CN102972289A - 一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法，包括以下步骤：(1)以MS培养基为基本培养基，添加6-BA、NAA、2，4-D等植物生长调节剂；(2)采集中国石蒜幼嫩叶片，灭菌；(3)将叶片片段，接种在合适的培养基上；(4)诱导阶段为暗培养，继代培养阶段和生根培养给予光照；(5)继代培养在小鳞茎达到0.5cm高度时进行；(6)生根培养；(7)驯化炼苗，保持湿润环境，待幼苗叶片伸展，即可进行正常管理。本发明利用中国石蒜叶片建立快繁体系，具有不破坏母鳞茎、保护珍稀种质的优点；得到的幼苗，具有遗传基础一致、性状稳定、生长势整齐等特点，在观赏和药用新品种繁育与利用中具有显著的竞争优势。

Description

一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法

1.技术领域

本发明涉及一种利用中国石蒜的叶片组织建立无菌培养体系快速培养再生植株的方法。 

2.背景技术

中国石蒜Lycoris chinensis属石蒜科Amaryllidaceae石蒜属Lycoris植物，广泛分布于东亚地区，在国内主要分布于长江流域以及西南诸省，以其独特的龙爪形花瓣而著称，花朵色彩艳丽，花形优美，是一类优良的球根花卉植物和药用植物。目前，已在华东地区的城市绿化中得到应用，但是，自然条件下，中国石蒜主要依靠鳞茎分球进行繁殖，繁殖系数较低，难以满足大规模的生产需要。由于快繁技术措施的滞后，园林应用与药用的采挖已严重影响其野生资源的数量，部分地区的野生种群已遭到毁灭性破坏，因此，解决其快繁技术问题已成为中国石蒜野生种群保护与园林生产应用的关键。 

组织培养技术作为植物品种快繁的主要手段已在鳞茎类植物中得到较为广泛的应用，它可以大幅度提高鳞茎的繁殖系数，满足中国石蒜快速大规模繁育生产的需要。尤其是利用中国石蒜的叶片作为外植体材料，进行诱导培养，并再生植株的新技术，不但能够实现中国石蒜的快速商业化生产，还具有不破坏母鳞茎、保护珍稀种质的优点，对于中国石蒜野生种群的保护具有特殊意义。 

CN102217540A公开了周坚的“一种中国石蒜的快速繁殖方法”发明专利技术，以中国石蒜的种胚为外植体，诱导再生植株，这种方法虽然繁殖系数较高，但种子的遗传背景较复杂，繁育出的后代性状有分离现象，限制了中国石蒜纯系品种的推广应用。而且以种胚作外植体只能一次性使用，采用叶片作外植体则可以多次采集并保存原鳞茎。 

3.发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是利用中国石蒜的叶片组织建立无菌培养体系培养再生植株。 

解决上述技术问题的技术方案是按如下步骤进行： 

(1)培养基配方和配制 

适宜外植体幼嫩叶片诱导的培养基配方：MS+6-BA 20mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L 

适宜无菌小叶诱导的培养基配方：MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L 

继代培养培养基配方：MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L 

生根培养培养基配方：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L 

具体的配制方法： 

A、按照MS培养基配方，把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类，每一类中各种药品分别称量，可按照一定倍数配制浓缩液，然后按照顺序量取所需体积混合在一起，最后加蒸馏水，定容至1 升； 

B、然后加入蔗糖、琼脂，调节ph值至5.9，微波炉加热，煮沸至溶液中琼脂完全溶解呈透明为止； 

C、将配制好的培养基分装在事先准备好的培养瓶中，1L一般可分装成20-22瓶，然后盖上盖子并注明标签。最后将用牛皮纸包好的培养皿、滤纸以及蒸馏水一道进行高压灭菌，灭菌温度为121℃，维持时间18-25min； 

D、灭菌过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，放置24小时后使用，一般应在灭菌后的两周内用完。 

(2)叶片采集和处理 

A：采集中国石蒜幼嫩叶段，采样袋密封带回实验室，清水仔细冲洗，去除叶片表面污物，然后移至接种室； 

B：选取中国石蒜无菌苗刚长出的嫩叶，在超净工作台上截成1cm左右的片断，直接接种； 

(3)灭菌和接种 

将清洗干净的叶段在超净工作台上按下列顺序进行灭菌：75％乙醇中消毒30-60s→无菌水清洗2次→0.1％ HgCl2溶液中灭菌8-10min→无菌水清洗4次→无菌滤纸吸干表面水分； 

然后用解剖刀将叶段切成0.8-1.0cm的片段，接种在培养基上，以上操作过程在酒精灯火焰30cm范围内进行； 

(4)培养条件 

将接种叶片片段的培养瓶整齐摆放在培养架上，诱导阶段为暗培养，温度25±2℃； 

继代培养阶段和生根培养阶段在光照条件下培养，光照强度1000-1200lx，光照时间16小时，温度25±2℃； 

(5)继代培养 

待叶片组织分化出的白色小鳞茎达到0.5cm高度时，进行继代培养，选用继代培养培养基，转接操作在超净工作台上进行，将小鳞茎上半部切除后，转接于新的培养基上，继代培养可连续培养多代，以实现快速增殖； 

(6)生根培养 

继代培养得到的小鳞茎达到0.5cm以上时，即可进行生根培养，将生长势健壮的中国石蒜小苗转接于生根培养基上，待长出3条以上的白色根须后，进行驯化； 

(7)驯化移栽 

A、驯化炼苗分两步进行，第一步，每天将培养瓶的盖子揭开一段时间，使幼苗接触外界空气，并逐渐延长时间，大约一周后完全揭开瓶盖； 

B、第二步，将幼苗取出，用清水清洗，除去附着的培养基，然后修剪较长的根须，移栽于基质中， 基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按1∶1∶1配制，保持基质湿润，空气湿度在90％以上，并加盖遮阳网； 

C、两周后，待幼苗叶片伸展，即可除去遮阳网，进行正常栽培管理。 

本发明的有益效果是：(1)利用中国石蒜叶片作为外植体材料，建立无菌快繁体系，进行诱导培养和继代培养，并再生植株，实现中国石蒜的快速繁育。(2)由无菌组织培养得到的中国石蒜幼苗，具有遗传基础一致、性状稳定、生长势整齐等特点，在观赏和药用新品种栽培中具有显著的竞争优势。 

4.附图说明

图1：无菌小叶诱导出小鳞茎(第1个月)；图2：叶片诱导小鳞茎(第2个月)；图3：叶片诱导的愈伤组织进行小鳞茎诱导(第3个月)；图4：小鳞茎增殖(第4个月)；图5：小鳞茎增殖(第5个月)。 

5.具体实施方式

下面结合实施例作进一步详述：本发明所指明的培养过程包括三个培养阶段，各培养阶段所用培养基配方均以MS培养基为基础，添加不同种类和不同浓度的植物生长调节剂构成。通过不同种类和不同浓度的植物生长调节剂的调节，调控中国石蒜叶片再生植株的发育过程，实现中国石蒜叶片的脱分化、再分化，得到再生植株。 

下面将不同培养阶段的中国石蒜培养物按四项实施例列于下表： 

实施例1：中国石蒜叶片于春季采集乳黄色尚未变绿的幼嫩叶片，采样袋密封带回实验室，清水仔细冲洗，去除叶片表面污物，然后送至接种室灭菌和接种；灭菌按下列顺序进行：75％乙醇中消毒30s-1min→无菌水清洗2次→01％ HgCl2溶液中灭菌8-10min→无菌水清洗4次→无菌滤纸吸干表面水分，期间要 保证叶片的组织活性；随后用解剖刀将叶段切成0.8-1.0cm的片段，四周剪出伤口，接种在培养基上，以上操作过程在酒精灯火焰30cm范围内进行；将接种叶片片段的培养瓶置于暗培养条件下，温度保持在25±2℃，经过2-3个月后，可观测到白色小鳞茎的分化； 

上表中其余实施例2-4对照该表中对应实施例序列所示原料及其过程参数，用实施例1相似方法进行操作，实施例3和实施例4所需培养周期在1个月左右，具体时间可按需要继代延长。 

上表的四项实施例中，成功率均在70％以上，对于未达到下一生长阶段要求的培养物，可延长培养时间，直至得到满意效果。 

总之本方法的关键是把握好接种材料的选择和处理、培养基的成分含量和培养条件，以及无菌实验操作三个环节，其中培养基的成分含量、培养条件和无菌实验操作较为容易掌握，但因接种材料的选择和处理方法，不易控制，故只对其用列表形式举出实施例予以说明。 

Claims (1)

1.一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法，其技术方案按如下步骤进行：

(1)培养基配方和配制

适宜外植体幼嫩叶片诱导的培养基配方：MS+6-BA 20mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L

适宜无菌小叶诱导的培养基配方：MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L

继代培养培养基配方：MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L

生根培养培养基配方：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L

具体的配制方法：

A、按照MS培养基配方，把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类，每一类中各种药品分别称量，可按照一定倍数配制浓缩液，然后按照顺序量取所需体积混合在一起，最后加蒸馏水，定容至1升；

B、然后加入蔗糖、琼脂，调节ph值至5.9，微波炉加热，煮沸至溶液中琼脂完全溶解呈透明为止；

C、将配制好的培养基分装在事先准备好的培养瓶中，1L一般可分装成20-22瓶，然后盖上盖子并注明标签。最后将用牛皮纸包好的培养皿、滤纸以及蒸馏水一道进行高压灭菌，灭菌温度为121℃，维持时间18-25min；

D、灭菌过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，放置24小时后使用，一般应在灭菌后的两周内用完。

(2)叶片采集和处理

A：采集中国石蒜幼嫩叶段，采样袋密封带回实验室，清水仔细冲洗，去除叶片表面污物，然后移至接种室；

B：选取中国石蒜无菌苗刚长出的嫩叶，在超净工作台上截成1cm左右的片断，直接接种；

(3)灭菌和接种

将清洗干净的叶段在超净工作台上按下列顺序进行灭菌：75％乙醇中消毒30-60s→无菌水清洗2次→0.1％ HgCl2溶液中灭菌8-10min→无菌水清洗4次→无菌滤纸吸干表面水分；

然后用解剖刀将叶段切成0.8-1.0cm的片段，接种在培养基上，以上操作过程在酒精灯火焰30cm范围内进行；

(4)培养条件

将接种叶片片段的培养瓶整齐摆放在培养架上，诱导阶段为暗培养，温度25±2℃；

继代培养阶段和生根培养阶段在光照条件下培养，光照强度1000-1200lx，光照时间16小时，温度25±2℃；

(5)继代培养

待叶片组织分化出的白色小鳞茎达到0.5cm高度时，进行继代培养，选用继代培养培养基，转接操作在超净工作台上进行，将小鳞茎上半部切除后，转接于新的培养基上，继代培养可连续培养多代，以实现快速增殖；

(6)生根培养

继代培养得到的小鳞茎达到0.5cm以上时，即可进行生根培养，将生长势健壮的中国石蒜小苗转接于生根培养基上，待长出3条以上的白色根须后，进行驯化；

(7)驯化移栽

A、驯化炼苗分两步进行，第一步，每天将培养瓶的盖子揭开一段时间，使幼苗接触外界空气，并逐渐延长时间，大约一周后完全揭开瓶盖；

B、第二步，将幼苗取出，用清水清洗，除去附着的培养基，然后修剪较长的根须，移栽于基质中，基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按1∶1∶1配制，保持基质湿润，空气湿度在90％以上，并加盖遮阳网；

C、两周后，待幼苗叶片伸展，即可除去遮阳网，进行正常栽培管理。

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