CN103053419B - 一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其中，包括如下步骤：A、消毒烟草种子的步骤；B、培育无菌种子苗的步骤；C、剪切无菌种子苗的步骤：D、配置若干待选生根培养基的步骤；E、筛选最优生根培养基的步骤。本发明工艺简单、节工省时、经济可靠，能够有效缩短筛选周期、简化筛选程序、节省筛选材料，直接利用种子在培养皿中获取无菌种子苗材料，直接进入生根筛选阶段，比常规筛选试验省略了培养不定芽的繁琐，节省了人力、物力与时间。且使用烟草无菌苗对培养基进行筛选，可以与愈伤组织诱导同时开展，加快了试验进度。此外，采用此种方法与不定芽筛选生根培养在诱导效果上表现一致。

Description

一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法

技术领域：

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法。

背景技术：

植物组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段，同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的理想途径。通常的植物组织培养需要经历愈伤组织-芽-小苗-生根的过程，如：中国专利申请2008101469482公开的落羽杉离体快速繁殖方法，其直接选用种子作为外植体，接着利用种子诱导不定芽，接着诱导生根培育壮苗，在诱导生根时直接选用了培养基。再如：中国专利申请2005100298416公开的一种蚕豆离体培养方法，其选用蚕豆种子培育出无菌种子苗，利用种子苗克隆3代群体后经环境胁迫筛选后进行诱导生根，诱导生根时也直接选用了培养基。

在诱导生根的过程中，如何优化或筛选最优的生根培养基是重要的，其直接影响组培苗的质量和移栽成活率。以烟草组织培养为例。烟草组织培养快速繁殖成苗过程大致经历愈伤组织的形成、不定芽的诱导、不定芽生根成苗三个阶段，其中不定芽的诱导生根直接影响组培苗的质量和移栽成活率，是影响快速繁殖的重要环节，也是烟苗移栽成活和集约化育苗生产技术体系的关键技术。有关烟草组织培养已有不少报道，近年来在培养基的优化、悬浮培养细胞体系和原生质体培养等方面也取得一些进展。但是当前诱导烟草组培苗生根过程中仍存在生根时间长，根系活力低、移栽成活率低等诸多问题，其中生根培养基是造成上述问题的关键因素之一。同时，生根培养基的筛选工作繁琐、周期长、和试验材料的浪费进一步限制了生根培养基筛选过程及条件的优化。为了优化烟草组培苗生长的培养基筛选方法，需要选择合适的生根材料和筛选方法，筛选出适合烟草不定芽生根条件的最佳培养基。

目前，烟草组培苗生根培养基的筛选主要选用愈伤组织诱导产生的不定芽作为生根鉴定材料，上述方法具有直接性，有效性、可靠性强等优点，但需要经历组培的前2个阶段获得鉴定材料才能开展筛选，存在周期长、程序复杂等缺点。而且，与上述现有技术相比，烟草种子十分小，仅有蚕豆或落羽杉种子的几百分之一，其产生的无菌种子苗也非常小、通过去掉小苗的根后，小苗茎部对培养基十分敏感、须根据其对培养基的反应程度和能否再次生根及其生根情况确定是否适合作为组培中不定芽的生根培养基。

因此，研究一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法来解决这种技术问题，一方面为缩短筛选生根培养基的时间和明确培养基因子对根系生长的影响，另一方面简化筛选程序和节省试验材料。鉴于这种技术问题，迫切需要形成一种工艺简单、节工省时、经济可靠，能够有效缩短筛选周期、简化筛选程序、节省筛选材料的一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种工艺简单、节工省时、经济可靠，能够有效缩短筛选周期、简化筛选程序、节省筛选材料的一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其中，包括如下步骤：

A、消毒烟草种子的步骤；

B、培育无菌种子苗的步骤；

C、剪切无菌种子苗的步骤：

D、配置若干待选生根培养基的步骤；

E、筛选最优生根培养基的步骤。

步骤A具体为：

选取籽粒饱满的未包衣的烟草种子120～150粒置于培养皿中，加入经质量百分比浓度为75％乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次；再用质量百分比浓度为0.1％HgCl₂溶液浸泡5～7min，再用无菌水冲洗4～5次，即获取消毒的烟草种子。

步骤B具体为：

用无菌镊子将步骤A所得消毒的烟草种子接种于含蔗糖1.5～3％、琼脂0.3～0.5％、pH5.6～6.0培养基的培养皿中，种子间距0.5～0.7cm，培养皿中的培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1.2～1.5cm，培养基在121℃湿热灭菌15-20min；最后将接种好的培养皿置于25-28℃、12h光照/d、无菌环境中培养7～10d；得无菌种子苗，直至无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖。

步骤C具体为：

无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖时，在超净工作台内用无菌剪刀沿无菌种子苗茎基部剪断，使带子叶部分长度控制在1.0～1.2cm，然后置于干燥无菌的滤纸上备用。

步骤D具体为：

配制若干待选的生根培养基，培养基硬度以无菌种子苗茎部能顺利进入为准，然后分别装入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121℃湿热灭菌15～20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固；用无菌水湿润无菌枪型镊子顶部，然后用湿润后镊子的顶部吸附无菌滤纸上的无菌种子苗绿色子叶，将其夹取到三角瓶内培养基的正中央，使无菌种子苗的茎1/3部分浸入培养基中，完成后用封口膜封口，于25～28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上。

步骤E具体为：

根据烟苗根是否长进生根培养基中，以及生根培养基中根的长度、数量、根系活力及干物质积累量的情况，鉴定出适合于烟草的最佳生根培养基。

步骤B中进一步包括配置培养基的步骤：

以配置1L培养基为准：先在烧杯中放入蒸馏水，接着称取20～30g蔗糖倒入烧杯，搅拌溶解，再加蒸馏水用量筒定溶至1L；用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调节pH5.6～6.0；然后称取3～5g琼脂粉(强度：1300g/cm²)，倒入上述配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化，稍微冷却后，分装入培养皿中，再装入培养基，培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1.2～1.5cm，接着放入消毒灭菌锅灭菌，在121℃湿热灭菌15～20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固。

步骤D中配置的若干待选的生根培养基为：

1/2MS、1/2MS+0.5g活性炭、1/2MS+1.5g活性炭、1/2MS+2.5g活性炭、MS、MS+0.5g活性炭、MS+1.5g活性炭、MS+2.5g活性炭。

步骤D中若干待选的生根培养基中进一步添加有生长激素NAA0.1-0.3(mg/L)。

所述烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法在筛选其他植物的不定芽生根培养基中的应用。

本发明的优点为：工艺简单、节工省时、经济可靠，能够有效缩短筛选周期、简化筛选程序、节省筛选材料，具体为：

1、直接利用种子在培养皿中获取无菌种子苗材料，直接进入生根筛选阶段，比常规筛选试验省略了培养不定芽的繁琐，节省了人力、物力与时间。通常常规筛选试验需要严格实验室条件和较大工作量。

2、使用烟草无菌苗对培养基进行筛选，可以与愈伤组织诱导同时开展，并且在短时间内可以完成大量培养基的筛选，在愈伤组织产生不定芽之前就能获取最佳的生根培养基，加快了试验进度。

3、采用此种方法与不定芽筛选生根培养在诱导效果上表现一致。

附图说明：

图1为本发明的筛选方法的流程示意图。

具体实施方式：

实施例一、如图1所示，为本发明的筛选方法的流程示意图。

其中，烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，如下：

A、消毒烟草种子的步骤；

B、培育无菌种子苗的步骤；

C、剪切无菌种子苗的步骤：

D、配置若干待选生根培养基的步骤；

E、筛选最优生根培养基的步骤。

步骤A具体为：选取籽粒饱满的未包衣的烟草种子150粒置于培养皿中，(选用净叶黄烟种)加入经质量百分比浓度为75％乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次；再用质量百分比浓度为0.1％HgCl₂溶液浸泡7min，再用无菌水冲洗5次，即获取消毒的烟草种子。

步骤B具体为：用无菌镊子将步骤A所得消毒的烟草种子接种于含蔗糖3％、琼脂0.5％、pH6.0培养基的培养皿中，种子间距0.5cm，培养皿中的培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1.2cm，培养基在121℃湿热灭菌15min；最后将接种好的培养皿置于28℃、12h光照/d、无菌环境中培养10d；得无菌种子苗，直至无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖。

步骤B中进一步包括配置培养基的步骤：

以配置1L培养基为准：先在烧杯中放入蒸馏水，接着称取30g蔗糖倒入烧杯，搅拌溶解，再加蒸馏水用量筒定溶至1L；用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调节pH6.0；然后称取5g琼脂粉(强度：1300g/cm²)，倒入上述配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化，稍微冷却后，分装入培养皿中，再装入培养基，培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1.2cm，接着放入消毒灭菌锅灭菌，在121℃湿热灭菌15min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固。

步骤C具体为：无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖时，在超净工作台内用无菌剪刀沿无菌种子苗茎基部剪断，使带子叶部分长度控制在1.0～1.2cm，然后置于干燥无菌的滤纸上备用。

步骤D具体为：配制若干待选的生根培养基，培养基硬度以无菌种子苗茎部能顺利进入为准，然后分别装入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121℃湿热灭菌15min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固；用无菌水湿润无菌枪型镊子顶部，然后用湿润后镊子的顶部吸附无菌滤纸上的无菌种子苗绿色子叶，将其夹取到三角瓶内培养基的正中央，使无菌种子苗的茎1/3部分浸入培养基中，完成后用封口膜封口，于25～28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上。

步骤D中配置的若干待选的生根培养基为：

1/2MS、1/2MS+0.5g活性炭、1/2MS+1.5g活性炭、1/2MS+2.5g活性炭、MS、MS+0.5g活性炭、MS+1.5g活性炭、MS+2.5g活性炭。

步骤D中若干待选的生根培养基中进一步添加有生长激素NAA0.1-0.3(mg/L)。

步骤E具体为：根据烟苗根是否长进生根培养基中，以及生根培养基中根的长度、数量及干物质积累量的情况，鉴定出适合于烟草的最佳生根培养基。

筛选结果如下表：

表1不同培养基诱导不定芽生根的效果影响

通过表1烟草无菌种子苗单株根条数、单株根总长、单株根干重在培养基中的表现得出，8种培养基中诱导生根效果较优为1/2MS培养基。

实施例二，筛选方法如下

a.选取籽粒饱满的未包衣Beinhart1000-1烟草种子140粒置于培养皿中，加入经75％乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次；再用0.1％HgCl2溶液浸泡7min，无菌水冲洗5次，即获取消毒的烟草种子。

b.用无菌镊子将消毒的烟草种子接种于含蔗糖2％、琼脂0.4％、pH6.0培养基的培养皿中，种子间距0.7cm，培养皿中培养基上表面距培养皿上盖的距离应控制在1.5cm，培养基在121℃湿热灭菌20min；最后将接种好的培养皿置于28℃、12h光照/d、无菌环境中培10d；待种子苗的两片子叶触到培养皿上盖即可。

以配置1L上述培养基为例，按顺序进行如下操作：

先在烧杯中放入一些蒸馏水，称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。加蒸馏水用量筒定溶至1L。用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调节6.0；然后称取5g琼脂粉(强度：1300g/cm2)，倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化，稍微冷却后，分装入培养皿中，装入培养基体积符合培养基上表面距培养皿上盖的距离应控制在1.5cm即可，放入消毒灭菌锅灭菌，在121℃湿热灭菌20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固。

c.无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖时在超净工作台内用无菌剪刀沿无菌种子苗茎基部剪断，使带子叶部分长度控制在1.0cm，然后置于干燥无菌的滤纸上备用。

d：配制需要筛选的生根培养基，培养基硬度应使无菌苗茎部能顺利进入而不折断为好，然后分别装入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121℃湿热灭菌15～20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固；用无菌水湿润无菌枪型镊子顶部，然后用湿润后镊子的顶部吸附无菌滤纸上的无菌种子苗绿色子叶，将其夹取到三角瓶内培养基的正中央，使无菌种子苗的茎1/3部分浸入培养基中，完成后用封口膜封口，于28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上；配置的若干待选的生根培养基为：1/2MS、1/2MS+0.5g活性炭、1/2MS+1.5g活性炭、1/2MS+2.5g活性炭、MS、MS+0.5g活性炭、MS+1.5g活性炭、MS+2.5g活性炭。若干待选的生根培养基中进一步添加有生长激素NAA0.1-0.3(mg/L)。

根据烟苗根是否长进培养基中，以及培养基中根的长度、数量及干物质积累量等情况，鉴定出适合于烟草不定芽生根的最佳培养基。

筛选结果如下表：

表2培养基中生长激素和活性炭对诱导生根的影响

通过表2烟草无菌种子苗单株根条数、单株根总长、单株根干重在培养基中的表现得出，4种培养基中诱导生根效果较优为0.2mg/L的T2培养基。

实施例三、

对比试验(一)，方法：外植体-愈伤诱导不定芽-不定芽生根--成苗。

选取籽粒饱满的烟草云85种子，经70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3次；再用0.1％HgCl2溶液浸泡7～9min，无菌水冲洗4～5次，接种于附加蔗糖2％、琼脂0.6％、不含激素的MS基本培养基上，置于25±0.5℃恒温培养箱中使其萌发。取适宜苗龄的无菌种子苗作为供试材料。

愈伤组织诱导分化培养以2/3MS为基本培养基，附加蔗糖3Og/L、琼脂5.5g/L，激素：6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L，培养基PH调至5.8，在121～126℃恒温灭菌20min，当无菌苗长至四叶一心时，取植株上的茎尖分别接种于相应的培养基上。培养温度为24-26℃，每日光照14h。

利用不定芽筛选生根培养基：试验材料为上述试验中愈伤组织分化出来的不定芽。培养基(x因素)：X1(MS)、X2(1/2MS)；活性碳(y因素)：Y。(0g)、Y1(0.5g)、Y2(1.0g)、Y3(1.5g)；激素(z因素)：Z(NAA0.2mg/L)。培养基附加蔗糖30g、琼脂5.5g，PH调至5.8，在121～126℃恒温灭菌20min，培养温度为24-26℃，每日光照14h。具体如表3所示，

表3实验处理设置

测定项目：

诱导不定芽生根：20天后各处理调查不定芽和无菌苗新根数、新根总长、新根干重。

结果：

不同培养基诱导不定芽生根的效果影响

由表4可以看出，在MS培养基中不加活性碳烟草不定芽新根数、新根总长、新根干重均最高，而随着活性碳用量增加。烟草不定芽新根数、新根总长、新根干重均呈下降趋势。1/2MS培养基结论与MS培养基相近。MS培养基中单株生根条数比1/2MS培养基小，但新根总长和单株根干重比1/2MS培养基高。活性碳用量0.5g与0g不定芽单株根干重差异不大，但用量达2.5g时与0g表现出明显差异。

表4不同培养基诱导不定芽生根的效果影响

培养基中生长激素和活性炭对诱导不定芽生根的影响

由表4可见，1/2MS和1/2MS+NAA0.2mg/L培养基在诱导生根率和单株生根条数上有较大差异，但是前者根质量较后者好。活性炭对烟草生根有明显的抑制作用，在具体生产实际中尽量避免活性炭的使用，同时在培养基中加入适量的激素以保证组培苗能有多而且健壮的根系。

对比试验二、方法：无菌种子苗筛选生根培养基-不定芽生根--成苗

a.选取籽粒饱满的未包衣云烟85种子120粒置于培养皿中，加入经75％乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次；再用0.1％HgCl2溶液浸泡5min，无菌水冲洗4次，即获取消毒的烟草种子。

b.用无菌镊子将消毒的烟草种子接种于含蔗糖1.5％、琼脂0.3％、pH5.6培养基的培养皿中，种子间距0.7cm，培养皿中培养基上表面距培养皿上盖的距离应控制在1.5cm，培养基在121℃湿热灭菌20min；最后将接种好的培养皿置于25℃、12h光照/d、无菌环境中培养7d；待种子苗的两片子叶触到培养皿上盖即可。

以配置1L上述培养基为例，按顺序进行如下操作：

先在烧杯中放入一些蒸馏水，称取20g蔗糖倒入，搅拌溶解。加蒸馏水用量筒定溶至1L。用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调节pH5.6；然后称取3g琼脂粉(强度：1300g/cm2)，倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化，稍微冷却后，分装入培养皿中，装入培养基体积符合培养基上表面距培养皿上盖的距离应控制在1.5cm即可，放入消毒灭菌锅灭菌，在121℃湿热灭菌20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固。

c.无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖时在超净工作台内用无菌剪刀沿无菌种子苗茎基部剪断，使带子叶部分长度控制在1.2cm，然后置于干燥无菌的滤纸上备用。

d：配制需要筛选的生根培养基，培养基硬度应使无菌苗茎部能顺利进入而不折断为好，然后分别装入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121℃湿热灭菌20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固；用无菌水湿润无菌枪型镊子顶部，然后用湿润后镊子的顶部吸附无菌滤纸上的无菌种子苗绿色子叶，将其夹取到三角瓶内培养基的正中央，使无菌种子苗的茎1/3部分浸入培养基中，完成后用封口膜封口，于25℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上；根据烟苗根是否长进培养基中，以及培养基中根的长度、数量、根系活力及干物质积累量等情况，鉴定出适合于烟草不定芽生根的最佳培养基。

筛选结果如下表：

表5不同培养基诱导种子无菌种子苗生根的效果影响

通过表5烟草无菌种子苗单株根条数、单株根总长、单株根干重在培养基中的表现得出，8种培养基中诱导生根效果较优为1/2MS培养基。

对比实验一与对比试验二比较结论

综上所述，本发明直接利用种子在培养皿中获取无菌种子苗材料，直接进入生根筛选阶段，比常规筛选试验省略了培养不定芽的繁琐，节省了人力、物力与时间。通常常规筛选试验需要严格实验室条件和较大工作量。使用烟草无菌苗对培养基进行筛选，可以与愈伤组织诱导同时开展，并且在短时间内可以完成大量培养基的筛选，在愈伤组织产生不定芽之前就能获取最佳的生根培养基，加快了试验进度。采用此种方法筛选的生根培养基与不定芽筛选生根培养在诱导生根效果上表现一致。所以，本发明能直接从烟草种子为材料筛选出适合于烟草组培中不定芽生根的培养基，这种方法工艺简单、节工省时、经济可靠，能够有效缩短筛选周期、简化筛选程序。

Claims (4)

1.一种利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、消毒烟草种子的步骤；

B、培育无菌种子苗的步骤；

C、剪切无菌种子苗的步骤：

D、配置若干待选生根培养基的步骤；

E、筛选最优生根培养基的步骤；

步骤A具体为：

选取籽粒饱满的未包衣的烟草种子120～150粒置于培养皿中，加入经质量百分比浓度为75％乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次；再用质量百分比浓度为0.1％HgCl₂溶液浸泡5～7min，再用无菌水冲洗4～5次，即获取消毒的烟草种子；

步骤B具体为：

用无菌镊子将步骤A所得消毒的烟草种子接种于含蔗糖1.5～3％、琼脂0.3～0.5％、pH5.6～6.0培养基的培养皿中，种子间距0.5～0.7cm，培养皿中的培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1.2～1.5cm，培养基在121℃湿热灭菌15-20min；最后将接种好的培养皿置于25-28℃、12h光照/d、无菌环境中培养7～10d；得无菌种子苗，直至无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖；

步骤C具体为：

无菌种子苗的两片子叶触到培养皿上盖时，在超净工作台内用无菌剪刀沿无菌种子苗茎基部剪断，使带子叶部分长度控制在1.0～1.2cm，然后置于干燥无菌的滤纸上备用；

步骤D具体为：

配制若干待选的生根培养基，培养基硬度以无菌种子苗茎部能顺利进入为准，然后分别装入250mL的三角瓶中，每瓶50mL，在121℃湿热灭菌15～20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固；用无菌水湿润无菌枪型镊子顶部，然后用湿润后镊子的顶部吸附无菌滤纸上的无菌种子苗绿色子叶，将其夹取到三角瓶内培养基的正中央，使无菌种子苗的茎1/3部分浸入培养基中，完成后用封口膜封口，于25～28℃、12h光照/d培养条件下，培养14d以上；

步骤E具体为：

根据烟苗根是否长进生根培养基中，以及生根培养基中根的长度、数量、根系活力及干物质积累量的情况，鉴定出适合于烟草的最佳生根培养基。

2.根据权利要求1所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤B中进一步包括配置培养基的步骤：

以配置1L培养基为准：先在烧杯中放入蒸馏水，接着称取20～30g蔗糖倒入烧杯，搅拌溶解，再加蒸馏水用量筒定容至1L；用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调节pH5.6～6.0；然后称取3～5g强度为1300g/cm²的琼脂粉，倒入上述配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化，稍微冷却后，分装入培养皿中，再装入培养基，培养基上表面距培养皿上盖的距离控制在1.2～1.5cm，接着放入消毒灭菌锅灭菌，在121℃湿热灭菌15～20min，灭菌后从灭菌锅中取出培养皿置于超净工作台令其冷却凝固。

3.根据权利要求1所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤D中配置的若干待选的生根培养基为：

1/2MS、1/2MS+0.5g活性炭、1/2MS+1.5g活性炭、1/2MS+2.5g活性炭、MS、MS+0.5g活性炭、MS+1.5g活性炭、MS+2.5g活性炭。

4.根据权利要求1所述利用烟草无菌种子苗筛选生根培养基的方法，其特征在于，步骤D中若干待选的生根培养基中进一步添加有生长激素NAA0.1-0.3mg/L。