CN111803482B - 鹿茸单体在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用及药物 - Google Patents

鹿茸单体在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用及药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鹿茸单体在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用及药物，涉及医药技术领域，本发明的发明人通过质谱的手段从鹿茸中筛选出了一类鹿茸单体16(R)‑HETE，并通过体外实验发现，该单体能够有效抑制破骨细胞分化、减少破骨细胞数量，同时不影响前体细胞的增殖或存活；并且，该单体对于小鼠乳腺癌骨转移有良好的治疗效果。因此，可以将鹿茸单体16(R)‑HETE应用于制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物，为乳腺癌骨转移提供一种新的治疗手段。

Description

鹿茸单体在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用及药物
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种鹿茸单体在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用及药物。
背景技术
乳腺癌是女性中最常见的恶性癌症之一，并且是由于重要器官中继发性肿瘤的发展而导致癌症死亡的主要原因。尽管原发性肿瘤的外科治疗通常有效，但普遍会发生难以根治的转移。据统计，约有百分之八十的乳腺癌患者随着疾病的进展而发生骨转移。骨转移很可能与一系列独特的骨骼并发症有关，包括骨痛、病理性骨折、高钙血症和脊髓压迫，这些并发症会降低患者的生活质量，会对患者的生存、活动能力和生活质量产生负面影响。此外，乳腺癌骨转移的临床并发症给个人和社会带来了巨大的经济负担。乳腺癌细胞在骨内的转移通常是溶骨性的，其典型特征是破骨细胞的过度活化导致的病理性骨吸收。核因子κB配体受体激活剂(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是破骨细胞分化和存活中最重要的两个调节因子。在乳腺癌骨转移中，乳腺癌细胞产生一些溶骨因子，其中一些因子通过增加成骨细胞RANKL的表达来激活破骨细胞生成，而另一些因子则与RANKL刺激产生协同作用或以独立于RANKL的方式激活破骨细胞生成。
因此，如何能够有效抑制乳腺肿瘤骨转移是亟待解决的难题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供鹿茸单体16(R)-HETE在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供一种用于抑制乳腺肿瘤骨转移的药物。
本发明提供了鹿茸单体16(R)-HETE在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用。
进一步的，所述鹿茸单体16(R)-HETE的分子式为C20H32O3，分子量为302.22457。
另外，本发明还提供了一种用于抑制乳腺肿瘤骨转移的药物，所述药物包括鹿茸单体16(R)-HETE。
进一步的，所述鹿茸单体16(R)-HETE的分子式为C20H32O3，分子量为302.22457。
进一步的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步的，所述药物的剂型包括口服制剂。
进一步的，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
进一步的，所述药物的有效给药剂量为50-100mg/kg/天。
进一步的，所述药物的有效给药剂量为75mg/kg/天。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的发明人通过质谱的手段从鹿茸中筛选出了一类鹿茸单体16(R)-HETE，并通过体外实验发现，该单体能够有效抑制破骨细胞分化、减少破骨细胞数量，同时不影响前体细胞的增殖或存活；并且，该单体对于小鼠乳腺癌骨转移有良好的治疗效果。因此，可以将鹿茸单体16(R)-HETE应用于制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物，为乳腺癌骨转移提供一种新的治疗手段。
以本发明的提供的鹿茸单体16(R)-HETE在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用为基础，含有鹿茸单体16(R)-HETE的药物，能够有效抑制抑制乳腺肿瘤骨的转移，具有积极的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的TRAP染色结果图；
图2为本发明实施例2提供的破骨细胞数量测试结果柱状图；
图3为本发明实施例2提供的破骨细胞表面积测试结果柱状图；
图4为本发明实施例2提供的破骨细胞核测试结果柱状图；
图5为本发明实施例3提供的细胞凋亡检测结果；
图6为本发明实施例3提供溴脱氧尿苷(BrdU)检测破骨细胞前体增殖结果；
图7为本发明实施例4提供钙离子浓度检测结果图；
图8为本发明实施例5提供肿瘤骨转移扫描检测图；
图9为本发明实施例5提供肿瘤骨转移数统计图；
图10为本发明实施例5提供肿瘤骨转移大小统计图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
根据本发明的第一个方面，提供了鹿茸单体16(R)-HETE在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用。
鹿茸为我国传统的名贵中药材，鹿茸化学成分复杂且具有补肾壮阳、强筋健骨、抗氧化、抗肿瘤等功效。本发明的发明人通过质谱的手段从鹿茸中筛选出了一类鹿茸单体16(R)-HETE，并通过体外实验发现，该单体能够有效抑制破骨细胞分化、减少破骨细胞数量，同时不影响前体细胞的增殖或存活；并且，该单体对于小鼠乳腺癌骨转移有良好的治疗效果。因此，可以将鹿茸单体16(R)-HETE应用于制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物，为乳腺癌骨转移提供一种新的治疗手段。
其中，本发明提供的所述鹿茸单体16(R)-HETE的分子式为C20H32O3，分子量为302.22457，为本实验室制备得到。
根据本发明的第二个方面，本发明还提供了一种用于抑制乳腺肿瘤骨转移的药物，所述药物包括鹿茸单体16(R)-HETE。
本发明提供的用于抑制乳腺肿瘤骨转移的药物的活性成分包括鹿茸单体16(R)-HETE，基于本发明的提供的鹿茸单体16(R)-HETE在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用，该药物能够有效抑制抑制乳腺肿瘤骨的转移，具有积极的作用。需要注意的是，基于本发明提供的鹿茸单体16(R)-HETE具有抑制乳腺肿瘤骨转移的用途，因此，包含该鹿茸单体16(R)-HETE的药物的具体应用可以为预防乳腺肿瘤骨转移，也可以为治疗乳腺肿瘤骨转移。
其中，所述鹿茸单体16(R)-HETE的分子式为C20H32O3，分子量为302.22457。
需要说明的是，本发明对用于抑制乳腺肿瘤骨转移的药物的活性成分不做具体限定，在包含鹿茸单体16(R)-HETE的基础上，根据实际应用，还可以包含在功能上能够起到协同作用或联合用药的其他活性成分。
在一些优选的实施方式中，药物还包括药学上可接受的辅料。
药学上可接受的辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。在本发明提供的药物中添加的药学上可接受的辅料，能够起到赋型、充当载体或提高稳定性的作用，此外，还具有增溶、助溶或缓控释等重要功能。
典型但非限制性的药学上可接受的辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂或释放阻滞剂中的一种或多种。
在一个优选的实施方式中，药物的剂型包括口服制剂。
当口服用药时，上述药物可制成任意口服可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。口服混悬剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。
任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
在一些优选的实施方式中，所述药物的有效给药剂量为50-100mg/kg/天，例如可以为，但不限于50mg/kg/天、60mg/kg/天、70mg/kg/天、80mg/kg/天、90mg/kg/或100mg/kg/天。
给药剂量和频率可以根据是预防性处理还是治疗性处理而不同。在预防性应用中，以相对低频率的间隔长期给予相对低的剂量。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量。
优选地，所述药物的有效给药剂量为75mg/kg/天。
当药物的有效给药剂量在上述优选范围内时，对乳腺癌骨转移能够起到更好的抑制作用。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
新鲜鹿茸由中国农业科学院特产研究所左家梅花鹿养殖基地提供，16(R)-HETE由本实验室合成。
实施例1筛选鹿茸有效单体
提前将水在4℃下冷却12h，每10克鹿茸添加1ml水混合后在4℃的条件下提取24小时，300rpm/min离心10min分离上清液，对上清液进行冻干形成冻干粉，进行代谢质谱检测，质谱条件为：
①正模式：加热器温度300℃；鞘气流速：45arb；辅助气流速：15arb；尾气流速：1arb；电喷雾电压：3.0KV；毛细管温度：350℃；S-Lens RF Level，30％；
②负模式：加热器温度300℃；鞘气流速：45arb；辅助气流速：15arb；尾气流速：1arb；电喷雾电压：3.2KV；毛细管温度：350℃；S-Lens RF Level，60％；
然后合成代谢质谱检测到的单体。
检测到如表1和2约200余种物质，人工合成这些单体，筛选出一类有效单体16(R)-HETE，其分子式为C20H32O3，分子量302.22457。
表1鹿茸冻干粉正模式代谢质谱结果
Figure BDA0002612427880000071
Figure BDA0002612427880000081
Figure BDA0002612427880000091
Figure BDA0002612427880000101
表2鹿茸冻干粉负模式代谢质谱结果
Figure BDA0002612427880000111
Figure BDA0002612427880000121
Figure BDA0002612427880000131
实施例2TRAP染色破骨细胞
从股骨和胫骨分离的骨髓细胞用40μm细胞过滤器纯化，并在含有10％(vol/vol)热灭活胎牛血清(FBS)(Gibco，USA)和50ng/ml小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(R&DSystems,USA)培养72h诱导分化为破骨细胞前体。在6孔板每孔培养1×106个细胞，对照组在含有10％胎牛血清、50ng/ml小鼠M-CSF和50ng/ml小鼠NF-KB配体受体或激活剂(RANKL)(R&D Systems,USA)的α-MEM培养基中进一步培养诱导破骨细胞再生和分化。实验组在含有10％胎牛血清、50ng/ml小鼠M-CSF和50ng/ml RANKL及75ng/ml 16(R)-HETE的α-MEM培养基中进一步培养诱导破骨细胞再生和分化。在第4-5天，使抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色破骨细胞。成熟破骨细胞被鉴定为多核(>3核)TRAP+细胞。用CytationTM5细胞成像多模式阅读器结合自动数字广域显微镜(BIOTEK,USA)拍摄染色细胞的照片，并使用CytationTM5细胞成像多模式阅读器结合自动数字广域显微镜分析软件(BIOTEK,USA)计数细胞数并统计细胞体积及细胞核大小。
检测结果如图1-图4所示，根据图1-图4可知，与对照组(0mg/l)相比，加入16(R)-HETE(75ng/ml)实验组的破骨细胞的生成较少，破骨细胞数量减少，破骨细胞表面积和单个破骨细胞核数量均有效减少。
实施例3 16(R)-HETE对破骨细胞前体细胞增殖和凋亡的影响
参照实施例2进行骨细胞的分化和再生处理，并如同实施例2进行对照和实验组分组，在第4-5天，使用AnnexinV：PE凋亡检测试剂盒I(BDBioScIsStices，USA)对凋亡测定进行定量。破骨细胞前体增殖用溴脱氧尿苷(BrdU)细胞增殖检测试剂盒(GEHealthcareLifeSciences，USA)进行定量，数据代表至少三个独立实验的平均值±SEM。
检测结果参见图5和图6，根据图5和图6可知，在浓度为75ng/ml时，16(R)-HETE治疗不影响M-CSF依赖的前体细胞增殖或凋亡率，上述实验在体外证明16(R)-HETE对破骨细胞分化有抑制作用，而不影响细胞增殖或存活。
实施例4 16(R)-HETE对破骨细胞钙离子浓度的影响
参照实施例2进行破骨细胞再生和分化处理，并如同实施例2进行对照和实验组分组，在第4-5天使用钙氟酶联免疫吸附试验进行检测(Lonza,Switzerland)。
检测结果参见图7，根据图7可知，在浓度为75ng/ml时，16(R)-HETE治疗可以较为显著地降低钙离子的活性，上述实验在体外证明16(R)-HETE对破骨细胞分化有抑制作用，而不影响细胞增殖或存活。
实施例5肿瘤骨转移扫描重建结果
6周雌性裸鼠(Balb/c-null)从辽宁长生生物技术股份有限公司购买，并在SPF条件下繁殖。皮下注射MDA-MB-231乳腺癌细胞系建立肿瘤骨转移模型，实验组以灌胃方式给予小鼠75mg/kg 16(R)-HETE治疗，4周后扫描(Quantum GX2 micro-CT Imaging System(PerkinElmer,USA)。统计全身骨肿瘤转移数及骨肿瘤转移大小。
检测结果如图8-10所根据图8-10可知，给予小鼠75mg/kg 16(R)-HETE治疗4周后，可有效抑制小鼠骨转移发生，减少全身骨肿瘤转移数和骨转移肿瘤大小。
根据上述实验可知道，鹿茸单体-16(R)-HETE通过抑制破骨细胞分化抑制乳腺癌骨转移。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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