CN102144554B

CN102144554B - 采用植物组织培养生产石蒜的方法

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Publication number: CN102144554B
Application number: CN2011100268153A
Authority: CN
Inventors: 刘浩
Original assignee: JIANGSU JIUJIU ENVIRONMENT TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU JIUJIU ENVIRONMENT TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-01-25
Filing date: 2011-01-25
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2031-01-25
Also published as: CN102144554A

Abstract

本发明涉及一种采用植物组织培养生产石蒜的方法，包括以下步骤：(1)MS培养基作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素制备培养基：(2)石蒜鳞茎作为外植体，消毒；(3)将鳞茎外植体接种在鳞茎诱导培养基上进行诱导培养，长出小鳞茎；(4)将小鳞茎转接入生根培养基上进行生根培养，使其具备独立从土壤、基质中吸收营养元素的能力；(5)将小鳞茎转接到培养基上培养；(6)把接种瓶瓶口打开进行炼苗；取出小鳞茎，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；转栽到大棚中，成活率达94％～96％。本发明取材较少，培养经济；可人为控制培养条件，不受自然条件的影响；生长周期短，繁殖率高；保证了石蒜的品质。

Description

采用植物组织培养生产石蒜的方法

技术领域

本发明涉及一种采用植物组织培养生产石蒜的方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

石蒜属(Lycoris)植物全世界有20多种，主要分布于中国和日本，少数产于缅甸和朝鲜，我国有16种，主要分布在长江以南地区。该属植物喜生于较阴湿的溪沟石岩旁，鳞茎外包有暗褐色膜质鳞被，叶扁长线形或狭线性，似大蒜，因而得其名。石蒜属植物很早就被用作药用植物来治病疗伤，据《本草纲目》等记载，石蒜具有解毒、祛痰、利尿、催吐等功效，主治痈疮恶核、咽喉肿痛、水肿等。石蒜属鳞茎含有石蒜碱，石蒜伦碱、加兰他敏、石蒜胺碱、多花水仙碱、二氢石蒜碱、雪花莲胺碱、伪石蒜碱、类石蒜碱、石蒜酊、石蒜醇等10多种生物碱。目前人们对石蒜属的生物碱进行了广泛的药理活性研究，其药物作用主要有如下几个方面：抗癌、抗肿瘤作用：研究表明，石蒜碱具有抗肿瘤作用，另外石蒜碱、加兰他敏有抗癌作用；作用于神经系统：加兰他敏可以用于治疗小儿麻痹后遗症、重症肌无力等；作用于心血管系统：石蒜伦碱、石蒜碱有降压作用；抗炎、抗菌作用：石蒜中提出药物-加兰他敏的药效作用已获得了世界神经病学会的认可。2002年该药已获准在美国、加拿大上市，先前已在21个国家，含大多数的欧洲主要市场获得了批准和上市，因此石蒜的人工栽培蕴含巨大的市场前景和社会效益。

石蒜的传统繁殖方法以分植鳞茎为主，繁殖率低并带有病菌，使品种严重退化，鳞茎萎缩，不利于其品质的延续和开发。利用组织培养技术在短时间内既能大规模的扩大植株的繁殖量，使其亲本的优良性状得以保存，并且不受自然环境条件的限制。组织培养技术已经在水仙、百合、风信子等球茎植物上得到很好的应用，固研究植物组织培养生产石蒜是很有现实意义的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种采用植物组织培养生产石蒜的方法，解决石蒜繁殖率低并带有病菌，使品种严重退化，鳞茎萎缩，不利于其品质延续和开发的问题，制备方法简单、切实可行，显著提高石蒜的繁殖速率以及保持其良好的品质。

按照本发明提供的技术方案，所述采用植物组织培养生产石蒜的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)培养基的制备：选择MS培养基作为基本培养基，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、3-吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)和3-吲哚丁酸(IBA)作为调控的生长激素分别制备三种培养基：

鳞茎诱导培养基A：MS+NAA 0.5～2.0mg/L+2，4-D 0.2～1.0mg/L+6-BA1.0～5.0mg/L，

生根培养基B：MS+IAA0.1～1.0mg/L+IBA0.1～1.0mg/L，

培养基C：MS+IAA 0.1～1.0mg/L；

培养基A和B中均附加20～35g/L蔗糖和4～5g/L琼脂，培养基C中附加15～25g/L蔗糖和1～2g/L琼脂，用1～2mol·L^-1的NaOH和HCL调节pH至5.8～6.0，并将培养基A、B和C在高压蒸汽灭菌锅0.1～0.15MPa，121～125℃灭菌15～20min；

(2)外植体的消毒：选用石蒜鳞茎作为外植体，用自来水冲洗1～2h，在无菌操作台上先用浓度0.5％～1％的84消毒2～4min，用无菌水冲洗3～4次，再用浓度为0.05％～0.1％的升汞消毒7～15min，最后用无菌水冲洗4～6次；

(3)石蒜小鳞茎诱导：将经步骤(2)消毒的鳞茎外植体切成8～12瓣，接种在鳞茎诱导培养基A上，接种瓶内每瓶平放1～3瓣，置于培养室内培养60～70d，在鳞茎外植体中长出小鳞茎；

(4)小鳞茎的生根：将小鳞茎转接入生根培养基B上，对小鳞茎进行生根培养，30～40d后石蒜小鳞茎的根长达到2～4cm，生根率达到90％以上，具备独立从土壤、基质中吸收营养元素的能力；

(5)小鳞茎继代培养：将生根的小鳞茎转接到培养基C上培养7～12d；

(6)炼苗及移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗5～7d，光照周期为16h·d^-1，光照强度为2000～2400Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的小鳞茎，用自来水洗净根部琼脂，再用蒸馏水稀释成500～600倍的多菌灵浸泡组培苗的根部20～30min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2000～2400Lux，白天23～25℃，晚上15～18℃，保持湿度在40％～60％；移栽后用1/12～1/10MS母液浇灌，罩上塑料杯保湿，10～15d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/12～1/10MS母液，30～40d后转栽到大棚中，成活率达94％～96％。

步骤(3)～步骤(5)中，培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2000～2400Lux，培养温度为25±2℃。

步骤(6)中，所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为1.5～2∶0.5～1.5∶0.5～1.5，所述混合基质在压力0.1～0.15MPa、温度121～125℃的条件下灭菌15～20min。

所述的1/12～1/10MS培养基母液的成分与MS培养基相同，将MS培养基母液稀释10～12倍。

本发明利用组织培养技术在短时间内既能大规模的扩大植株的繁殖量，并且使其亲本的优良性状得以保存。本发明利用植物细胞全能性以及细胞极性和再生特性，将其从植物中分离出来并给予一定的培养条件，是这些已分化的细胞脱分化，然后再在一定的条件下再分化，最后形成完整的植株。因此组织培养就是细胞脱分化和再分化的过程。利用组织培养技术进行石蒜的无性快速繁殖具有许多优点，首先取材较少，培养经济，使用很少的外植体就能培养出大量的石蒜小鳞茎；其次可人为控制培养条件，不受自然条件的影响，跳出了植物生长环境、地域以及季节时间的限制；生长周期短，繁殖率高，能在较短的时间繁殖出大量的小鳞茎，缩短了石蒜的生长周期；保证了石蒜的品质，石蒜的传统繁殖方法以分植鳞茎为主，繁殖率低并带有病菌，使品种严重退化，鳞茎萎缩，而组织培养主要采用无性繁殖，避免了品种中的病毒通过有性遗传给下一代；管理方便，便于自动化控制。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例一：一种采用植物组织培养石蒜的方法，包括以下步骤：

(1)培养基的制备：选择MS培养基(Murashige和Skoog，1962)作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备三种培养基：鳞茎诱导培养基A：MS+NAA mg/L+2，4-D 0.2mg/L+6-BA 1.0mg/L，生根培养基B：MS+IAA 0.1mg/L+IBA 0.1mg/L，培养基C：MS+IAA 0.1mg/L；培养基A和B中均附加20g/L蔗糖和4g/L琼脂，培养基C中附加15g/L蔗糖和1g/L琼脂，用1mol·L^-1的NaOH和HCL调节pH至5.8，并将培养基A、B和C在高压蒸汽灭菌锅0.1MPa，121℃灭菌15min；

(2)外植体的消毒：选用石蒜鳞茎作为外植体，用自来水冲洗1h，在无菌操作台上先用浓度0.5％的84消毒4min，用无菌水冲洗4次，再用浓度为0.05％的升汞消毒14min，最后用无菌水冲洗6次；

(3)石蒜小鳞茎诱导：将经步骤(2)消毒的鳞茎外植体切成8瓣，接种在鳞茎诱导培养基A上，接种瓶内每瓶平放1瓣，置于培养室内培养60d，在鳞茎外植体中长出小鳞茎；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养温度为25±2℃；

(4)小鳞茎的生根：将小鳞茎转接入生根培养基B上，对小鳞茎进行生根培养，30d后石蒜小鳞茎的根长达到2cm，生根率达到90％以上，具备独立从土壤、基质中吸收营养元素的能力；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养温度为25±2℃；

(5)小鳞茎继代培养：将生根的小鳞茎转接到培养基C上培养7d；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养温度为25±2℃；

(6)炼苗及移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗5d，光照周期为16h·d^-1，光照强度为2000Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的小鳞茎，用自来水洗净根部琼脂，再用蒸馏水稀释成500倍的多菌灵浸泡组培苗的根部20min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2000Lux，白天23℃，晚上15℃，保持湿度在40％；移栽后用1/12MS母液浇灌，罩上塑料杯保湿，10d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/12MS母液，30d后转栽到大棚中，成活率达94％。所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为1.5∶0.5∶0.5，所述混合基质在压力0.1MPa、温度121℃的条件下灭菌15min。

实施例二：一种采用植物组织培养石蒜的方法，包括以下步骤：

(1)培养基的制备：选择MS培养基(Murashige和Skoog，1962)作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备三种培养基：鳞茎诱导培养基A：MS+NAA 2.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 5.0mg/L，生根培养基B：MS+IAA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L，培养基C：MS+IAA 1.0mg/L；培养基A和B中均附加35g/L蔗糖和5g/L琼脂，培养基C中附加25g/L蔗糖和2g/L琼脂，用2mol·L^-1的NaOH和HCL调节pH至6.0，并将培养基A、B和C在高压蒸汽灭菌锅0.15MPa，125℃灭菌20min；

(2)外植体的消毒：选用石蒜鳞茎作为外植体，用自来水冲洗2h，在无菌操作台上先用浓度1％的84消毒2min，用无菌水冲洗2次，再用浓度为0.1％的升汞消毒7min，最后用无菌水冲洗4次；

(3)石蒜小鳞茎诱导：将经步骤(2)消毒的鳞茎外植体切成12瓣，接种在鳞茎诱导培养基A上，接种瓶内每瓶平放3瓣，置于培养室内培养70d，在鳞茎外植体中长出小鳞茎；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养温度为25±2℃；

(4)小鳞茎的生根：将小鳞茎转接入生根培养基B上，对小鳞茎进行生根培养，40d后石蒜小鳞茎的根长达到4cm，生根率达到90％以上，具备独立从土壤、基质中吸收营养元素的能力；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养温度为25±2℃；

(5)小鳞茎继代培养：将生根的小鳞茎转接到培养基C上培养12d；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养温度为25±2℃；

(6)炼苗及移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗7d，光照周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的小鳞茎，用自来水洗净根部琼脂，再用蒸馏水稀释成600倍的多菌灵浸泡组培苗的根部30min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2400Lux，白天25℃，晚上18℃，保持湿度在60％；移栽后用1/10MS母液浇灌，罩上塑料杯保湿，15d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/10MS母液，40d后转栽到大棚中，成活率达96％。所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为2∶1.5∶1.5，所述混合基质在压力0.15MPa、温度125℃的条件下灭菌20min。

实施例三：一种采用植物组织培养石蒜的方法，包括以下步骤：

(1)培养基的制备：选择MS培养基(Murashige和Skoog，1962)作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备三种培养基：鳞茎诱导培养基A：MS+NAA 0.6mg/L+2，4-D 0.3mg/L+6-BA 1.2mg/L，生根培养基B：MS+IAA 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L，培养基C：MS+IAA 0.2mg/L；培养基A和B中均附加25g/L蔗糖和4.5g/L琼脂，培养基C中附加16g/L蔗糖和1.2g/L琼脂，用1.2mol·L^-1的NaOH和HCL调节pH至5.9，并将培养基A、B和C在高压蒸汽灭菌锅0.12MPa，122℃灭菌16min；

(2)外植体的消毒：选用石蒜鳞茎作为外植体，用自来水冲洗1.2h，在无菌操作台上先用浓度0.6％的84消毒3min，用无菌水冲洗3次，再用浓度为0.06％的升汞消毒12min，最后用无菌水冲洗5次；

(3)石蒜小鳞茎诱导：将经步骤(2)消毒的鳞茎外植体切成9瓣，接种在鳞茎诱导培养基A上，接种瓶内每瓶平放2瓣，置于培养室内培养65d，在鳞茎外植体中长出小鳞茎；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养温度为25±2℃；

(4)小鳞茎的生根：将小鳞茎转接入生根培养基B上，对小鳞茎进行生根培养，35d后石蒜小鳞茎的根长达到3cm，生根率达到90％以上，具备独立从土壤、基质中吸收营养元素的能力；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养温度为25±2℃；

(5)小鳞茎继代培养：将生根的小鳞茎转接到培养基C上培养8d；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养温度为25±2℃；

(6)炼苗及移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗6d，光照周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的小鳞茎，用自来水洗净根部琼脂，再用蒸馏水稀释成550倍的多菌灵浸泡组培苗的根部25min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2200Lux，白天24，晚上16℃，保持湿度在50％；移栽后用1/11MS母液浇灌，罩上塑料杯保湿，12d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/11MS母液，35d后转栽到大棚中，成活率达95％。所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为1.6∶0.6∶0.6，所述混合基质在压力0.12MPa、温度122℃的条件下灭菌16min。

实施例四：一种采用植物组织培养石蒜的方法，包括以下步骤：

(1)培养基的制备：选择MS培养基(Murashige和Skoog，1962)作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备三种培养基：鳞茎诱导培养基A：MS+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.8mg/L+6-BA 2.0mg/L，生根培养基B：MS+IAA 0.6mg/L+IBA 0.6mg/L，培养基C：MS+IAA 0.6mg/L；培养基A和B中均附加30g/L蔗糖和4.6/L琼脂，培养基C中附加22g/L蔗糖和1.5g/L琼脂，用1.8mol·L^-1的NaOH和HCL调节pH至6.0，并将培养基A、B和C在高压蒸汽灭菌锅0.14MPa，124℃灭菌18min；

(2)外植体的消毒：选用石蒜鳞茎作为外植体，用自来水冲洗1.5h，在无菌操作台上先用浓度0.8％的84消毒3min，用无菌水冲洗4次，再用浓度为0.08％的升汞消毒10min，最后用无菌水冲洗5次；

(3)石蒜小鳞茎诱导：将经步骤(2)消毒的鳞茎外植体切成10瓣，接种在鳞茎诱导培养基A上，接种瓶内每瓶平放2瓣，置于培养室内培养65d，在鳞茎外植体中长出小鳞茎；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2300Lux，培养温度为25±2℃；

(4)小鳞茎的生根：将小鳞茎转接入生根培养基B上，对小鳞茎进行生根培养，38d后石蒜小鳞茎的根长达到3cm，生根率达到90％以上，具备独立从土壤、基质中吸收营养元素的能力；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2300Lux，培养温度为25±2℃；

(5)小鳞茎继代培养：将生根的小鳞茎转接到培养基C上培养10d；培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2300Lux，培养温度为25±2℃；

(6)炼苗及移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗6d，光照周期为16h·d^-1，光照强度为2300Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的小鳞茎，用自来水洗净根部琼脂，再用蒸馏水稀释成560倍的多菌灵浸泡组培苗的根部28min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2300Lux，白天24℃，晚上17℃，保持湿度在55％；移栽后用1/12MS母液浇灌，罩上塑料杯保湿，14d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/12MS母液，36d后转栽到大棚中，成活率达95％。所述混合基质中蛭石∶珍珠岩∶营养土的质量比为1.8∶1.0∶1.0，所述混合基质在压力0.14MPa、温度124℃的条件下灭菌18min。

对本发明的实施例移栽后的石蒜组培苗进行生物量的测试，为了不影响其生长，只对其叶片的增长进行测量，叶片的增长情况见表1。本发明得到的石蒜组培苗繁殖速度快，培养基质的选择最佳，因此生物量的增长迅速，品质得到完好的保存。

表1叶片的增长情况

Claims

1.一种采用植物组织培养生产石蒜的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）培养基的制备：选择MS培养基作为基本培养基，2,4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素分别制备三种培养基：

鳞茎诱导培养基A: MS+NAA 0.5~2.0mg/L+2,4-D 0.2~1.0mg/L+6-BA 1.0~5.0mg/L，

生根培养基B: MS+IAA 0.1~1.0mg/L +IBA 0.1~1.0mg/L，

培养基C: MS+ IAA 0.1~1.0mg/L；

培养基A和B中均附加20~35g/L蔗糖和4~5g/L琼脂，培养基C中附加15~25g/L蔗糖和1~2g/L琼脂，用1~2mol·L^-1的NaOH和HCL调节pH至5.8~6.0，并将培养基A、B和C在高压蒸汽灭菌锅0.1~0.15MPa，121~125℃灭菌15~20min；

（2）外植体的消毒：选用石蒜鳞茎作为外植体，用自来水冲洗1~2h，在无菌操作台上先用浓度0.5%~1%的84消毒2~4min，用无菌水冲洗3~4次，再用浓度为0.05%~0.1%的升汞消毒7~15min，最后用无菌水冲洗4~6次；

（3）石蒜小鳞茎诱导：将经步骤（2）消毒的鳞茎外植体切成8~12瓣，接种在鳞茎诱导培养基A上，接种瓶内每瓶平放1~3瓣，置于培养室内培养60~70d，在鳞茎外植体中长出小鳞茎；

（4）小鳞茎的生根：将小鳞茎转接入生根培养基B上，对小鳞茎进行生根培养，30~40d后石蒜小鳞茎的根长达到2~4cm，生根率达到90%以上，具备独立从土壤、基质中吸收营养元素的能力；

（5）小鳞茎继代培养：将生根的小鳞茎转接到培养基C上培养7~12d；

（6）炼苗及移栽：把接种瓶瓶口打开在培养室内散射光下炼苗5~7d，光照周期为16h·d^-1，光照强度为2000~2400Lux，培养室温度为25±2℃；取出接种瓶内的小鳞茎，用自来水洗净根部琼脂，再用蒸馏水稀释500~600倍的多菌灵浸泡组培苗的根部20~30min，移栽至以蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；将营养杯放到人工气候箱中，光周期为16h·d^-1，光照强度为2000~2400Lux，白天23~25℃，晚上15~18℃，保持湿度在40%~60%；移栽后用1/12~1/10MS母液浇灌，罩上塑料杯保湿，10~15d后去掉塑料杯，隔两周浇一次1/12~1/10MS母液，30~40d后转栽到大棚中，成活率达94%~96%；

步骤（3）~步骤（5）中，培养条件为：光周期为16h·d^-1，光照强度为2000~2400Lux，培养温度为25±2℃。

2.如权利要求1所述采用植物组织培养生产石蒜的方法，其特征是：步骤（6）中，所述混合基质中蛭石:珍珠岩:营养土的质量比为1.5~2:0.5~1.5:0.5~1.5，所述混合基质在压力0.1~0.15MPa、温度121~125℃的条件下灭菌15~20min。

3.如权利要求1所述采用植物组织培养生产石蒜的方法，其特征是，所述1/12~1/10MS培养基母液的成分与MS培养基相同，将MS培养基母液稀释10~12倍。