25mg/L的1/2培养基。所得愈伤组织的诱导率达97.06％，植株再生率为77.5％。
实施例4：
培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于诱导培养基为添加4.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.03mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培养基；继代培养基中添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.25mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及1.0mg/LCuSO4；胚性愈伤组织诱导培养基中添加0.25mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.10mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生诱导培养基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.25mg/L的1/2培养基。所得愈伤组织的诱导率达99.67％，植株再生率为79.3％。
实施例5：
培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于采用的外植体为草地早熟禾品种‘午夜极品’(Midnight)。诱导培养基为添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培养基；继代培养基中添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.2mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.6mg/LCuSO4；胚性愈伤组织诱导培养基中添加0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.08mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生诱导培养基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.2mg/L的1/2培养基。所得愈伤组织的诱导率达95.06％，植株再生率为75.3％。
实施例6：
培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于采用的外植体为草地早熟禾品种‘百蒂雅’(Bartitia)。诱导培养基为添加3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培养基；继代培养基中添加3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.2mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.6mg/LCuSO4；胚性愈伤组织诱导培养基中添加0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.08mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生诱导培养基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.2mg/L的1/2培养基。所得愈伤组织的诱导率达96.5％，植株再生率为74.86％。
实施例7：
培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于采用的外植体为草地早熟禾品种‘新歌来德’(Nuglode)。各培养阶段的培养基及外源激素等用量同实施例2。所得愈伤组织的诱导率达95.43％，植株再生率为75.46％。
实施例8：
培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于采用的外植体为草地早熟禾品种‘纳苏’(Nassue)。各培养阶段的培养基及外源激素等用量同实施例3。所得愈伤组织的诱导率达96.67％，植株再生率为70.75％。
附表1：
MS基本培养基成分
    组分    成分 含量(mg/L)
大量元素 硝酸铵     1650
硝酸钾     1900
磷酸二氢钾     170
七水合硫酸镁     370
二水合氯化钙     440
微量元素 四水合硫酸锰     22.3
七水合硫酸锌     8.6
硼酸     6.2
碘化钾     0.83
二水合钼酸钠     0.25
六水合氯化钴     0.025
五水合硫酸铜     0.025
有机元素 肌醇     100
烟酸     0.5
盐酸硫胺素     0.1
盐酸吡哆醇     0.5
甘氨酸     2.0
铁盐 七水合硫酸亚铁     27.8
乙二胺四乙酸二钠     37.3
  其它 蔗糖     30000
附表2：
N6基本培养基成分
    组分     成分 含量(mg/L)
大量元素 硫酸铵     460
硝酸钾     2830
磷酸二氢钾     400
七水合硫酸镁     185
二水合氯化钙     166
微量元素 四水合硫酸锰     10
七水合硫酸锌     1.5
硼酸     1.6
碘化钾     0.8
有机元素 甘氨酸     2.0
烟酸     0.5
盐酸硫胺素     1
盐酸吡哆醇     0.5
铁盐 七水合硫酸亚铁     27.8
乙二胺四乙酸二钠     37.3
  其它 蔗糖     50000
附表3：
CC基本培养基成分
    组分     成分 含量(mg/L)
大量元素     硝酸铵     32
    硝酸钾     60.6
    磷酸二氢钾     6.8
    七水合硫酸镁     12.35
    二水合氯化钙     29.4
微量元素     四水合硫酸锰     0.0575
    七水合硫酸锌     0.0288
    硼酸     0.0155
    碘化钾     0
    二水合钼酸钠     0.0012
    六水合氯化钴     0.0000119
    五水合硫酸铜     0.0000125
有机元素     肌醇     0.5
    烟酸     0.03
    盐酸硫胺素     0.0425
    盐酸吡哆醇     0.005
    甘氨酸     0.01
铁盐     七水合硫酸亚铁     27.8
   乙二胺四乙酸二钠     37.3
其它     蔗糖     30000
    麦芽糖     20000
    甘露醇     36430
附表4：
NB基本培养基成分
    组分     成分 含量(mg/L)
大量元素 硝酸铵     0
硝酸钾     141.5
磷酸二氢钾     20
七水合硫酸镁     9.25
二水合氯化钙     8.3
微量元素 四水合硫酸锰     0.05
七水合硫酸锌     0.01
硼酸     0.015
碘化钾     0.00375
二水合钼酸钠     0.00125
六水合氯化钴     0.00125
五水合硫酸铜     0.00125
有机元素 肌醇     0.5
烟酸     0.005
盐酸硫胺素     0.05
盐酸吡哆醇     0.005
甘氨酸     0
谷氨酰胺     500
脯氨酸     500
铁盐 七水合硫酸亚铁     27.8
乙二胺四乙酸二钠     37.3
其它 蔗糖     30000
水解酪蛋白     300
附表5：
MSM基本培养基成分
    组分    成分 含量(mg/L)
大量元素 硝酸铵     1650
硝酸钾     1900
磷酸二氢钾     170
七水合硫酸镁     370
二水合氯化钙     440
微量元素 四水合硫酸锰     22.3
七水合硫酸锌     8.6
硼酸     6.2
碘化钾     0.83
二水合钼酸钠     0.25
六水合氯化钴     0.025
五水合硫酸铜     0.025
有机元素 肌醇     0
烟酸     0
盐酸硫胺素     9.9
盐酸吡哆醇     9.5
尼克酸     4.5
铁盐 七水合硫酸亚铁     27.8
乙二胺四乙酸二钠     37.3
其它 蔗糖     30000
水解酪蛋白     2000

Claims (1)

1.一种建立草地早熟禾再生体系的方法，其特征在于所述的方法具体步骤包括：(1)将草地早熟禾成熟种子用稀释后的洗涤剂洗涤，用流动的自来水充分冲洗后，移入无菌环境，用70～75％乙醇和0.1％升汞组合灭菌，再用无菌水冲洗3～5次后，接种于无菌芽床进行萌芽诱导，待种子开始萌芽或萌动时，将其转入无菌环境，对芽体切割后接种到诱导培养基中，黑暗条件下诱导愈伤组织，诱导培养基为添加2.0～4.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培养基；(2)诱导得到的愈伤组织接种于添加2.0～3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.02～0.3mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.5～0.9mg/LCuSO4的MSM培养基，进行两次继代培养，继代周期20天，获得胚性愈伤组织；(3)选择胚性愈伤组织接种于添加0.1～1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.05～0.2mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培养基，弱光培养，光照强度为200～400勒克斯；(4)诱导得到的体细胞胚接种于仅添加噻重氮苯基脲TDZ0.05～0.3mg/L的1/2MS培养基，蔗糖用量为15g/L，见光培养，光照强度为2000～3000勒克斯，整个培养过程，培养温度为20℃～30℃，每培养20天换一次新鲜培养基。
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CN1596617A (zh) * 2004-08-06 2005-03-23 山东大学 一种建立早熟禾遗传转化体系的方法及应用

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Title
草地早熟禾愈伤组织诱导及植株再生 信金娜等，中国草地，第26卷第4期 2004 *
草地早熟禾成熟胚离体培养植株再生技术的研究 佘建明等，草地学报，第11卷第1期 2003 *
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