CN102007867B - 一种油茶无性系组培苗生根方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种通过组织培养快速繁殖获得大量生根的油茶无性系完整植株的技术，包括继代培养基的筛选及激素配比、壮苗培养基的筛选及激素配比、生根预处理、生根培养基的筛选及激素配比的过程。其中继代培养基采用WPM+BA3-7mg/L+IBA0.1-2mg/L+ZT0.05-2mg/L进行增殖，增殖周期缩短至30-40天，增殖系数达4.2-9.1；采用WPM+IBA0.1-2mg/L+生物素0.5-3mg/L进行壮苗，20-25d苗木即可用于生根；将2-4厘米高的组培苗在用IBA处理后，直接接种在(1/4-1)MS+AC200-600mg/L的培养基上，25-30天后，组培苗生根形成完整植株，生根率达85％以上。

Description

一种油茶无性系组培苗生根方法

技术领域

本发明涉及一种油茶无性系组培苗生根方法，具体是提供一种通过组织培养快速繁殖获得大量生根的油茶无性系苗木的方法。

背景技术

油茶(Camellia spp)是我国特有的优质木本油料树种，与油棕、椰子和油橄榄并称为世界四大木本油料树种^[1]。油茶种子榨取的茶油营养丰富，不饱和脂肪酸含量高达90％以上，是理想的食用油^[2]，被誉为“东方橄榄油”^[3]。此外，茶油在工业上可被用于制取油酸及其酯类、生产肥皂和凡士林等，也可制成硬脂酸和甘油；在医药上，可用于制作针剂和调制各种药膏、药丸等；在化妆业上，通过精炼可制作成天然高级美容护肤系列化妆品。茶籽榨油后的枯饼，可提取残油、茶皂素，发酵后可作高蛋白饲料，还能通过粉碎用来作生物杀虫剂和机床的抛光粉等^[4]。油茶全身都是宝，具有重要的经济利用价值和社会资源价值。发展油茶生产有利于缓解我国食用油长期依赖进口，供需紧张的矛盾，对提高我国国民经济和人民生活水平具有重大意义。

目前生产上常用的无性繁殖方式-芽苗砧嫁接法，该方法繁殖系数低，育苗周期长，操作繁杂，嫁接成活率和合格苗出圃率均较低，造林成活率不稳定，造林成本高，林相整齐度差，苗木繁殖系数低，难以满足全国油茶产业发展对油茶优良无性系的需求，迫切需要研究油茶优良无性系高效组培快繁新技术。

组培快繁技术具有繁殖速度快、方法简单、操作简便，材料消耗少，不受季节和地域限制的特点，同时子代能够保持母株的优良遗传特性。因此，研究油茶优良无性系组培快繁技术，对缓解油茶苗木紧张、加快油茶产业发展、推动山区经济和提高人民生活水平具有重大战略意义。获得大量生根且根系发达的组培苗，是实现规模化组培育苗的关键，不仅能显著提高试管苗移栽成活率，而且能大幅降低生产成本，大大提高了组培苗的经济效益。

20世纪80年代初期，国内有学者对油茶组织培养开展了研究。目前，油茶组织培养方面的研究主要集中在外植体、培养基的选择、激素和其他培养物的添加、植株再生及其他条件等方面的研究。

(1)外植体的选择。油茶培养成功的外植体有普通油茶的子叶、下胚轴、幼胚、花药、腋芽，以及油茶与越南油茶杂交品种的子叶胚，油茶与小果油茶杂交品种的成年树茎尖。2002年，中南林学院毕方铖等对油茶的茎段、幼胚、子叶在离体条件下进行诱导，获得再生植株^[5]。李建安等(2003)对小果油茶和广宁红花油茶的花药进行离体培养，并诱导形成愈伤组织^[6]。2005年，中南林学院张智俊以油茶优良无性系湘林4号腋芽和子叶为外植体，分别采用附加不同种类激素的MS培养基对其进行组织培养实验，诱导出了完整植株。由腋芽培养产生的再生植株可用于优良无性系的快速扩繁，而以子叶诱导产生胚状体获得油茶优良无性系的再生植株，不仅能满足常规育种的需要，也将为今后开展油茶转基因育种工作打下良好的基础^[7]。

(2)培养基及培养条件的选择。组织培养时，油茶生长在一个相对可控的环境中，培养基的种类营养状况及生存条件对其生长发育方向起着不可忽视的作用。初代培养能否启动与分化，培养基的选择是一个关键。长期以来，根据培养的组织不同，目的不同，已设计了多种培养基。毕方铖等(2004)以普通油茶Camellia oleifera优良无性系湘林4号为实验材料，研究了离体条件下带芽的茎段、幼胚、子叶的愈伤组织的形成和植株再生技术，发现茎段离体培养以MS为基本培养基，附加6-BA 3.0mg·L^-1+NAA 1.0mg·L^-1对芽进行诱导，诱导率达到83.33％；继续在此培养基上继代得到丛生芽，增殖比例为1∶20；对于幼胚和子叶，附加2，4-D 2.0mg·L^-1+KT 1.0mg·L^-1诱导愈伤组织得到很好的效果，将愈伤组织转到附加6-BA 3.0mg·L^-1+NAA 0.05mg·L^-1和6-BA 2.5mg·L^-1+IAA 1.5mg·L^-1的培养基上诱导出不定芽，诱导率达到90％以上；芽苗增殖以MS+6-BA 2.5mg·L^-1+IAA 1.5mg·L^-1的培养基为好^[5]。张智俊等(2005)以油茶优良无性系“湘林4号”子叶为外植体，采用附加不同种类激素的MS培养基对其进行组织培养实验。研究结果表明：子叶形成胚性愈伤组织的最适合培养基为MS+2.0mg.L^-12，4-D+1.0mg.L^-1KT；油茶优良无性系的生根培养基以MS+7.0mg.L^-1NAA最适，但获得的再生苗大多只有一条主根，须根很少，试管苗移栽难以成活，故未能获得移栽成活的植株^[7]。

(3)此外，针对油茶组织培养中的褐变、污染、生根难等问题的研究也取得一定的进展。闻丽等(2008)以普通油茶花药培养中褐化的愈伤组织为材料进行了组织化学分析。发现，无褐化愈伤组织的细胞含淀粉、脂滴相对较多，而褐化愈伤组织细胞的含量相对较少；褐化愈伤组织的细胞含单宁类物质、过氧化物酶含量相对较多，而无褐化愈伤组织的细胞含量相对较少。便于了解褐化的本质原因，从而确定更加有效的培养技术措施^[8]。油茶生根有相当大的难度，毕方铖等发现：在油茶幼苗的生根培养中，用NAA和IBA产生的生根效果均较好，且出根快，但获得的再生苗大多只有一条主根，须根很少；在空气中未接触培养基所形成的不定根，却有很多白色绒毛状的须根出现，但很细弱，在继代培养中易折断。

以上检索到的文献表明，山茶科山茶属植物油茶的组培苗生根十分困难，且移栽难以成活。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种生根率高、根系质量好、生产成本低的油茶组培苗高效生根新技术。

本发明提供的油茶无性系组培苗高效生根方法，包括初代培养、继代培养、壮苗培养和生根培养过程，其中

(1)继代培养基的筛选及激素配比：将获得的无菌苗转移到继代培养基上进行增殖，培养基为WPM+BA3--7mg/L+IBA0.1--2mg/L+ZT0.05--2mg/L；

(2)壮苗培养基的筛选及激素配比：对增殖过程中获得的无菌苗进行壮苗，采用WPM+IBA0.1--2mg/L+生物素0.5--3mg/L进行壮苗，待组培苗长到2--4厘米后进行生根诱导；

(3)生根材料的激素预处理：将组培苗的基部在1000～4000ppm的IBA溶液中浸泡5--10秒；

(4)生根培养基的筛选：将经过预处理的组培苗接种在(1/4--1)MS+AC200--600的培养基上，25--30天后，组培苗生根形成完整植株。

采用本发明提供的继代培养基，使增殖周期缩短至30天，增殖系数达4.2～9.1。经过壮苗培养基、激素预处理及生根培养基后，生根率达85％以上。

附图说明

图1油茶组培苗增殖，增殖系数7.1；

图2油茶组培苗壮苗过程；

图3油茶组培苗生根状；

图4油茶组培苗生根成活状；

图5油茶组培苗生根成活状。

具体实施方式

实施例1

从油茶健壮植株上剪取当年生新稍，取顶端4--6厘米进行消毒处理；将初代获得的无菌苗转移到WPM+BA3mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.05mg/L继代培养，增殖周期为40天，增殖系数达4.2；将增殖过程中获得的无菌苗采用WPM+IBA1.0mg/L+生物素0.5mg/L进行壮苗，25天组培苗长至2--4厘米时从培养瓶中取出，将组培苗的基部在1000ppm的IBA溶液中浸泡10秒，然后接种在1/4MS+AC200的培养基上，30天后生根率达89％。生根后，将组培苗移至营养杯中，基质为泥炭土∶珍珠岩＝3∶1，移栽成活率达93％。

具体操作如下：

(1)将获得的无菌苗转移到继代培养基上进行增殖，培养基用300ml的广口瓶分装，每瓶30ml，封口膜包扎，在121℃和1.1kg.cm^-2条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。培养条件的筛选：在培养温度为25±2℃，光照1500～2000LX，每日光照时间为12h的培养室中培养。结果参见图1。

(2)将增殖获得的无菌苗转移到壮苗培养基上进行壮苗，培养基用300ml的广口瓶分装，每瓶30ml，封口膜包扎，在121℃和1.1kg.cm^-2条件下，用高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。培养条件同(1)。结果参见图2。

(3)将组培苗的基部在1000ppm的IBA溶液中浸泡10秒，然后接种在1/4MS+AC200的培养基上，30天后生根率达89％。结果参见图3-4。

(4)将已生根的组培苗移至营养杯中，杯中基质由泥炭土∶珍珠岩按一定比例配制，杯子置于具间歇喷雾设施的温室大棚中生根管理，温度保持20～30℃，喷雾间歇时间10分钟，喷雾时间10秒，移栽成活率达93％。结果参见图5。

实施例2

从油茶健壮植株上剪取当年生新稍，取顶端4--6cm进行消毒处理；将初代获得的无菌苗转移到WPM+BA5mg/L+IBA2mg/L+ZT2mg/L继代培养，增殖周期为30天，增殖系数达9.1；将增殖过程中获得的无菌苗采用WPM+IBA0.1mg/L+生物素2mg/L进行壮苗，25天组培苗长至2--4厘米时从培养瓶中取出，将组培苗的基部在3000ppm的IBA溶液中浸泡5秒，然后接种在MS+AC600的培养基上，25天后生根率达91％。生根后，将组培苗移至营养杯中，基质为泥炭土∶珍珠岩＝2∶1，移栽成活率达91％。

具体操作参见实施例1。

实施例3

从油茶健壮植株上剪取当年生新稍，取顶端4--6cm进行消毒处理；将初代获得的无菌苗转移到WPM+BA5mg/L+IBA0.1mg/L+ZT1mg/L继代培养，增殖周期为35天，增殖系数达7.1；将增殖过程中获得的无菌苗采用WPM+IBA2mg/L+生物素3mg/L进行壮苗，25天组培苗长至2--3厘米时从培养瓶中取出，将组培苗的基部在4000ppm的IBA溶液中浸泡5秒，然后接种在1/2MS+AC400的培养基上，30天后生根率达85％。生根后，将组培苗移至营养杯中，基质为泥炭土∶珍珠岩＝1∶1，移栽成活率达89％。

具体操作参见实施例1。

参考文献：

[1]庄瑞林.中国油茶[M].北京：中国林业出版社，1988

[2]陈永忠，杨小胡，彭邵锋.我国油茶良种选育研究现状及发展策略[J].林业科技开发.2005.19(4)：1--4

[3]黎先胜.我国油茶资源的开发利用研究[J].湖南科技学院学报，2005，26(11)：127-129

[4]柳荣祥，朱全芬.茶皂素表面活性剂及其应用研究进展[J].日用化学工业，1996，(5)：32-35.

[5]毕方铖，谭晓风，张智俊，等.油茶离体培养诱导再生植株的研究[J].经济林研究，2004，22(2)：5-9.

[6]李建安，张日清，石明旺，等.油茶两物种花药培养愈伤组织诱导试验[J].经济林研究，2003，21(3)：36-38.

[7]张智俊，罗淑萍，李亚玲，等.油茶优良无性系子叶体细胞胚植株再生[J].植物学通，2005，22(增刊)：43～49.

[8]闻丽，张日清，刘友全，等.不同培养条件对油茶花药愈伤组织形成的影响[J].经济林研究，2007，25(2)：9-14.

Claims (2)

1.油茶无性系组培苗生根方法，包括初代培养、继代培养、壮苗培养和生根培养过程，其中

(1)继代培养基的筛选及激素配比：从油茶健壮植株上剪取当年生新稍，取顶端4—6厘米进行消毒处理，将初代培养获得的无菌苗转移到继代培养基上进行增殖，培养基为WPM+BA3-7mg/L+IBA0.1-2mg/L+ZT0.05-2mg/L；

(2)壮苗培养基的筛选及激素配比：对增殖过程中获得的无菌苗进行壮苗，采用WPM+IBA0.1-2mg/L+生物素0.5-3mg/L进行壮苗，待组培苗长到2-4厘米后进行生根诱导；

(3)生根材料的激素预处理：将组培苗的基部在1000～4000ppm的IBA溶液中浸泡5-10秒；

(4)生根培养基的筛选：将经过预处理的组培苗接种在(1/4-1)MS+AC200-600mg/L的培养基上，25-30天后，组培苗生根形成完整植株。

2.一种油茶无性系组培苗继代培养基，其组成是WPM+BA 3-7mg/L+IBA 0.1-2mg/L+ZT 0.05-2mg/L。 

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