KR101147861B1 - 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 산삼 또는 인삼을 포함하는 인삼류(Panax ginseng)의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 후천성 면역결핍증(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물은 천연물 유래 조성물로서 기존 약물 치료제의 부작용을 최소화하여 인체에 안전하면서도, 효과적으로 CD4+ T 세포 등 T 세포의 수를 증가시키고 HIV(human immunodeficiency virus)의 수를 감소시켜 면역불능에 따른 기회적 감염, 신경기능장애, 신생물 성장, 궁극적으로 사망에 이르는 위험을 방지하므로, 후천성 면역결핍증의 예방, 치료 및 증상완화에 유용하다.
인삼류, 산삼, 인삼, 형성층, 후천성 면역결핍증
Description
본 발명은 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양물을 유효성분으로 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
1982년 미국 로스안젤레스에서 후천성 면역결핍증 증후군(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS) 환자가 최초로 발견된 이래, 전세계적으로 AIDS 환자 수가 증가하고 있으며, 국내에서도 1985년인 미국인 AIDS 환자가 발견된 이래 꾸준한 증가를 보여 치료제 개발 등의 대책이 심각하게 대두되고 있다.
인간면역결핍바이러스(이하 HIV라 한다)는 주로 사람의 임파구를 공격하는 바이러스로서 외피(envelope)로 둘러싸여 있으며, 유전물질인 RNA 게놈 (genome)을 DNA로 역전사시킨 후 숙주세포의 DNA에 삽입시키는 특성을 가지고 있어 레트로바이러스로 불려지기도 한다. HIV 구조는 가장 내부에 유전정보인 RNA와 역전사효소 (reverse transcriptase)가 존재하고, 이 RNA와 역전사효소는 껍질 단백질에 의해 둘러싸여 있으며, 그 바깥쪽에는 gp120과 gp41으로 불리는 당단백질을 포함하는 지질막이 보호막을 형성하고 있으며, gp120는 바이러스가 T-세포를 인식하여 침투하는데 결정적 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
HIV는 CD4 세포막 단백질(CD4)이 HIV-1 바이러스에 대한 세포 수용체 역할을 하기 때문에, CD4+ T 세포를 목표로 한다. 바이러스의 세포진입은 세포내 CD4 수용체 분자와 결합하는 gp120에 의존하는데, HIV 감염은 이런 세포형의 고갈을 유도하고 따라서 면역불능, 기회적 감염, 신경기능장애, 신생물 성장,궁극적으로 사망을 야기한다.
급속한 HIV 감염자 및 AIDS환자의 증가에 따라 미국, 프랑스, 캐나다, 일본 등 세계 여러나라에서 치료제 개발에 박차를 가하여 왔으며, 지금까지 알려진 항 HIV 물질로는 미국의 FDA의 허가를 얻은 2,3-azidothymidine(AZT), dideoxyinosine(ddI), dideoxycytidine(ddC) 등이 있으나, 이들도 심한 부작용의 발생과 더불어 완전한 치료효과를 기대하기는 매우 어려운 실정으로 새로운 약제의 개발이 매우 중요한 과제로 인식되어 왔다.
또 다른 치료제로서 HIV의 프로테아제 저해제가 있다. 프로테아제 저해제는 HIV가 외피 단백질과 효소들이 모두 붙어있는 gag 단백질 과 gag-pol 단백질과 같 은 전구 단백질형태를 만든 후, 자체내의 프로테아제에 의해 분해하여 외피 단백질과 프로테아제, 역전사효소 및 인티그라제 (integrase) 등을 제조하고, 이 과정에서 프로테아제를 억제하면 바이러스의 복제가 중단되는 것을 기초하여 개발된 것이다. 단백질 분해효소 억제제로서는 사퀴나비르 (saquinavir), 리토나비르(ritonavir), 인디나비르 (indinavir) 등이 개발되어 AIDS 환자의 치료제로 사용하고 있다. 그러나 이 또한 당뇨병, 용혈, 출혈, 과지방혈증, 지방대사 장해 등의 부작용을 가지며, 치료제를 장기간 복용해야 하기 때문에 치료제에 대한 내성주가 출현하여 심각한 문제를 일으키고 있다.
이에 본 발명자들은 후천성 면역결핍증(AIDS)의 예방 및 치료 효과가 우수한 천연물 유래 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 산삼 및 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물이 후천성 면역결핍증(AIDS)의 예방 및 치료에 우수한 효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 기존 후천성 면역결핍증(AIDS) 치료제의 부작용을 최소화한 후천성 면역결핍증의 예방 및 치료 활성을 나타내는 천연물 유래 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼류(Panax ginseng)의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 후천성 면역 결핍증(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(a) 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임;
(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및
(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 T 세포를 증가시키는 면역 증진제를 제공한다.
본 발명은 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물은 천연물 유래 조성물로서 기존 약물 치료제의 부작용을 최소화하여 인체에 안전하면서도, 효과적으로 CD4+ T 세포 등 T 세포의 수를 증가시키고 HIV(human immunodeficiency virus)의 수를 감소시켜 면역불능에 따른 기회적 감염, 신경기능장애, 신생물 성장,궁극적으로 사망에 이르는 위험을 방지하므로, 후천성 면역결핍증의 예방, 치료 및 증상완화에 유용하다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "형성층(cambium)"이란 식물의 줄기와 뿌리를 굵어지게 해서 식물이 부피생장을 할 수 있도록 하는 조직이다. 형성층은 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로써 식물조직배양의 절편체로 사용 시 세포의 고속 및 대량생 산이 가능하다고 보고되어 있다 (대한민국 등록특허 제0533120호).
본원에서 "파쇄물"이란 세포를 detergent 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 세포주의 "추출물"이란 세포를 용매에 녹여 분리한 물질로, 증류 또는 증발을 이용하여 농축될 수 있다. 추가적으로 본원에서 "배양물"이란 배양된 세포주 및 배양액을 포함하는 물질로서, 이때 배양된 세포주는 배양조건에 의하여 분화되거나 유용물질의 생산능 및/또는 분비능이 향상된 세포주를 모두 포함하는 개념이다.
본원에서 "선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)"란 탈분화 과정을 거쳐 미분화 상태로 존재하는 것이 아닌, 본래부터 분화 전 상태를 유지하는 것을 말한다.
본원에서 "T 세포"란 흉선에서 유래하는 면역에서 주된 역할을 하는 림프구로서, 세포표면에 CD4 항원을 발현하는 CD4+ T 세포는 헬퍼 T 세포(helper T cell)라 하고, 세포표면에 CD8 항원을 발현하는 CD8+ T 세포는 세포 독성 T 세포(cytotoxic T cell)라 한다. 이중 헬퍼 T 세포는 B 세포의 항체 생성이나 세포 독성 T 세포의 활성화를 보조한다.
본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 인삼류(Panax ginseng)의 형성층 유래동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 인삼류(Panax ginseng)는 산삼 또는 인삼을 포함하며 (Lian M.L. et al., J. Plant Biology, 45: 201, 2002; Han J.Y. et al., J. Plant Biology, 49:26, 2006; Teng W.L. et al., Tissue and Organ Culture, 68:233, 2002), 이때, 본 발명에서 상기 산삼 또는 인삼은 노지삼 또는 조직배양삼류(부정근 및 부정근 유래 세포주)를 포함한다.
본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주는 (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; (b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및 (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타내는 것을 특징으로 한다. 또한, 추가적으로 (a) 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재함; (b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및 (c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동질적인 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있다:
(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,
이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및
(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
이때, 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 삼투 스트레스 공정은 형성층 특이적으로 세포주를 유도하기 위한 것으로서, 바람직하게는 상기 IAA 또는 IBA를 포함하는 배지에서 배양하기 전에 수행하여 형성층 이외의 일반 조직, 즉, 피층(cortex), 사부(phloem), 목부(xylem), 수(pith)에서는 분열능을 잃어 추후 IAA 또는 IBA와 같이 형성층분열 특이적인 호르몬을 처리하여 배양하는 경우 괴사되도록 한다. 이때 삼투제는 0.5~2M의 함량으로 처리하고, 냉장 또는 상온에서 16시간 내지 24시간 동안 삼투 스트레스를 가한 후, 처리한 삼투 스트레스를 제거하는 것이 바람직하나, 삼투제의 농도, 처리 시간 및 온도는 식물체별, 조직별 상태에 따라 달라질 수 있으므로 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 IAA 또는 IBA는 0.1~5㎎/ℓ의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (c) 단계는 바람직하게는 유도된 형성층 유래 세포주를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 형성층 유래 세포주를 회수하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 2,4-D, 피클로람 및 IBA 중 어느 하나는 바람직하게는 1~5mg/L, 더욱 바람직하게는 2mg/L의 함량으로 사용한다.
본 발명에서 사용한 배지는 통상의 식물 조직 배양을 위한 배지로써, 일례로 N6배지, SH배지, MS 배지, AA 배지, LS 배지, B5배지, WPM 배지, LP배지, White배지, GD배지, DKW배지, DCR 배지 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 저급알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 저급알코올은 메탄올, 에탄올 등 탄소수가 1 내지 5인 알코올을 의미한다.
한편, CD4+ T 세포는 그들이 체내에서 마주치는 항원에 반응하여 특이적으로 인지하고 증식하며, 동시에 다른면역체계세포를 통제하는 림포킨(lymphokine)으로 알려진 각종 단백질을 방출한다. 또한, CD4+ T 세포에 의한 시그날(signaling)에 따라, B 임파구 세포가 항원을 인지하여 세포 사이의 체액을 따라 운동하는 항원성 박테리아 및 바이러스를 중화하거나 제거하기 위한 특정 항체를 분비한다. 유사하게, CD4+ T 세포로부터의 시그날에 따라서, CD8+ T 세포(cytotoxic T cell)가 활성화되어 세포내 병원체로 감염된 세포를 죽인다. 이외에, CD4+ T 세포는 감염 및 초기 악성 종양에 대한 반응에 수반되는, 자연 킬러세포(natural killer cell) 및 대식세포로서 알려진 면역체계 세포의 활성화를 조절한다.
AIDS의 면역결핍은 이러한 CD4+ T 세포의 중요성을 명확하게 설명하며, 이들 세포의 결손 때문에, AIDS 환자로부터 잔류하는 CD4+ T 세포의 항원에 대한 반응은 감소되거나 없어져서 필수적인 면역-조절 인자의 이상 생성이 나타난다. CD4+ T 세포의 감소된 수 및 감소된 기능적 용량 때문에, B 세포 및 세포 독성 T 세포(CD8+ T 세포)의 성숙을 위해서 직접 제공되는 그들의 필수적 역할을 충족시킬 수 없게 된다. 따라서, HIV(human immunodeficiency virus)에 감염된 환자를 모니터닝하기 위하여 CD4+ T 세포의 수 또는 퍼센티지를 측정한다 (Giorgi J.V. et al ., Clin . Immunol. Newslett ., 10:55, 1990).
이에 본 발명의 실시예에서는, 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포주를 후천성 면역결핍증(AIDS)로 진단된 환자에게 투여한 결과, 헬퍼 T 세포인 CD4+ T 세포의 수가 증가함을 확인하였다. 이에 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주가 HIV 바이러스에 의해 감소된 면역성을 증가시키며, 후천성 면역결핍증(AIDS)에 대한 예방 및 치료 효과가 있는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포주를 후천성 면역결핍증(AIDS)로 진단된 환자에게 투여한 다음, 혈장 중 HIV의 RNA 수치를 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 투여에 의하여, HIV의 RNA 수치가 유의미하게 감소함을 확인할 수 있었으며, 또한 투여에 의하여 HIV 바이러스가 미검출된 환자도 확인할 수 있었다. 이러한 HIV의 감소 또는 미검출은 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 HIV 증식 억제 내지 사멸효과를 의미할 뿐만 아니라, AIDS의 치료의 증거가 된다. 특히, AIDS 환자에 대한 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 투여로 인한 HIV 미검출은 AIDS 치료제로서 주목할 만한 결과로서, AIDS 완치의 가능성을 제시하는 결과이다.
따라서, 본 발명에서는 상기 동질적인 세포주 파쇄물 및 추출물을 함유하는 조성물이 후천성 면역결핍증의 예방 및 치료 효과를 나타냄을 제시하는 구체적인 실시예가 없다 하더라도, 상기에서 살펴본 바와 같이 그 세포주가 후천성 면역결핍증의 예방 및 치료에 활성을 가지는 것을 확인한바, 본 발명에 따른 동질적인 세포주 파쇄물 또는 추출물을 함유한 조성물의 경우에도 후천성 면역결핍증의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하 다고 할 것이다.
본 발명에 따른 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물, CD4+ T 세포를 증가시키는 면역 증진제는, 상기 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 각각 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.
본원에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명에 따른 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물을 첨가함으로써 식품의 기능성을 향상시킨 것을 의미한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포주의 후천성 면역결핍증(AIDS)의 예방 및 억제 효과를 확인하였으나, 그 파쇄물 또는 그 추출물, 및 그 세포주를 함유하는 배양물을 사용해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예
1: 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 제조
1-1: 식물재료의 준비
(1) 도 1의 (a)의 A는 본 발명에서 사용한 산삼의 전형적인 모습을 보여준다. 산삼을 준비한 다음, 산삼의 주근부를 사용하기 위해 흐르는 물로 겉표면에 묻어 있는 흙이나 그 외의 오염물질을 제거하고 액체 세제를 이용하여 주근의 표면을 씻어 준 다음, 흐르는 물에 방치를 하였다. 깨끗하게 씻은 조직은 클린벤치 내에 준비된 멸균된 플라스크에 넣고 70% 에탄올로 30초 내지 1분 정도 살균하였다. 그 후 멸균수로 헹궈 주고 1% 내지 1.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite, Junsei, Japan)을 이용하여 5분 내지 15분 정도로 소독액을 처리하였다. 이때, 소독액이 효과적으로 조직 내로 침투하게 하기 위해 TWEEN 20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate, Junsei, Japan)을 몇 방울 정도 떨어뜨려 처리하였다. 이 과정이 마쳐지면 멸균수로 3회 내지 5회 정도로 헹궈 주었다. 이 후에 살균 처리한 조직의 갈변화를 방지하기 위해 항산화제가 포함된 BIM(browning inhibition medium)에 살균된 주근을 넣고 30분 내지 1시간 정도 진탕배양하고 멸균된 여과지에 놓고 물기를 제거하였다.
사용된 BIM의 조성 및 사용농도는 표 1과 같다.
<표 1> BIM 조성 및 사용 농도
| 구성성분 | 사용농도 |
| McCown WPM salt | 1/4 strength |
| Sucrose | 1%(w/v) |
| PVP(polyvinyl pyrrolidone) | 0.5%(w/v) |
| Ascorbic acid | 100mg/L |
| Citric acid | 150mg/L |
| pH 5.8로 보정 | |
여기서, 염농도는 전체의 1/4에 해당하는 양만 첨가한다.
그 후, 상기 재료를 갈변이 되는 것을 방지하기 위해 항산화제가 포함된 CS solution (cutting sloution, 표 2)이 담긴 멸균 접시에 놓고, 겉껍질을 얇게 벗겨 내고 반으로 갈라 각 부분에서 분열능이 왕성한 형성층 부분이 포함되게 해서 가로×세로×높이=0.5~0.7cm×0.5~0.7cm×0.2~0.5mm의 크기로 절단을 하였다. 도 1의 (a)의 B는 산삼의 주근부에서 형성층이 포함되도록 상기 크기로 절단을 하여 절편체를 제조한 모습이다.
<표 2> CS(cutting solution)
| 구성성분 | 사용농도 |
| PVP(Polyvinyl pyrrolidone) | 0.5%(w/v) |
| Ascorbic acid | 100mg/L |
| Citric acid | 150mg/L |
(2) 생물반응기(bioreactor)에서 유지 중인 100년된 산삼부정근을 준비하고 역시 표 2의 CS solution이 담긴 멸균접시에 놓고 역시 상기와 동일한 방법으로 형성층을 포함하는 절편체를 수득하였다.
1-2: 산삼 주근부 형성층 포함 절편체에의 삼투제의 처리
실시예 1-1에서 제조된 절편체에서, 분화된 조직 즉, 사부, 목부, 수 등은 괴사시키고 분열조직인 형성층만을 생존시키기 위해 삼투 스트레스를 처리하였다. 상기 형성층 포함 절편체를 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1, 표 3)에 블로팅(blotting)을 하여 1M 수크로오즈(Duchefa, Netherland) 용액이 담긴 플라스크에 넣어 냉장상태에서 16~24시간 동안 삼투스트레스를 처리한 후 0.05M 수크로오즈 용액(sucrose solution)에서 5분간, 0.1M sucrose 용액에서 5분간 처리하여 고농도의 sucrose에 의한 스트레스를 해제하였다. 그 후 상기 삼투 스트레스가 해제된 형성층 포함 절편체를 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1)에 올려서 물기를 제거하였다.
<표 3> 전치상 배지(배지 1) 조성
| 조성 | mM | mg/L | |
| Macroelements |
Ca(NO3)2 | 2.35 | 471.26 |
| NH4NO3 | 5 | 400 | |
| MgSO4·7H2O | 1.5 | 180.54 | |
| K2SO4 | 5.68 | 990 | |
| CaCl2·2H2O | 0.65 | 72.5 | |
| KH2PO4 | 1.25 | 170 | |
| 조성 | μM | mg/L | |
| Microelements |
MnSO4·4H2O | 131.94 | 22.3 |
| ZnSO4·7H2O | 29.91 | 8.6 | |
| Na2MoO4·2H2O | 1.03 | 0.25 | |
| H3BO3 | 100.27 | 6.2 | |
| CuSO4·5H2O | 1.0 | 0.25 | |
| FeNa-EDTA | 100 | 36.7 | |
| Vitamin |
Glycine | 26.64 | 2.0 |
| myo-Inositol | 554.94 | 100 | |
| Nicotinic acid | 4.06 | 0.5 | |
| Pyridoxine-HCl | 2.43 | 0.5 | |
| Thiamine-HCl | 2.96 | 1.0 | |
1-3: 산삼의 형성층 포함
절편체에서
형성층 기원의 동질적인 세포주 유도
형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 유도하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 삼투 스트레스를 처리한 절편체를 세포주 유도 배지 (배지 2, 표 4)에 치상하였다. 치상에 사용된 배지는 하기 <표 4>에 수록된 바와 같다. 치상된 절편체는 22±1℃ 암조건에서 배양하였다.
<표 4> 형성층 기원의 동질적인 세포주 유도를 위한 배지 조성(배지 2)
| 조성 및 조건 | 사용농도 및 조건 |
| Salt | Full strength WPM |
| Sucrose | 3%(w/v) |
| IAA(Indole-3-acetic acid) | 2mg/L |
| pH | 5.8 |
| Gelrite | 0.3%(w/v) |
| Ascorbic acid | 100mg/L |
| Citric acid | 150mg/L |
이때, 삼투 처리를 하지 않고 바로 동질적인 세포주 유도배지에 치상한 절편체에서는 <표 5>에 수록된 바와 같이 치상 초기(2~3일 내)에 빠르게 형성층 중심으로 노랗게 반응을 보이다가 시간이 지나면서 절편체 전체가 노랗게 변하는 양상을 보였다. 형성층 중심의 노란 반응을 보인 절편체를 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주 분리 및 증식 최적 배지(배지 3)에 계대를 하여 계속적인 동질적인 세포주 유도 및 증식을 시도하였으나 갈변 양상이 심화되었고, 시간이 경과해도 갈변 반응외에 어떤 반응도 보이지 않았다.
반면, 삼투 처리를 하고 해제를 한 후 동질적인 세포주 유도배지에 치상한 절편체는 <표 5>에 기재된 바와 같이, 다른 조직에서는 세포가 유도되지 않고 형성층에서만 특이적으로 동질적인 세포가 유도됨이 관찰되었다. 즉, 삼투 처리를 한 후, 해제를 하여 치상한 절편체에서는 배양 3~7일 사이에 절편체의 형성층 부위가 연노랑색으로 변하기 시작하였다. 이로부터 약 7~14일 후 연노랑색으로 변한 부위에서 동글동글한 세포주가 유도됨을 관찰하였다. 이때, 노지산삼의 형성층 포함 절편체 및 산삼부정근의 형성층 포함 절편체 모두 동일한 결과가 관찰되었다. 도 1의 (a)의 C는 산삼의 형성층 포함 절편체 중 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질성 세포주가 유도된 모습을 나타낸다.
한편, 삼투 처리를 한 절편체를 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질적인 세포주 유도배지가 아닌 통상적인 인삼, 산삼 등 인삼류 배양에서 사용하는 2,4-D를 포함하는 배지를 사용하였을 때는 배양 7~10일 사이에 절편체의 전체 부분이 노랑색으로 변하기 시작해서 이로부터 약 7~14일 후 전체 절단면에서 세포가 유도됨이 관찰되었다.
<표 5> 삼투 처리 한 절편체와 처리하지 않은 절편체의 반응 비교
| 처리별 | 무처리 | 16시간 처리 | 20시간 처리 | 24시간 처리 |
| 양상 | 치상 초기에 형성층 중심으로 노란 반응이 진행되면서 이런 반응이 절편체 전체로 퍼지는 경향을 보였음. 그 후 형성층을 포함한 절편체 전체적으로 갈변 반응이 심하게 진행되어 더 이상 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질성 세포주 유도는 나타나지 않았음 | 형성층에서만 특이적으로 세포가 유도됨이 관찰됨. 삼투 스트레스 처리 시간을 달리하여 처리한 결과, 서로 유사한 결과를 보였음. 즉, 상기 처리 시간별 반응물간 큰 차이는 보이지 않음. |
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1-4: 분리된 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주의 증식
상기 실시예 1-3에서 유도된 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 이용하여 증식에 사용하였다. 배지는 하기 <표 6>에 제시된 기본 염(salt) 조성을 바탕으로 <표 7>에 제시된 대로 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주의 증식 최적 배지를 사용하였다. 이때, <표 7>에서 2,4-D는 노지산삼의 형성층으로부터 유도된 동질적인 세포주의 증식에, IBA는 산삼부정근으로부터 유도된 동질적인 세포주의 증식에 사용하였다.
<표 6> 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주 분리 및 증식 최적 배지의 기본 salt 조성
| 조성 | mM | mg/L | |
| Macroelements | CaCl2ㆍ2H2O | 2.99 | 332.02 |
| KH2PO4 | 1.25 | 170 | |
| KNO3 | 18.79 | 1900 | |
| MgSO4 | 1.5 | 180.54 | |
| NH4NO3 | 20.61 | 1650 | |
| 조성 | uM | mg/L | |
| Microelements | CoCl2·6H2O | 0.11 | 0.025 |
| CuSO4·5H2O | 0.1 | 0.025 | |
| FeNa-EDTA | 100 | 36.7 | |
| H3BO3 | 100.27 | 6.2 | |
| KI | 5.0 | 0.83 | |
| MnSO4·4H2O | 100 | 16.9 | |
| Na2MoO4·2H2O | 1.03 | 0.25 | |
| ZnSO4·7H2O | 29.91 | 8.6 | |
| Vitamins | Glycine | 26.64 | 2.0 |
| myo-Inositol | 554.94 | 100 | |
| Nicotinic acid | 4.06 | 0.5 | |
| Pyridoxine-HCl | 2.43 | 0.5 | |
| Thiamine-HCl | 0.3 | 0.1 | |
<표 7> 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주 분리 및 증식 최적 배지 조성(배지 3)
| 조성 및 조건 | 사용농도 및 조건 |
| Salt | Full strength MS |
| Sucrose | 3%(w/v) |
| IBA (Indole-3-butyric acid) 또는 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) | 2mg/L |
| pH | 5.8 |
| Gelrite | 0.3%(w/v) |
| Ascorbic acid | 100mg/L |
| Citric acid | 150mg/L |
도 1의 (a)의 C에 나타난 바와 같이 삼투 스트레스 처리와 배지 2를 사용하여 형성층에서만 특이적으로 동질적인 세포가 유도된 후, <표 8>에 제시된 배지 3으로 계대한 결과, 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포가 계속적으로 분열·증식하여 배양 약 10~20일 후에 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 분리할 수 있었다. 이렇게 분리된 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주를 동일 배지 에서 배양하여 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 다시 증식시켰다. 도 1 (a)의 D는 분리된 형성층 특이적 동질적인 세포주를 <표 7>에 제시된 배지 3에서 증식시킨 모습이다.
1-5: 분리된 세포주의 특성관찰
상기 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주를 하기 <표 8>의 액상 배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다. 이때, <표 8>에서 2,4-D는 노지산삼의 형성층으로부터 유도된 동질적인 세포주의 배양에, IBA는 산삼부정근으로부터 유도된 동질적인 세포주의 배양에 사용하였다.
한편, 인삼의 자엽 유래 캘러스(callus)도 <표 8>의 배지 4에서 배양하여 본 발명에 따른 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주와 비교하였다.
<표 8> Suspension medium in Panax ginseng . (배지 4)
| 조성 및 조건 | 사용농도 및 조건 |
| Salt | Full strength MS |
| Sucrose | 3%(w/v) |
| IBA (Indole-3-butyric acid) 또는 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) | 2mg/L |
| pH | 5.8 |
먼저 세포 응집정도(biological microscope CX31, Olympus, Japan)를 살펴 볼 때, <표 9>와 같이 본 발명에 따른 2,4-D를 처리한 노지산삼의 형성층 유래 세 포주는 현탁배양 시 95%이상의 단세포 수준으로 존재함을 관찰할 수 있었고, 본 발명에 따른 IBA를 처리한 부정근의 형성층 유래 세포주 역시 60%이상이 단세포 수준으로 존재함이 관찰되어, 본 발명에 따른 세포주는 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재하는 특징이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1(b)의 A에 나타난 바와 같이, 2,4-D를 처리한 노지산삼의 형성층 유래 세포주 및 IBA를 처리한 부정근의 형성층 유래 세포주 모두 다수개의 작은 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 관찰할 수 있었으며, 미분화상태임을 확인할 수 있었다. 그러나 이에 반하여, 인삼 자엽 유래 캘러스(callus, 생물자원센터, KCTC PC10224)를 관찰한 결과, 도 1 (b)의 B에 나타난 바와 같이, 다수개의 작은 액포가 관찰되지 않고 하나의 큰 액포가 관찰된 것으로 나타났다.
<표 9> The type of cell aggregates of Panax ginseng long-term cultures
| Large cell aggregates |
Moderate cell aggregates |
Small cell aggregates |
Single cell population |
Explant source |
| 90% |
7% |
2% |
1% |
cotyledon |
| 0 |
0 |
5% |
95% |
cambium (2,4-D처리시) |
| 5% |
10 |
25% |
60% |
cambium (IBA 처리시) |
| Large cell aggregates, size higher than 1.5×103㎛; Moderate cell aggregates 1×103㎛; Small cell aggregates 4×102㎛＜size＜ 1×103㎛ |
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한편, 대량 배양 가능성을 살펴보기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서 인삼의 자엽(cotyledon) 유래 캘러스와 본 발명에 따른 산삼의 형성층 유래 동질성 세포를 배양하였다. 배지는 <표 8>의 액체배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1°C로 일정하게 유지하였다.
그 결과, <표 10>에 나타난 바와 같이, 인삼의 자엽(cotyledon) 유래 배양물의 배가시간(doubling time)은 플라스크에서는 21일인데 반해 반응기(reactor)에서는 28일로 길어졌다. 이것은 반응기 내에서의 생장고리 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 전단에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 판단되었다.
한편, 본 발명에 따른 2,4-D를 처리한 노지산삼의 형성층 유래 세포 배양물의 배가시간은 3~4일로, IBA를 처리한 산삼부정근의 형성층 유래 세포 배양물의 배가시간은 5~6일로, 모두 플라스크와 반응기 사이에 차이가 없거나 오히려 단축되었다. 형성층 유래 동질적인 세포 배양물은 생물반응기 내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 링(ring)이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작으며, 크기가 작고 많은 액포(vacuole)를 가지고 있어 전단에 대한 민감성이 약하여 세포 생존율(cell viability)의 감소를 가져오지 않는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주는 대량배양을 위한 생물 반응기에서 교반작용에 따른 전단 스트레스에 대하여 낮은 민감성을 가지므로, 생물반응기 내에서 급속 대량 생장이 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 전단스트레스에 대하여 5~9배의 낮은 민감성을 가짐을 알 수 있었다.
<표 10> 액체 현탁배양 및 생물 반응기에서의 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주와 인삼 자엽 유래 세포의 배가 시간
| Explant source |
Doubling time (day) | |
| flask | bioreactor | |
| cotyledon | 21 | 28 |
| cambium (2,4-D 처리시) |
5 |
3~4 |
| cambium (IBA 처리시) |
7 |
5~6 |
한편, 이질적인 세포주인 인삼 자엽(cotyledon) 유래 캘러스(생물자원센터, KCTC PC10224)와 형성층 유래 동질적인 세포주에 대하여 동결보존을 실시하였다. 현탁배양물은 배양 6일에서 8일 된 것을 사용하며, 동결보존제는 0.5M glycerol(DUCHEFA, The Netherlands)과 0.5M DMSO(DUCHEFA, The Netherlands)와 1M sucrose(DUCHEFA, The Netherlands) 포함된 배지이고, 5ml cryovial(Duran, USA)에 옮겼다. 동결보존제에 처리되는 세포 접종량은 200mg/ml 이다. 동결보존제 처리된 현탁세포는 30분간 냉동고에 유지한 다음 deep freezer에 3시간 보관 후 액체질소에 침지시켜 냉동시켰다.
그 후 해빙을 위하여 액체질소에 20분 이상 유지된 배양세포를 꺼내어 40℃ 항온수조에 넣고 1~2분간 해동시켰다. 세포 재생장을 위해, 세포 현탁액을 무균상태의 깔때기 및 여과지를 사용하였다. 여과된 세포는 filter paper가 포함된 고형생장배지상에 적용시키고 30분간 실온에서 안정화 시킨 다음, 다시 신선한 고형생장배지로 다시 옮겨졌다.
그 결과, 인삼 자엽 유래 이질적인 세포주는 재생장을 하지 않는 반면, 형성 층 유래 동질적인 세포주는 4주 후 재생장을 시작하여 증식하는 양상을 보였고 증식률 상에 있어서 동결보존 전 후 차이를 보이지 않았다.
실시예
2: 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포주의 건조 및 추출물 제조
실시예 1의 산삼부정근의 형성층 유래 동질적인 세포주로부터 다음과 같이 건조 및 추출하였다.
(1) 건조 세포주의 제조
(i) 배양액을 제거시킨 세포주를 동결건조 또는 열풍건조 하였다.
(ⅱ) 상기 건조된 세포주는 분쇄기를 이용하여 분쇄하여 얻었다.
(2) 증류수 추출물의 제조
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 세포주 및 열풍건조, 동결건조 세포주 500g에 5000ml의 증류수를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 추출하여 얻었다.
(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다.
(ⅲ) 상기에서 얻은 증류수 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 감압 농축하였다.
(3) 에탄올 추출물의 제조
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 세포주 및 열풍건조, 동결건조 세포주 500g에 5000ml의 에탄올를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 추출하여 얻었다.
(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 에탄올 가용성물질을 얻었다.
(ⅲ) 상기에서 얻은 에탄올 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 감압 농축하였다.
실험예
1: 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 후천성 면역결핍증 예방 및 치료 효과의 확인 (1)-
CD4
+ T 세포 수/
CD8
+ T 세포 수의 비 측정
본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 후천성 면역결핍증 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여, HIV(human immunodeficiency virus) 양성 반응을 보이는 AIDS 환자(76년생, 남, 2006년 8월 AIDS 감염자로 진단됨)에 대하여 상기 실시예 2의 (1)에서 제조된 건조 세포주 분쇄물을 파우더 형태로 투여하였다. 복용은 하루에 세 번 (아침, 점심 및 저녁) 1g씩 물에 용해한 형태로 9일 (투여시작: 2008년 8월 19일)간 경구투여하였다. 투약 중 다른 AIDS 치료제의 복용은 없었으며, 투여로 인한 부작용은 없는 것으로 나타났다.
투여 9일 후, 환자로부터 채혈한 후 각 샘플을 CD4 항원에 대한 피코에리드린-결합 항체 (phycoerythrin-conjugated antibodies)와 CD8 항원에 대한 형광 이소티오시아네이트-결합 항체 (fluoresein isothiocyanate-conjugated antibodis)로 배양 (Simultest reagent; Becton dichknson, San Jose, CA)하였다. 즉, CD4+ 및 CD8+ T 세포들은 상기 방법대로 염색한 후, FACScan flow cytometer (Becton- Dickinson)로 제조사가 제시한 설명서의 측정방법에 따라 측정하였다. 상기에서 얻어진 세포 수를 기초로, CD4+ T 세포 수/ CD8+ T 세포 수의 비를 계산하였다.
<표 11> 임상례 1
| 검사항목 | 참고치 | 20070502 | 20070627 | 20070829 | 20071024 | 20071226 | 20080227 | 20080430 | 20080603 | 20080617 | 20080702 | 20080730 | 20080827 |
| 검사간격(일) | 56 | 63 | 56 | 63 | 63 | 63 | 34 | 14 | 15 | 28 | 28 | ||
| CD4+T | 500~1500cells/㎕ | 431 | 390 | 490 | 448 | 387 | 397 | 350 | 403 | 352 | 408 | 280 | 616 |
| CD8+ T | 800~1200cells/㎕ | 762 | 581 | 756 | 384 | 1000 | |||||||
| CD4/CD8 | 1 | 0.53 | 0.61 | 0.54 | 0.73 | <0.62 | |||||||
투여시작시점: 2008년 8월 19일
그 결과, 상기 표 11 및 도 2에 나타난 바와 같이, 투여 후 CD4+ T 세포의 수가 ㎕당 616 세포 수로 측정되어 참고치를 기준으로 볼 때, 정상치에 달함을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포주의 투여에 의하여 CD4+ T 세포의 수가 증가한 것으로 나타났다.
또한, CD8+ T 세포 수의 경우도 투여 전 ㎕당 384 세포 수로 매우 적게 측정되었으나, 투여 후 정상 범위 내로 관찰되었다. 따라서, 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주의 투여에 의하여 CD8+ T 세포의 수도 증가한 것으로 확인되었다.
한편, CD4+ T 세포의 수/CD8+ T세포의 수 비는 투여 직전보다 투여 후 1에 가까운 양상으로 관찰되었다. 통상적으로 정상인에서 CD4+ T 세포의 수/CD8+ T세포의 수 비율은 1 정도이나, AIDS 환자의 경우 CD4+ T 세포의 수가 절대적으로 감소하고 CD8+ T세포의 경우는 AIDS 초기에는 면역과활성화가 진행되어 CD8+ T세포 수가 증가하는 양상을 보이다가 점차 감소하는 양상으로 나타난다. 따라서, AIDS 초기에는 CD4+ T 세포의 수/CD8+ T세포의 수 비율이 감소하는 경향을 보이다가 이 비율이 변하는 양상으로 나타난다.
상기 실험결과에서는 투여 직전 CD4+ T 세포의 수 / CD8+ T 세포의 수가 투여 후 오히려 감소하였으나, 이는 투여 전 CD8+ 세포의 수도 급감함에 따른 것으로 투여 후 결과는 CD4+T 세포수와 CD8+ T 세포 수가 정상범위내로 증가된 것으로 나타난바, 전반적으로 HIV에 대한 면역성은 증가된 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따른 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포주는 HIV에 의해 감소된 면역성을 증가시키며, 후천성 면역결핍증(AIDS)에 대한 예방 및 치료 효과가 있는 것으로 확인되었다.
실험예
2: 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 후천성 면역결핍증 예방 및 치료 효과의 확인 (2) -
CD4
+ T세포 수치의 측정
본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 후천성 면역결핍증 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여, 추가적으로 HIV 양성 반응을 보이는 AIDS 환자들에 대하여 상기 실시예 2의 (1)에서 제조된 동결건조 세포주 분쇄물을 파우더 형태로 투여하였다. 복용은 하루에 세 번 (아침, 점심 및 저녁) 1g씩 물에 용해 한 형태로 경구투여하였다. 투약 중 다른 AIDS 치료제의 복용은 없었으며, 투여로 인한 부작용은 없는 것으로 나타났다.
투여기간은 환자별로 상이하며, 투여 후 환자에게서 2~3mL의 혈액을 채혈하여 각 샘플에 BD MultiTESTTM 시약(CD3 형광 이소티오시아네이트 항체(FITC), CD8 피코에리드린 항체(PE), CD45 페리디닌 클로로필 단백질 항체 (PerCP), CD4 allophycocyanin 항체(APC); Becton-Dickinson, Britain)을 가하여 각 형광-라벨된 항체가 혈구 표면 항원에 결합하게 한 후, Facs cd4 machine (BD, Britain)로 제조사가 제시한 설명서의 측정방법에 따라 CD4 수치를 측정하였다.
측정한 결과 및 각 환자별 투여기간은 다음과 같다.
<표 12> 임상례 2 (SEX/BIRTH: F/49; 국적: 가나; 투여개시일: 2009-07-29)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) |
| before | 2009-07-28 | 180 |
| 1st | 2009-08-05 | 500 |
임상례 2의 환자의 경우, 투여 전 AIDS로 인한 극심한 증상은 없었으나, 투여 전 3개월간 기침, 두통, 설사, 고혈압, 붉은 반점이 확인되었으나, 투여 후 이러한 증상들이 감소되었으며, 투여 전 CD4+ T 세포의 수치가 180으로 매우 낮았으나, 투여 후 500으로 정상범위로 높아졌음을 확인할 수 있었다.
AIDS의 면역결핍은 CD4+ T 세포의 결손 때문에, AIDS 환자로부터 잔류하는 CD4+ T 세포의 항원에 대한 반응은 감소되거나 없어져서 필수적인 면역-조절 인자의 이상 생성이 나타나는 것으로, CD4+ T 세포의 수 또는 퍼센티지를 측정하여 치료경과를 확인하는바, 이러한 CD4+ T 세포의 증가는 본 발명에 따른 동질적인 세포 주가 AIDS를 치료하는 효과가 있음을 나타낸다.
<표 13> 임상례 3 (SEX/BIRTH: M/32; 국적: 가나; 투여개시일: 2009-09-10)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) |
| before | 2009-09-09 | 260 |
| 1st | 2009-09-16 | 316 |
임상례 3의 환자의 경우, AIDS로 진단받은 후 ARV(anti-retro virus) 치료제를 복용한 경험이 없는 환자로 복용 후 단기간 동안 수치가 260에서 316으로 증가되었음을 확인할 수 있었으며, 이러한 CD4+ T 세포의 증가는 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 AIDS를 치료하는 효과가 있음을 나타낸다.
<표 14> 임상례 4 (SEX/BIRTH: F/31; 국적: 가나; 투여개시일: 2009-06-20)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) |
| before | 2009-06-19 | 282 |
| 1st | 2009-07-17 | 320 |
임상례 4의 환자의 경우, CD4+ T 세포의 수치가 투여 전 282에서 320으로 증가된 것으로 확인되었으며, 이러한 CD4+ T 세포의 증가는 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 AIDS를 치료하는 효과가 있음을 나타낸다.
<표 15> 임상례 5 (SEX/BIRTH: M/38; 국적: 가나; 투여개시일: 2009-06-20)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) |
| before | 2009-06-19 | 443 |
| 1st | 2009-07-17 | 485 |
| 2nd | 2009-09-08 | 559 |
임상례 5의 환자의 경우, CD4+ T 세포의 수치가 투여 전 443에서 559로 계속 적으로 증가된 것으로 확인되었으며, 이러한 CD4+ T 세포의 증가는 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 AIDS를 치료하는 효과가 있음을 나타낸다.
<표 16> 임상례 6 (SEX/BIRTH: M/45; 국적: 가나; 투여개시일: 2009-08-12)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) |
| before | 2009-08-11 | 484 |
| 1st | 2009-08-19 | 527 |
| 2nd | 2009-09-09 | 613 |
임상례 6의 환자의 경우, CD4+ T 세포의 수치가 투여 전 484에서 613으로 계속적으로 증가된 것으로 확인되었으며, 이러한 CD4+ T 세포의 증가는 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 AIDS를 치료하는 효과가 있음을 나타낸다.
<표 17> 임상례 7 (SEX/BIRTH: F/45; 국적: 가나; 투여개시일: 2009-06-24)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) |
| before | 2009-06-23 | 690 |
| 1st | 2009-07-08 | 1073 |
임상례 7의 환자의 경우, 투여로 인하여 만성기침, 빈혈 등 통상 AIDS에 수반되는 증상들이 해소되는 효과를 확인할 수 있었으며, CD4 수치가 690에서 1073으로 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다.
상기 측정결과를 종합하면, 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주는 CD4+T 세포수의 수를 증가시키는 것으로 확인되었다. AIDS의 면역결핍이 CD4+ T 세포의 결손 때문으로 AIDS 환자로부터 잔류하는 CD4+ T 세포의 항원에 대한 반응은 감소되거나 없어져서 필수적인 면역-조절 인자의 이상 생성이 나타남을 고려할 때, 본 발명에 따른 산삼의 형성층 유래 세포주는 후천성 면역결핍증(AIDS)에 대한 예방 및 치료 효과가 있는 것으로 확인되었다.
실험예
3: 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 후천성 면역결핍증 예방 및 치료 효과의 확인 (3) -
HIV
의
RNA
수치 측정
본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 후천성 면역결핍증 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여, HIV의 RNA 측정을 위한 RT-PCR 수행이 가능한 HIV 양성 반응을 보이는 AIDS 환자들에 대하여 추가적으로 HIV 바이러스 RNA 수치를 측정하였다.
실험예 3과 동일하게 각 AIDS 환자들에 대하여 상기 실시예 2의 (1)에서 제조된 동결건조 세포주 분쇄물을 파우더 형태로, 복용은 하루에 세 번 (아침, 점심 및 저녁) 1g씩 물에 용해한 형태로 경구투여하였다. 투약 중 다른 AIDS 치료제의 복용은 없었으며, 투여로 인한 부작용은 없는 것으로 나타났다.
투여기간은 환자별로 상이하며, 투여 후 환자에게서 혈액을 채혈한 다음 이로부터 혈장(plasma)를 수득하여 RoChe사(스위스)의 COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Test, version 2.0[v2.0]을 이용하여 제조사의 지침에 따라 정량적인 RT-PCR을 수행하였다. 이때, HIV-1 RNA의 정량은 동일회사의 COBAS® TaqMan® Analyzer 또는 COBAS® TaqMan® 48 Analyzer를 이용하여 측정하였다. 한편, 일부 환 자에 대해서는 CD4+ T 세포의 수도 함께 측정하였으며, 이는 실험예 2와 동일한 방법으로 측정하였다.
측정한 결과 및 각 환자별 투여기간은 다음과 같다.
<표 18> 임상례 8 (SEX/BIRTH: M/51; 국적: 케냐; 투여개시일: 2009-06-20)
| Time | Date | HIV-1 RNA (copies/mL) (정상범위: 미검출) |
| before | 2009-06-19 | 6,252 |
| 1st | 2009-07-02 | 3,574 |
임상례 8의 환자의 경우, AIDS로 진단받은 후 ARV 치료제를 복용한 경험이 없는 환자로 혈장 중 HIV-1 RNA 수치를 측정한 결과, 첫번째 테스트에서 투여 전 6,252의 데이터에 비하여 3,574로 수치가 급감함을 확인할 수 있었다.
이러한 HIV 바이러스의 현저한 감소는 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 HIV 바이러스를 증식 억제 내지 사멸하는 효과를 가짐을 의미할 뿐만 아니라, AIDS의 치료 또는 예방용 조성물로서 유효하게 사용할 수 있음을 보이는 증거가 된다.
<표 19> 임상례 9 (SEX/BIRTH: F/38; 국적: 가나; 투여개시일: 2009-09-10)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) | HIV-1 RNA (copies/mL) (정상범위: 미검출) |
| before | 2009-09-10 | 377 | 1,508 |
| 1st | 2009-09-16 | 380 | 1,675 |
| 2nd | 2009-09-24 | - | 751 |
임상례 9의 환자의 경우, 첫번째 테스트 결과에서는 소폭의 증가만을 보였으나, 이후 두번째 측정결과 혈장 중 HIV-1 RNA 수치가 투여 전 1,508의 데이터에 비하여 751로 수치가 급감함을 확인할 수 있었다.
이러한 HIV 바이러스의 현저한 감소는 본 발명에 따른 세포주가 HIV 바이러 스를 증식 억제 내지 사멸하는 효과를 가짐을 의미할 뿐만 아니라, AIDS의 치료 또는 예방용 조성물로서 유효하게 사용할 수 있음을 보이는 증거가 된다.
<표 20> 임상례 10 (SEX/BIRTH: M/34; 국적: 케냐; 투여개시일: 2009-06-20)
| Time | Date | HIV-1 RNA (copies/mL) (정상범위: 미검출) |
| before | 2009-06-19 | 18,232 |
| 1st | 2009-07-02 | 6,791 |
| 2nd | 2009-07-17 | 3,847 |
| 3rd | 2009-09-01 | 1,875 |
임상례 10의 환자의 경우, 투여 전 혈장 중 HIV-1 RNA 수치가 18,232로 매우 높았으나, 이후 계속적인 투여에 의하여 점차 감소하여 1,875로 급감되었음을 확인할 수 있었다.
이러한 HIV 바이러스의 현저한 감소는 본 발명에 따른 세포주가 HIV 바이러스를 증식 억제 내지 사멸하는 효과를 가짐을 의미할 뿐만 아니라, AIDS의 치료 또는 예방용 조성물로서 유효하게 사용할 수 있음을 보이는 증거가 된다.
<표 21> 임상례 11 (SEX/BIRTH: F/26; 국적: 태국; 투여개시일: 2009-07-19)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) | HIV-1 RNA (copies/mL) (정상범위: 미검출) |
| before | 2009-03-21 | 233 | 36,594 |
| 1st | 2009-09-16 | 387 | 30,000 |
임상례 11의 환자의 경우, CD4 수치의 증가와 HIV-1 RNA의 감소 모두 확인할 수 있었으며, 이에 본 발명에 따른 세포주가 AIDS의 치료 또는 예방용 조성물로서 유효하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<표 22> 임상례 12 (SEX/BIRTH: F/35; 국적: 가나; 투여개시일: 2009-08-12)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) | HIV-1 RNA (copies/mL) (정상범위: 미검출) |
| before | 2009-08-10 | 919 | 45,209 |
| 1st | 2009-08-19 | 962 | 18,786 |
임상례 12의 환자의 경우, CD4 수치의 증가와 HIV-1 RNA의 감소 모두 확인할 수 있었으며, 이에 본 발명에 따른 세포주가 AIDS의 치료 또는 예방용 조성물로서 유효하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<표 23> 임상례 13 (SEX/BIRTH: F/35; 국적: 가나; 투여개시일: 2009-06-24)
| Time | Date | CD4 count(X 105/L) | HIV-1 RNA (copies/mL) (정상범위: 미검출) |
|
| before | 2009-06-24 | 414 | - | |
| 1st | 2009-07-08 | 457 | - | |
| 2nd | 2009-07-29 | 490 | - | |
| 3rd | 2009-08-05 | 550 | - | |
| 1st | 2009-09-16 | - | 2,709 | |
| 2nd | 2009-09-24 | - | 2,540 | |
임상례 13의 환자의 경우, 초기 투여기간 중에는 CD4 수치만을 측정하여 수치가 점차 증가함을 확인하였으며, 이후 두차례에 걸쳐 HIV-1 RNA 수치를 측정하여 투여에 따라 감소함을 확인하였다. 이러한 실험결과는 본 발명에 따른 세포주가 AIDS의 치료 또는 예방용 조성물로서 유효하게 사용될 수 있음을 제시한다.
<표 24> 임상례 14 (SEX/BIRTH: M/46; 국적: 미얀마; 투여개시일: 2009-05)
| 투여기간 | HIV-1 RNA (copies/mL) (정상범위: 미검출) |
| 약 2개월 | 미검출 |
임상례 14의 환자의 경우, 도 3에 나타난 바와 같이, 약 2개월의 투여 후 HIV-1 RNA가 미검출로 확인되었다 (임상례 14의 환자의 경우, QIAGEN사(독일)의 artus®HIV-1 RG RT-PCR 키트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 Rotor-Gene Real-Time 분석을 수행하였다). AIDS 환자에 대한 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 투여로 인한 HIV 미검출은 AIDS 치료제로서 주목할 만한 결과로서, AIDS 완치의 가능성을 제시하는 결과이다.
상기 측정결과를 종합하여 보면, 환자별 개인차로 인하여 감소 폭은 다를 수 있으나, 모두 본 발명에 따른 세포주의 투여에 의하여 HIV의 RNA의 수치가 감소함을 확인할 수 있었다. 이러한 HIV 바이러스의 감소 또는 미검출은 본 발명에 따른 세포주의 HIV 바이러스 증식 억제 내지 사멸효과를 의미할 뿐만 아니라, AIDS의 치료 및 예방의 증거가 된다.
제조예
1.
약학제제
제조예
제제예 1. 정제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 100㎎을 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합하여 통상의 정제제조방법에 따라 제조하였다.
제제예 2. 캡슐제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 500㎎을 연질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 3. 시럽제의 제조
실시예 1에서 제조된 세포주 1g, 이성화당 10g, 만니톨 5g, 적량의 정제수의 함량으로 통상적인 액제제의 제조방법에 따라 100㎖의 시럽제를 제조하였다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 200㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1%의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.
제조예 2. 기능성 식품의 제조 : 기능성 음료의 제조
제조예 1.
실시예 1에서 제조한 세포주 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
제조예 2.
실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조 제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 세포주의 유도과정(a)과, 산삼의 형성층 유래 세포주((b)A) 및 인삼의 자엽 유래 캘러스세포주(생물자원센터, KCTC PC10224)를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 산삼 형성층 유래 세포주를 투여하기 전 77일부터 투여 후 9일까지 CD4+ T 세포수 및 CD4+T 세포수/CD8+ T 세포수의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 임상례 14 환자에 대한 HIV-1 RNA 검출결과를 제시한다.
Claims (12)
- 인삼류(Panax ginseng)의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 후천성 면역 결핍증(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)의 예방 또는 치료용 조성물:(a) 탈분화 과정을 거치지 않은 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임; 및(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임.
- 제 1항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물:(a) 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재함;(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스 (shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐;(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및(d) 다수개의 액포(vacuole)을 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
- 인삼류(Panax ginseng)의 형성층에서 유도되고, 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물:(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
- 제3항에 있어서, 상기 (c) 단계는 유도된 형성층 유래 세포주를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 형성층 유래 세포주를 회수하는 것을 특징으로 하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것임을 특징으로 하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물.
- 인삼류의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 개선용 기능성 식품:(a) 탈분화 과정을 거치지 않은 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임; 및(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임.
- 제 6항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 개선용 기능성 식품:(a) 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재함;(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐;(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및(d) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
- 제6항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 개선용 기능성 식 품:(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
- 제8항에 있어서, 상기 (c) 단계는 유도된 형성층 유래 세포주를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 형성층 유래 세포주를 회수하는 것을 특징으로 하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 개선용 기능성 식품.
- 인삼류의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 T 세포를 증가시키는 면역 증진제:(a) 탈분화 과정을 거치지 않은 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임; 및(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임.
- 제10항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 T 세포를 증가시키는 면역 증진제:(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
- 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계는 유도된 형성층 유래 세포주를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 형성층 유래 세포주를 회수하는 것을 특징으로 하는 T 세포를 증가시키는 면역 증진제.
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