BR112014016076B1

BR112014016076B1 - Peptídeo, vetor, construção de peptídeo quimérico e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112014016076B1
Application number: BR112014016076-7A
Authority: BR
Inventors: Angelita Rebollo Garcia; Fariba Nemati; Didier Decaudin; Jeronimo Bravo Sicilia; Jesus Maria Fominaya Gutierrez
Original assignee: Sorbonne Université; Institut Curie
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2022-03-15
Also published as: AU2012360845B2; JP2015504050A; CN104271147B; CA2859712C; EP2797616A1; IL233280A0; US20140364376A1; KR102071514B1; JP6169606B2; CN104271147A; AU2012360845A1; US9644001B2; US20160257713A1; WO2013098337A1; EP2797616B1; ES2748937T3; BR112014016076A2; US9353155B2; SG11201403683PA; SG10201607271SA

Abstract

PEPTÍDEO, VETOR, CONSTRUÇÃO DE PEPTÍDEO QUIMÉRICO, ÁCIDO NUCLEICO E USO DOS MESMO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A invenção se refere a peptídeos de penetração celular, opcionalmente ligados a um peptídeo pró-apoptótico, úteis como agentes pró-apoptóticos, para a inibição de proliferação celular in vitro e para o tratamento de tumores.

Description

FARMACÊUTICA

[0001] A invenção diz respeito a peptídeos de transporte que penetram a membrana celular.

Antecedentes da invenção:

[0002] Apoptose é a morte celular geneticamente programada e a sua desregulação é associada com, entre outras patologias, câncer. Enquanto apoptose é conhecida por depender nos membros da família Bcl-2 e caspases, dados recentes sugerem que duas importantes famílias de fosfatases, PP1 e PP2A, são atores cruciais envolvidos nas decisões de vida celular ou morte celular. A fosfatase Ser/Thre PP2A tem sido implicada em ambas, indução e prevenção de apoptose, apontando para uma complexa reciprocidade das ações de fosfatase. Diversas fosfatases recentemente tornaram-se alvos atrativos para o tratamento de uma variedade de doenças, incluindo cânceres. Contudo, os únicos fármacos clínicos que tem como alvo a fosfatase são os imunosupressores ciclosporina A e FK506.

[0003] Peptídeos de penetração celular (CPP) são moléculas que podem se mover para dentro de células sem causar dano às membranas, levando à proposição de seu uso como vetores para a entrega de carga terapêutica. Diversos CPP foram identificados, tais como Tat, antennapedia, ou SHV1 VP22. Estes peptídeos podem cruzar a membrana celular e alcançar o citoplasma e/ou o núcleo. Peptídeos de penetração interagindo com as proteínas PP1/PP2A foram projetados. Esta abordagem, nomeada “Tecnologia de Fosfatagem Farmacológica” (DPT), foi descrita em Guergnon et al., 2006 e nos pedidos de patente internacionais WO2003/011898 e WO2004/011595. Um peptídeo pro-apoptótico, chamado DPT-C9h, que especificamente desregula a interação entre caspase-9 e PPP2A, utilizou-se desta sequencia penetrante (pedido de patente internacional WO2010/112471).

[0004] Contudo, este peptídeo possui uma meia-vida curta, o que é uma real desvantagem para usos clínicos.

Sumário da invenção:

[0005] Os presentes peptídeos modificados superam este problema pois não são digeridos por proteases séricas humanas. Esta nova propriedade torna possível a redução da dosagem de peptídeo injetada, assim como a escala de sua administração.

[0006] A invenção provê um peptídeo que compreende a sequência de aminoácidos a seguir (I): X1-KKKIK-Φ-EI-X2-X3 (I) (SEQ ID NO:1) onde X1 está vago, é um resíduo de lisina, ou valina- lisina; X2 está vago, é um resíduo de lisina, ou lisina- isoleucina; X3 está vago ou é uma sequência de aminoácidos com 1 a 4 aminoácidos; e W é um resíduo de aminoácido que é diferente de arginina; ou um peptídeo resistente a proteólise derivado da sequência (I) por uma ou mais modificações químicas, ou um peptídeo substancialmente homólogo derivado da sequência (I) por uma ou mais substituições conservadoras.

[0007] A invenção ainda provê um vetor compreendendo tal peptídeo, como um peptídeo de penetração celular, acoplado a uma molécula de interesse.

[0008] A invenção ainda provê uma construção de peptídeo quimérico, compreendendo tal peptídeo, fundido a um peptídeo pró-apoptótico, onde o peptídeo de penetração é preferencialmente fundido no N-terminal do peptídeo pró- apoptótico.

[0009] Outro aspecto da invenção é um vetor compreendendo um ácido nucleico compreendendo (i) uma sequência codificada de nucleotídeos para o peptídeo de penetração celular acoplada a (ii) uma sequência de nucleotídeos de interesse, para uso em terapia genética ou transferência genética in vivo ou ex vivo.

[0010] Usando a construção de peptídeo quimérico, ou um ácido nucleico codificando tal construção de peptídeo quimérico, para a inibição de proliferação celular in vitro, é também englobada.

[0011] Outra matéria da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo tal vetor ou um peptídeo quimérico tal como aqui descrito, em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0012] A invenção ainda se refere ao uso de peptídeos quiméricos ou as composições farmacêuticas de acordo com a invenção para o tratamento de doenças hiperproliferativas ou doenças parasíticas.

Descrição detalhada da invenção:

[0013] Os inventores trabalharam para melhorar a estabilidade dos peptídeos divulgados na WO2010/112471, em particular o peptídeo DPT-C9h que é sujeito à degradação por proteases. Este peptídeo corresponde a um peptídeo de penetração associado à sequência ao local de ligação da caspase-9 à PP2A. Este peptídeo induz apoptose em linhas celulares humanas. Além disso, possui um efeito apoptótico específico apenas em células B tumorais isoladas de pacientes de leucemia linfocítica crônica sem efeito em células saudáveis. Além disso, o peptídeo induz importante redução no tamanho do tumor quando injetado em camundongos portadores de xenotransplante de câncer de mama humano.

[0014] DPT-C9 consiste na sequência VKKKKIKREIKI- YVETLDDIFEQWAHSEDL (SEQ ID NO:6), onde VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO:7) é o peptídeo penetrante.

[0015] Os inventores demonstraram que uma mutação no peptídeo penetrante dramaticamente aumenta a estabilidade de todo o peptídeo, enquanto mantém suas propriedades, em particular sua habilidade de induzir apoptose.

[0016] De acordo com a invenção, uma mutação do resíduo de arginina no peptídeo penetrante previne clivagem de proteases.

[0017] Os inventores então projetaram peptídeos compreendendo a sequência de aminoácidos a seguir (I): X1-KKKIK-Φ-EI-X2-X3 (I) (SEQ ID NO:1) onde X1 está vago, é um resíduo de lisina, ou valina- lisina; X2 está vago, é um resíduo de lisina, ou lisina- isoleucina; X3 está vago ou é uma sequência de aminoácidos de 1 a 4 aminoácidos; e W é um resíduo de aminoácido diferente da arginina.

[0018] Numa concretização preferida, W é A, K ou N. Ainda preferencialmente W é não conservador no que diz respeito à arginina. Numa concretização preferida, W é então um resíduo de aminoácido diferente de lisina, asparagina, ou glutamina. Preferencialmente W é alanina.

[0019] Numa concretização preferida, X1 é valina-lisina; X2 é lisina-isoleucina; X3 está vago.

[0020] O peptídeo preferido é VKKKKIKAEIKI (SEQ ID NO:2).

[0021] Outro peptídeo é VKKKKIKKEIKI (SEQ ID NO:10).

[0022] Ainda outro peptídeo é VKKKKIKNEIKI (SEQ ID NO:11). Definições:

[0023] O termo “paciente” se refere a um humano ou animal não humano, preferencialmente um mamífero, incluindo machos, fêmeas, adultos e crianças necessitando um tratamento onde um efeito pró-apoptótico é desejado.

[0024] Conforme aqui usados, os termos “tratamento” ou “terapia” incluem tratamentos curativos ou profiláticos. Particularmente, tratamento curativo refere-se a qualquer alívio, melhoria e/ou eliminação, redução e/ou estabilização (e.g., fracasso em progredir para estágios mais avançados) de um sintoma, assim como retardo na progressão de um sintoma de uma desordem particular.

[0025] Tratamento profilático refere-se a quaisquer de: impedir o aparecimento, reduzir o risco de desenvolvimento, reduzir a incidência, atrasar o aparecimento, reduzir o desenvolvimento, assim como aumentar o tempo para o aparecimento de sintomas de uma desordem particular.

[0026] Os termos “peptídeo de penetração” ou “peptídeo de penetração celular” (ou “CPP”) ou “peptídeo de transporte”, usados de forma intercambiável, significam que o peptídeo é capaz de se deslocar para dentro de células sem causar dano substancial na membrana, e podem ser usados como vetores de outras moléculas a eles ligadas. Os termos referem-se a peptídeos de penetração celular catiônicos, também chamados peptídeos de transporte, peptídeos portadores, ou domínios de transdução de peptídeos. O CPP, conforme aqui monstrado, possui a capacidade de induzir penetração celular de um peptídeo fundido ao CPP dentro de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% das células de uma dada população de cultura celular, incluindo todos os inteiros entre estes, e permitem deslocamento macromolecular dentro de múltiplos tecidos in vivo após administração sistêmica. Um peptídeo de penetração celular pode também se referir a um peptídeo que, quando trazido ao contato com uma célula em condições apropriadas, passa do ambiente externo para o ambiente intracelular, incluindo o citoplasma, organelas como a mitocôndria, ou o núcleo da célula, em condições significantemente maiores que difusão passiva. Esta propriedade pode ser avaliada por diversos métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica.

[0027] Duas sequências de aminoácidos são “homólogas”, “substancialmente homólogas” ou “substancialmente similares” quando um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos por resíduos biologicamente similares ou quando mais de 80% dos aminoácidos forem idênticos, ou quando mais de 90%, preferencialmente mais que aproximadamente 95%, forem similares (funcionalmente idênticos). Preferencialmente, as sequências similares ou homólogas são identificadas por alinhamento usando, por exemplo, o programa de engavetamento GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the CGC Package, Version 7, Madison, Wisconsin), ou quaisquer dos programas conhecidos na técnica (BLAST, FASTA, etc.). Preferencialmente, estes peptídeos homólogos não incluem dois resíduos de cisteína, prevenindo asssim a ciclização.

[0028] O termo “substituição conservadora” conforme aqui usado denota a substituição de um resíduo de aminoácido por outro, sem alterar a conformidade geral e função do peptídeo, incluindo, mas não limitado a, substituição de um aminoácido por um possuindo propriedades similares (tais como, por exemplo, polaridade, potencial de ligação de hidrogênio, acidez, base, forma, hidrofobicidade, aromaticidade, e afins). Aminoácidos com propriedades similares são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, arginina, histidina e lisina são aminoácidos hidrofílicos-básicos e podem ser intercambiáveis. Similarmente, isoleucina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por leucina, metionina ou valina. Aminoácidos hidrofílicos neutros, que podem ser substituídos um por outro, incluem asparagina, glutamina, serina e treonina.

[0029] Como “substituído” ou “modificado” a presente invenção inclui os aminoácidos que foram alterados ou modificados de aminoácidos de ocorrência natural.

[0030] Assim sendo, deve ser entendido que no contexto da presente invenção, uma substituição conservadora é reconhecida na técnica como a substituição de um aminoácido por outro aminoácido de propriedades similares. Exemplos de substituições conservadoras estão dispostos na Tabela 1 abaixo: Tabela 1. Substituições conservadoras I

[0031] Alternativamente, aminoácidos conservadores podem ser agrupados conforme descrito em Lehninger, 1975, conforme demonstrado na Tabela 2, imediatamente abaixo. Tabela 2. Substituições conservadoras II

[0032] Como ainda outra alternativa, substituições conservadoras exemplares estão dispostas na Tabela 3, imediatamente abaixo: Tabela 3. Substituições Conservadoras III

Preparação de peptídeos:

[0033] Peptídeos aqui descritos podem ser sintetizados usando métodos sintéticos conhecidos para aqueles versados na técnica, por exemplo, síntese química ou recombinação genética. Em uma concretização preferida, peptídeos são obtidos pela condensação passo a passo de resíduos de aminoácidos, tanto por condensação de um fragmento pré-formado já contendo uma sequência de aminoácido na ordem apropriada, ou por condensação de diversos fragmentos previamente preparados, enquanto se protegem os grupos funcionais de aminoácidos excetuando-se aqueles envolvidos na ligação de peptídeos durante a condensação. Em particular, os peptídeos podem ser sintetizados de acordo com o método originalmente descrito por Merrifield.

[0034] Exemplos de tecnologias de síntese química são síntese de fase sólida e síntese de fase líquida. Como uma síntese de fase sólida, por exemplo, o aminoácido correspondente ao C- terminal do peptídeo a ser sintetizado é ligado a um suporte que é insolúvel em solventes orgânicos, e por repetição alternada de reações, um onde aminoácidos com seus grupos aminados e grupos funcionais de cadeia lateral protegidos por grupos protetores apropriados são condensados um por um em ordem do C-terminal ao N-terminal, e um onde os aminoácidos ligados à resina ou ao grupo protetor dos grupos aminados ou dos peptídeos são soltos, a cadeia de peptídeos é assim estendida desta maneira. Métodos de síntese de fase sólida são amplamente classificados pelo método tBoc e método Fmoc, dependendo do tipo de grupo protetor usado. Grupos protetores tipicamente usados incluem tBoc (t- butoxicarbonil), Cl-Z (2-clorobenziloxicarbonil), Br-z (2- bromobenziloil carbonil), Bzl (benzil), Fmoc (9- fluorenilmetoxicarbonil), Mbh (4, 4’-dimetoxi benzidril), Mtr (4-metoxi-2, 3, 6-trimetil benzenesulfonil), Trt (tritil), Tos (tosil), Z (benziloxi carbonil) e Clz-Bzl (2, 6-diclorobenzil) para os grupos aminados; e tBu (t-butil) para os grupos hidroxila. Após a síntese do peptídeo desejado, ele está sujeito à reação de desproteção e cortado do suporte sólido. Tal reação de corte do peptídeo pode ser provocada por fluorido de hidrogênio ou ácido sulfônico tri-flurometano para o método Boc, e com TFA para o método Fmoc.

[0035] Alternativamente, o peptídeo pode ser sintetizado utilizando-se técnicas de recombinação. Neste caso, um ácido nucleico e/ou um construção genético, compreendendo ou consistindo em uma sequência nucleotídica codificando um peptídeo de acordo com a invenção, polinucleotídeos com sequencias nucleotídicas complementares a uma das sequências acima e sequências hibridizando tais polinucleotídeos sob condições rigorosas.

[0036] A invenção ainda se refere a um construção genético consistindo em ou compreendendo um polinucleotídeo conforme aqui definido, e sequências regulatórias (tais como promotores, ampliadores, exterminadores, etc.) permitindo a expressão (e.g. transcrição e tradução) de um peptídeo de acordo com a invenção numa célula portadora.

[0037] Assim, noutro aspecto, a invenção se refere a um portador ou célula portadora que exprime (ou que sob condições apropriadas é capaz de expressar) um peptídeo da invenção; e/ou que contém um polinucleotídeo da invenção ou construção genético da invenção.

[0038] O método de produção do peptídeo pode opcionalmente compreender os passos para purificar o referido peptídeo, modificar quimicamente o referido peptídeo, e/ou formular tal peptídeo numa composição farmacêutica. Construções quiméricas:

[0039] O peptídeo X1-KKKIK-W-EI-X2-X3 (I) (SEQ ID NO:1) é útil na invenção como um peptídeo de penetração celular (CPP).

[0040] A invenção então provê vetores, compreendendo tal peptídeo, como um peptídeo de penetração celular, acoplado a uma molécula de interesse.

[0041] A molécula de interesse pode ser acoplada a um ou diversos destes CPP.

[0042] A molécula de interesse pode ser qualquer agente terapêutico, incluindo um agente citotóxico (preferencialmente um peptídeo pro-apoptótico), um agente antiviral, ou antibacteriano, ou antiparasítico.

[0043] Numa concretização preferencial, construções de peptídeos quiméricos, compreendendo tal peptídeo, fundido a um peptídeo pro-apoptótico, podem ser preparadas.

[0044] Preferencialmente o peptídeo pro-apoptótico é fundido no C-terminal do peptídeo de penetração.

[0045] O peptídeo pro-apoptótico pode ser qualquer dos peptídeos pro-apoptóticos de interesse.

[0046] A construção de peptídeo quimérico pode preferencialmente ter um comprimento compreendendo entre 23 e 70 aminoácidos, preferencialmente entre 23 e 40 aminoácidos.

[0047] Numa concretização preferencial, o peptídeo pro- apoptótico é um fragmento da proteína caspase-9.

[0048] De acordo com uma concretização, construções de peptídeos quiméricos úteis na invenção compreendem, ou consistem na seguinte sequência de aminoácidos: Y-X4a-ETLD-X4b-I-X5-EQWA-X6-S-X7 (SEQ ID NO:3) onde X4a é valina ou isoleucina; X4b é ácido aspártico ou glicina; X5 é fenilalanina ou leucina; X6 é arginina ou histidina; X7 está vago ou é glutamato, ou glutamato-aspartato, ou glutamato-aspartato-leucina; ou um peptídeo resistente a proteólise derivado do referido peptídeo pro-apoptótico por uma ou mais modificações químicas, ou um peptídeo substancialmente homólogo derivado da SEQ ID NO:3 por uma ou mais substituições conservadoras.

[0049] Tais peptídeos homólogos ou resistentes a proteólise induzem apoptose celular, in vitro ou in vivo. Ensaios para determinar se uma molécula, por exemplo um peptídeo, induzem apoptose celular são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a incubação de células com o peptídeo candidato e a determinação se a apoptose é induzida por tal candidato, e.g. por rotulação Annexin V e PI de células e identificando-as como células apoptóticas, estas sendo Annexin V+ e PI-.

[0050] Numa concretização preferida, X4a é valina; X4b é ácido aspártico; X5 é fenilalanina; e X6 é histidina.

[0051] Numa concretização particular, a construção de peptídeo quimérica é VKKKKIKAEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (SEQ ID NO:4) também aqui designada Mut3-DPT-C9h.

[0052] Em outra concretização particular, a construção de peptídeo quimérico é VKKKKIKAEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL (SEQ ID NO:5).

[0053] Em outra concretização particular, a construção de peptídeo quimérico é VKKKKIKKEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (SEQ ID NO:12) também aqui designada Mut1-DPT-C9h.

[0054] Em outra concretização particular, a construção de peptídeo quimérico é VKKKKIKKEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL (SEQ ID NO:13).

[0055] Numa concretização particular, a construção de peptídeo quimérico é VKKKKIKNEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (SEQ ID NO:14) Também aqui designada Mut2-DPT-C9h.

[0056] Em ainda outra concretização particular, a construção de peptídeo quimérico é VKKKKIKNEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL (SEQ ID NO:15).

[0057] Em ainda outra concretização, o peptídeo pro- apoptótico é um peptídeo PP2Ah que compreende ou consiste em: a) a sequencia de aminoácido DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (SEQ ID NO:8); b) uma sequência de aminoácido substancialmente homóloga à SEQ ID NO:8, preferencialmente ao menos 80% idêntica à SEQ ID NO:8, que induza apoptose celular; ou c) um peptídeo resistente à proteólise que induza apoptose celular e que derive do peptídeo definido em a) ou b) por uma ou mais modificações químicas.

[0058] Numa concretização preferida, o peptídeo pro- apoptótico compreende ou consiste na sequência DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (SEQ ID NO: 9).

[0059] Numa concretização particular, a construção de peptídeo quimérico é VKKKKIKAEIKI- DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (SEQ ID NO:16).

[0060] Em outra concretização particular, a construção de peptídeo quimérico é VKKKKIKKEIKI- DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (SEQ ID NO:17).

[0061] Em ainda outra concretização particular, a construção de peptídeo quimérico é VKKKKIKNEIKI- DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (SEQ ID NO:18). Proteção adicional contra proteólise:

[0062] Os N- e C-terminais dos peptídeos aqui descritos podem ser opcionalmente protegidos contra proteólise. Por exemplo, o N-terminal pode ser na forma de um grupo acetil, e/ou o C- terminal pode ser na forma de um grupo amido. Modificações internas dos peptídeos para serem resistentes à proteólise também são vislumbradas, e.g. onde ao menos uma ligação de peptídeo -CONH- é modificada e substituída por uma ligação reduzida (CH2NH), uma ligação retro-inversa (NHCO), uma ligação metilene-oxi (CH2-O), uma ligação thiometileno (CH2-S), uma ligação carba (CH2CH2), uma ligação cetometileno (CO-CH2), uma ligação hidroxietileno (CHOH-CH2), uma ligação (N-N), uma ligação E-alceno, ou também uma ligação -CH=CH-.

[0063] Por exemplo, o peptídeo pode ser modificado por acetilação, acilação, amidação, ligação cruzada, ciclização, formação de ligação dissulfídica, formação de cruzamentos covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, carboxilação gama, glicosilação, formação de âncoras GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristilação, oxidação, forsforilação, e afins.

[0064] Os peptídeos da invenção podem ser compostos de aminoácidos na configuração D, que tornam os peptídeos resistentes à proteólise. Eles também podem ser estabilizados por ligações cruzadas intramoleculares, e.g. modificando-se ao menos dois resíduos de aminoácidos com cadeias olefínicas laterais, preferencialmente cadeias alquenílicas C3-C8, preferencialmente cadeias penten-2-yl, seguidas por ligações químicas cruzadas das cadeias, de acordo com a dita tecnologia de “grampo” descrita em Walensky et al., 2004. Por exemplo, aminoácidos nas posições i e i+4 a i+7 podem ser substituídos por aminoácidos não naturais que mostram resíduos olefínicos reativos. Todos estes peptídeos resistentes a proteólise quimicamente modificados são englobados na presente invenção.

[0065] Em outro aspecto da invenção, peptídeos são covalentemente amarrados à uma molécula de polietilenoglicol (PEG) por seu C-terminal ou a um resíduo de lisina, notavelmente um PEG de 1500 a 4000 MW, para um decréscimo de liberação urinária e em doses terapêuticas usado para um aumento na meia- vida em plasma sanguíneo. Em ainda outra concretização, a meia- vida do peptídeo é aumentada incluindo-se o peptídeo num material polímero biodegradável e biocompatível para um sistema de distribuição de fármaco formando microesferas. Polímeros e copolímeros são, por exemplo, poli(D,L-lactídeo-co-glicólido) (PLGA) (conforme ilustrado em US2007/0184015, SoonKap Hahn et al.). Ácidos nucleicos

[0066] A invenção também se refere a um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de nucleotídeo codificando um peptídeo de acordo com a invenção.

[0067] A invenção também se refere a uma construção genética consistindo em ou compreendendo um polinucleotídeo conforme aqui definido, e sequências regulatórias (tais como promotores, ampliadores, exterminadores, etc.) permitindo a expressão (e.g. transcrição e tradução) de um peptídeo de acordo com a invenção numa célula portadora.

[0068] As construções genéticas da invenção podem ser DNA ou RNA, e são preferencialmente DNA de cadeia dupla. As construções genéticas da invenção também podem ser numa forma apropriada para a transformação da célula portadora ou organismo portador desejados, numa forma apropriada para a integração dentro do DNA genômico da célula portadora desejada ou numa forma apropriada para replicação independente, manutenção e/ou herança no organismo portador desejado. Por exemplo, as construções genéticas da invenção podem ser na forma de um vetor, tais como, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo, YAC, um vetor viral ou transposon. Em particular, o vetor pode ser um vetor de expressão, i.e. um vetor que pode prover para expressão in vitro e/ou in vivo (e.g. numa célula portadora apropriada, organismo portador e/ou sistema de expressão).

[0069] Num preferido mas não limitante aspecto, uma construção genética da invenção compreende i) pelo menos um ácido nucleico da invenção; operavelmente conectado a ii) um ou mais elementos regulatórios, tais como um promotor e opcionalmente um exterminador apropriado; e opcionalmente também iii) um ou mais elementos de construções genéticas tais como sequências 3’- ou 5’-UTR, sequências líderes, marcadores de seleção, marcadores de expressão/genes de reportagem, e/ou elementos que podem facilitar ou aumentar (a eficiência de) transformação ou integração.

[0070] Numa concretização particular, o ácido nucleico codificando o peptídeo de penetração celular da invenção é acoplado ou fundido a um ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína de interesse. O peptídeo de interesse pode ser um peptídeo pro-apoptótico conforme aqui descrito. Mais geralmente o peptídeo ou proteína de interesse pode ser qualquer peptídeo ou proteína a se expressar, tais como peptídeo terapêutico ou polipeptídeo, assim como qualquer peptídeo antigênico ou imunogênico se assim desejado.

[0071] O ácido nucleico pode especialmente ser transportado por um vetor viral, tais como um adenovírus ou um lentivírus, para infecção e expressão ex vivo ou in vivo do peptídeo ou da proteína de interesse acoplada ao peptídeo de penetração celular. Atividade pro-apoptótica:

[0072] Os peptídeos quiméricos conforme aqui definidos, ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos, são úteis para a inibição de proliferação celular in vitro ou in vivo.

[0073] Eles são agentes terapêuticos úteis, em particular para o tratamento de doenças hiperproliferativas.

[0074] É então descrito um método de tratamento de uma doença hiperproliferativa num paciente em necessidade, cujo método compreende a administração em tal paciente da construção de peptídeo quimérico, ou de um ácido nucleico codificando tal construção.

[0075] Os peptídeos (ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos) são úteis para o tratamento de um tumor, em particular um tumor cancerígeno, preferencialmente num paciente humano.

[0076] A doença proliferativa pode ser câncer, tal como câncer hematológico, em particular leucemia mielógina aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, célula B, linfoma de célula T cutâneo, ou um câncer não-hematológico, por exemplo cerebral, epidermóide (em particular de pulmão, mamas, ovário), de cabeça e pescoço (células escamosas), de bexiga, gástrico, pancreático, de cabeça, de pescoço, renal, de próstata, coloretal, esofagal, ou de tireóide, e melanoma.

[0077] Diferentes tipos de câncer podem incluir, mas não esão limitados a fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leimiosarcoma, rabdomiosarcoma, linfoma, leucemia, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de célula sudorípara, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma de duto bilial, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma de pequena célula pulmonar, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, e retinoblastoma, melanoma uveal e câncer de mama.

[0078] Mais particularmente os peptídeos aqui descritos (ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos) são úteis no tratamento de cânceres que exibem uma desregulação de PP1 e/ou PP2A ou que exibem uma sobre-expressão da proteína anti- apoptpótica Bcl-2, um regulador apoptótico que interage com e é controlado por PP1 e PP2A.

[0079] Altos níveis de expressão do gene bcl-2 humano foram encontrados em todos os linfomas com translocações t (14; 18) cromossomais, incluindo leucemias linfocíticas das células de tipo pre-B, neuroblastomas, carcinomas nasofringeais, e muitos adenocarcinomas da próstata, mamas e cólon. Especialmente sobreexpressão do bcl-2 foi encontrada em leucemia linfocítica (CLL) (Deng et al., 2009; Prickett et al., 2004).

[0080] Numa concretização preferida, o tumor cancerígeno é então um linfoma, especialmente uma leucemia, tal como leucemia linfocítica crônica (CLL).

[0081] Ainda, os peptídeos quiméricos (ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos) podem ser usados para o tratamento de metástases.

[0082] De acordo com outra concretização, a desordem hiperproliferativa pode ser uma desordem hiperproliferativa não- cancerosa tal como hiperplasia benigna da pela (e.g., psoríase) ou próstata (e.g., hipertrofia prostática benigna (BPH)), artrite reumatóide, doença intestinal inflamatória, osteoartrite, leiomiomas, adenomas, lipomas, hemangiomas, fibromas, oclusão vascular, restenose, aterosclerose, ou leucoplasia pilosa oral.

[0083] Os peptídeos quiméricos (ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos) conforme aqui descritos podem também ser usados para o tratamento de doenças parasíticas.

[0084] Em particular, os peptídeos quiméricos (ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos) podem ter a habilidade de diminuir a carga parasítica num sujeito d ao menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%.

[0085] A invenção também provê um método de tratamento de uma doença parasítica num paciente em necessidade, cujo método compreende a administração em tal paciente de um peptídeo quimérico ou um ácido nucleico codificando tal peptídeo.

[0086] Preferencialmente, a doença parasítica é devida a um parasita que pertence às espécies Trypanosoma, Theileria ou Plasmodium.

[0087] A doença parasítica causada pelo Trypanosoma pode ser doença do sono em humanos, doença de Chagas em humanos, doença de Nagana em gado ruminante, cavalos e porcos, tripanosomíase em pássaros, tripanossomíase ou durina em cavalos e outros Equidae.

[0088] A doença parasítica causada pelo Theileria pode ser teleriose tropical, a Febre da Costa do Mediterrâneo, a Febre da Costa Leste ou piroplasmose equina ou ovina.

[0089] A doença parasítica causada pelo Plasmodium pode ser malária. Composições farmacêuticas:

[0090] Os vetores da invenção, em particular peptídeos quiméricos (ou ácidos nucleicos codificando tal peptídeo) podem ser administrados por qualquer via conveniente incluindo intravenosa, oral, transdermal, subcutânea, mucosal, intramuscular, intrapulmonar, intranasal, parenteral, retal, vaginal e topical. A via intranasal é de interesse particular.

[0091] De forma mais vantajosa, a administração intra-tumoral também é contemplada.

[0092] O agente terapêutico é formulado em associação a um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0093] A composição farmacêutica pode também incluir, ou ser combinada com qualquer outro princípio ativo, tais como em particular agentes anti-câncer, e.g. quimioterapia citotóxica convencional com inibidores de replicação de DNA tais como agentes de ligação de DNA em particular drogas alquilantes ou intercalantes, ou inibidores I ou II de topoisomerase, ou com agentes anti-mitogênicos como alcalóides. Em outra concretização, os vetores da invenção, em particular peptídeos quiméricos (ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos), podem ser combinados com inibidores de protease (quinase, aromatase, ATPase), anticorpos monoclonais ou hormônios ou análogos a hormônios.

[0094] Numa concretização preferencial, o agente terapêutico pode ser administrado por eletroporação. Eletroporação, também conhecida como eletropermeabilização ou eletroinjeção, é a permeabilização de membranas celulares como a consequência da aplicação de certos campos elétricos curtos e intensos transversalmente à membrana celular, às células ou aos tecidos. Tipicamente, eletroporação consiste na injeção de compostos, preferencialmente por via intramuscular ou intradermal, seguida pela aplicação de uma série de pulsos elétricos por meio de eletrodos conectados a um gerador. As condições para a aplicação de um campo elétrico na zona de injeção agora são bem conhecidas por pessoas versadas na técnica, e são em particular descritas na patente US5468223. Estas pessoas versadas na técnica serão capazes de adaptar estas condições de acordo com cada caso. O campo elétrico pode ser de pulsos de 50-200 microssegundos de campos elétricos de alta potência na extensão de 1-5000 V/cm e com uma frequência entre 0,1 e 1000 hertz. Tipicamente, uma sequencia de oito pulsos de 100 microssegundos de 1000-1500 V/cm com uma frequencia de 1 hertz é aplicada.

[0095] O agente terapêutico, tal como o peptídeo quimérico, é formulado em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0096] A preparação de uma composição farmacológica que contém ingredientes ativos nela dissolvidos ou dispersos é bem conhecida na técnica e não deve ser limitada com base na formulação. Tipicamente tais composições são preparadas como injetáveis tanto como soluções líquidas ou suspensões; contudo, formas sólidas apropriadas para a solução, ou suspensões, em líquido antes do uso podem também ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada. Em particular, as composições farmacêuticas podem ser formuladas em forma de dosagem sólida, por exemplo, cápsulas, tabletes, pílulas, pós, drágeas ou grânulos.

[0097] A escolha de veículo e o conteúdo da substância ativa no veículo são geralmente determinadas de acordo com a solubilidade e as propriedades químicas do composto ativo, o modo particular de administração e as provisões a serem observadas na prática farmacêutica. Por exemplo, excipientes como lactose, citrato de sódio, carbonato de sódio, fosfato dicálcico e agentes desintegradores como amido, ácidos algínicos e certos silicatos complexos combinados com lubrificantes tais como estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco podem ser usados para preparar tabletes. Para preparar uma cápsula, é vantajoso usar lactose e glicóis polietilênicos de alto peso molecular. Quando suspensões aquosas forem usadas elas podem conter agentes emulsificantes ou agentes que facilitam a suspensão. Diluentes como sucrose, etanol, glicol polietilênico, glicol propileno, glicerol e clorofórmio ou misturas destes também podem ser usadas.

[0098] A preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tais como microsferas injetáveis, partículas bio-erosíveis, compostos poliméricos (tais como ácido polilático ou ácido poliglicólico), pérolas ou lipossomas, que podem prover a liberação controlada ou sustentada do produto.

[0099] A dosagem é selecionada pela pessoa versada de forma que o efeito pro-apoptótico é alcançado, e depende da forma de administração e da forma de dosagem que é usada. A dose diária total do peptídeo quimérico administrada a um paciente em doses únicas ou divididas pode ser em quantidades, por exemplo, de em torno de 0,001 a até em torno de 100mg/kg de massa corporal diariamente e preferencialmente 0,01 a 10 mg/kg/dia. As unidades de composição de dosagem podem conter tais quantidades de quantos submúltiplos forem usados para chegar à dosagem diária. Deve ser entendido, contudo, que o nível específico de dosagem para qualquer paciente em particular vai depender de uma variedade de fatores incluindo a massa corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo e via de administração, taxas de absorção e excreção, combinação com outros fármacos e a severidade da doença em particular sendo tratada.

[0100] Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão divulgados na seção experimental a seguir, que deve ser considerada como ilustrativa e não limitando o escopo do presente pedido. LEGENDAS DAS FIGURAS:

[0101] A Figura 1 é um gráfico que mostra a estabilidade dos peptídeos mutados analizada por fracionamento Proteominer e Maldi-Tof. A razão de intensidade de cada pico é representada, relativamente a seu próprio controle. O resíduo R foi mutado para K (Mut1-DPT-C9h), N (Mut2-DPT-C9h) ou A (Mut3-DPT-C9h). Círculo: controle peptídeo DPT-C9h (SEQ ID NO:6), Quadrado: Mut1-DPT-C9h, Triângulo: Mut2-DPT-C9h, Losango: Mut3-DPT-C9h.

[0102] A Figura 2 mostra uma análise de apoptose por coloração com anexina-V-FITC de linhagem ceular de câncer de mama HBCx- 12A que foi tratada por 24h com 100 μM dos peptídeos controle e mutados.

[0103] A Figura 3 mostra a biodistribuição de Cy5DPT-C9h e Cy5Mut3DPT-C9h. Camundongos foram enxertados em interescapular com xenoenxerto de câncer de mama luminal HBCx-3. Eles receberam uma injeção intraperitoneal de DPT-C9h ou Mut3DPT-C9h marcados com Cy5 a 5 mg/kg. Camundongos de controle receberam o excipiente controle (glicose 5%). Os camundongos foram examinados entre 0 (antes da injeção) e 168h após a injeção. A fluorescência dos tumores foi calculada e normalizada usando software Living Image. EXEMPLOS: Exemplo 1: Projeto e caracterização de peptídeos de penetração DPT-C9h não degradáveis modificados 1.1. Materiais e métodos Síntese de peptídeo e sequência

[0104] Peptídeos foram sintetizados num sintetizador automatizado de múltiplos peptídeos com procedimento de fase sólida e química padrão Fmoc. A pureza e composição dos peptídeos foi confirmada por HPLC de fase reversa e por análise de aminoácidos. Análise da estabilidade do peptídeo em soro humano

[0105] Análise de degradação dos peptídeos foi feita por Proteominer e Maldi-Tof conforme previamente descrito. 1.2. Resultados

[0106] DPT-C9h é VKKKKIKREIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (SEQ ID NO:6).

[0107] O resíduo R foi modificado para K (Mut1-DPT-C9h), N (Mut2-DPT-C9h) ou A (Mut3-DPT-C9h).

[0108] Figura 1 mostra que o peptídeo Mut3-DPC-C9h não é degradado após 24h de contato com o soro humano. Além disso, outras mutações mostram alta estabilidade quando comparadas com o peptídeo de control (DPT-C9h). Exemplo 2: Efeito de DPT-C9h modificado na apoptose 2.1. Materiais e métodos Células

[0109] Câncer de mama humano HBCx-12A, linha celular foi isolada de xenotranslantes primários de câncer humano e foi cultivada em meio RPMI suplementada com 10% de FCS. Detecção de apoptose por coloração anexina-V-FITC

[0110] Células apoptóticas foram detectadas usando Anexina-V (-FITC de biociências BD) conforme descrito pelo fabricante. Brevemente, as células foram lavadas em 1x tampão de ligação, centrifugadas e então resuspensas em 200 μl de um tampão de ligação contendo Annexin V-FITC (0,1 μl/ml) e PI (0,5 μg/ml). Após incubação em temperatura ambiente no escuro por 10 minutos, células foram analisadas por citometria de fluxo. Dados adquiridos pelo FACSCalibur (biociências BD) foram analisados pelo software Cellquest Pro. 2.2. Resultados

[0111] Os inventores então analisaram se os peptídeos modificados mantém a capacidade de induzir apoptose. A linha de células cancerosas HBCx-12A foi tratada por 24h com 100 μM de peptídeos de controle e modificados. A apoptose foi analisada por coloração anexina-V-FITC. Conforme mostrado na Figura 2, os peptídeos analisados induzem níveis similares de apoptose. O mesmo resultado foi observado quando usando as linhas celulares HBC-x3 e HBCx-17. Exemplo 3: Biodistribuição de Mut3DPT-C9h em tumores 3.1. Materiais e métodos Síntese de peptídeos e sequência

[0112] Peptídeos (DPT-C9h e Mut3DPT-C9h) foram sintetizados conforme descrito acima. O fluorocromo Cy5 foi adicionado durante a síntese do peptídeo. Ensaios de fluorescência

[0113] Camundongos foram IP (intraperitonialmente) injetados com o peptídeo Cy5DPT-C9h ou Mut3DPT-C9h (5mg/kg) e então analisados em momentos diferentes após a injeção.

[0114] Imagens de fluorescência foram realizadas com o sistema de imagens IVIS (IVIS100, Caliper Life Sciences, USA). Camundongos foram anestesiados sob análise. Tempo de aquisição de imagens foi entre 1s a 10s, dependendo do sinal de fluorescência. Análise foi executada usando o software Living Image V. 2.50 (Caliper Life Sciences). 3.2. Resultados Biodistribuição do Mut3DPT-C9h e DPT-C9h nos modelos de xenotransplante de câncer de mama

[0115] Os inventores tinham interesse em analisar e comparar a biodistribuição de ambos os peptídeos. Figura 3 mostra a biodistribuição de Cy5DPT-C9h e Cy5Mut3DPT-C9h num modelo de xenotransplante de câncer de mama. Camundongos foram intraperitonialmente (IP) injetados e a biodistribuição foi analizada em tempos diferentes após a injeção.

[0116] Figura 3 mostra que 6h após a injeção IP, os inventores foram capazes de detectar ambos os peptídeos no tumor. O pico máximo de detecção de Cy5 Mut3DPT-C9h é detectado 23h após a injeção, diminuindo levemente a intensidade da fluorescência após este tempo. Finalmente, nível considerável de Cy5Mut3DPT- C9h foi detectado 168h após a injeção. O nível máximo de fluorescência de Cy5DPT-C9h foi detectado 6h após a injeção, diminuindo levemente após este período de tempo. Nível baixo de Cy5DPT-C9h foi detectado após 168h de tratamento.

[0117] Conjuntamente, estes resultados mostram que Cy5- marcado DPT-C9h e Cy5-marcado Mut3DPT-C9h alcançam o tumor. Mais importante, Cy5-marcado Mut3DPT-C9h mostrou ser mais estável que o peptídeo original, DPT-C9h.

[0118] O peptídeo modificado Mut3DPT-C9h mostra uma biodistribuição no tumor mais sustentada que o peptídeo original (DPT-C9h), já que nós fomos capazes de detectar a fluorescência do fluorocromo Cy5 por mais tempo que a fluorescência de DPT- C9h.

[0119] Esta nova propriedade vai permitir que se reduza a dosagem de peptídeo injetada assim como a escala de administração. Em suma, as novas modificações possuem uma clara vantagem, se comparadas com os peptídeos de controle e possuem uma nova característica já que elas não são degradáveis por proteases de soro. REFERÊNCIAS Deng X, Gao F, and W. Stratford May. Dephosphorylation and up-regulation of Bcl2- p53 binding Protein phosphatase 2A inactivates Bcl-2’s antiapoptotic function by dephosphorylation and up-regulation of Bcl2-p53 binding. Blood. 2009 Jan 8;1 13(2):422-8. Guergnon, F. Dessauge, V. Dominguez, J. Viallet, X. Cayla, A. Rebollo, V.Yuste, S.Susin, PE. Bost and A. Garcia Use of penetrating peptides interacting with PP1/PP2A proteins as a basis for a new Drug Phosphatase Technology. Mol. Pharmacol. (2006) 69:1 1 15-1 124. Lehninger, (1975) Biochemistry, Second Edition, Worth Publishers, Inc. New York, NY. pp. 71-77. Pitton, C, Rebollo, A., Van Snick, J., Theze, J. and Garcia, A. (1993) High affinity and intermediate affinity forms of the human IL-2 receptor expressed in an IL-9-dependent murine T cell line deliver proliferative signals via differences in their transduction pathways. Cytokine, 5, 362-371. Prickett TD, and Brautigan D (2004). Ovelapping binding sites in Protein Phosphatase 2A for association with regulatory 1 and a4 (mTap42) subunits. J.Biol.Chem. 279,38912-38920. Walensky et al., Science, 2004, 305:1466-1470.

Claims

1. Peptídeo caracterizado por consistir da sequência de aminoácidos VKKKKIKAEIKI (SEQ ID NO:2), VKKKKIKKEIKI (SEQ ID NO:10) ou VKKKKIKNEIKI (SEQ ID NO:11).

2. Vetor caracterizado por compreender o peptídeo conforme definido na reivindicação 1, como um peptídeo de penetração celular, acoplado a um agente terapêutico.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o agente terapêutico ser selecionado a partir do grupo consistindo de um agente citotóxico, um agente antiviral, um agente antibacteriano e um agente antiparasítico.

4. Construção de peptídeo quimérico caracterizada por compreender o peptídeo conforme definido na reivindicação 1, como um peptídeo de penetração celular, fundido ao N-terminal de um peptídeo pró-apoptótico.

5. Construção de peptídeo quimérico de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ter um comprimento de 23 a 40 aminoácidos.

6. Construção de peptídeo quimérico de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por ser VKKKKIKAEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (SEQ ID NO:4), VKKKKIKAEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL (SEQ ID NO:5), VKKKKIKKEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (SEQ ID NO: 12), ou VKKKKIKNEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (SEQ ID NO: 14).

7. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o vetor conforme definido na reivindicação 2 ou 3, ou a construção de peptídeo quimérico conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender i) o vetor compreendendo um peptídeo conforme definido na reivindicação 1 como um peptídeo de penetração celular, acoplado a um agente citotóxico, ou ii) o peptídeo quimérico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 6, para uso no tratamento de uma doença hiperproliferativa.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a doença hiperproliferativa ser câncer.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por o câncer ser um câncer de mama.