CN110447541A - 一种生菜离体培养高频再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生菜离体培养高频再生的方法，将生菜无菌苗的子叶和下胚轴作为外植体离体培养并在出芽培养基上诱导成芽，再将芽转接到生根培养基上大量成苗，所述出芽培养基的主要成分为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 6‑BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，所述生根培养基的主要成分为：MS基本培养基+0.1mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂。本发明的一种生菜离体培养高频再生的方法，采用特定激素配比培养基，培育周期比现有再生体系时间缩短7～10d，外植体分化频率能实现100％，再生成苗率能保证在95％以上，节省了实验及人工成本。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞组织培养技术领域，具体涉及一种生菜离体培养高频再生的方法。
背景技术
植物细胞工程是一种利用离体培养细胞进行遗传操作，实现植物品种改良的生物技术。而植物细胞组织离体培养技术作为开展细胞工程与基因工程研究的基本手段，具有实验条件可控、可重复性强及试管苗长势一致等特点，同时也是获得基因改良植株的技术基础。生菜为菊科莴苣属下的一个变种,富含维生素C和多种矿质元素，是一种食用价值较高的蔬菜类群；同时，该类群具有生长周期短、适宜栽培地广以及栽种条件简单等特性；而且，外源基因在叶片中可被稳定表达，不需要高温处理即可通过消化途径被人体或动物机体有效吸收。因此，生菜已作为植物生物反应器被应用于植物转基因工程中，而建立高效的生菜转基因遗传转化体系的前提条件是建立生菜组织培养高频再生体系。
“申选系列”生菜是上海市农业科学院对生菜的变异株进行多年系统选育得到的耐热、抗性强且品质佳的新品种，其中申选一号生菜为散叶类型，申选四号为半结球奶油生菜类型，在上海郊区及华东地区有一定的推广面积，已于2010年获得上海市农作物品种审定委员会审认定(编号为：沪农品认蔬果2010第014、015号)。
目前，生菜作为一种主要的绿叶菜，除了产量之外其品质也越来越受人们的关注，生菜育种以往都是采用常规方法，即不同形态或类型间杂交，然后自交，在以后自交世代中依据各个性状进行综合选择。生菜几乎没有明显的杂种优势，即使有一定的杂种优势，也由于其花器官甚小，杂交技术难度大，很难应用于生产。因而，生产上推广的品种中很少采用杂交一代，且通过传统杂交育种方式选育生菜新品种面临耗时耗工、性状分离不稳定等系列问题，为了缩短育种年限及更有针对性地改良现有“申选系列”生菜的目的性状获得更优质的新品种，必须依靠细胞与基因工程技术辅助传统选育，而建立“申选系列”生菜不同基因型离体培养高效再生体系是进一步开展生菜细胞工程与转基因研究以及新品种选育的前提和基础。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的现有生菜品种育种过程中年限较长的缺陷，本申请提出一种生菜离体培养高频再生的方法，通过采用特定的激素配比培养基，针对不同的外植体通过通行培养基便可诱导愈伤组织及出芽，比现有再生体系时间能缩短7～10d。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种生菜离体培养高频再生的方法，其特征在于，将生菜无菌苗的子叶和下胚轴离体培养在出芽培养基上诱导成芽，再将芽转接到生根培养基上大量成苗；
所述出芽培养基的主要成分为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；
所述生根培养基的主要成分为：MS基本培养基+0.1mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂。
其优选的技术方案为：
如上所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，具体步骤如下：
(1)无菌接种：将种子转入消毒瓶中，以含量为1～2％的次氯酸钠为表面消毒剂，手动上下振荡10～15min，消毒完成后进入超净工作台倒掉消毒液以无菌水冲洗2～3遍种子，每遍5～8min；沥干水分后接种于MS培养基上；
(2)愈伤组织诱导出芽：无菌苗生长5～7d后，将外植体放置于出芽培养基中诱导愈伤组织及芽分化，培养条件为：温度24～26℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d，于光照培养室中培养；
(3)转接生根：待不定芽形成并伸长达1～2cm，从外植体上剥离脱分化再生成的每个不定芽转移到生根培养基，生根培养的时间为7～10d,培养条件与上述出芽培养基相同；
在将不定芽转移到生根培养基之前，应该将外植体每周继代到出芽培养基一次。
如上所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，无菌接种前，对种子进行如下处理：将干燥的生菜种子以30～40℃的温水浸泡3～4h，直至种子充分吸胀，促进种子的萌发。
如上所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，所述诱导出芽培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.2mg/L的激素NAA和0.5mg/L的激素6-BA，经高压灭菌后分装至培养皿中。
如上所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，所述生根培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.1mg/L的激素IAA，经高压灭菌后分装至培养瓶中。
如上所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，所述外植体为无菌苗的子叶5～8mm切段和下胚轴3～6mm切段；
适宜的外植体对植物组织培养至关重要，不同的外植体诱导效果不同，发育阶段、生理状态、外植体的类型、大小和幼嫩程度及其位置等均能影响外植体细胞全能性和组织器官再生性的表达。目前，关于生菜离体再生方面的研究，大多选择子叶作为外植体且子叶和下胚轴通过间接器官发生途径获得植株再生所需的激素配比不同；
如上所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，培育周期比现有再生体系时间缩短7～10d，这是因为通过出芽培养基直接诱导出愈伤组织并分化出绿色芽点，待芽点生长伸长便可转接到生根培养基，减少了愈伤组织转接不同激素配比培养基诱导出芽的环节。
有益效果：
本发明的一种生菜离体培养高频再生的方法，采用特定的激素配比培养基，选取子叶5～8mm切段和下胚轴3～6mm切段为外植体，避免了外植体过大易污染、过小分化能力弱问题；针对不同的外植体通过一种通行培养基便可诱导愈伤组织及出芽，减少了愈伤组织转接不同激素配比培养基诱导出芽的环节，能在25～30d的短时间内获得大量再生苗，比现有再生体系时间能缩短7～10d，成苗时间短，节省了实验及人工成本，快速高效；不仅如此，采用本发明的方法能够使得外植体出愈率和分化频率实现100％，再生成苗率能保证在95％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种生菜离体培养高频再生的方法，其具体步骤如下：
(1)将干燥的生菜种子以30℃的温水浸泡3h，直至种子充分吸胀；
(2)无菌接种：将种子转入消毒瓶中，以含量为1％的次氯酸钠为表面消毒剂，上下振荡10min，倒掉消毒液以无菌水冲洗2遍种子，每遍5min；沥干水分后接种于MS培养基上，于光照培养室中培养，温度24℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d；
(3)诱导愈伤组织及出芽：待无菌苗生长5d，切取3mm下胚轴和5mm子叶切段作为外植体放置于出芽培养基中诱导愈伤组织及芽分化，注意将子叶切段正面朝上，保证切口与培养基充分接触；培养过程中外植体每两周继代到出芽培养基一次；于光照培养室中培养，温度24℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d；所述诱导出芽培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.2mg/L的激素NAA和0.5mg/L的激素6-BA，经高压灭菌后分装至培养皿中；
(4)转接生根：待不定芽形成并伸长达1cm，从外植体上剥离脱分化再生成的每个不定芽转移到生根培养基，于光照培养室中培养，温度24℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d；所述生根培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.1mg/L的激素IAA，经高压灭菌后分装至培养瓶中；
如上所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，培育周期比现有再生体系时间缩短10d。
实施例2
一种生菜离体培养高频再生的方法，其具体步骤如下：
(1)将干燥的生菜种子以40℃的温水浸泡4h，直至种子充分吸胀；
(2)无菌接种：将种子转入消毒瓶中，以含量为2％的次氯酸钠为表面消毒剂，上下振荡15min，倒掉消毒液以无菌水冲洗3遍种子，每遍8min；沥干水分后接种于MS培养基上，于光照培养室中培养，温度26℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d；
(3)诱导愈伤组织及出芽：待无菌苗生长7d，切取6mm下胚轴和8mm子叶切段作为外植体放置于出芽培养基中诱导愈伤组织及芽分化，注意将子叶切段正面朝上，保证切口与培养基充分接触；培养过程中外植体每两周继代到出芽培养基一次；于光照培养室中培养，温度26℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d；所述诱导出芽培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.2mg/L的激素NAA和0.5mg/L的激素6-BA，经高压灭菌后分装至培养皿中；
(4)转接生根：待不定芽形成并伸长达2cm，从外植体上剥离脱分化再生成的每个不定芽转移到生根培养基，于光照培养室中培养，温度26℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d；所述生根培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.1mg/L的激素IAA，经高压灭菌后分装至培养瓶中；
如上所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，培育周期比现有再生体系时间缩短7d。
实施例3
一种生菜离体培养高频再生的方法，其具体步骤如下：
(1)将干燥的生菜种子以35℃的温水浸泡3.5h，直至种子充分吸胀；
(2)无菌接种：将种子转入消毒瓶中，以含量为1.5％的次氯酸钠为表面消毒剂，上下振荡12min，倒掉消毒液以无菌水冲洗2遍种子，每遍6min；沥干水分后接种于MS培养基上，于光照培养室中培养，温度25℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d；
(3)诱导愈伤组织及出芽：待无菌苗生长6d，切取4mm下胚轴和7mm子叶切段作为外植体放置于出芽培养基中诱导愈伤组织及芽分化，注意将子叶切段正面朝上，保证切口与培养基充分接触；培养过程中外植体每两周继代到出芽培养基一次；于光照培养室中培养，温度25℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d；所述诱导出芽培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.2mg/L的激素NAA和0.5mg/L的激素6-BA，经高压灭菌后分装至培养皿中；
(4)转接生根：待不定芽形成并伸长达1.5cm，从外植体上剥离脱分化再生成的每个不定芽转移到生根培养基，于光照培养室中培养，温度25℃，光照强度2000lx，光照时长为16h/d；所述生根培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.1mg/L的激素IAA，经高压灭菌后分装至培养瓶中。
采用上述的一种生菜离体培养高频再生的方法，培育周期比现有再生体系时间缩短9d。
Claims (7)
1.一种生菜离体培养高频再生的方法，其特征在于，将生菜无菌苗的子叶和下胚轴离体培养并在出芽培养基上诱导成芽，再将芽转接到生根培养基上大量成苗；
所述出芽培养基的主要成分为：MS基本培养基+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；
所述生根培养基的主要成分为：MS基本培养基+0.1mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂。
2.根据权利要求1所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)无菌接种：将种子转入消毒瓶中，以含量为1～2％的次氯酸钠为表面消毒剂，上下振荡10～15min，倒掉消毒液以无菌水冲洗2～3遍种子，每遍5～8min；沥干水分后接种于MS培养基上；
(2)愈伤组织诱导出芽：无菌苗生长5～7d后，将外植体放置于出芽培养基中诱导愈伤组织及芽分化；
(3)转接生根：待不定芽形成并伸长达1～2cm，从外植体上剥离脱分化再生成的每个不定芽转移到生根培养基。
3.根据权利要求2所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，其特征在于，步骤(1)前，对种子进行如下处理：将干燥的生菜种子以30～40℃的温水浸泡3～4h，直至种子充分吸胀。
4.根据权利要求1或2所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，其特征在于，所述诱导出芽培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.2mg/L的激素NAA和0.5mg/L的激素6-BA，经高压灭菌后分装至培养皿中。
5.根据权利要求1或2所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，其特征在于，所述生根培养基的配置方法为：在MS基本培养基中添加含量为0.1mg/L的激素IAA，经高压灭菌后分装至培养瓶中。
6.根据权利要求2所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，其特征在于，所述外植体为无菌苗的子叶5～8mm切段和下胚轴3～6mm切段。
7.根据权利要求1所述的一种生菜离体培养高频再生的方法，其特征在于，培育周期比现有再生体系时间缩短7～10d。
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Cited By (1)
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| CN112841038A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-05-28 | 北京农学院 | 生菜快速组织培养再生的方法 |
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2019
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