CN112841038A - 生菜快速组织培养再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生菜快速组织培养再生的方法，包括：将生菜种子进行消毒处理后，接种到无菌水中培养5天；在生菜种子发芽并在两片子叶完全展开后，将两片子叶的叶尖和叶柄去掉后，将剩下的中间叶片接种到诱导培养基上，诱导培养3～4周；选取诱导培养后长出的完整芽，接种到培养瓶的生根培养基中，生根培养3周，当根长达到移栽标准时，将培养瓶开瓶炼苗得到生菜组培苗，将生菜组培苗移栽管理，即完成生菜组培培养。该方法能够快速、高效的建立生菜完整的组织培养再生的体系，并成功获得了生菜组培苗，提高了种子成活率和生根率，能够短期内生产大量优质再生种苗。
Description
技术领域
本发明涉及生菜培育领域，尤其涉及一种生菜快速组织培养再生的方法。
背景技术
生菜(Lactuca sative L.)为菊科莴苣属植物，原产欧洲地中海沿岸。生菜为一年生或二年生蔬菜，因可以生食而得名，具有很高营养价值，富含蛋白质、纤维、酚类等多种有机物，在食用和药用方面均具有较高的价值，是深受我国人民喜爱的蔬菜之一。随着生菜在世界的推广种植，备受消费者的青睐，已被列为世界菊科植物基因组研究计划。
目前的生菜主要利用种子繁殖，在露天和温室里种植，但这种利用种子繁殖的方式存在繁殖周期长的缺点；而生菜组织培养报道较少，进展缓慢，并没有很好的能在短期内使生菜快速繁殖的生菜组织培养方法。
发明内容
基于现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种生菜快速组织培养再生的方法，能解决现有利用种子繁殖生菜，所存在的繁殖周期长的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明实施例提供一种生菜快速组织培养再生的方法，包括：
将生菜种子进行消毒处理后，接种到无菌水中培养5天；
在所述生菜种子发芽并在两片子叶完全展开后，将两片子叶的叶尖和叶柄去掉后，将剩下的中间叶片接种到诱导培养基上，诱导培养3～4周；
选取诱导培养后长出的完整芽，接种到培养瓶的生根培养基中，生根培养3周，当根长达到移栽标准时，将所述培养瓶开瓶炼苗得到生菜组培苗，将所述生菜组培苗移栽管理，即完成生菜组培培养。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的生菜快速组织培养再生的方法，其有益效果为：
通过以生菜种子为材料，依次进行的消毒、无菌水培养、诱导培养、生根培养和移栽处理，该方法能够快速、高效的繁殖生菜无菌组培苗植株，提高了种子成活率和生根率，能够短期内生产大量优质再生种苗，便于为生菜分子研究提供基础。
具体实施方式
下面结合本发明的具体内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
本发明实施例提供一种生菜快速组织培养再生的方法，是一种能快速培养无菌生菜的方法，构建了菊科生菜完整的组织培养体系，包括：
将生菜种子进行消毒处理后，接种到无菌水中培养5天；
在所述生菜种子发芽并在两片子叶完全展开后，将两片子叶的叶尖和叶柄去掉后，将剩下的中间叶片接种到诱导培养基上，诱导培养3～4周；
选取诱导培养后长出的完整芽，接种到培养瓶的生根培养基中，生根培养3周，当根长达到移栽标准时，将所述培养瓶开瓶炼苗得到生菜组培苗，将所述生菜组培苗移栽管理，即完成生菜组培培养。
上述方法中，作为材料的生菜种子选取饱满、无病虫害的生菜种子。
上述方法中，按以下方式对生菜种子进行消毒处理，包括：
在超净工作台中，将生菜种子放在含有无菌水的组培瓶中浸润6个小时；
然后将浸润后的生菜种子取出用质量浓度5％的次氯酸钠浸泡14min后，再用无菌水浸泡3遍，每遍浸泡1min，即完成生菜种子的消毒处理。
上述方法中，将消毒处理后的生菜种子按以下方式接种到无菌水中培养5天，包括：
将消毒处理后的生菜种子放置在含有无菌水的培养皿中发芽；
每天温度控制为白天22℃，夜晚17℃，光照控制为光照16h，黑暗8h。
上述方法中，将剩下的中间叶片接种到诱导培养基上，先在黑暗条件下培养3天，再进行诱导培养3～4周。
上述方法中，无菌水为高压灭菌后的水。
上述方法中，所用的诱导培养基的组成成分为：纯水、MS(Murashige and Skoog培养基；chembase产品)、6-BA溶液(6-Benzylamino-purine母液浓度为1mg/mL)、NAA溶液(1-naphthylacetic acid母液浓度为1mg/mL)、蔗糖和琼脂；
每1L诱导培养基含有：MS 4.33g、6-BA溶液100μL、NAA溶液100μL、蔗糖30g和琼脂7g，将上述各组分定容至1L纯水中，进行高压灭菌即得到该诱导培养基。
所述诱导培养基的pH为6.0。
上述方法中，所述生根培养基的组成成分为：纯水、MS(Murashige and Skoog培养基；chembase产品)、NAA溶液(1-naphthylacetic acid母液浓度为1mg/mL)、蔗糖和琼脂；
每1L生根培养基中含有：MS 2.17g、NAA溶液100μL、蔗糖30g和琼脂7g，将上述各组分定容至1L纯水中，再进行高压灭菌即得到该生根培养基。
所述生根培养基pH为5.8。
上述方法中，将所述生菜组培苗从培养瓶中移栽至温室中完成移栽管理。
本发明通过对生菜种子消毒时间进行检验，对诱导培养基和生根培养基进行筛选，并对移栽进行了摸索，建立了生菜这一草本作物完整的组织培养再生的体系，成功获得了生菜组培苗，在无菌条件下缩短生菜生长发育周期，能够快速、高效的繁殖生菜无菌组培苗植株，提高了种子成活率和生根率，短期内能够生产大量优质再生种苗，并适用于生菜分子机理研究进一步应用，为后续的生菜分子研究提供试验基础。
下面对本发明实施例具体作进一步地详细描述。
本发明主要是将生菜种子进行消毒处理，接种到诱导培养基上培养上，培养3～4周；选取生长健壮的芽，接种到生根培养基中，培养3周；当生根率达到一定数量，根长达到移栽标准，即可将将组培苗移栽管理，构建生菜完整的组织培养再生体系。
实施例
本实施例提供一种生菜快速组织培养再生的方法，包括以下步骤：
步骤1，生菜种子处理：
首先在超净工作台中，将种子放在含有无菌水的组培瓶中浸润6个小时，然后将种子取出进行消毒处理；对该种子用5％次氯酸钠浸泡14min，随后用无菌水浸泡3遍，每遍浸泡1min，随后将该种子放置在含有无菌水的培养皿中，让种子在无菌水条件中发芽。每天温度控制在白22℃/晚17℃；光照控制在光16h/暗8h；
上述步骤1中，选取生菜饱满无病虫害的种子，首先在超净工作台中，将种子放在含有无菌水的组培瓶中浸润6个小时，然后将种子取出进行消毒处理；分别用75％的乙醇和5％NaClO溶液进行消毒处理，其中处理14min的质量浓度5％NaClO溶液，无菌率达高100％，发芽率高达95％。
表1不同消毒浓度对生菜种子发芽的影响
注：不同小写字母表示在0.05水平上差异不显著。
步骤2，启动培养：
将准备好的材料接种到诱导培养基A1上培养上，其中诱导培养基A1为：MS 4.33g/L+6-BA 100μL+NAA 100μL+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，愈伤状态较较好，生芽率高，分化效果良好；出芽率高达95％，确定为最佳诱导培养基。
下表2为本发明的诱导培养基A1与其它几种诱导培养基A2-A7的对比
表2不同激素组合对生菜出芽诱导的影响
注：不同小写字母表示在0.05水平上差异不显著。
步骤3，生根培养：
待叶片长至2cm以上时，通过无菌条件下取出选取生长健壮的芽，接种到生根培养基中，生根培养基C5为：1/2MS 2.17g/L+NAA 100μL+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，生根率高达100％，高于另外几种生根培养基，确定为最佳生根培养基。
下表3为本发明的生根培养基C5与其它几种生根培养基C1-C4、C6的对比
表3不同激素浓度对生菜生根的影响
| 培养基 | 6-BA(μL) | NAA(μL) | 生根率％ |
| C1 | 50 | 50 | 5d |
| C2 | 50 | 100 | 85b |
| C3 | 50 | 200 | 50c |
| C4 | - | 50 | 70b |
| C5 | - | 100 | 100a |
| C6 | - | 200 | 75b |
步骤5，移栽：
当生根率达到一定数量，当根系健壮，根长达到移栽标准，最后将组培苗移栽管理。
本发明以生菜种子作为组织培养再生的材料，设计不同浓度梯度的种子消毒时间，在含有不同激素的培养基上进行组织培养再生的研究，构建了生菜完整的组培快繁体系，该体系能够快速、高效的繁殖生菜组培苗植株，并能够提高了种子成活率和生根率，能够短期内生产大量优质再生种苗，能够为今后的生菜分子机理研究的进一步的研究提供基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种生菜快速组织培养再生的方法，其特征在于，包括：
将生菜种子进行消毒处理后，接种到无菌水中培养5天；
在所述生菜种子发芽并在两片子叶完全展开后，将两片子叶的叶尖和叶柄去掉后，将剩下的中间叶片接种到诱导培养基上，诱导培养3～4周；
选取诱导培养后长出的完整芽，接种到培养瓶的生根培养基中，生根培养3周，当根系完整且根长达到移栽标准时，将所述培养瓶开瓶炼苗得到生菜组培苗，将所述生菜组培苗移栽管理，即完成生菜组培培养。
2.根据权利要求1所述的生菜快速组织培养再生的方法，其特征在于，所述方法中，按以下方式对生菜种子进行消毒处理，包括：
在超净工作台中，将生菜种子放在含有无菌水的组培瓶中浸润6个小时；
然后将浸润后的生菜种子取出用质量浓度5％的次氯酸钠浸泡14min后，再用无菌水浸泡3遍，每遍浸泡1min，即完成生菜种子的消毒处理。
3.根据权利要求1或2所述的生菜快速组织培养再生的方法，其特征在于，所述方法中，将消毒处理后的生菜种子按以下方式接种到无菌水中培养5天，包括：
将消毒处理后的生菜种子放置在含有无菌水的培养皿中发芽；
每天温度控制为白天22℃，夜晚17℃，光照控制为光照16h，黑暗8h。
4.根据权利要求1或2所述的生菜快速组织培养再生的方法，其特征在于，所述方法中，将剩下的中间叶片接种到诱导培养基上，先在黑暗条件下培养3天，再进行诱导培养3～4周。
5.根据权利要求1或2所述的生菜快速组织培养再生的方法，其特征在于，所述无菌水为高压灭菌后的水。
6.根据权利要求1或2所述的生菜快速组织培养再生的方法，其特征在于，每1L诱导培养基含有：MS 4.33g、6-BA溶液100μL、NAA溶液100μL、蔗糖30g和琼脂7g，将上述各组分定容至1L纯水中，进行高压灭菌即得到该诱导培养基；
该诱导培养基的pH为6.0。
7.根据权利要求1或2所述的生菜快速组织培养再生的方法，其特征在于，每1L生根培养基中含有：1/2MS 2.17g、NAA溶液100μL、蔗糖30g和琼脂7g，将上述各组分定容至1L纯水中，再进行高压灭菌即得到该生根培养基；
所述生根培养基的pH为5.8。
8.根据权利要求1或2所述的生菜快速组织培养再生的方法，其特征在于，所述方法中，将所述生菜组培苗从培养瓶中移栽至温室中完成移栽管理。
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