KR20090121944A - 해양미생물 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당뇨합병증을 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 해양 미생물 대사체를 유효성분으로 하는 당뇨합병증을 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 해양 미생물 대사체는 지방독성에 의한 혈관내피세포 사멸 및 염증반응 억제에 탁월한 효능을 나타내어 당뇨합병증의 대표적인 인 동맥경화증을 억제하는데 효과가 있음을 확인하였다.

혈관내피세포, 당뇨병성 합병증, 동맥경화증

Description

해양미생물 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing and treating diabetic complications comprising marine microorganism metabolite}

본 발명은 당뇨합병증을 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 해양 미생물 대사체를 유효성분으로 하는 당뇨합병증을 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 해양 미생물 대사체는 지방독성에 의한 혈관내피세포 사멸 및 염증반응 억제에 탁월한 효능을 나타내어 당뇨합병증의 대표적인 인 동맥경화증을 억제하는데 효과가 있음을 확인하였다.

당뇨병은 혈액 내 포도당 농도가 높아져서 발병하는 만성 대사 질환이다. 혈중 당농도가 높으면 췌장 베타세포는 이를 인지하여 인슐린을 분비하고 분비된 인슐린은 표적세포(근육, 간, 지방세포)에서 포도당 흡수를 촉진하여 혈당을 낮추게 한다. 그러나 식후 일정시간이 지나도 혈액 내 포도당 농도가 높은 수준으로 유지되거나, 공복시에도 혈액 내 포도당 농도가 높은 수준으로 유지되면 당뇨병이라 말 한다. 혈액 내에 포도당이 지속적으로 증가되면 눈, 신장 및 신경 손상뿐만 아니라 뇌경색, 협심증 및 말초혈관질환 등의 심각한 합병증의 발생을 높이는 것으로 알려져 있으며 그 중에서도 혈관 합병증이 발생할 위험이 높은 것으로 알려져 있다.

당뇨병성 혈관 합병증은 크게 미세혈관 합병증과 대혈관 합병증으로 나눌 수 있다. 미세혈관 합병증은 당뇨병 환자에게 흔하게 발생하는 실명과 신부전증의 원인이 되며 망막, 신장 사구체, 신경내막 등 작은 혈관에 양성인 당질을 포함한 혈장 단백질이 침착되는 것이 특징이다. 대혈관 합병증은 일반적으로 죽상경화증을 의미하는데, 죽상경화증이란 혈관 안쪽에 죽상반이라고 하는 지방의 덩어리가 축척됨으로써 혈관이 좁아지면서 딱딱해 지는 질환이다. 이는 당뇨병환자에서 가장 흔하고 중대한 만성합병증의 하나로 당뇨병 환자에게서는 발병 빈도가 비당뇨병환자에 비교하여 2∼4배 높으며 제 2형 당뇨병 환자 뿐 아니라 제 1형 당뇨병 환자의 주된 사망원인이 된다 (Robertson LA et al., Mechanisms linking diabetes mellitus to the development of atherosclerosis: a role for endoplasmic reticulum stress and glycogen synthase kinase-3. Can J Physiol Pharmacol 84: 39-48, 2006).

혈관은 크게 내막, 중막, 외막의 3개의 층으로 구성되어 있다. 내막은 혈액이 흐르는 가장 안쪽으로 내피세포로 이루어져 있고, 중막은 평활근 세포, 외막은 콜라겐으로 이루어져 있다. 당뇨병성 대혈관 합병증의 발달은 혈관 안쪽에 존재하는 혈관내피세포의 세포사와 기능이상으로부터 시작하여 면역세포가 활성화되고 cytokine, growth factor들이 면역세포와 혈관세포로부터 분비되어 결과적으로는 평활근 세포의 증식을 유도하는 인자들을 분비하여서 혈관 내강이 좁아지고 탄력성을 잃게 되어 발생한다. 따라서 혈관 합병증은 내피세포의 세포사, 면역세포의 활성화, 평활근 세포의 증식 등이 주요 원인으로 알려져 있으며 이들은 서로 밀접하게 연관되어 있다 (Victor J et al., : Vascular proliferation and atheroscerosis: New perspectives and therapeutic strategies. Nature Med 8: 1249-1256, 2002). 최근에는 고밀도 지단백 (high density lipoprotein, HDL)의 감소와 저밀도 지단백 (low density lipoprotein, LDL)의 산화적 변형 또한 중요한 인자로 알려져 있다 (Dersch K, Ichijo H, Bhakdi S, Husmann M: Fatty acids liberated from low-density lipoprotein trigger endothelial apoptosis via mitogen-activated protein kinases. Cell Death Differ 12: 1107-1114, 2005).

앞에서 설명한 것처럼 혈관내피세포는 혈액이 흐르는 가장 안쪽에 존재하는 세포로 건강한 혈관을 유지하기 위해서 여러 가지 생리적 과정에 작용하고 있는데 그 중에서 가장 중요한 기능은 자극에 의해서 혈관 확장물질을 분비하는 것이다. 혈관 확장물질로는 산화질소, prostacyclin 등이 있고 반면에 혈관 수축물질로는 endothelin-1, thromboxane 등이 있다. 특히 혈관 확장물질인 산화질소는 세포증식을 억제하여 혈관병변의 성장을 완화시키는 등 혈관질환의 예방에 중요한 역할을 하며, 또한 당뇨병 환자에서는 이러한 산화질소가 감소되어 있다고 알려져 있다 (Kim JA etal., : Reciprocal relationship between insulin resistance and endothelial dysfunction: Molecular and pathophysiological mechanisms. Circ 113: 1888-1904, 2006). 이처럼 혈관내피세포는 혈관의 항상성과 기능유지에 중요 하기 때문에 혈관내피세포이상이나 세포사가 생기면 혈관 합병증을 일으키는 여러 요인들이 더욱 많이 유발되게 되는 결과가 생기게 된다. 따라서 혈관내피세포의 세포사와 기능이상은 혈관 합병증을 유발하는 하나의 원인이 된다. Lee 등의 연구에 의하면 혈관 합병증이 유도된 당뇨병성 동물 모델인 Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rat (OLETF)에서 내피세포사멸이 혈관 합병증 유도에 원인이 됨을 알 수 있다 (Lee WJ et al., : Alpha-lipoic acid prevents endothelial dysfunction in obese rats via activation of AMP-activated protein kinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol 25: 2488-2494, 200). 또한 죽상경화증이 걸린 환자의 혈관 조직에서 내피세포의 세포사가 증가되어 있다고 보고되어있다(Olivier T et al., : Relation between endothelial cell apoptosis and blood flow direction in human atherosclerotic palques. Circ 101: 2450-2453 2000). 지금까지 보고된 혈관내피세포의 손상은 고혈당에 의한 산화 스트레스, angiotensin Ⅱ, oxidized-low density lipoprotein (ox-LDL), TNF-α같은 proinflammatory cytokine, Plasma free fatty acid (FFA) 같은 인자들에 의해서 유도된다고 알려져 있다.

FFA는 고혈압, 비만, 당뇨병과 같은 대사증후군에서는 높은 농도로 존재하며 그로 인해서 혈관내피세포는 FFA에 많은 시간 노출되어있는 것이 사실이다. 또한 이 같은 대사증후군 환자에게서는 혈관 합병증이 많이 유발되기 때문에 FFA에 의한 혈관내피세포 사멸의 연구는 더욱더 중요하다. 일반적으로 FFA는 포화지방산 (Saturated fatty acid)과 불포화지방산 (Unsaturated fatty acid)으로 나누어지며 포화지방산 중 가장 높은 농도를 보이는 palmitate는 다른 조직에서 세포사를 일으 킨다고 알려져 있다 (Harald S et al., : Palmitate-induced interleukin-6 expression in human coronary artery endothelial cells. Diabetes 53: 3209-3216, 2004). Palmitate의 대사과정은 다음과 같다. 우선 세포 내로 유입된 palmitate는 palmitoyl-CoA로 전환되는데, 이러한 palmitoyl-CoA는 여러 가지 물질을 합성할 수 있는 전구체로 작용한다. 첫째 palmitoyl-CoA는 serine과 함께 ceramide 합성유도하고, 둘째 포도당으로부터 대사된 glyceraldehyde-3-phosphate와 함께 DAG의 합성을 증가시키고 triglycerol의 합성을 유도한다. 셋째 palmityl-CoA는 마이토콘드리아로 유입되어 citrate로 대사되고 citrate는 γ-linolenoyl CoA와 결합하고 여러 단계를 거쳐 Arachidonic acid (AA)가 된다. 이렇게 대사가 된 대사 중간 물질들은 혈관내피세포에서 독성 물질로 작용하며, 또한 중간 대사물질이 세포의 사멸과 연관된 신호를 조절할 수 있다. 지금까지 보고된 palmitate로 인한 혈관내피세포의 세포사에 대한 기작을 보면 가장 많이 알려진 것은 ROS 합성의 증가 (Yamagishi 등, 2002)와 산화스트레스 증가 또는 Bcl-2 같은 anti-apoptotic 분자의 감소로 인하여 mitochondria에서 cytochrome C의 방출에 의한 세포사멸, MAP-kinase인 p38의 인산화와 serine/threonine protein phosphatase type 2Cβ (PP2Cβ)의 활성을 통해 혈관내피세포의 세포사가 일어난다는 결과도 있다 (Dersch K et al.,: Fatty acids liberated from low-density lipoprotein trigger endothelial apoptosis via mitogen-activated protein kinases. Cell Death Differ 12: 1107-1114, 2005). 즉 FFA는 다양한 기작으로 혈관 내피세포에 손상을 유도할 수있으며 이는 죽상경화증을 유도하는 시발점이 될 수 있다.

혈관 합병증의 특징 중 하나는 내피세포의 기능이상과 연관되어 면역반응 표지들의 발현이 증가되어 있다는 것이다. 이러한 표지들로는 cytokine의 분비, adhesion molecule, macrophage와 T cell의 활성화가 있다 (Belay Tesfamariam 등, 2007). 이전까지 알려져 있는 면역반응 증가의 기작을 보면 TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α)와 IL-1β (Interleukins-1β) 같은 cytokine의 증가는 JNK와 IKKβ에 의한 것이며 이로 인해 AP-1, NF-κB가 활성화된다고 알려져 있다. 또한 활성화 된 NF-κB에 의해서 ICAM (Intercellular Adhesion Molecule), VCAM (Vascular Cell Adhesion Molecule), E-selectin 같은 adhesion molecule들이 활성화 된다. 이러한 adhesion molecule의 활성화는 혈관질환을 유발한다고 보고되어 있다. 반면 당뇨환자에게서 감소되어 있는 NO는 anti-inflammatory 기능을 가지고 있으며 NF-κB의 활성을 억제한다고 알려져 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 당뇨합병증을 억제 또는 예방하는 물질을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

해양미생물 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨 합병증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 해양 미생물은 Chromohalobacter 속인 것이 바람직하고, 상기 미생물은 Chromohalobacter salexigens(KCTC 11333BP)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 있어서, 상기 해양 미생물 대사체는 헥산 용매로부터 추출되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 있어서, 상기에 기재된 용매 외에도 물 또는 예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등과 같은 C1-4의 알콜, 또는 이들의 혼합용매를 용매로 사용하여 추출하여 열탕추출, 소니케이션 등 통상의 방법으로 추출물을 형성하거나, 이 추출물의 동결건조물을 형성하여 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "해양 미생물"이란 강화도 주변 갯벌시료를 채취하여 갯 벌 시료로부터 Zobell 배지를 이용하여 균주를 분리한 후, 새로운 배지에서 집락의 형태등에 따라 각각의 균주를 순수 분리하여 배양했다.

본 발명에 있어서, "해양 미생물 대사체"란 해양 미생물이 Zobell 배지에 존재하는 영양성분을 이용하여 성장하면서 생산해내는 모든 대사 산물을 의미하며, 대사산물은 세포 내에 존재하거나, 미생물이 분비하는 경우에는 배지에 존재한다.

또한 본 발명은 a) 해양 미생물 균주를 배양하는 단계;

b) 상기 배양된 균주를 용매를 이용하여 추출하는 단계;

c) 상기 추출된 해양 미생물 대사체를 농축하는 단계; 및

d) 상기 농축된 대사체를 분리하는 단계를 포함하는 당뇨 합병증 예방 및 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 당뇨합병증 질환은 뇌졸중, 관상동맥성 심장질환, 동맥경화증, 심근경색 등의 심혈관 질환, 피부 감염, 세소혈관증, 신경병증, 치료약제에 의한 피부반응 등에 의한 피부 증상, 수정체의 혼탁, 백내장, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증 또는 당뇨병성 신경병증, 바람직하게는 뇌졸중, 관상동맥성 심장질환, 동맥경화증, 심근경색 등의 심혈관 질환이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 동맥경화증이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 당뇨합병증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 해양 미생물 대사체를 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴,칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate),수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등

이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가 능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol),마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 내지 600 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 500 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 해양 미생물 대사체를 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다.

또한, 당뇨합병증 질환의 예방 및 치료 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 해양 미생물 대사체를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파

르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명을 설명한다.

당뇨병성 환자들의 혈액에는 포도당과 지방산이 증가 되어 있기에 일반인에 비해서 혈관질병이 유발할 가능성이 4배 이상 높다. 본 발명은 혈관내피세포사멸 및 내피세포의 손상을 억제함으로 당뇨병성 동맥경화증 발병을 억제하기 위해 안출 되었으며, 해양 미생물로부터 혈관내피세포 사멸 및 염증반응 억제하는 물질 개발이 본 발명의 목적이다. 본 발명자들은 수백종의 해양미생물에서 대사체를 추출하였고 지방독성에 대해서 혈관내피세포 사멸 및 염증반응을 억제하는 물질을 검색한 결과 CCRB608-2을 개발하였다. CCRB608-2은 종래의 몇몇 당뇨병 치료제에 비해 우수한 혈관내피세포 사멸 및 염증반응 억제 효과를 보였으며, 해양 미생물로 부터 무제한으로 생산해 낼 수 있는 것이 그 특징이다.

본 발명은 1) 해양 미생물로부터 대사체를 분리하는 단계 및 분리된 미생물 추출물의 독성시험 단계, 분리한 해양미생물 대사체의 효능을 검사하기 위해서 혈관내피세포에 불포화지방산인 palmitate를 첨가하여 혈관내피세포 사멸과 염증반응을 유도하는 시스템을 구축하는단계, 2) 혈관내피세포에 CCRB608-2을 전처리하고 palmitate를 첨가한 후 혈관내피세포 사멸과 단구세포의 혈관 부착 및 단구세포 부착 단백질의 발현 정도를 분석하는 효능 확인 단계로 구성되어있다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여, 상세하게 살펴보기로 한다.

1. 해양미생물 배양, 추출 및 균주 동정

도 1a는 해양미생물에서 혈관내피세포 사멸 및 염증을 억제하는 물 질(CCRB608-2)의 추출방법을 나타내는 흐름도이며, 도 1b는 CCRB608-2을 생산해내는 균주를 Easy24plusE kit를 이용하여 생리학적 검사를 한 결과이며, 도 1c는 CCRB608-2 생산 균주의 16s rDNA를 분리하여 sequencing한 균주 동정 결과이다.

도 1a는 갯벌시료를 한천배지에 배양시키고 순수 분리한 CCRB608-2 생산 균주를 사각 배양 병 (Nalgene squre bottle)에서 sea water complete medium을 이용하여 수일간 진탕 배양시켜서 배양액을 얻는 대량 생산 단계이다. 본 단계를 통해 순수 분리된 미생물로 혈관내피세포 사멸 및 염증반응 억제 물질을 제한 없이 생산 할 수 있다. 다음 단계는 추출단계로 상기 얻어진 배양액에 헥산(hexane) 유기 용매를 첨가하여 진탕 혼합시킨 후, 일정시간을 방치하여 유기용매층을 분리하는 것이다. 본 발명에서는 특히 헥산 유기용매를 사용하는 것이 바람직하였고, 이러한 유기용매에 포함되어 있는 추출물을 얻기 위하여 유기용매층을 분리하였다. 다음 단계는 상기 분리된 유기용매층을 회수하여 농축시킨 후, 용매를 제거하여 CCRB608-2을 회수하는 단계이다. 이와 같이 유기용매층을 농축시킨 다음에 용매를 제거하여 추출물을 회수하면, 불순물이 거의 없고 유효성분함량이 높은 추출물을 얻을 수 있다.

CCRB608-2를 생산하는 균주 동정을 위하여 생리학적 검사와 16s rDNA를 분리하였고 sequencing을 수행하였다. 생리학적 검사는 Easy24plusE kit를 사용하여 해양미생물의 활성 특성을 조사하였다. 그 결과를 도 1b에 도시하였고, 추출물은 Chromohalobacter salexigens 균에 속하는 것임을 확인하였다. 다음으로 CCRB608-2 생산균주의 16s rDNA를 분리하였고 sequencing을 수행하여 동정 작업을 진행하였 다. 그 결과 CCRB608-2 생산균주가 Chromohalobacter salexigens sp균에 속하는 것임을 확인하였으며, 상기 균주를 Chromohalobacter salexigens sp CCRB608-2로 명명하였다.

상기 균주는 대한민국 대전시 유성구 소재 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 5월 15일 KCTC11333BP로 기탁하였다.

2. Zibrafish embryogenesis 를 이용한 CCRB608 -2의 독성 시험

본 실험은 상기 분리한 CCRB608-2의 독성 유무를 판단하기 위한 실험으로 Zibra fish embryogenesis 시기에 CCRB608-2를 첨가한 후 배발생을 형태학적으로 관찰하고 부화율을 측정하였다. 본 실험은 Yeo MK 등의 선행연구에서 제시한 방법에 따라 수행하였다(Yeo MK.,:The effect of Bisphenol A and nonylphenol on zebrafish embryogenesis. Korea Society Environmental Health 29(5):1-7, 2003). 각각의 군 별로 50개의 배를 발생시키고 배발달 단계중 제 2 세포기 단계 즉 0.75 hpf (hour post fertilized)에 CCRB608-2와 cisplatin을 처리하고 8 hpf, 10 hpf, 24 hpf에 실체 현미경을 이용하여 관찰하였다. 배 발생 단계의 관찰을 위한 기준은 Kimmel et al. 의 방법을 따랐다(Kimmel W et al.,: Stages of embryonic development in zebra fish. Developmental Dynamic 203:253-310, 1995). 부화율은 약제를 첨가하고 72 시간 후에 측정한 값으로 전체 수정이된 개체들 중 부화된 개체을 백분율로 계산하였다.

3. 지방산 독성을 이용한 혈관내피 사멸 및 염증반응 모델 구축

본 실험은 상기 분리한 CCRB608-2의 효능을 검증하기 위하여 구축한 실험이 다. 지방 독성을 이용한 혈관내피세포의 사멸과 염증 모델을 구축하기 위하여, 불포화 지방산인 palmitate를 혈관세포에 첨가하여 혈관내피세포 독성을 유발시키고 일정시간이 지난 후 MTT 분석을 통해 세포 생존력을 측정하였으며, 단구 세포 부착 반응과 단구 세포 부착 분자 발현 정도를 형광 현미경과 RT-PCR을 이용하여 분석하였다.

3.1 Palmitate 준비

Palmitate/BSA (bovineserum albumin) 의 결합은 Listenberger의 방법에 다라 준비하였다. 20 mM의 palmitate 용액과 0.01M NaOH를 70℃에서 30분 동안 교반기에서 배양 후 fatty acid soaps를 PBS에 녹여져있는 5% BSA와 3:1의 비율로 섞어준다. 만들어진 Palmitate/BSA 결합체를 농도에 맞추어 세포에 넣어 배양한다.

3.2 생존력 확인 실험

혈관내피세포의 생존 확인을 위해서 MTT 실험을 수행하였다. 혈관내피세포에 0.5 mg/ ml 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetra zoiliumbrom ide (MTT)를 첨가하고 37℃, CO₂ 배양기에서 2시간 배양한다. 상등액을 제거한 후 acidic isopropanol (0.04 N HCl)을 첨가하여 RT에서 30분 동안 배양한 후 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존력을 확인하였다.

3.3 Caspase 3

Palmitate에 의한 혈관내피세포 사멸의 형태는 주로 apoptosis이며, 이과정 에서 caspase 3 라는 단백질 활성을 동반한다. CCRB608-2가 palmitate에 의한 caspase 3 활성을 조절하는지 확인하기 위하여 웨스턴브랏 분석을 이용하였다. 혈관내피세포를 분주하고 24 시간 후 CCRB608-2를 다양한 농도로 세포에 전처리하고 palmitate를 첨가한다. 24 시간 후 세포를 수거하고 웨스턴브랏 분석을 통해 세포의 caspase 3 활성을 조사하였다.

3.4 혈관내피세포에 단구세포의 부착 확인 실험

CCRB608-2의 효능 실험으로 혈관 내피세포에 단구세포의 부착 정도를 확인 할 수 있는 실험이다. 건강한 공여자의 혈액으로부터 Ficoll-Paque^TM PLUS (Amersham BioScience. Cat No. 17-1440-02, AB Uppsala, Sweden ) 분리법을 통해 단구세포를 분리한다. 즉 우선 혈액 10 ml과 동량의 PBS를 섞어서 준비한다. 50 ml 튜브에 20 ml ficol을 넣고 그위에 준비한 동량의 혈액을 ficol과 섞이지 않게 첨가한다. 700 g 로 20분 동안 원심분리 후 중간층에 있는 단구세포를 모아 RPMI 1640 (Cellgro Cat. No. 50-020-PB, mediatech, VA, USA) 배지로 세척하고 다시 500 g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 모은다. 다음 단계는 단구세포를 형광염료인 Calcein (BD^TM Calcein AM Fluorescent Dye, Cat No, 354217, San Diego, CA)으로 염색하는 과정으로, calcein을 RPMI 배지로 1: 3000배 희석하여 튜브에 있는 세포와 섞어서 37℃에서 1시간 동안 배양한다.

한편 1 X 10⁵의 혈관내피세포를 24 well plate에 분주하고 37℃에서 24시간 동안 배양 한 후 palmitate를 150 μM로 처리하고 6시간 정도 배양하여 준비한다. Calcein으로 염색된 단구 세포를 palmitate 처리한 혈관 내피세포에 첨가하여 1시간 배양 후 혈관내피세포를 PBS로 3번 세척하고 단구세포의 부착정도를 형광 현미경을 이용하여 분석한다.

3.5 혈관내피세포에서 부착 분자 발현 확인 실험

1 X 10⁵의 혈관내피세포를 24 well plate에 분주하고 37℃에서 24시간 동안 배양 한 후 palmitate를 150 μM로 처리하고 6시간 정도 배양하여 준비한다. RT-PCR 방법을 이용하여 I-CAM 등 부착 분자들의 발현을 확인한다.

프라이머 이름	시퀀스
GAPDH (Forward)(서열번호:1)	5'-TGG TAT CGT GGA AGG ACT CAT G-3'
GAPDH (Reverse) (서열번호:2)	5'-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3'
VCAM (Forward) (서열번호:3)	5'-ATG ACA TGC TTG ACC AGG-3'
VCAM (Reverse) (서열번호:4)	5'-GTG TCT CCT TCT TTG ACA CT-3'
ICAM (Forward) (서열번호:5)	5'-AAT GCC CAG ACA TCT GTG TCC C-3'
ICAM (Reverse) (서열번호:6)	5'-GGC AGC GTA GGG TAA GGT TCT T-3'

상기 표는 부착 분자 발현 확인 프라이머이다.

혈관내피세포를 12 well plate에 3×10⁵ 개씩 분주하여 24시간 배양한 후, 150 μM palmitae를 처리하고 6시간 더 배양하였다. 배양 후 RNA Zol-B를 이용해 전체 RNA를 뽑고 정량하였다. 1 ug의 RNA를 1000 u AMV 역전사 효소 0.5 ul, 2.5 mM dNTP 4 ul, Random 9mer 1 ul, RNase inhibitor 0.5 ul, Mgcl₂ 4 ul, 10× RT buffer 2 ul와 혼합아여 30˚C 10분, 42˚C 30분, 99˚C 5분 동안 역전사 반을 시켜 cDNA를 합성하였다. 이렇게 얻어진 cDNA로 아래의 primer 들을 사용하여 PCR (32 cycle)을 진행하였다. 1.5% agarose gel에서 PCR반응물을 전기 영동하여 Ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 분석하였다.

4. CCRB608 -2의 효능확인

도 2, 3은 혈관내피세포에서 CCRB608-2의 효능을 확인한 실험이다. 혈관내피세포에 CCRB608-2을 전처리하고 불포화지방산인 palmitate를 첨가하여 일정시간 배양 후 MTT 분석을 통해 혈관내피세포 생존력을 측정하였고, western blotting 기법으로 caspase 3 활성을 측정하였다. 그 결과 CCRB608-2은 지방독성에 의한 혈관내피세포 사멸을 탁월하게 억제시키는 효과를 나타냈다. 불포화지방산인 palmitate는 혈관내피세포에 염증반응을 유도하여 혈관세포에 I-CAM, V-CAM, E-selectin 발현을 증가시켜 단구세포가 잘 부착하는 환경을 조성한다. CCRB608-2가 palmitate에 의한 혈관내피세포의 염증반응을 조절 할 수 있는지 확인하기 위하여 혈관내피세포에 CCRB608-2를 전처리하고 palmitate를 첨가하여 일정시간 배양 후 단구세포의 부착 능력과 I-CAM 발현을 RT-PCR로 측정하였다. 그 결과 CCRB608-2은 지방독성에 의한 혈관내피세포 염증반응을 탁월하게 억제시키는 효과를 나타냈다.

해양미생물인 Chromohalobacter salexigens 로 부터 분리된 대사체(CCRB608-2)는 당뇨합병증 중 하나인 동맥경화증 발병을 유도하는 혈관 내피세포의 손상을 억제하고, 손상된 부위에 염증세포의 부착을 억제하여 염증반응을 줄이는 것을 보여주었다. 또한 본 발명으로 얻어진 CCRB608-2은 인간의 제대 정맥 혈관내피세포 (human umbilical vein endothelial cell)에서 지방산에 의한 세포독 성을 억제하는 효과를 보였다. CCRB608-2은 양성 대조군인 NAC과 비교하여 볼때 3배 이상의 혈관내피세포 사멸억제 효과를 나타냈고 다른 양성 대조군인 LiCl과 비슷한 수준의 혈관내피세포 생존력 보호 효과를 나타냈다. 또한 CCRB608-2은 혈관내피세포에서 caspase 3 활성을 농도 의존적으로 억제하였다. 또한 CCRB608-2은 지방독성과 TNF-α에 의한 혈관 내피세포의 활성 및 단구세포의 혈관내피세포 부착을 억제하는 특성을 나타냈다. CCRB608-2는 현재 알려진 당뇨합병증 중 대표적인 예인 동맥경화증 치료제 중 항산회제 보다 지방독성에 의한 혈관내피세포 손상 및 염증반응 억제에 탁월한 효능이 있음을 확인하였다.

이하에서는 본 발명을 비한정적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자한다. 본 발명 하기부분은 발명을 이해를 돕고자 예시를 들어 부연 설명하였다.

실시예 1: 해양미생물 배양 및 추출

해양미생물은 강화도 주변 갯벌시료를 췌취하여 ZoBell 배지 (5 g peptone, 1g yeast extract, Agar 15 g/liter, Aged Sea water 50 % in D.W. pH 7.0)을 이용하여 분리하고 순수 배양하여 준비하였다. 단계 1은 갯벌에서 순수 분리한 CCRB608-2 생산 균주를 사각 배양 병 (Nalgene squre bottle)에서 sea water complete medium (해양 완전배지: 5 g Bacto tryptone, 3g Yeast extract, 3 ml Glycerol, Aged Sea water 75 % in D.W. pH 7.0)을 이용하여 5일간 170 rpm, 30℃ 로 진탕 배양시켜서 배양액을 얻는 대량 생산 배양 단계이다. 본 단계를 통해 순수 분리된 미생물로 혈관내피세포 사멸 및 염증반응 억제 물질을 제한 없이 생산할 수 있다. 2 단계는 추출단계로 상기 얻어진 배양액에 대한 유기용매 추출은 각 균주의 배양액에 대하여 유기용매 Hexane (polarity index = 0.06)을 이용하여 추출하였으며, 배양액 500 ml에 각각의 유기용매 500 ml을 첨가하여 유기용매에 추출될 물질이 충분히 추출될 수 있도록 Shaking Incubator에서 16 시간 이상 진탕 혼합 (170 rpm, 30℃) 후 유기용매 층과 배양액 층을 모두 separation funnel에 옮겨서 두층이 분리되도록 4 시간 이상 방치하였다. 두 층이 분리되면 유기용매 층만을 회수하여 speed vacuum evaporator를 이용하여 유기 용매층을 농축시킨 다음에 용매를 완전히 제거하여 추출물을 회수하여, 불순물이 거의 없고 유효성분함량이 높은 추출물을 얻었다.

실시예 2: 생리학적 검사 및 16s rDNA sequencing 에 의한 균주 동정

상기 2에 따라서 생리학적 검사 및 16s rDNA sequencing으로 균주 동정을 수행하였다. 자세한 결과는 도 1b에 도시하였다.

균주의 형태는 1000 X 광학 현미경하에서 수행하였다. 생리학적 검사는 장내 세균 동정 키트인 Easy24plusE kit (Komed 사, 한국)를 사용하였고, 활성이 확인된균주는 16s rDNA sequencing를 통해 동정 작업을 수행하였다. 해양 미생물에서 chromosomal DNA를 분리한 후 16s rDNA에 특이한 primer를 이용하여 sequcing하였다. 그 결과 상기 2에 따른 추출물은 Chromohalobacter salexigens 균에 속하는 것임을 확인하였다. 16s rDNA sequencing 결과는 도 1b에 그 결과를 기록하였다.

실시예 3: Zibra fish 를 이용한 CCRB608 의 독성 시험

상기 분리한 CCRB608-2의 독성 유무를 판단하기 위한 실험으로 Zibra fish embryogenesis 시기에 CCRB608-2를 첨가한 후 배발생을 형태학적으로 관찰하고 부화율을 측정하였다. Zebrafish는 본 실험실에서 사육된 7-8월령의 zebrafish (Danio rerio, wild type)를 사용하였다. 약 300개의 zebrafish egg를 수정하고 배발생을 위해 탄소 여과장치를 거친물에서 28.5℃로 배양하며 배를 발생 시켰다. 각각의 실험군은 약 50개의 배를 한 그룹으로 하였고 실험군에 약물처리는 0.75 hpf (hour post fertilized)시기인 배발달 단계 중 제 2 세포기 단계에 수행하였다. 실험군에는 CCRB608-2 200 ㎍/ml, 대조군에는 동량의 DMSO, 음성 대조군에는 cisplatin 30 ㎍/ml을 처리하였다. 약물 처리 후 8 hpf, 10 hpf, 24 hpf 시기에 실체 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과 실험군인 CCRB608-2 처리한 군은 대조군과 비슷한 모양의 배발생 형태를 보인 반면에 cisplatin을 처리한 음성 대조군은 8 hpf 시기부터 대조군과는 상이한 모양을 보였고 10 hpf 시기에는 배의 한면부터 죽어가는 모습을 보였으며 24 hpf 시기에는 세포들이 완전히 죽은 모습을 나타냈다. 각 군의 부화율은 약제를 첨가하고 72 시간 후에 측정하였다. 부화율은 전체 수정이된 개체들 중 부화된 개체을 백분율로 계산하였다. 그 결과 대조군인 DMSO 처리군에서는 53%의 부화율을 보였고 실험군인 CCRB608-2 처리한 군은 51%의 부화율을 나타냈으며 음성 대조군인 cisplatin 군은 34%의 낮은 부화율을 나타냈다. 즉 CCRB608-2는 zibrafish 배발생기와 부화율에 어떤 영향도 주지 않았기에 CCRB608-2 자체의 독성은 없다고 할 수 있다.

실시예 4: 분리한 해양 미생물대사체의 효능확인

분리한 해양미생물 대사체의 효능을 검사하기 위해서 혈관내피세포에 CCRB608-2을 전처리하고 불포화지방산인 palmitate를 첨가하여 혈관내피세포 사멸과 단구세포의 혈관 부착 및 단구세포 부착 단백질의 발현 정도를 분석하였다.

4-1. 혈관내피세포의 확보

실험에 사용한 혈관내피세포는 인간의 제대 정맥 내피세포(HUVECs)로써 실험에 자주 이용되고있는 대표적인 내피세포 중 하나이다. CloneticsHUVECs 는 Cambrex Bio Science (Cat No. C2519A, Walkersville, Md., USA) 구입하였고, 여러명의 공여자로부터 분리한 혈관내피세포가 함께 섞여있는 배치였다. 분양 후 6 passage의 세포를 질소 탱크에 저장하였고 모든 실험은 7 passage에서 배양한 세포를 사용하였다. 혈관내피세포를 배양하기 위한 배지로 EGM-2 bullet kit (Clonetics Cat. No. CC-4176, Walkersville, Md., USA)를 이용하였고 100 ㎍/ml streptomycin (Cas. NO. 3810-74-0, Duchefa biochemie, Haarlem, Netherland)로 첨가하여 사용하였다. 혈관내피세포는 5% CO₂와 37℃의 온도를 유지하면서 배양하였다.

4.2 CCRB608 -2 실험군 및 대조군

본 발명에 따른 혈관내피세포 사멸억제 물질인 CCRB608-2은 DMSO에 녹여서 주사기 여과기 (0.2 uM)를 이용하여 멸균상태를 유지하여 사용하였다. 또한 CCRB608-2의 세포사멸억제 활성 측정 테스트를 위한 양성 대조군 시료로는 ROS를 scavinging하는 물질인 2 mM N-acetylcysteine (NAC)과 GSK 억제제인 LiCl를 이용하였고, 음성 대조군 시료로는 DMSO를 이용하였다. NAC, LiCl 과 DMSO는 Sigma-Aldrich (Sigma korea NAC Cat. No. A9165, LiCl Cat. No. L4408, DMSO Cat. No. C6164, Kyunggi-do., Korea)에서 구입하여 사용하였다.

4.3 혈관내피세포에서 CCRB608 -2의 효능확인 실험

본 발명에 따른 추출물인 CCRB608-2가 palmitate에 의한 혈관내피세포 사멸에 효능이 있는지 확인한 실험으로 혈관내피세포는 인간의 배꼽 정맥 혈관내피세포를 이용하였으며, MTT assay와 caspase 3 활성 측정을 통해서 세포의 생존력 및 사멸을 확인하였다. 또한 혈관내피세포에 CCRB608-2을 전처리하고 불포화지방산인 palmitate를 첨가하여 단구세포의 혈관 부착 및 단구세포 부착 단백질의 발현 정도를 RT-PCR로 분석하였다.

4.3.1 CCRB608 -2은 palmitate 에 의한 혈관내피세포 사멸 독성을 억제함

본 발명의 추출물인 CCRB608-2을 혈관내피세포에 40 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μg/ml의 전 처리하고, 30분 후 150 μM palmitate을 처리하고 24시간 37℃, CO₂ 배양기에서 배양한다. MTT 분석을 통해 세포의 생존력을 측정하였다. 도 2 A는 혈관내피세포에서 CCRB608-2 처리시 palmitate에 의한 내피세포사멸이 억제된 결과 그래프이다.

즉, 혈관내피세포를 2X 10⁴의 농도로 96 well에 분주하고 배양기에서 24시간 배양한다. 본 발명의 추출물은 EGM-2 배지에 최종농도가 40 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μg/ml 준비하였고, 음성 대조군은 EGM-2 배지에 CCRB608-2과 동량의 DMSO를 첨가하여 준비하였고, 양성대조군은 2 mM NAC 과 10 mM LiCl를 배지에 첨가하여 준비하였다. 충분히 자란 96 well의 혈관내피세포에서 배지를 제거한 후 준비된 시료를 첨가하고 30분 후 150 μM palmitate를 첨가하여 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한다. 세포의 생존력 실험은 다음과 같은 과정으로 진행되었다. 배양이 끝난 혈관내피세포에 배지를 제거하고 0.5 mg/ml MTT를 100 ㎕씩 첨가하여 2-3 시간 CO₂ 배양기에서 배양한다. 상등액을 제거한 후 acidic isopropanol (0.04 N HCl)을 첨가하여 RT에서 30분 동안 배양한 후 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존력을 정량하였다. 그 결과를 도 3 a에 나타내었다.

결과를 정리하면, 도 3 a에 도시한 바와 같다. 각 실험은 3회 반복한 것으로 평균값으로 나타냈고 평균값 ± SD로 표시하였다. *는 통계 처리에 의한 유의성이 있음을 의미한다. 음성 대조군은 혈관내피사멸을 억제하지 못하였으며 양성 대조군인 NAC는 약 40%, LiCl은 80% 생존율을 나타냈다. 이는 문헌에서 제공되는 정보와 일치하는 것으로 양성 대조군의 실험이 정확하게 되었음을 의미한다. 실험군인 CCRB608-2는 80%의 생존율을 나타냈으며, 음성대조군 비교하여 탁월한 수준으로 세포사멸을 억제하였고, 농도 의존적으로 혈관내피세포 사멸을 억제하는 현상을 나타냈다.

4.3.2 CCRB608 -2은 palmitate 에 의한 caspase 3 활성을 억제함

본 발명의 추출물인 CCRB608-2을 혈관내피세포에 40 μg/ml, 20 μg/ml의 농도로 전 처리하고, 30분 후 150 μM palmitate을 처리하고 24시간 37℃, CO₂ 배양기에서 배양한다. 웨스턴브랏 분석을 통해 세포의 caspase 3 활성을 조사하였다. 도 3 b는 혈관내피세포에서 CCRB608-2 처리시 palmitate에 의한 caspase 3 활성이 저해된 결과이다.

즉, 혈관내피세포를 2X 10⁶의 농도로 60 φ에 분주하고 배양기에서 24시간 배양한다. 본 발명의 추출물은 EGM-2 배지에 최종농도가 40 μg/ml, 20 μg/ml이 되도록 준비하였고, 음성 대조군은 EGM-2 배지에 CCRB608-2과 동량의 DMSO를 첨가하여 준비하였다. 충분히 자란 혈관내피세포에 준비된 시료를 첨가하고 30분 후 150 μM palmitate를 첨가하여 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한다. caspase 3 활성 분석은 다음과 같은 과정으로 진행되었다.

세포를 수거한 후 PBS로 2번 세척하고 500 g로 원심분리 후 pellet만 취하여 100 ㎕의 RIPA Buffer[ 1% tritonX-1oo, 1% sodium deoxycholate, 50 mM sodium chloride, 50 mM tris-Hcl, 1 mM sodium vanadate, 1 mM PMSF]를 이용해 세포로부터 단백질을 분리, 정량하여 sample buffer[187 mM Tris-HCL(pH6.8), 6% SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0.3% bromphenol blue]에 희석하여 5분간 끓인 후 15% SDS-polyacrylamid gel에 30 ㎍ 단백질을 전기영동하였다. Gel에서 PVDF membranes으로 단백질을 이전하고 5% skim milk로 blocking 하였다. 일차항체인 cleaved caspase 3, actin antibodies (Cell Signaling technology Cleaved caspase 3 Cat. No. 9661, Actin Cat. No. 4968, Beverly., MA USA)를 반응 시키고 세척한 후 이차항체인 horseradish peroxidase linked antibodies를 부착후 ECL system (Amersham, UK)에서 cleaved caspase 3 활성을 확인하였다.

그 결과 음성 대조군은 caspase 3 활성을 유도하지 않은 반면 palmitate는 caspase 3 활성을 유도하였다. CCRB608-2은 20 μg/ml과 40 μg/ml 각각의 농도에서 caspase 3 활성을 음성 대조군과 같은 수준으로 저해하는 효과를 나타내었다.

4.3.3 CCRB608 -2는 혈관내피세포에 단구세포 부착을 억제함

본 발명의 추출물인 CCRB608-2을 혈관내피세포에 40 μg/ml과 20 μg/ml을 전 처리하고, 30분 후 150 μM palmitate 또는 TNF-α 10 ng/ml을 처리하고 6시간 37℃, CO₂ 배양기에서 배양한다. 일반 공여자의 혈액에서 단구세포를 분리하여 형광염색을 한 후 혈관내피세포와 함께 배양하고 일정시간이 지난 후 단구세포가 혈관세포에 어느 정도 부착되어 있는지 조사하였다.

즉, 혈관내피세포를 2X 10⁵의 농도로 24 well plate에 분주하고 배양기에서 24시간 배양한다. 본 발명의 추출물은 EGM-2 배지에 최종농도가 40 μg/ml, 20 μg/ml 준비하였고, 음성 대조군은 EGM-2 배지에 CCRB608-2과 동량의 DMSO를 첨가하여 준비하였다. 충분히 자란 24 well plate의 혈관내피세포에서 배지를 제거한 후 준비된 시료를 첨가하고 30분 후 150 μM palmitate 또는 TNF-α 10 ng/ml을 첨가하여 6시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한다. 단구세포는 상기 방법으로 준비하였다. 건강한 공여자의 혈액으로부터 Ficoll-Paque^TM PLUS를 이용해 단구세포를 분리하였다. 즉 우선 혈액 10 ml과 동량의 PBS를 섞어서 준비한다. 50 ml 튜브에 20 ml ficol을 넣고 그위에 준비한 동량의 혈액을 ficol과 섞이지 않게 첨가한다. 700 g 로 20분 동안 원심분리 후 중간층에 있는 단구세포를 모아 RPMI 1640 배지로 세척하고 다시 500 g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 모은다. 형광염료인 Calcein을 1:3000으로 희석하여 단구세포와 섞어서 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 형광 염색이된 단구세포를 배양하고 있는 혈관내피세포에 첨가하여 1시간 정도 배양 후 PBS로 3번 세척후 단구세포의 부착정도를 형광 현미경을 이용하여 분석한다.

그 결과 음성 대조군인 DMSO를 처리한 혈관내피세포에는 단구세포가 부착하지 않았고, palmitate 또는 TNF-α를 처리한 혈관내피세포는 각각 20%, 80%의 단구 세포가 부착하는 양상을 보였다. 이는 문헌에서 제공되는 정보와 일치하는 것으로 실험이 정확하게 진행되었음을 의미한다. 그러나 palmitate에 40 μg/ml, 20 μg/ml CCRB608-2을 전 처리한 혈관내피세포 의 단구세포 부착율은 각각 2%, 0% 였다. 또한 TNF-α에 40 μg/ml, 20 μg/ml CCRB608-2을 전 처리한 혈관내피세포 의 단구세포 부착율은 각각 40%, 30% 였다. 즉 CCRB608-2은 palmitate 또는 TNF-α에 의한 단구세포 부착 유의적으로 감소시키는 우수한 물질임을 확인하였다.

4.3.4 CCRB608 -2는 혈관내피세포에서 염증세포 부착 물질 발현을 억제함

본 발명의 추출물인 CCRB608-2을 혈관내피세포에 40 μg/ml, 20 μg/ml을 전 처리하고, 30분 후 150 μM palmitate을 처리하고 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양한다. 6 시간 후 RT-PCR 방법을 이용하여 ICAM 등 부착 분자들의 발현을 확인한다.

즉, 혈관내피세포를 2X 10⁵의 농도로 24 well plate에 분주하고 배양기에서 24시간 배양한다. 본 발명의 추출물은 EGM-2 배지에 최종농도가 40 μg/ml, 20 μg/ml 준비하였고, 음성 대조군은 EGM-2 배지에 CCRB608-2과 동량의 DMSO를 첨가하여 준비하였다. 충분히 자란 24 well plate의 혈관내피세포에서 배지를 제거한 후 준비된 시료를 첨가하고 30분 후 150 μM palmitate를 첨가하여 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양한다. 6시간 배양 후 RNA Zol-B를 이용해 전체 RNA를 뽑고 정량하였다. 1 ug의 RNA를 1000 u AMV 역전사 효소 0.5 ul, 2.5 mM dNTP 4 ul, Random 9mer 1 ul, RNase inhibitor 0.5 ul, Mgcl₂ 4 ul, 10× RT buffer 2 ul와 혼합아여 30˚C 10분, 42˚C 30분, 99˚C 5분 동안 역전사 반을 시켜 cDNA를 합성하였다. 이렇게 얻어진 cDNA로 상기 ICAM, GAPDH primer 들을 사용하여 PCR (32 cycle)을 진행하였다. 1.5% agarose gel에서 PCR반응물을 전기 영동하여 Ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 분석하였다.

그 결과 음성 대조군인 DMSO를 처리한 혈관내피세포에는 부착분자인 ICAM의 발현이 증가하지 않았고, palmitate를 처리한 혈관내피세포는 ICAM의 발현이 유도되었다. 이는 문헌에서 제공되는 정보와 일치하는 것으로 실험이 정확하게 진행되었음을 의미한다. 그리고 40 μg/ml, 20 μg/ml CCRB608-2을 전 처리한 혈관내피세포의 부착분자인 ICAM의 발현은 농도 의존적으로 감소하는 양상을 나타냈다. 즉 CCRB608-2은 palmitate에 의한 부착 분자인 ICAM의 발현을 감소시키는 우수한 물질 임을 확인하였다.

도 1은 CCRB608-2을 함유하는 해양미생물 균주동정 결과를 나타낸 그림.

도 1a는 해양미생물 배양 및 대사물질 추출 방법을, 1b는 CCRB608을 함유하는 해양미생물의 균주 동정 (16s rDNA sequencing 분석)을 나타낸다.

도 2는 Zibrafish에서 CCRB608-2의 독성 시험을 나타낸 그림.

2a는 Zibrafish 배발생 단계에 CCRB608-2 처리 후 형태학적 관찰을, 2b는 수정된 Zibrafish eggs에 CCRB608-2 처리 후 부화율 측정을 나타냄.

도 3은 혈관 내피세포에 CCRB608-2 처리 후 지방독성에 의한 사멸억제 효과를 나타낸 그림.

3a는 혈관내피세포 사멸억제 효과 (MTT 분석)를, 3b는 Caspase 3 활성 억제 효과 (사진)를 나타냄.

도 4는 혈관내피세포에 CCRB608-2을 처리 후 염증반응 저해 효과를 나타낸 그림.

4a는 혈관 내피세포에 단구세포의 부착 억제 효과를, 4b는 염증세포 부착 단백질 발현 억제 효과를 나타냄.

<110> Ajou University Industry Cooperation Foundation <120> Composition for preventing and treating diabetic complications comprising marine microorganism metabolite <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 1 tggtatcgtg gaaggactca tg 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 2 tccttggagg ccatgtgggc cat 23 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VCAM <400> 3 atgacatgct tgaccagg 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VCAM <400> 4 gtgtctcctt ctttgacact 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ICAM <400> 5 aatgcccaga catctgtgtc cc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ICAM <400> 6 ggcagcgtag ggtaaggttc tt 22

Claims (9)

1. 해양미생물 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨 합병증 예방 및 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 해양 미생물은 Chromohalobacter 속인 것을 특징으로 하는 당뇨 합병증 예방 및 치료용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 미생물은 Chromohalobacter salexigens(KCTC 11333BP)인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 해양 미생물 대사체는 헥산 용매로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 당뇨합병증 질환은 뇌졸중, 관상동맥성 심장질환, 동맥경화증, 또는 심근경색 심혈관 질환인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 조성물.
6. a) 해양 미생물 균주를 배양하는 단계;

   b) 상기 배양된 균주를 용매를 이용하여 추출하는 단계;

   c) 상기 추출된 해양 미생물 대사체를 농축하는 단계; 및

   d) 상기 농축된 대사체를 분리하는 단계를 포함하는 당뇨 합병증 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 해양 미생물은 Chromohalobacter 속인 것을 특징으로 하는 당뇨 합병증 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 Chromohalobacter salexigens(KCTC 11333BP)인 것을 특징으로 하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 해양 미생물 대사체는 헥산 용매로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.

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