KR101713166B1 - 말똥진흙버섯 추출물을 포함하는 다발성 경화증 및 자가면역성 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말똥진흙버섯의 추출물을 포함하는 조성물에 대한 것이다. 말똥진흙버섯의 추출물을 포함하는 조성물은 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물에서 1) 중추신경계의 염증과 수초탈락을 억제하여 임상증상을 개선하며, 2) 중추신경계로의 T 세포, 대식세포 및 B 세포 등 면역세포의 침윤을 억제하며, 3) 중추신경계 혈관내피세포에서 혈관세포부착분자(VCAM)-1의 발현을 억제하며, 4) 림프구에서 integrin-α4의 발현을 억제한다. 따라서 본 발명의 조성물은 자발성 경화증 및 각종 면역성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 목질진흙버섯 또는 바우미진흙버섯의 추출물을 자발성 경화증 및 각종 면역성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 조성물의 형태로도 제공될 수 있다.

Description

말똥진흙버섯 추출물을 포함하는 다발성 경화증 및 자가면역성 질환의 예방 및 치료용 조성물{A composition comprising extract of a mushroom, Phellinus igniarius, for prevention and treatment of multiple sclerosis and other autoimmune diseases}

본 발명은 말똥진흙버섯(Phellinus igniarius)의 추출물을 포함하는 다발성 경화증 및 자가면역성 질환의 예방 및 치료에 유효한 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 추출물을 추출하는 방법을 제공한다.

다발성 경화증(multiple sclerosis)은 자가면역성 염증성 퇴행성 신경질환 (autoimmune inflammatory neurodegenerative disease)의 대표적 질환으로 아시아계와 아프리카계 사람에게는 발생빈도가 그리 높지 않은 편이나 유럽계 사람 특히 30대 백인 여성에게서 가장 많이 발생하며, 유럽계 백인에서는 100,000명당 200명의 빈도로 발병한다.

다발성 경화증은 시각 장애, 사지의 근무력증과 이로 인한 보행장애, 통증 또는 무감각을 수반하는 피부감각 장애, 배변 및 배뇨 장애, 언어 및 청각 장애, 인지 장애 등을 수반하며 이들 장애는 완화 및 재발이 반복되면서 점차 심해지는 경우가 많다. 이러한 신경성 장애는 중추신경계 내의 염증성 반응으로 인한 신경세포의 축삭을 둘러싸고 있는 수초(myelin sheath)의 손상에 기인한다. 병변은 뇌와 척수의 백질 부위에 산재성으로 나타나며 병변부에서는 전형적 현상인 정맥주위 염증세포 침윤을 수반하는 염증성 반응과 신경섬유의 수포성 수초탈락이 관찰되며 그 외에도 희소돌기아교세포의 소실, 성상아교세포의 증식 등이 수반된다.

다발성 경화증의 원인 및 병리학적 진행과정이 아직까지 완전히 밝혀지지 않았으나, 세포성 면역계와 체액성 면역계가 모두 관여하는 자가면역 반응인 것으로 알려졌다 (Engelhardt, Clin. Exp. Neuroimmunol. 1: 79-93, 2010). 다발성 경화증의 면역학적 발병과정을 약술하면 다음과 같다.

자가(self) myelin에 반응하는 자가반응성 CD4＋ T 세포가 뇌염 등 여러 가지 원인에 의해 혈액으로부터 중추신경계의 실질조직으로 이동한 후 그곳에 존재하는 항원공급세포가 제공하는 myelin이 포함된 '주조직적합성복합체 class II 분자'에 의해 재활성화된다. 재활성화된 CD4+ T 세포는 스스로 복제증식하여 몇 개의 subset로 분화하여 세포성 면역을 주도한다. 이들 CD4+ T 세포는 또 다른 면역세포인 대식세포와 B 세포를 중추신경계 속으로 유인하는 물질을 분비하는 한편 염증유발 물질도 분비한다.

자가반응성 CD8+ T 세포도 혈액에서 중추신경계에 들어오면 myelin이 포함된 '주조직적합성복합체 class II 분자'에 의해 재활성화되어 스스로 복제증식하고 항원결정인자함유 세포를 세포독성적으로 공격하여 파괴한다.

대식세포는 중추신경계에 상존하는 미세아교세포와 협동으로 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 중추 신경계로 유인하고 활성화시키는 한편 BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)를 분비하여 B 세포를 활성화시킨다. 또한 대식세포는 전염증성 cytokine을 분비하여 myelin을 파괴하고 항체와 보체로 표지된 myelin을 포식하여 제거한다.

중추신경계에 침윤한 항원특이적 B 세포는 T 세포에 대해 항원공급세포로서 작용한다. 또한 항원특이적 B 세포와 T 세포가 상호작용하게 되면 B 세포와 T 세포가 동시에 증식한다. 한편 B 세포는 형질세포로 분화하여 myelin에 대한 항체와 보체를 분비한다.

한편 면역세포가 뇌혈관을 통과하기 위해서는 뇌혈관내피세포 및 면역세포에서 세포부착분자가 발현되어야 한다. 다발성 경화증의 경우 뇌혈관에서는 혈관세포부착분자(vascular cell adhesion molecule)-1의 발현이 또한 면역세포에서는 integrin-α4의 발현이 각각 증가한다.

다발성 경화증은 이미 언급한 바와 같이 세포성 면역계와 체액성 면역계가 모두 관여하는 면역질환이므로 각종 면역치료법이 시도되었다: 1) 면역허용성 항원을 이용한 자가반응성 T 세포의 민감소실법, 2) T 세포 지향성 cytokine, B 세포 표면분자 또는 세포부착분자에 대한 단일클론항체 또는 interferon-γ 등을 이용한 면역요법, 3) 혈장분리반출법 등이 시도되었다. 이러한 치료법은 긍정적인 결과를 가져오지만, 바람직하지 못한 부작용으로 인해 사용이 제한적이다(Steinman & Zamvil, Ann. Neurol. 60:12-21, 2006). 따라서 다발성 경화증 환자를 위해 부작용과 독성이 없는 안전한 약물의 개발이 절실한 실정이다.

진흙버섯속(genus Phellinus)의 버섯은 전통적으로 아시아에서 만성질환의 치료에 사용되어 왔으며, 최근 그것의 의학적 효능이 밝혀지고 있다(Dai et al, Appl. Microbiol. Biotech. 87: 1587-1593, 2010). 목질진흙버섯(Phellinus linteus)에서 추출한 다당류인 β-glucan이 강력한 면역조절 효능을 지니고 있어 암 및 면역질환 치료에 유효하다. 또한, 말똥진흙버섯도 아시아 지역에서 약용버섯으로 사용되어 왔으며 역시 면역조절 효능을 가진다.

본 발명은 말똥진흙버섯 추출물을 포함하는 다발성 경화증의 예방 및 치료에 유효하며, 부작용과 독성이 낮고 안전한 새로운 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 아울러 본 발명은 진흙버섯속에 속하는 또 다른 종인 목질진흙버섯 및 바우미진흙버섯(Phellinus baumii) 추출물에서도 다발성 경화증의 예방 및 치료에 동일한 효과가 있는 새로운 조성물을 얻을 수 있음을 발견하여 이를 제공하고자 한다.

본 발명은 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 및 바우미진흙버섯으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 버섯 추출물을 포함하는 다발성 경화증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

바람직하게, 상기 추출물은

i) 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 및 바우미진흙버섯으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 버섯을 열수 추출하는 단계;

ii) 상기 열수 추출물을 냉 에탄올과 혼합하여 침전물을 취하는 단계 및

iii) 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 동결 건조하는 단계로부터 얻어지는 것이다.

실험적 자가면역성 뇌수막염(experimental autoimmune encephalomyelitis)은 임상적 증상 및 병리학적 소견이 다발성 경화증과 매우 유사하여 다발성 경화증을 연구하기 위한 대표적 실험동물 모델로 사용된다(Steinman & Zamvil, Ann. Neurol. 60:12-21, 2006). 그러므로 본 발명에서는 실험적 자가면역성 뇌수막염을 이용해 상기 조성물이 다발성 경화증에 유효함을 입증한다.

바람직하게, 상기 조성물은 실험적 자가면역성 뇌수막염의 임상증상지수 및 발병률을 크게 완화시킨다.

바람직하게, 상기 조성물은 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 중추신경계에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포 및 B 세포의 침윤을 억제하는 한편 수초 탈락 현상을 억제한다.

바람직하게, 상기 조성물은 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 중추신경계에서 세포부착분자의 일종인 혈관세포부착분자(vascular cell adhesion molecule(VCAM))-1의 발현을 감소시킨다.

바람직하게, 상기 조성물은 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 국소 림프절에서 integrin-α4가 강하게 발현되는 림프구의 수를 감소시킨다.

또한 본 발명은 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 및 바우미진흙버섯으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 버섯의 추출물을 포함하는 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 다발성 경화증 예방 또는 치료용 제제를 제공한다.

또한 본 발명은 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 및 바우미진흙버섯으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 버섯의 추출물을 포함하는 조성물 및 담체를 포함하는 다발성 경화증 예방 및 개선용 건강보조 식품 또는 기능성 식품을 제공한다.

또한 본 발명은 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 및 바우미진흙버섯으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 버섯의 추출물을 포함하는 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제1형 당뇨병, Hashimoto 갑상선염, celiac 병, 거대세포성 동맥염, 백선, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 간염 또는 과민성 장 증후군 등의 각종 면역질환의 예방 및 치료용 제제를 제공한다.

또한 본 발명은 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 및 바우미진흙버섯으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 버섯의 추출물을 포함하는 조성물 및 담체를 포함하는 제1형 당뇨병, Hashimoto 갑상선염, celiac 병, 거대세포성 동맥염, 백선, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 간염 또는 과민성 장 증후군 등의 각종 면역질환의 예방 및 개선용 건강보조 식품 또는 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 또는 바우미진흙버섯의 추출물을 포함하는 조성물은 혈관내피세포와 면역세포에서 각각 세포부착인자의 발현을 억제함으로써 면역세포의 중추신경계 내 유입을 차단한다. 그 결과 중추신경계의 염증반응과 수초탈락이 억제되어 다발성 경화증의 발병과 증상이 개선된다. 그러므로 본 발명의 조성물은 다발성 경화증의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 조직 내로 침윤한 면역세포에 의해 발병되는 제1형 당뇨병, Hashimoto 갑상선염, celiac 병, 거대세포성 동맥염, 백선, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 간염 또는 과민성 장 증후군 등의 면역질환의 예방 및 치료에 활용될 수 있다.

도1은 myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)35-55을 사용하여 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 일일 임상증상지수(A) 및 발병률(B)에 대한 「말똥진흙버섯의 물 추출물의 에탄올 침전물(Piwep)」의 개선 효과를 나타낸 것이다. MOG+Vehicle: MOG 단독 투여군, MOG+Piwep: MOG와 Piwep의 병합투여군
도2는 MOG를 사용하여 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 대뇌(Cbr) 및 소뇌(Cbl)에서 혈관주변 염증세포 침윤에 대한 Piwep의 억제 효과를 나타낸 것이다. MOG+Vehicle(X400)은 MOG+Vehicle(X100)의 표시 영역을 4배 확대한 것이다. MOG+Vehicle: MOG 단독 투여군, MOG+Piwep: MOG와 Piwep의 병합투여군.
도3은 MOG를 사용하여 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 척수에서 혈관주변 염증세포 침윤에 대한 Piwep의 억제 효과(H & E) 및 수초 탈락에 대한 Piwep의 억제 효과(LFB & PAS)를 나타낸 것이다. MOG+Vehicle(X400)은 MOG+Vehicle(X100)의 표시 영역을 4배 확대한 것이다. MOG+Vehicle: MOG 단독 투여군, MOG+Piwep: MOG와 Piwep의 병합투여군.
도4는 MOG를 사용하여 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 척수에서 무리분화세포표면분자(cell surface molecule for cluster differentiation, CD)인 CD4, CD8, F4/80 및 CD20의 면역반응성에 대한 Piwep의 억제 효과를 나타낸 것이다. N: 정상군, V: MOG+Vehicle군, P: MOG+Piwep군.
도5는 MOG를 사용하여 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 척수에서 무리분화세포표면분자인 CD4, CD8, CD11b 및 CD20에 특이적인 mRNA의 발현에 대한 Piwep의 억제 효과를 나타낸 것이다. N: 정상군, V: MOG+Vehicle, P: MOG+Piwep.
도6은 MOG를 사용하여 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 척수에서 세포부착분자(cell adhesion molecule)인 혈관세포부착분자(VCAM)-1과 integrin-α4에 특이적인 mRNA 발현에 대한 Piwep의 억제 효과를 나타낸 것이다. N: 정상군, V: MOG+Vehicle, P: MOG+Piwep.
도7은 MOG를 사용하여 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 경부 림프절에서 세포부착인자인 integrin-α4 면반응역성에 대한 Piwep의 억제 효과를 나타낸 것이다. Normal: 정상군, MOG+Vehicle: MOG 단독 투여군, MOG+Piwep: MOG와 Piwep의 병합투여군
도8은 MOG를 사용하여 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 임상증상지수에 대한 「목질진흙버섯의 물 추출물의 에탄올 침전물(Plwep, A)」 및 「바우미진흙버섯의 물 추출물의 에탄올 침전물(Pbwep, B)」의 억제 효과를 나타낸 것이다. MOG+Vehicle: MOG 단독 투여군, MOG+Plwep: MOG와 Plwep의 병합투여군, MOG+Pbwep: MOG와 Pbwep의 병합투여군.

본 발명은 중추신경계로의 각종 면역세포의 침윤을 방지하여 중추신경계의 염증과 수초탈락을 억제함으로써 다발성 경화증의 예방 및 치료에 유효하게 작용하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 조성물의 제조방법 및 투여방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 말똥진흙버섯으로부터 추출된 추출물을 포함한다. 다른 실시예에서 본 발명의 조성물은 또한 목질진흙버섯 또는 바우미진흙버섯으로부터 제조되는 추출물을 포함한다.

본 발명에서 말똥진흙버섯 추출물은 i) 상기 버섯을 열수 추출하는 단계; ii) 상기 열수 추출물을 냉 에탄올과 혼합하여 침전물을 취하는 단계 및 iii) 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 동결 건조하는 단계로부터 얻어진다.

본 발명에서는 말똥진흙버섯의 자실체 가루를 이용한다. 이는 버섯 추출물을 보다 효율적으로 얻기 위한 것으로 자실체 가루를 이용할 경우 추출 표면적이 넓어지므로, 추출 과정에서 보다 많은 유효 성분들이 추출될 수 있기 때문이다.

다음으로, 자실체 가루의 추출물을 얻기 위해 자실체 가루를 증류수에 넣고 끓이는 과정을 거친다. 이때 100℃ ~ 104℃의 온도에서 3시간 이상에 걸쳐 끓임으로써 유효 성분이 충분히 추출되도록 한다.

이렇게 얻은 추출물은 감압 농축하여 유효 성분의 함량을 높인다. 그런 다음, 감압 농축된 추출물을 냉 에탄올과 혼합한다. 상기 에탄올 혼합물을 4℃ 이하의 온도에서 하룻밤 동안 방치하여 침전시킨다.

다음으로 혼합물을 원심분리하여 침전물을 취한다. 마지막으로, 상기 침전물을 다시 증류수에 용해한 다음 동결건조시킨다.

실험적 자가면역성 뇌수막염은 임상적 증상 및 병리학적 소견이 다발성 경화증과 매우 유사하므로 본 발명에서는 실험적 자가면역성 뇌수막염을 이용하여 말똥진흙버섯 추출물을 함유하는 조성물이 다발성 경화증에 유효함을 입증한다.

본 발명에서 상기 조성물은 실험적 자가면역성 뇌수막염의 발병률 및 임상증상지수를 크게 감소시킨다. 또한 상기 조성물은 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 척수에서 혈관 주변에 염증성 세포의 침윤을 차단하는 한편 수초탈락을 억제한다. 따라서, 상기 조성물은 실험적 자가면역성 뇌수막염의 임상적 증상과 징후 및 병리학적 변화를 극적으로 완화시킨다.

실험적 자가면역성 뇌수막염에서 중추신경계에 여러 종류의 면역세포가 침윤하며 이들은 각각 다른 기전으로 염증 및 수초탈락에 관여하므로, 본 발명에서는 상기 조성물이 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 중추신경계에서 각종 면역세포의 침윤에 대한 효과를 관찰한다. 상기 조성물은 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 척수에서 무리분화세포표면분자인 CD4, CD8, F4/80 및 CD20에 대한 면역반응성을 감소시키며 또한 CD4, CD8, CD11 및 CD20에 특이적인 mRNA의 발현을 현저히 억제한다. 이러한 결과는 본 발명의 조성물이 실험적 자가면역성 뇌수막염에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포 및 B 세포가 중추신경계로 침윤하는 것을 차단함을 입증한다.

중추신경계에서 혈관으로부터 실질조직으로 면역세포가 이동하기 위해서는 중추신경계의 혈관 내피세포뿐만 아니라 면역세포의 표면에 세포부착분자들이 강하게 발현되어야 한다. 본 발명에서는 혈관내피세포에서 발현되는 혈관세포부착분자(VCAM)-1와 면역세포에서 발현되는 integrin-α4의 발현에 대한 말똥진흙버섯 추출물의 효과를 관찰한다. 본 발명에서는 상기 조성물이 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 척수에서 (VCAM)-1에 특이적인 mRNA의 발현을 억제하며 또한 국소 림프절에서 integrin-α4에 대해 강한 면역반응성을 나타내는 림프구의 수를 감소시킨다. 이러한 결과는 본 발명의 조성물이 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물에서 중추신경계의 혈관 내피세포뿐만 아니라 면역세포에서 세포부착분자의 발현을 억제하며 그로 인하여 중추신경계로의 면역세포의 침윤이 차단됨을 입증한다. 또한 본 발명의 조성물이 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 척수에서 integrin-α4에 특이적인 mRNA의 발현을 억제한다. 이러한 결과는 상기 조성물로 인하여 실험적 자가면역성 뇌수막염에서 중추신경계 내의 혈관을 통과하여 실질조직에 침윤한 림프구의 수가 감소됨을 의미한다.

한편 목질진흙버섯 또는 바우미진흙버섯으로부터 추출된 추출물을 포함하는 조성물도 실험적 자가면역성 뇌수막염의 임상증상지수를 낮추는 것으로 확인된다.

본 발명에 대한 구체적인 설명에서는 단지 말똥진흙버섯 추출물을 포함하는 조성물의 실험적 자가면역성 뇌수막염에 대한 실시예만을 기재한다. 그러나 본 발명의 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 또는 바우미진흙버섯의 추출물을 포함하는 조성물은 다발성 경화증 치료 또는 예방용에 한정되는 것이 아니라 다발성 경화증과 유사한 면역학적 기전을 갖는 다른 자가면역성 질환의 예방 및 치료에도 사용될 수 있다. 이러한 질환에는 제1형 당뇨병, Hashimoto 갑상선염, celiac 병, 거대세포성 동맥염, 백선, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 간염 또는 과민성 장 증후군 등의 각종 면역질환이 포함된다. 따라서 본 발명의 권리범위는 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 또는 바우미진흙버섯의 추출물을 포함하는 조성물을 상기 각종 자가면역성 질환의 예방 및 치료의 용도로서 사용하는 것에도 미치는 것으로 이해되어야 한다.

한편, 본 발명의 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 또는 바우미진흙버섯의 추출물을 포함하는 조성물은 다발성 경화증 예방 및 치료용 제제 또는 건강보조 식품 또는 기능성 식품으로 이용될 수 있다.

상기 제제는 경구 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 경구용일 경우, 조성물은 알약, 캡슐 또는 액상의 형태로 제형화 된다. 비경구용일 경우, 조성물은 다양한 부형제, 담체, 희석제 등 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있으며, 용이하게 선택 가능한 것과 함께 제형화 된다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 이는 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것으로 여겨져서는 안 된다.

실시예 1

[말똥진흙버섯으로부터 물 추출물의 에탄올 침전물 제조]

말똥진흙버섯의 자실체 가루를 중량 대비 10배의 증류수에 넣고 3시간 끓인 다음 여과하여 고형성분을 제거하고 추출액을 감압 농축하였다. 상기 농축 추출액을 용량대비 2배의 냉 에탄올(-20℃)과 혼합하고 4℃ 이하에서 하룻밤 동안 방치하였다. 에탄올 혼합물을 원심분리하여 침전물을 취하고 그것을 다시 증류수에 용해한 다음 동결건조하였으며, 이를 「말똥진흙버섯의 물 추출물의 에탄올 침전물(Piwep)」이라 명명하였다.

[실험적 자가면역성 뇌수막염의 유발 및 Piwep 투여]

6-7주령의 C57BL/6 mouse 암컷을 실온 및 습도가 조절되는 환경에 적응시켰다. Myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)35-55을 phosphate buffered saline에 200 ㎍/100 ㎕의 농도로 용해한 후, 동량의 complete Freund's adjuvant(Mycobacterium tuberculosis H37RaA를 400 ㎍ 함유)와 혼합하고 그 혼합물 200 ㎕을 실험동물의 가슴부위 피하에 2 부위로 나누어 주사하였다. 백일해균 독소(pertussis toxin)를 PBS에 400 ng/200 ㎕의 농도로 용해하고 그 용해물 200 ㎕을 MOG 첫 번째 주사 후 0일과 2일에 각각 1회씩 복강 내로 주사하였다. MOG를 주사한 후 7일째에 MOG와 complete Freund's adjuvant의 혼합물 200 ㎕을 추가 접종하였다. 「말똥진흙버섯의 물 추출물의 에탄올 침전물(Piwep)」을 생리식염수에 용해하고 필터를 이용해 멸균한 다음, MOG의 첫 번째 주사 후 0일부터 하루 간격으로 매일 1회 100 ㎎/㎏씩 복강 내로 주사하였다.

[실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 동물의 임상증상 평가]

MOG 첫 번째 주사 후 매일 실험동물의 행동을 관찰하고 실험적 자가면역성 뇌수막염의 임상증상 정도를 다음과 같은 평가기준에 따라 평가하여 지수화하였다.

Grade 0: 정상

Grade 1: 꼬리의 처짐

Grade 2: 꼬리의 처짐, 뒷다리의 쇠약

Grade 3: 꼬리의 처짐, 뒷다리의 부분적 마비, 보행장애

Grade 4: 꼬리의 처짐, 양쪽 뒷다리의 완전마비

Grade 5: 빈사상태 또는 사망

도1에 실험적 자가면역성 뇌수막염의 임상증상에 대한 Piwep의 효과를 제시한다. MOG를 투여하여 실험적 자가면역성 뇌수막염을 유발하면 임상증상이 MOG를 첫 번째 주사한 후 13일째에 처음으로 발현되기 시작하여 20일째에 임상증상지수가 최고치에 도달하였다. 실험적 자가면역성 뇌수막염의 최대 임상증상지수 및 발병률에 미치는 Piwep의 효과를 하기 표 1에 나타내었다.

	MOG+Vehicle (n=20)	MOG+Piwep (n=20)
Maximal clinical score	3.15±0.39	0.20±0.09
% Maximal incidence	90 (18/20)	20 (4/20)

표1에 의하면 실험적 자가면역성 뇌수막염의 최대 임상증상지수 및 최대발병률에 미치는 Piwep의 효과가 확인된다. 실험적 자가면역성 뇌수막염만을 유발한 MOG+Vehicle 군에서 최대 임상증상지수는 3.15±0.39이었으며 발병률은 90%(20마리 중 18마리에서 발병)이었다. 반면, 실험적 자가면역성 뇌수막염을 유발하면서 Piwep를 투여한 MOG+Piwep 군에서는 최대 임상증상지수가 0.20±0.09 그리고 발병률이 20%(20마리 중 4마리에서 발병)이어서 MOG+Vehicle 군에 비해 각각 현저히 낮아졌다. 이러한 결과는 Piwep가 MOG로 유발한 실험적 자가면역성 뇌수막염의 임상증상과 발병률을 크게 감소시킴을 나타낸다.

[중추신경계의 병리학적 연구]

실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 중추신경계에서 Piwep가 염증세포 침윤과 수초탈락에 미치는 효과를 다음과 같이 관찰하였다.

MOG를 첫 번째 주사 후 21일째에 실험동물을 마취하고 심장을 통해 4% paraformaldehyde를 함유하는 PBS 용액을 관류하여 뇌와 척수를 고정하였으며 뇌와 척수를 적출하고 동일한 고정액에서 후고정하였다. 뇌와 척수를 paraffin으로 포매한 다음 5 ㎛ 두께의 연속절편을 제작하였다. 뇌 절편을 통상적 방법에 따라 Hematoxylin-Eosin(H & E)법으로 염색하고 염증세포의 침윤상태를 관찰하였다. 또한 척수 절편을 Hematoxylin-Eosin(H & E)법 또는 Luxol Fast Blue(LFB)-Periodic Acid Schiff(PAS)법으로 염색하여 염증세포의 침윤상태와 수초의 탈락상태를 각각 관찰하였다.

도2는 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 대뇌(Cbr) 및 소뇌(Cbl)에서 혈관주변의 염증세포 침윤에 대한 Piwep의 효과를 보여준다. MOG만을 투여한 MOG+Vehicle군에서 혈관주변에 염증세포가 침윤하는 현상이 관찰되나, Piwep를 투여한 MOG+Piwep군에서는 그런 현상이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Piwep가 실험적 자가면역성 뇌수막염에 수반되는 중추신경계에서의 염증세포 침윤을 크게 억제함을 제시한다.

도3은 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 실험동물의 척수에서 염증세포 침윤 및 수초탈락에 대한 Piwep의 효과를 보여준다. MOG만을 투여한 MOG+Vehicle군에서 혈관주변에 아주 심한 염증세포의 침윤이 나타났으나 Piwep를 투여한 MOG+Piwep군에서는 그러한 염증세포의 침윤이 관찰되지 않았다. 또한 MOG+Vehicle 군에서 아주 심한 수초의 탈락이 관찰되었으나 MOG+Piwep군에서는 그러한 수초의 탈락이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Piwep가 실험적 자가면역성 뇌수막염에 수반되는 중추신경계에서의 염증성 세포 침윤과 수초 탈락현상을 억제함으로써 실험적 자가면역성 뇌수막염의 발병을 억제함을 나타낸다.

[척수의 면역조직화학적 연구]

Piwep가 각종 면역세포의 척수 내 침윤에 미치는 효과를 각 면역세포에 특이하게 발현되는 클러스터 분화에 대한 세포표면분자(cell surface molecules for cluster differentiation, CD)에 대한 면역조직화학법을 이용하여 관찰하였다.

4% paraformaldehyde를 관류하여 고정한 척수를 동일한 고정액에서 후고정시킨 후 4℃에서 2일간 30% sucrose를 함유하는 phosphate buffered saline으로 세척하였다. 30 ㎛ 두께의 척수 동결절편을 CD4, CD8, F4/80에 대한 monoclonal antibody 또는 CD20에 대한 염소의 polyclonal antibody를 제1항체로 사용하였으며 anti-mouse IgG 항체 또는 anti-goat IgG 항체를 각각 제2항체로 사용하였다. 면역반응은 통상적인 방법에 따라 ABC reagent에서 배양 후 0.06% 3,3＇-diaminobenzidine으로 발색하였다.

도4는 면역조직화학법으로 염색된 척수를 보여준다. 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 동물의 척수에서 CD4, CD8, F4/80 및 CD20의 면역반응성이 크게 상승하였으며 Piwep가 이러한 무리분화세포표면인자 면역반응성의 상승을 현저히 억제하였다. 이러한 결과는 Piwep가 실험적 자가면역성 뇌수막염 발생 시 중추신경계 조직으로의 CD4＋T 세포, CD8＋T 세포, 대식세포, B 세포 등의 침윤을 억제함을 의미한다.

[척수에서 CD4, CD8, CD11b 및 CD20 특이 mRNA의 발현에 대한 분석]

Piwep가 각종 면역세포의 척수 내 침윤에 미치는 효과를 확인하기 위해 각 면역세포의 표면에 특이하게 발현되는 클러스터 분화에 대한 세포표면분자의 mRNA 양을 역전사중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)를 이용하여 다음과 같이 측정하였다.

MOG의 첫 번째 주사 3주 후에 실험동물을 마취하고 심장을 통하여 PBS를 관류한 다음 척수를 채취하였다. Trizol reagent를 이용하여 척수에서 총 RNA을 추출한 다음 CD4, CD8, CD11b 및 CD20에 대한 특이적 mRNA의 발현을 통상적인 RT-PCR법으로 다음과 같이 측정하였다. cDNA 합성 kit를 사용하여 1 ㎍ RNA으로부터 제1 cDNA strain을 합성하였다. Oligonucleotide primer는 다음과 같다: CD4 forward 5＇-TGT GCC GAG CCA TCT CTC TTA GG-3＇, reverse 5＇-GCA CTG AGA GTG TCA TGC CGA AC-3＇; CD8 forward 5＇-ATG CAG CCA TGG CTC TGG C-3＇, reverse 5＇-GCA TGT CAG GCC CTT CTG GGT-3＇; CD11b forward 5＇-GGG CAC GGT GGC AGG TGA A-3＇, reverse 5＇-GCT GGC TGT GGG AGG CAC TG-3＇; CD20 forward 5＇-AAA ACC TCC AGG AAG AGT TTG GTC-3＇, reverse 5＇-CGA TCT CAT TTT CCA CTG GCA AG-3＇. β-actin forward 5＇-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3＇, reverse 5＇-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3＇. RT-PCR 반응물을 agarose gel 상에서 분리한 다음 ethidium bromide로 염색하고 Image J를 사용하여 RNA의 양을 측정하였다.

도5는 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 동물의 척수에서 CD4, CD8, CD11b 및 CD20에 대한 특이적 mRNA의 발현을 관찰한 결과이다. 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 동물의 척수에서 CD4, CD8, CD11b 및 CD20에 대한 특이적 mRNA의 발현이 크게 상승하였으며 Piwep가 이러한 무리분화세포표면인자에 특이적인 mRNA 발현의 상승을 현저히 억제하였다. 이러한 결과는 Piwep가 실험적 자가면역성 뇌수막염에 수반된 중추신경계 조직으로의 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포 및 B 세포의 침윤을 억제함을 의미하며, 앞에서 면역조직화학법으로 관찰한 연구결과와 잘 부합한다.

[척수에서 세포부착분자의 mRNA의 발현에 대한 분석]

면역세포가 혈관을 통과하기 위해서는 면역세포의 세포부착분자가 결합할 혈관세포부착분자(VCAM))-1가 혈관 내피세포 표면에서도 발현되어야 하므로 Piwep가 VCAM-1의 발현에 미치는 효과를 척수에서 다음과 같이 관찰하였다. 또한 중추신경계 내로 침윤한 면역세포에는 integrin-α4가 표현되어 있을 것으로 예상되므로 척수 내의 integrin-α4 발현 정도를 측정하여 Piwep가 면역세포의 침윤에 미치는 영향을 다음과 같이 관찰하였다.

MOG를 첫 번째 주사 후 21일째에 실험동물을 마취하고 심장을 통해 냉(4 ℃) 생리적 식염수를 관류하여 혈액을 제거한 후 척수를 채취하고 척수조직에서 세포부착분자 중 혈관세포부착분자(VCAM))-1과 integrin-α4에 대한 특이적 mRNA의 발현을 RT-PCR 법으로 측정하였다.

cDNA 합성 kit를 사용하여 1 ㎍ RNA으로부터 제1 cDNA strain을 합성하였다. Oligonucleotide primer는 다음과 같다: vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 forward 5＇-AGG CAC AGC TGC AGG ATG CC-3＇, reverse 5＇-GGA GGG GGC GGG GCT GTA AT-3＇; integrin-α forward 5＇-CCA CTA CGA TCG CTC CGC CTG T-3＇, reverse 5＇-CCA CTA CGA TCG CTC CGC CTG T-3＇. β-actin forward 5＇-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3＇, reverse 5＇-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3＇. RT-PCR 반응물을 agarose gel 상에서 분리한 다음 ethidium bromide로 염색하고 Image J를 사용하여 RNA의 양을 측정하였다.

도6은 척수에서 VCAM-1 및 integrin-α4에 대한 특이적 mRNA의 발현을 관찰한 결과이다. 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 동물의 척수에서 VCAM-1 및 integrin-α4에 대한 특이적 mRNA의 발현이 상승하며, Piwep가 이들 세포부착분자에 대한 특이적 mRNA의 발현을 현저히 감소시켰다. 이러한 결과는 Piwep가 중추신경계 혈관내피세포에서 혈관세포부착분자의 발현이 증가하는 것을 억제하여 중추신경계 내로 면역세포가 침윤한 것을 방지함을 입증한다. 특히 Piwep에 의해 integrin-α4 에 대한 특이적 mRNA의 발현이 감소된 것은 Piwep에 의해 중추신경계 내로 침윤된 면역세포의 수가 감소하였음을 의미한다.

[림프절에서 integrin-α4 발현에 대한 면역조직화학법적 관찰]

면역세포가 혈관을 통과하기 위해서는 세포부착분자를 세포 표면에 발현하여 VCAM-1과 같은 혈관세포부착분자와 결합해야 하므로 Piwep가 면역세포의 세포부착분자인 integrin-α4 발현에 미치는 효과를 경부 림프절에서 다음과 같이 관찰하였다.

MOG의 첫 번째 주사 3주 후 경부 림프절을 중성 formaldehyde 용액에서 2일간 고정하였다. Paraffin으로 포매하고 5㎛ 절편을 제작한 다음 anti-integrin-α4 단일클론항체 및 anti-mouse IgG 항체를 각각 제1 및 제2항체로 사용하여 면역조직학법으로 염색하였다. 면역반응은 통상적인 방법에 따라 ABC reagent에서 배양한 후 0.06% 3,3＇-diaminobenzidine으로 발색하였다.

도7은 경부 림프절에서 integrin-α4에 대한 면역조직화학법적 소견을 보여준다. 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 동물의 림프절에서 integrin-α4에 대해 면역반응성을 강하게 나타내는 림프구의 출현이 증가하였으며, Piwep를 투여하면 integrin-α4에 대해 강한 면역반응성을 나타내는 림프구는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Piwep가 실험적 자가면역성 뇌수막염 발생 시 림프절에서 림프구의 integrin-α4 발현을 억제함을 의미한다.

실시예 2

[목질진흙버섯 또는 바우미진흙버섯의 물 추출물의 에탄올 침전물의 제조]

목질진흙버섯 또는 바우미진흙버섯으로부터 실시예 1에서와 동일한 방법으로 물 추출물의 에탄올 침전물인 Plwep(목질진흙버섯) 또는 Pbwep(바우미진흙버섯)를 각각 획득하였다.

[목질진흙버섯 추출물과 바우미진흙버섯 추출물의 실험적 자가면역성 뇌수막염에 대한 효과]

말똥진흙버섯과 동일 속에 속하는 목질진흙버섯의 추출물(Plwep)과 바우미진흙버섯의 추출물(Pbwep)이 실험적 자가면역성 뇌수막염의 임상지수에 미치는 효과를 관찰하였다.

도8에 실험적 자가면역성 뇌수막염이 유발된 동물의 임상증상에 대한 Plwep 및 Pbwep 효과를 제시한다. Plwep와 Pbwep는 모두 실험적 자가면역성 뇌수막염의 임상지수를 현저히 억제한다. 이러한 결과는 목질진흙버섯 추출물과 바우미진흙버섯 추출물도 말똥진흙버섯 추출물과 마찬가지로 모두 실험적 자가면역성 뇌수막염의 임상증상을 크게 개선함을 의미한다.

Claims (13)

1. 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 및 바우미진흙버섯으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 버섯 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제1항에서,
   상기 추출물은
   i) 말똥진흙버섯, 목질진흙버섯 및 바우미진흙버섯으로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 버섯을 열수 추출하는 단계;
   ii) 상기 열수 추출물을 냉 에탄올과 혼합하여 침전물을 취하는 단계 및
   iii) 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 동결 건조하는 단계로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료용 약학조성물.
3. 제1항에서,
   상기 조성물은 중추신경계에서 염증 및 수초 탈락을 억제하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료용 약학조성물.
4. 제1항에서,
   상기 조성물은 중추신경계에서 세포표면분자인 CD4, CD8, CD11(또는 F4/80) 및 CD20의 발현을 억제하거나 또는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포 및 B 세포의 중추신경계 내로의 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료용 약학조성물.
5. 제1항에서,
   상기 조성물은 중추신경계에서 혈관세포유착분자(VCAM)-1의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료용 약학조성물.
6. 제1항에서,
   상기 조성물은 중추신경계에서 integrin-α4의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료용 약학조성물.
7. 제1항에서,
   상기 조성물은 림프구에서 integrin-α4의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료용 약학조성물.
8. 제1항의 약학조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 다발성 경화증의 예방 및 치료용 약학제제.
9. 제8항에서,
   상기 제제는 알약, 캡슐 또는 경구용 또는 비경구용의 액상인 것을 특징으로 하는 다발성 경화증의 예방 및 치료용 약학제제.
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