CN101402675B - 一种靶向抑制ανβ3阳性细胞增殖的环肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向抑制αvβ3阳性细胞增殖的环肽，它们的制备和应用，本发明的环肽，其氨基酸序列如下：Cys Arg Gly Asp Val Cit Arg Leu Arg Trp Arg LysCys其中N端Cys与C端Cys通过二硫键成环。

Description

一种靶向抑制ανβ3阳性细胞增殖的环肽

技术领域

本发明涉及一种多肽药物，特别是涉及一种具有预防和治疗血管生成相关性疾病作用的多肽，它们的制备和应用。

背景技术

血管生成(angiogenesis)通常只发生在诸如伤口愈合、女性月经周期、妊娠和胎儿生长等情况下，但是在慢性炎症、肿瘤侵袭转移的过程中也存在该现象。病理状态下发生的血管生成相关疾病包括：各种肿瘤；血管性疾病如血管畸形、动脉硬化、血管粘连、浮肿性硬化症；眼病如角膜移植后新血管形成、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病、血管形成角膜病、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维素增生、粒状结膜炎；炎症性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、甲状腺炎；皮肤病如牛皮癣、毛细血管扩张、化脓性肉芽肿、脂溢性皮炎和痤疮等。

与传统的抗癌/抗炎治疗相比，抗血管生成治疗具有许多优点：(1)治疗发生时，血管形成已被启动，因此，抗血管生成治疗对正常内皮细胞影响不大，具有良好的特异性；(2)血管内皮细胞暴露在血液中，循环中的药物直接作用于新生血管壁，故药物能够直接发挥作用，所用药物剂量小、疗效高；(3)血管内皮细胞基因相对稳定，不易突变，因而不易发生耐药；(4)作用具有放大效应，因为一个内皮细胞可支持50～100个肿瘤细胞生长；(5)几乎所有的肿瘤和慢性炎症病灶都要依赖于血管供给营养，故抗瘤/抗炎谱广。正因为如此，血管生成抑制剂的研发受到了学术界、商业界的广泛重视。

总体来说，血管生成抑制策略主要有以下几种：(1)阻断血管生成因子的合成和释放，或拮抗其作用，如VEGF单抗Avastin、Endostatin、IFN-α2a、SU5416等；(2)阻断内皮细胞降解周围基质的能力，如基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂，如Marimastat、AG3340、Neovastat等；(3)直接抑制内皮细胞的功能，如Thalidomide、TNP-470、Squalamine等；(4)阻断内皮细胞表面整合素的作用，如Vitaxin、EMD121974等。另外，还有一些非特异性作用机制的血管生成抑制剂，如CLA、IL-12、IM862等。上述策略中绝大部分并非真正只对新生的血管内皮细胞起作用，故系统性毒性副作用在所难免。唯有整合素αvβ3抗体如Vitaxin或拮抗剂如EMD121974可真正靶向到新生的血管内皮细胞，并在多种动物模型中抑制肿瘤生长，目前处于II期临床试验中。

整合素αvβ3是粘附分子整合素家族的重要成员之一，在正常休止期内皮细胞和其他健康组织中的表达极其有限，而高表达于新生的血管内皮细胞及部分恶性肿瘤细胞(黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌细胞)膜表面，高表达的αvβ3通过与细胞外基质中纤维粘连素和粘蛋白的相互作用诱导内皮细胞的分化、增殖及迁移，故αvβ3是新生血管的标记。该分子的表达特征使得靶向整合素αvβ3以治疗血管生成相关性疾病成为可能。细胞膜整合素αvβ3的天然配体绝大部分均含精-甘-天冬氨酸(RGD)基序，进一步研究证实，利用含RGD序列的多肽，可阻止整合素αvβ3与细胞外基质中纤维粘连素和粘蛋白的相互作用，进而抑制新生血管内皮细胞的增殖。如西仑吉肽(cilengitide.EMD2121974)的化学结构式为c(RGDf(NMe)V)，是c(RGDfV)改良后得到的化合物。实验表明，该环状RGD肽对肺癌移植瘤具有抗血管生成和生长抑制双重作用，并增加肿瘤细胞对放疗的敏感性。也有研究证实，RGD多肽(如RGDS)可通过内皮细胞膜表面αvβ3的内化作用进入细胞内，进入细胞内的RGD多肽可与促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9结合并激活其促凋亡活性，进而诱导内皮细胞的凋亡。

研究表明，转录因子NF-KB在细胞凋亡和增殖中也发挥重要作用，其活化可通过直接上调凋亡抑制因子(c-IAP1、c-IAP2、和IXAP)、TNF受体相关因子(TRAF1和TRAF2)、锌指蛋白A20、超氧化锰歧化酶、Bcl-2同系物A1/Bfl-1和IEX-IL等抗凋亡基因的表达，抑制细胞的凋亡。而新生血管内皮细胞的持续增殖有赖于NF-κB的持续活化，抑制NF-κB的活性可有效阻止血管内皮细胞的增殖。

由p50和p65两亚基形成的异二聚体是NF-κB的典型代表，是NF-κB所有形式中最重要的一种，几乎存在于体内所有细胞，其含量远高于其它二聚体。此异二聚体的氨基末端可构成1个环状结构域，由其介导与DNA碱基特异性结合。晶体衍射分析显示，p50/p65异源二聚体与免疫球蛋白κ链基因增强子κB序列特异性结合的方式为：p50亚单位的Arg-54、Arg-56、Tyr-57、Glu-60、His-64和Lys-241氨基酸残基与κB序列5′端的5′-G_-5G_-4G_-3A_-2C_-1-3′碱基系列特异结合；p65亚单位的Arg-33、Arg-35、Arg-36、Glu-39、和Arg-187，与κB序列3′端的5′-T₊₁T₊₂C₊₃C₊₄-3′4个碱基对特异结合。另外，由NF-kB p50/p65异源二聚体的氨基端和二聚化结构域共同构成的环状结构域，还可非特异地识别DNA核糖磷酸骨架。即由p50和p65N末端共同构成的这一环状结构域形成了NF-κB的DNA结合结构域，介导其与顺式作用元件的结合，值得注意的是，这种结合为特异性结合。NF-κB激活靶基因首先需要DNA结合结构域识别靶基因启动子区域内的顺式作用元件，并与之结合，后在p65反式激活域的辅助下，激活靶基因的表达。因此，若我们获得能够拮抗p65亚基与其顺式作用元件结合的多肽，则势必能够达到拮抗NF-κB转录活性的效果，最终达到抑制NF-κB调控靶基因表达及治疗血管生成相关性疾病的目的。我们选用酵母双杂交系统，以NF-κB p65 DNA结合域为诱饵蛋白，从随机肽库中筛选NF-κB相互作用多肽，并鉴定这些多肽的功能。目前我们已筛选获得8条具有不同序列的NF-κB p65亚基拮抗肽，这里所列的多肽序列中含有其中一条拮抗肽序列(RLRWRKC)，另外5条分别见专利200510007479.2，200510069451.1。

由于NF-κB存在于所有的细胞，故只有对病灶部位细胞实施抑制NF-κB活性的靶向策略，才不致引起机体生理功能的广泛紊乱，而RGD多肽为实现这一策略提供了可能。研究证实，化疗靶向的化疗药物主要集中在一些具有高细胞毒性，但是单独使用时其系统毒性又相当高的药物，如将其特异性靶向到表达整合素αvβ3的肿瘤细胞或肿瘤组织新生血管内皮细胞，则可以在提高药物效率和减少使用剂量的同时也减轻其系统毒性。主要的化疗药物有阿霉素(doxorubicin)和紫杉醇(paclitaxel，PTX)两类。而用于靶向的组件主要是含RGD序列的环肽和模拟肽段如二环肽CDCRGDCFC、聚乙二醇包被的长循环脂质体-RGD(RGD-PEG-LCL)、RGD-4C、c(RGDfK)、RGD10(GARYCRGDCFDG)等。但应用该靶向组件将NF-κB抑制剂导入αvβ3阳性细胞的研究尚未见报道。

由于RGD多肽序列与NF-κB p65亚基拮抗肽序列在细胞内的作用靶点不同，故在两序列间设计一合适的linker至关重要，设计的基本要求应该是：既要让整个多肽序列在细胞外保持稳定(能耐受降解)，又要让其在细胞内被迅速裂解为两个片断以发挥各自的作用。缬氨酸-瓜氨酸linker符合这一要求，研究证实，缬氨酸-瓜氨酸linker在小鼠体内的半衰期为144小时(6天)，明显长于腙键和二硫键形成的linker的半衰期(二者的半衰期分别为<2天、1天)，缬氨酸-瓜氨酸linker在猕猴体内的半衰期为230小时(9.6天)，这是迄今为止报道最长的药物-linker半衰期，但药物进入靶细胞后缬氨酸-瓜氨酸linker可被溶酶体酶如组织蛋白酶B迅速裂解。这里所列的多肽序列中的N端含有RGD序列片段(CRGD)、C端含有NF-κBp65亚基拮抗肽序列片段(RLRWRKC)，二者通过缬氨酸-瓜氨酸linker(VCit)连接，从而构成完整的全长序列：CRGDVCit RLRWRKC。而序列首尾的两个半胱氨酸(C)可通过二硫键成环，环化设计不仅可增加RGD与靶细胞表面整合素αvβ3的亲和力，提高其靶向性，而且环肽可耐受血清蛋白酶降解，半衰期明显延长，其生物利用度得以大幅度提高，从而可减少药物使用剂量。而成环的二硫键在细胞浆高浓度谷胱甘肽(比血浆中的浓度高100～1000倍)作用下裂解，两次裂解反应可使环肽变为两个分离的肽段——CRGDVCit和NF-κB拮抗肽(RLRWRKC)，后者因解除了分子内的空间位阻干扰，故可高效地发挥其抑制靶细胞活化及增殖的效应。

发明内容

本发明涉及一种含精-甘-天冬氨酸序列、能够与持续增殖的血管内皮细胞及部分恶性肿瘤细胞(黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌细胞)的细胞膜整合素αvβ3相结合的环肽。该环肽中的精-甘-天冬氨酸序列可特异识别αvβ3阳性细胞，结合在细胞膜表面的环肽经αvβ3内化入靶细胞后，迅速裂解为含精-甘-天冬氨酸序列以及含核因子-κB p65亚基拮抗肽序列的两个片段，后者因摆脱了分子内空间位阻的干扰，故可高效发挥对αvβ3阳性细胞的增殖抑制效应。本发明还涉及该环肽的制备和应用。

本发明的环肽，其氨基酸序列如下：

Cys Arg Gly Asp Val Cit Arg Leu Arg Trp Arg Lys Cys(N端Cys与C端Cys通过二硫键成环)

本发明的环肽，其用途是预防和治疗血管生成相关性疾病，包括各种肿瘤；血管性疾病如血管畸形、动脉硬化、血管粘连、浮肿性硬化症；眼病如角膜移植后新血管形成、新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病、血管形成角膜病、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维素增生、粒状结膜炎；炎症性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、甲状腺炎；皮肤病如牛皮癣、毛细血管扩张、化脓性肉芽肿、脂溢性皮炎和痤疮等。

本发明还包括含有本发明的环肽的药物组合物。本发明的药物组合物，必要时可以含有药物可接受的载体。本发明的药物组合物，可以以任何形式的药物制剂形式存在。如适合口服的制剂或适合注射的制剂，优选是注射剂。最优选是冷冻干燥注射剂。

本发明还包括本发明的环肽的制备方法，所述方法选自基因重组方法或化学合成方法。如：常规的固相合成方法、溶液中合成方法。

具有本发明氨基酸序列结构的环肽可与核因子-κB p65亚基专一结合，并阻断核因子-κB与其顺式作用元件的结合，从而抑制核因子-κB的生物学活性，即核因子-κB调控各种靶基因表达的活性。此种结构多肽既可以以多肽形式单独存在，也可与其它蛋白和多肽融和，或被甲基化、乙酰化和氨基化等修饰，或进行个别氨基酸的突变或替代，或插入蛋白质表面的特定部位，如凸环区，或与其它物质连接。无论以什么形式存在，含此结构多肽的物质可能表现出与核因子-κB p65亚基结合，并抑制核因子-κB活性的作用。

本发明通过酵母双杂交技术筛选获得与核因子-κB p65亚基新型结合多肽，并证实了此条多肽具有抑制核因子-κB生物活性的功能，在此基础上设计并合成了具有靶向抑制αvβ3阳性细胞增殖的新型环肽，这对进一步开发成血管生成相关性疾病的预防和治疗药物具有重要意义。

研究结果表明，本发明设计并合成的环肽只对αvβ3阳性细胞有效，能够抑制细胞核因子-κB所调控的靶基因的表达，从而抑制细胞增殖。因而可以成为新的抑制血管生成的药物或药物前体，本发明的多肽可以用于预防和治疗血管生成相关性疾病。

附图说明

图1为环肽疏水性分析结果。

图2为环肽对核因子-κB p65亚基与DNA结合的竞争抑制实验结果。

图3为环肽进入αvβ3阳性细胞的激光共聚焦检测结果。

A：罗丹明标记的多肽与人脐静脉内皮细胞共培养30分钟

B：罗丹明标记的多肽与人乳腺癌细胞MDA-MB-231共培养30分钟

C：罗丹明标记的多肽与小鼠巨噬细胞共培养4小时

图4为环肽对VEGF介导的人脐静脉内皮细胞增殖的抑制效应的实验结果。

图5为环肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞(αvβ3+)增殖的抑制效应的实验结果。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、多肽的理化性质分析

将本发明多肽分子的氨基酸序列按ANTHPROT V5.0软件所要求的格式输入，后计算多肽分子的各种理化特征常数。

结果见表1、图1

               表1多肽理化特征常数分析结果

实施例2、多肽对核因子-κB p65亚基与DNA顺式作用元件结合的竞争抑制实验

多肽1为线形肽(RLRWRKC)、多肽2为全长环肽，序列的合成由上海华大天源生物科技有限公司合成，纯度>95％。于包被了核因子-κB顺式作用元件的96孔酶联板(购自美国Clontech公司的Mercury^TM Transfactor p65 kits)中加入150μl/孔转录因子封闭液，室温孵育15min；弃转录因子封闭液后加入50μl/孔用转录因子封闭液稀释的检测样品，样品分别为含10ng/μl的p65标准蛋白作为阳性对照、含10ng/μl的p65标准蛋白同时加入系列浓度阳性多肽、含10ng/μl的p65标准蛋白同时加入相同系列浓度阴性肽，室温孵育1h，空白对照为加入50μl转录因子封闭液；加入转录因子封闭液150μl/孔洗涤3次，每次4min，去除洗涤液；加入用转录因子封闭液以1:500稀释的p65抗体100μl/孔，室温孵育1h；加入转录因子封闭液150μl/孔洗涤3次，每次4min，去除洗涤液；加入用转录因子封闭液以1:1000稀释的羊抗兔IgG-HRP二抗100μl/孔，室温孵育30min；加入转录因子缓冲液250μl/孔洗涤4次，每次4min，去除洗涤液；加入TMB底物，室温孵育10min，待液体变蓝后，用100μl/孔的终止液终止反应；于450nm和630nm双波长检测OD值。p65结合肽对p65与其顺式作用元件结合的抑制百分数计算公式为：(p65标准蛋白阳性对照孔OD-多肽孔OD)/p65标准蛋白阳性对照孔OD。

结果表明，本发明的多肽可特异性抑制p65与其DNA顺式作用元件的结合，而这种抑制效应具有量效关系，即抑制作用随着多肽浓度的升高而增加，而阴性肽则不影响p65与其DNA顺式作用元件的结合。其中多肽1的作用优于多肽2，可能是多肽2(环肽)的空间位阻导致其与p65的亲和力下降所致。见图2。

实施例3、环肽进入αvβ3阳性细胞的激光共聚焦检测

本实验中环肽及标记由上海华大天源生物科技有限公司合成，纯度>95％。在无脂质体转染的细胞培养体系中，将荧光素(罗丹明)标记的多肽(终浓度为75μM)与人脐静脉内皮细胞、其他αvβ3阳性细胞(如人乳腺癌细胞MDA-MB-231)共培养30分钟，与αvβ3阴性细胞(如小鼠巨噬细胞)共培养4小时，激光共聚焦显微镜下观察结果。

结果显示，人脐静脉内皮细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231内可见荧光素标记的多肽，但多肽即使与小鼠巨噬细胞共培养4小时，也只能见到少许多肽进入细胞(可能是巨噬细胞对多肽的非特异性吞噬所致)。表明本多肽可进入到αvβ3阳性细胞内，而不能或极少进入到αvβ3阴性细胞内。见图3。

实施例4、环肽抑制αvβ3阳性细胞增殖的实验

本实验中环肽由上海华大天源生物科技有限公司合成，纯度>95％。以含10％小牛血清的RPMI1640培养人脐静脉内皮细胞(添加10μg/ml的VEGF)、人乳腺癌细胞MDA-MB-231，取对数生长期的细胞，经0.25％胰酶消化后计数，以2.5×10⁴/ml的细胞浓度接种在96孔板中，每孔接种100μl，使细胞接种量分别为2.5×10³/孔。待细胞培养贴壁4小时后，按分组的不同分别加入系列浓度的多肽100μl，终浓度分别为75μM、37.5μM、18.75μM、9.375μM，同时设αvβ3单抗预处理组(RPMI1640配制成5μg/100μl)，待细胞培养72小时后以MTT法测定细胞增殖，采用多功能读板机在波长570nm下测量各孔OD值。

结果表明，本发明的环肽可抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231在体外的增殖反应，且该抑制效应具有量效关系，即抑制作用随多肽浓度的升高而增强，而将αvβ3单抗预处理这两类细胞，则可阻止环肽肽的上述效应。表明环肽的抑制效应是通过αvβ3而介导的。见图4、图5。

实施例5、环肽制备方法的操作步骤

固相多肽合成的主要操作步骤如下：1、树脂溶涨：将Wang-Resin树脂放入反应管中，加DMF(15ml/g)，30min。2、脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。3、检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。4、洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。5、缩合：加入保护氨基酸三倍过量，活化剂HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，反应30min。6、洗涤：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。7、重复二至六操作依次连接氨基酸(从C端到N端顺序)，最后一次洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次。9、裂解：配制裂解液(10ml/g)——TFA 94.5％；水2.5％；EDT2.5％；TIS1％，120min。10、吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。11、HPLC纯化：以水和乙腈做流动相，在流动相中加入0.1％的TFA，梯度从5％--85％，使用C18反相柱。12、二硫键的形成：用醋酸水溶解多肽，比例应需要而定，稀释到多肽浓度为0.5-1.6mg/ml，最终醋酸的浓度为5％，用碳酸氨调节PH值到6，加DMSO(10-20％体积)在25℃，反应2-3天(HPLC或Ellman test监测)。13、HPLC纯化：稀释最终溶液到TFA为0.05％，乙腈为5％，上反相柱除掉DMSO和其他杂质。14、冻干。

Claims (8)

1.一种靶向抑制αvβ3阳性细胞增殖的环肽，其氨基酸序列如下：

Cys Arg Gly Asp Val Cit Arg Leu Arg Trp Arg Lys Cys

其中N端Cys与C端Cys通过二硫键成环。

2.含有权利要求1的环肽的一种靶向抑制αvβ3阳性细胞增殖的药物组合物。

3.权利要求2的药物组合物，其中含有药物可接受的载体。

4.权利要求2的药物组合物，是注射剂。

5.权利要求2的药物组合物，是冷冻干燥注射剂。

6.权利要求1的环肽的制备方法，其特征在于，所述方法选自基因重组方法或化学合成方法。

7.权利要求6的制备方法，其特征在于，所述方法选自固相合成方法、溶液中合成方法。

8.权利要求1的环肽在制备抑制VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231在体外的增殖反应的药物中的应用。

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