KR102071514B1 - 세포-투과성 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시험관내 세포 증식을 억제하기 위한, 그리고 종양을 치료하기 위한, 프로-아폽토시스 제제로서 유용한, 선택적으로 프로-아폽토시스 펩티드에 연결되는, 세포-투과성 펩티드에 관한 것이다.

Description

세포-투과성 펩티드{CELL-PENETRATING PEPTIDES}
본 발명은 세포막을 투과하는 셔틀 펩티드에 관한 것이다.
아폽토시스는 유전적으로 프로그래밍된 세포 사멸이며, 이의 탈조절은 다른 병적측면들 중에서 암과 연관된다. 아폽토시스는 Bcl-2 패밀리 구성원 및 카스파제에 의존하는 것으로 알려져 있으며, 최근 데이터에 따르면 세린/트레오닌 포스파타아제의 2개의 주요 패밀리 PP1 및 PP2A가 세포 수명 또는 세포 사멸 결정에 관여하는 주요 인자라는 점이 제안되었다. Ser/Thr 포스파타아제 PP2A는 아폽토시스의 유도 및 방지 모두에 연루되었으며, 이는 포스파타아제 작용의 복합 상호작용을 나타낸다. 최근에, 여러 포스파타아제들이 암을 비롯한 다양한 질환들을 치료하기 위한 매력적인 표적이 되어왔다. 그러나, 포스파타아제를 표적으로 하는 유일한 임상 약물은 면역억제 시클로스포린 A 및 FK506이다.
세포 투과성 펩티드(CPP)는 막 손상을 일으키지 않으면서 세포 내로 전좌할 수 있는 분자이며, 이는 치료적 카르고를 전달하기 위한 벡터로서의 사용을 제안한다. 여러 CPP, 예컨대 Tat, 안테나페디아, 또는 SHV1 VP22가 확인되었다. 이들 펩티드는 세포막을 횡단하여 세포질 및/또는 핵에 도달할 수 있다. PP1/PP2A 단백질과 상호작용하는 투과성 펩티드가 설계되었다. "DPT(Drug Phosphatase Technology)"라고 명명된 이러한 접근법은 문헌 [Guergnon et al, 2006]과 국제특허출원 WO2003/011898 및 WO2004/011595에 개시되어 있다. 카스파제-9와 PP2A 사이의 상호작용을 특이적으로 탈조절하는, DPT-C9h로 명명된 프로-아폽토시스 펩티드는, 상기 투과성 서열을 사용하였다(국제특허출원 WO2010/112471).
그러나, 이러한 펩티드는 짧은 반감기를 나타내며, 이는 임상적 사용에 대해 현실적인 결점이 된다.
본 발명의 요약
본 발명의 돌연변이 펩티드는 인간 혈청 프로테아제에 의해 소화되지 않기 때문에, 상기 문제점을 극복한다. 이와 같은 새로운 성질에 의해, 투여 스케쥴 뿐만 아니라 주사되는 펩티드의 투여량이 감소될 수 있다.
본 발명은 하기 아미노산 서열 (I)을 포함하는 펩티드, 또는 하나 이상의 화학적 개질에 의해 서열 (I)로부터 유래된 단백질분해(proteolysis)-내성 펩티드, 또는 하나 이상의 보존성 치환에 의해 서열 (I)로부터 유래된 실질적 상동성(homologous) 펩티드를 제공한다:
X1-KKKIK-Ψ-EI-X2-X3 (I) (서열번호 1)
여기서, X1은 공백(vacant)이거나, 또는 리신 잔기 또는 발린-리신이고;
X2는 공백이거나, 또는 리신 잔기 또는 리신-이소류신이고;
X3은 공백이거나, 또는 1 내지 4개 아미노산의 아미노산 서열이고;
Ψ은 아르기닌 외의 다른 아미노산 잔기임.
또한, 본 발명은 관심 분자에 커플링된 상기 펩티드를 세포 투과성(penetrating) 펩티드로서 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 프로-아폽토시스(pro-apoptotic) 펩티드에 융합된 상기 펩티드를 세포 투과성 펩티드로서 포함하는 키메라 펩티드 구축물(construct)을 제공하며, 이때 상기 투과성 펩티드는 바람직하게는 프로-아폽토시스 펩티드의 N-말단에 융합된다.
본 발명의 또다른 측면은 상기 세포 투과성 펩티드 또는 상기 키메라 펩티드 구축물을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이다.
본 발명의 또다른 측면은, 생체내 또는 생체외에서 유전자 치료 또는 유전자 도입에 사용하기 위한, (ii) 관심 뉴클레오티드 서열에 커플링된 세포 투과성 펩티드를 코딩하는 (i) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터이다.
또한, 시험관내 세포 증식을 억제하기 위한, 키메라 펩티드 구축물의 사용 또는 상기 키메라 펩티드 구축물을 코딩하는 핵산의 사용이 포함된다.
본 발명의 추가 측면은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 상기 키메라 펩티드 또는 상기 벡터를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 과증식성 질환 또는 기생충 질환을 치료하기 위한, 본 발명에 따른 키메라 펩티드 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명자들은 WO2010/112471에 개시되어 있는 펩티드, 특히 프로테아제에 의한 분해를 받게 되는 펩티드 DPT-C9h의 안정성을 개선하기 위해 연구하였다. 상기 펩티드는 PP2A에 대한 카스파제-9의 결합 부위의 서열에 연관되는 투과성 펩티드에 대응하는 것이다. 상기 펩티드는 인간 세포주에서 아폽토시스를 유도한다. 또한, 이는 건강한 세포에 대해 영향을 미치지 않으면서, 만성 림프성 백혈병 환자로부터 단리된 종양 B 세포에서만 특이적인 아폽토시스 효과를 갖는다. 또한, 상기 펩티드는 인간 유방 암 이종이식(xenograft)을 갖는 마우스에 주사된 경우에 종양 크기의 중요한 감소를 유도한다.
DPT-C9는 서열 VKKKKIKREIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(서열번호 6)으로 구성되며, 여기서 VKKKKIKREIKI(서열번호 7)은 투과성 펩티드이다.
본 발명자들은 투과성 펩티드의 돌연변이에 의해 전(whole) 펩티드의 안정성이 극적으로 증가되면서, 펩티드의 성질, 특히 아폽토시스의 유도 능력이 유지된다는 것을 보여주었다.
본 발명에 따르면, 투과성 펩티드에서 아르기닌 잔기의 돌연변이에 의해 프로테아제로부터 분할이 방지된다.
이에 따라, 본 발명자들은 하기 아미노산 서열 (I)을 포함하는 펩티드를 설계하였다:
X1-KKKIK-Ψ-EI-X2-X3 (I) (서열번호 1)
여기서, X1은 공백(vacant)이거나, 또는 리신 잔기 또는 발린-리신이고;
X2는 공백이거나, 또는 리신 잔기 또는 리신-이소류신이고;
X3은 공백이거나, 또는 1 내지 4개 아미노산의 아미노산 서열이고;
Ψ는 아르기닌 외의 다른 아미노산 잔기임.
바람직한 구현예에서, Ψ는 A, K 또는 N이다. 더 바람직하게는, Ψ는 아르기닌과 관련하여 비-보존적이다. 바람직한 구현예에서, Ψ는 아스파라긴 또는 글루타민, 리신과 다른 아미노산 잔기이다. 바람직하게는 Ψ는 알라닌이다.
바람직한 구현예에서,
X1은 발린-리신이고;
X2는 리신-이소류신이고;
X3은 공백이다.
바람직한 펩티드는 VKKKKIKAEIKI(서열번호 2)이다.
또다른 펩티드는 VKKKKIKKEIKI(서열번호 10)이다.
또다른 펩티드는 VKKKKIKNEIKI(서열번호 11)이다.
정의:
"환자"는 인간 또는 비-인간 동물, 바람직하게는 포유류를 나타내며, 여기에는 프로-아폽토시스 효과를 원하는 치료가 필요한 수컷, 암컷, 성인 및 유아가 포함된다.
본 명세서에서, "치료" 또는 "치료법"에는 치유적 및/또는 예방적 처치가 포함된다. 특히, 치유적 처치는 특정 장애의 증상의 진행 지연 뿐만 아니라, 증상의 완화, 개선 및/또는 제거, 감소 및/또는 안정화(예컨대, 더 진행된 단계로 발전하지 못하게 함) 등을 나타낸다.
예방적 처치는 특정 장애의 증상이 개시되는 시간을 연장시키는 것 뿐만 아니라, 개시의 중단, 진행 위험의 감소, 발병율의 감소, 개시의 지연, 진행의 감소 등을 나타낸다.
"투과성 펩티드" 또는 "세포-투과성 펩티드(cell-penetrating peptide)"(또는 "CPP") 또는 "셔틀 펩티드"는 상호 교환적으로 사용되며, 이들은 펩티드가 막을 실질적으로 손상시키지 않으면서 세포내로 이동할 수 있다는 것을 의미하며, 다른 분자들에게 연결되는 경우 다른 분자들의 벡터로서 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 용어는 수송 펩티드, 담체 펩티드 또는 펩티드 도입 도메인이라고도 지칭되는 양이온성 세포 투과성 펩티드를 나타낸다. 본 발명에서 보여지는 바와 같이 CPP는, 주어진 세포 배양 군의 세포의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 내에서(그 사이의 모든 정수들을 포함함), 상기 CPP에 융합된 펩티드의 세포 투과를 유도하는 능력을 가지며, 전신 투여하는 경우 생체내 복수의 조직들에서 고분자의 전좌를 가능하게 한다. 또한, 세포-투과성 펩티드는, 적합한 조건하에서 세포와 접촉되는 경우 수동 확산보다 더 유의적으로 큰 조건하에서 외부 환경으로부터 세포내 환경(여기에는 세포질, 미토콘드리아와 같은 세포소기관, 또는 세포의 핵이 포함됨)으로 통과하는 펩티드를 나타낼 수 있다. 이와 같은 성질은 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있는 다양한 방법들에 의해 평가될 수 있다.
2개의 아미노산 서열은, 하나 이상의 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 대체된 경우에 또는 80% 이상의 아미노산이 동일하거나 또는 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상의 아미노산이 유사한(기능적으로 동일한) 경우에, "상동성", "실질적 상동성" 또는 "실질적 유사"이다. 바람직하게는, 유사 또는 상동 서열은 예를 들어 GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램 또는 당업계에 알려져있는 임의의 프로그램들(BLAST, FASTA 등)을 사용하여 정렬에 의해 확인된다. 바람직하게는, 이러한 상동 펩티드에는 2개의 시스테인 잔기가 포함되지 않으며, 이에 따라 고리화가 방지된다.
본 명세서에서 "보존성 치환"은 펩티드의 전체 형태(conformation) 및 기능을 변형시키지 않으면서 아미노산 잔기를 다른 잔기로 대체하는 것을 나타내며, 여기에는 아미노산을 유사한 성질(예를 들어, 극성, 수소 결합 전위, 산성, 염기성, 모양, 소수성, 방향성 등)을 갖는 것으로 대체하는 것이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 유사한 성질을 갖는 아미노산은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 아르기닌, 히스티딘 및 리신은 친수성-염기성 아미노산이며, 상호교환될 수 있다. 이와 유사하게, 이소류신 소수성 아미노산은 류신, 메티오닌 또는 발린으로 대체될 수 있다. 서로에 대해 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산에는 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌이 포함된다.
"치환된" 또는 "개질된"에 의해, 본 발명에는 자연발생적 아미노산으로부터 변형되거나 개질된 아미노산들이 포함된다.
이와 같이 본 발명의 측면에서, 보존성 치환은 하나의 아미노산을 성질이 유사한 다른 아미노산으로 치환하는 것으로서 당업계에서 인식하고 있다는 점이 이해되어야 할 것이다. 보존성 치환의 예는 하기 표 1에 나타낸다.
보존성 치환 I
측쇄 특징 아미노산
비극성 G A P I L V
극성-비전하 C S T M N Q
극성-전하 D E K R
방향성 H F W Y
기타 N Q D E
선택적으로, 보존성 아미노산은 문헌 [Lehninger, 1975]에 개시된 바와 같이 하기 표 2에서처럼 그룹지을 수 있다.
보존성 치환 II
측쇄 특징 아미노산
비극성(소수성)
A. 지방성 A L I V P
B. 방향성 F W
C. 황-함유 M
D. 경계선 G
비전하-극성
A. 히드록실 S T Y
B. 아미드 N Q
C. 설프히드릴 C
D. 경계선 G
양전하(염기성) K R H
음전하(산성) D E
선택적으로, 대표적인 보존성 치환을 하기 표 3: "보존성 치환 III"에 나타낸다.
Figure 112014070594442-pct00001
펩티드 제조:
본 명세서에 기재되는 펩티드들은 당업계의 통상의 기술자에게 알려져있는 표준 합성 방법들, 예를 들어 화학적 합성 또는 유전적 재조합을 이용하여 합성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 펩티드는 아미노산 잔기의 단계별 축합을 통해 획득되는데, 이는 적절한 순서로 아미노산 서열을 이미 함유하는 사전-형성된 단편의 축합에 의해 수행되거나, 또는 미리 제조된 여러 단편들의 축합에 의해 수행되며, 축합 동안 펩티드 결합에 관여하는 것들을 제외한 아미노산 관능기는 보호된다. 특히, 펩티드는 본래 Merrifield가 개시한 방법에 따라 합성될 수 있다.
화학적 합성 기법의 예는 고체상 합성 및 액체상 합성이다. 고체상 합성으로서, 예를 들어, 합성하려는 펩티드의 C-말단에 상응하는 아미노산이 유기 용매에 불용성인 지지체에 결합되는데, 이는 아미노기 및 측쇄 관능기가 적절한 보호기에 의해 보호된 아미노산이 C-말단으로부터 N-말단으로의 순서로 차례대로 축합되는 반응과, 펩티드의 아미노기의 보호기 또는 수지에 결합된 아미노산이 방출되는 반응이 번갈아 반복됨으로써 수행되고, 이와 같은 방식으로 펩티드 사슬이 연장된다.
고체상 합성 방법은 이용되는 보호기의 유형에 따라 크게 tBoc 방법과 Fmoc 방법으로 분류된다. 통상적으로 이용되는 보호기에는, 아미노기에 대해서는 tBoc(t-부톡시카르보닐), Cl-Z(2-클로로벤질옥시카르보닐), Br-Z(2-브로모벤질옥시카르보닐), Bzl(벤질), Fmoc(9-플루오레닐메톡시카르보닐), Mbh(4,4'-디메톡시디벤즈히드릴), Mtr(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐), Trt(트리틸), Tos(토실), Z(벤질옥시카르보닐) 및 Clz-Bzl(2,6-디클로로벤질); 구아니디노기에 대해서는 NO2(니트로) 및 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐); 히드록실기에 대해서는 tBu(t-부틸)가 포함된다. 원하는 펩티드를 합성한 후에, 탈보호 반응이 수행되고, 고체 지지체로부터 절단된다. 이와 같은 펩티드 절단 반응은 Boc 방법에 대해서는 플루오르화 수소 또는 트리-플루오로메탄 설폰산에 의해 수행될 수 있으며, Fmoc 방법에 대해서는 TFA에 의해 수행될 수 있다.
선택적으로, 펩티드는 재조합 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 이 경우, 핵산 및/또는 유전적 구축물은, 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 상기 서열들 중 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 엄격한 조건하에서 상기 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 서열로 구성되거나 또는 이것들을 포함한다.
또한, 본 발명은 숙주 세포에서 본 발명에 따른 펩티드를 발현(예컨대, 전사 및 번역)시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 및 조절 서열(예컨대, 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등)로 구성되거나 또는 이것들을 포함하는 유전적 구축물에 관한 것이다.
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 발현하는 (또는 적절한 상황에서 발현할 수 있는); 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 유전적 구축물을 함유하는, 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
선택적으로, 펩티드의 제조방법은 상기 펩티드를 정제하는 단계, 상기 펩티드를 화학적으로 개질하는 단계, 및/또는 상기 펩티드를 약학 조성물로 제형화시키는 단계를 포함할 수 있다.
키메라 구축물:
본 발명에서, 펩티드 X1-KKKIK-Ψ-EI-X2-X3 (I) (서열번호 1)은 세포 투과성 펩티드(CPP)로서 유용하다.
따라서, 본 발명은 관심 분자에 커플링된 상기 펩티드를 세포 투과성 펩티드로서 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 관심 분자는 하나 또는 수개의 CPP에 커플링될 수 있다.
상기 관심 분자는 임의의 치료제일 수 있으며, 여기에는 세포독성제(바람직하게는, 프로-아폽토시스 펩티드), 항-바이러스제, 또는 항-박테리아제, 또는 항-기생충제가 포함된다.
바람직한 구현예에서, 프로-아폽토시스 펩티드에 융합된 상기 펩티드를 투과성 펩티드로서 포함하는 키메라 펩티드 구축물이 제조될 수 있다.
바람직하게는, 상기 프로-아폽토시스 펩티드는 투과성 펩티드의 C-말단에 융합된다.
프로-아폽토시스 펩티드는 임의의 관심 프로-아폽토시스 펩티드일 수 있다.
키메라 펩티드 구축물은 바람직하게는 23 내지 70개의 아미노산, 바람직하게는 23 내지 40개의 아미노산이 포함된 길이를 가질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 프로-아폽토시스 펩티드는 카스파제-9 단백질의 단편이다.
일구현예에 따르면, 본 발명에서 유용한 키메라 펩티드 구축물은 하기 아미노산 서열로 구성되거나 또는 이것을 포함하며:
Y-X4a-ETLD-X4b-I-X5-EQWA-X6-S-X7 (서열번호 3)
여기서,
X4a는 발린 또는 이소류신이고;
X4b는 아스파르트산 또는 글리신이고;
X5는 페닐알라닌 또는 류신이고;
X6은 아르기닌 또는 히스티딘이고;
X7은 공백이거나, 또는 글루타메이트, 또는 글루타메이트-아스파르테이트, 또는 글루타메이트-아스파르테이트-류신임;
본 발명은 하나 이상의 화학적 개질에 의해 상기 프로-아폽토시스 펩티드로부터 유래된 단백질분해-내성 펩티드, 또는 하나 이상의 보존성 치환에 의해 서열번호 3으로부터 유래된 실질적 상동성 펩티드를 제공한다.
상기 단백질분해-내성 또는 상동성 펩티드는 시험관내 및/또는 생체내에서 세포 아폽토시스를 유도한다. 분자, 예를 들어 펩티드가 세포 아폽토시스를 유도하는지 여부를 결정하기 위한 어세이는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이는 예를 들어, 후보 펩티드를 갖는 세포를 배양하는 단계, 및 상기 후보 펩티드에 의해 아폽토시스가 유도되는지 여부를 예컨대 세포의 Annexin V 및 PI 라벨링에 의해 결정하고, Annexin V+ 및 PI-인 것을 아폽토시스 세포로서 식별하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서,
X4a는 발린이고;
X4b는 아스파르트산이고;
X5는 페닐알라닌이고;
X6은 히스티딘이다.
특정 구현예에서, 상기 키메라 펩티드 구축물은 다음과 같으며, 이는 또한 본원에서 설계된 Mut3-DPT-C9h이다:
VKKKKIKAEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (서열번호 4).
또다른 특정 구현예에서, 상기 키메라 펩티드 구축물은 다음과 같다:
VKKKKIKAEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL (서열번호 5).
또다른 특정 구현예에서, 상기 키메라 펩티드 구축물은 다음과 같으며, 이는 또한 본원에서 설계된 Mut1-DPT-C9h이다:
VKKKKIKKEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (서열번호 12).
또다른 특정 구현예에서, 상기 키메라 펩티드 구축물은 다음과 같다:
VKKKKIKKEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL (서열번호 13).
특정 구현예에서, 상기 키메라 펩티드 구축물은 다음과 같으며, 이는 또한 본원에서 설계된 Mut2-DPT-C9h이다:
VKKKKIKNEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL (서열번호 14).
또다른 추가 특정 구현예에서, 상기 키메라 펩티드 구축물은 다음과 같다:
VKKKKIKNEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL (서열번호 15).
또다른 추가 구현예에서, 상기 프로-아폽토시스 펩티드는 하기를 포함하거나 하기로 구성되는 PP2Ah 펩티드이다:
a) 아미노산 서열 DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (서열번호 8);
b) 세포 아폽토시스를 유도하고, 서열번호 8과 실질적으로 상동인, 바람직하게는 서열번호 8과 80% 이상 동일한, 아미노산 서열; 또는
c) 하나 이상의 화학적 개질에 의해 상기 a) 또는 b)에서 정의된 펩티드로부터 유래되고, 세포 아폽토시스를 유도하는, 단백질분해-내성 펩티드.
바람직한 구현예에서, 상기 프로-아폽토시스 펩티드는 서열 DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(서열번호 9)를 포함하거나 이것으로 구성된다.
특정 구현예에서, 상기 키메라 펩티드 구축물은 다음과 같다:
VKKKKIKAEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (서열번호 16).
또다른 특정 구현예에서, 상기 키메라 펩티드 구축물은 다음과 같다:
VKKKKIKKEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (서열번호 17).
또다른 추가 특정 구현예에서, 상기 키메라 펩티드 구축물은 다음과 같다:
VKKKKIKNEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (서열번호 18).
단백질분해에 대한 추가 보호:
본 명세서에 기재되는 펩티드의 N-말단 및 C-말단은 단백질분해에 대해 선택적으로 보호될 수 있다. 예를 들어, N-말단은 아세틸기의 형태일 수 있거나, 및/또는 C-말단은 아미드기의 형태일 수 있다. 단백질분해에 대해 내성인 펩티드의 내부 개질이 또한 고려되는데, 예컨대 적어도 -CONH- 펩티드 결합이 (CH2NH) 감소된 결합, (NHCO) 레트로-인버소 결합, (CH2-O) 메틸렌-옥시 결합, (CH2-S) 티오메틸렌 결합, (CH2CH2) 카르바 결합, (CO-CH2) 세토메틸렌 결합, (CHOH-CH2) 히드록시에틸렌 결합), (N-N) 결합, E-알센(alcene) 결합 또는 -CH=CH- 결합에 의해 대체되거나 개질된다.
예를 들어, 펩티드는 아세틸화, 아실화, 아미드화, 가교결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 공유 가교결합 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 인산화 등에 의해 개질될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 D 배열의 아미노산(들)으로 구성될 수 있으며, 이는 펩티드가 단백질분해에 내성이 되도록 한다. 이는 또한 분자내 가교결합에 의해 안정화될 수 있는데, 예컨대 문헌 [Walensky et al, 2004]에 개시된 소위 "staple" 기법에 따라 올레핀성 곁사슬, 바람직하게는 C3-C8 알케닐 사슬, 바람직하게는 펜텐-2-일 사슬에 의해 둘 이상의 아미노산 잔기를 개질시키고, 그 후 사슬의 화학적 가교결합을 수행함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 위치 i 및 i+4 내지 i+7에서 아미노산들은 반응성 올레핀성 잔기를 나타내는 비자연적 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 이들 모든 단백질분해-내성 화학적-개질된 펩티드들은 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또다른 측면에서, 비뇨기 클리어런스 및 사용된 치료적 투여량의 감소를 위해, 그리고 혈장에서 반감기의 증가를 위해, 펩티드는 C-말단 끝에 의해 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자에, 또는 리신 잔기에, 특히 1500 또는 4000 MW의 PEG에 공유 결합된다. 또다른 구현예에서, 펩티드 반감기는, 마이크로스피어를 형성하는 약물 전달 시스템을 위한 생분해성 및 생적합성 폴리머 물질에 펩티드를 함유시킴으로써 증가된다. 폴리머 및 코폴리머는 예를 들어 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)(PLGA)이다(US2007/0184015, SoonKap Hahn et al 참조).
핵산
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 숙주 세포에서 본 발명에 따른 펩티드를 발현(예컨대, 전사 및 번역)시킬 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드 및 조절 서열(예컨대, 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등)로 구성되거나 또는 이것들을 포함하는 유전적 구축물에 관한 것이다.
본 발명의 유전적 구축물은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 이중나선 DNA이다. 또한, 본 발명의 유전적 구축물은 목적하는 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 형질전환에 적합한 형태이거나, 목적하는 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 통합에 적합한 형태이거나, 또는 목적하는 숙주 유기체에서 독립적 복제, 유지 및/또는 유전에 적합한 형태일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전적 구축물은 예를 들어 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스 벡터 또는 트랜스포존과 같은 벡터의 형태일 수 있다. 특히, 상기 벡터는 발현 벡터, 즉 시험관내에서 및/또는 생체내에서(예컨대, 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템에서) 발현을 위해 제공될 수 있는 벡터일 수 있다.
바람직하지만 제한적이지는 않은 측면에서, 본 발명의 유전적 구축물은 i) 본 발명의 하나 이상의 핵산; ii) 상기 i)에 작동적으로 연결된 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 선택적으로 적합한 터미네이터; 및 선택적으로 iii) 유전적 구축물의 하나 이상의 추가 요소, 예컨대 3'- 또는 5'-UTR 서열, 리더 서열, 선택적 마커, 발현 마커/리포터 유전자, 및/또는 형질전환 또는 통합(의 효율성)을 촉진시키거나 증가시킬 수 있는 요소를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 세포-투과성 펩티드를 코딩하는 핵산은 관심대상인 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산에 커플링되거나 융합된다. 관심 펩티드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 프로-아폽토시스 펩티드일 수 있다. 보다 일반적으로, 관심 펩티드 또는 단백질은 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드 뿐만 아니라 원한다면 임의의 항원성 또는 면역원성 펩티드와 같이 발현하려는 임의의 펩티드 또는 단백질일 수 있다.
특히, 상기 핵산은, 세포-투과성 펩티드에 커플링된 관심 펩티드 또는 단백질의 생체외 또는 생체내 감염 및 발현을 위해, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 또는 렌티바이러스에 의해 운반될 수 있다.
프로-아폽토시스 활성:
본 명세서에 기재된 키메라 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산은, 시험관내 또는 생체내 세포 증식의 억제에 유용하다.
이들은 치료제, 특히 과증식성 질환 치료제로서 유용하다.
따라서, 본 발명에는 환자의 과증식성 질환 치료방법이 기재되며, 상기 방법은 키메라 펩티드 구축물 또는 상기 구축물을 코딩하는 핵산으로 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 펩티드(또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산)는 종양, 특히 암 종양을 치료하는데 유용하며, 바람직하게는 인간 환자에게서 유용하다.
과증식성 장애는 암, 예컨대 혈액 암, 특히 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프성 백혈병(CLL), 다발성 골수종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, B 세포, 피부 T 세포 림프종, 또는 비-혈액 암, 예를 들어 뇌, 표피(특히, 폐, 유방, 난소), 두경부(편평상피 세포), 방광, 위, 췌장, 두부, 경부, 신장, 전립선, 결장, 식도 또는 갑상선 암, 및 흑색종일 수 있다.
다양한 유형의 암에는, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피-육종, 활액막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 림프종, 백혈병, 편평상피 세포 암종, 기저세포 암종, 선암, 한선 암종, 피지선 암종, 유두암종, 유두상선암종, 낭종암, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희돌기교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 및 망막아종, 포도막 흑색종 및 유방 암이 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 본 발명에 기재된 펩티드(또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산)는, PP1 및 PP2A와 상호작용하고 이에 의해 조절되는 아폽토시스 조절자, 항-아폽토시스 단백질 Bcl-2의 과발현을 나타내거나, 또는 PP1 및/또는 PP2A의 탈조절을 나타내는, 암의 치료에 유용하다.
인간 bcl-2 유전자의 높은 수준의 발현은, 다수의 대세포 비-호지킨 림프종들과 대부분의 여포성 B 세포 림프종들이 포함되는 t(14; 18) 염색체 전좌를 갖는 모든 림프종들에서 발견되었다. 또한, bcl-2 유전자의 높은 수준의 발현은 신경아세포종, 비인두 암종, 및 전립선, 유방 및 결장의 다수의 선암들, 전-B 세포 유형의 림프성 백혈병이 포함되는 t(14; 18) 염색체 전좌를 갖지 않는 백혈병들에서 발견되었다. 특히, bcl-2의 과발현은 만성 림프성 백혈병(CLL)에서 발견되었다(Deng et al, 2009; Prickett et al, 2004).
따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 암 종양은 림프종, 특히 백혈병, 예컨대 만성 림프성 백혈병(CLL)이다.
또한, 상기 키메라 펩티드(또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산)는 전이를 치료하는데 사용될 수 있다.
또다른 구현예에 따르면, 상기 과증식성 장애는 비-암 과증식성 장애, 예를 들어 피부(예컨대, 건선) 또는 전립선(예컨대, 양성전립선비대증(BPH))의 양성 비후증, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 변형성관절증, 평활근종, 선종, 지방종, 혈관종, 섬유종, 혈관 폐색, 재협착증, 죽상동맥경화증, 또는 구강 모상 백반증일 수 있다.
또한, 본 발명에 기재된 상기 키메라 펩티드(또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산)는 기생충 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
특히, 상기 키메라 펩티드(또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산)는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 대상체에서 기생충 로드(load)를 감소시키는 능력을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 환자의 기생충 질환 치료방법을 제공하며, 상기 방법은 키메라 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산으로 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 기생충 질환은 트리파노소마, 테일레리아 또는 플라스모듐 종에 속하는 기생충에 기인한다.
트리파노소마에 의해 야기되는 기생충 질환은 인간의 수면증 질환, 인간의 샤가스병, 반추류 가축, 말 및 돼지의 나가나 병, 새의 트리파노소마증, 말 및 다른 말과의 두린느(dourine) 또는 커버링 질환일 수 있다.
테일레리아에 의해 야기되는 기생충 질환은 열대 테일레리아병, 지중해 코스트 열병, 이스트 코스트 열병, 또는 말 또는 양 피로플라즈마병일 수 있다.
플라스모듐에 의해 야기되는 기생충 질환은 말라리아일 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 벡터, 특히 키메라 펩티드(또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산)는 정맥내, 경구, 경피, 피하, 점막, 근육내, 폐내, 비강내, 비경구, 직장, 질 및 국부 경로를 비롯한 임의의 편리한 경로를 통해 투여될 수 있다. 비강내 경로가 특히 관심대상이 된다.
유리하게는, 종양내 투여가 또한 고려된다.
치료제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된다.
또한, 상기 약학 조성물은 임의의 다른 활성성분, 예를 들어 특히 항암제, 예컨대 DNA 복제 억제제, 예컨대 DNA 결합제, 특히 알킬화 또는 인터칼레이트화 약물, 항대사제제, 예컨대 DNA 폴리머라제 억제제, 또는 토포이소머라제 I 또는 II 억제제에 의한, 또는 항-유사분열제제, 예컨대 알칼로이드에 의한 통상의 세포독성 화학요법을 포함하거나 이것들과 조합될 수 있다. 추가 구현예에서, 본 발명의 벡터, 특히 키메라 펩티드(또는 상기 펩티드를 코딩하는 핵산)는 프로테아제(키나아제, 아로마타아제, ATP아제) 억제제, 모노클로날 항체 또는 호르몬 또는 호르몬 유사체와 조합될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 치료제는 전기천공에 의해 투여될 수 있다. 전기천공은 전기투과 또는 전기주입으로도 알려져 있으며, 이는 세포막, 세포 또는 조직에 걸쳐 특정의 짧고 강한 전계를 적용한 결과로서 세포막의 투과화이다. 통상적으로, 전기천공은 화합물을 바람직하게는 근육내 또는 피내 경로를 통해 주사하는 단계, 그 후 발전기에 연결된 전극들을 이용하여 일련의 전기 펄스를 적용하는 단계로 구성된다. 주사 영역에서 전계를 적용하기 위한 조건은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 특히 US 특허 5468223에 개시되어 있다. 당업계의 통상의 기술자라면 각 경우에 따라 상기 조건들을 조정할 수 있을 것이다. 상기 전계는 0.1 내지 1,000 헤르쯔의 주파수와 1-5000 V/cm의 50-200 마이크로초 펄스의 고강도 전계일 수 있다. 통상적으로, 1 헤르쯔의 주파수와 1000-1500 V/cm의 일련의 8개 100 마이크로초 펄스가 적용된다.
상기 치료제, 예컨대 키메라 펩티드는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된다.
활성성분이 조성물에 용해되거나 분산된 약학 조성물의 제제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 제형화에 기초하여 제한될 필요가 없다. 통상적으로, 상기 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능하도록 제조되지만; 사용하기 전에 액체 상태인 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수도 있다. 상기 제제는 또한 에멀젼화될 수 있다. 특히, 상기 약학 조성물은 고체 투여 형태, 예를 들어 캡슐, 정제, 알약, 분말, 드라제 또는 과립으로 제형화될 수 있다.
비히클의 선택과 비히클 내 활성물질의 함량은 일반적으로 활성 화합물의 용해도 및 화학적 성질, 특정 투여 방식, 및 의약 실무에서 제공되는 조항들에 따라 결정된다. 예를 들어, 부형제, 예컨대 락토스, 시트르산 나트륨, 탄산 칼슘, 인산 이칼슘, 및 붕해제, 예컨대 전분, 알긴산, 및 스테아르산 마그네슘, 라우릴 황산 나트륨 및 탈크와 같은 윤활제와 조합되는 특정 복합 실리케이트는 정제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 캡슐을 제조하기 위해, 유리하게는 락토스 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이 사용된다. 수성 현탁액이 사용될 때, 이는 현탁을 촉진시키는 제제 또는 에멀젼화제를 함유할 수 있다. 희석제, 예컨대 수크로스, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 클로로포름 또는 이들의 혼합물이 또한 사용될 수도 있다.
제제화는 생성물의 조절된 방출 또는 지연된 방출을 제공할 수 있는 제제, 예컨대 주사가능 마이크로스피어, 생침식성 입자, 폴리머성 화합물(예컨대, 폴리락산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포솜에 의한 원하는 분자의 제형화를 포함할 수 있다.
투여량은, 프로-아폽토시스 효과가 달성되도록 그리고 투여 경로 및 사용되는 투여 형태에 따라 당업계의 통상의 기술자에 의해 선택된다. 단일 투여량 또는 분할 투여량에서 대상체에게 투여되는 키메라 펩티드의 총 일일 투여량은 예를 들어 매일 약 0.001 내지 약 100 mg/kg 체중의 양, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg/day의 양이 될 수 있다. 투여 단위 조성물은 일일 투여량을 만드는데 사용될 수 있도록 이의 약수에 해당하는 양을 함유할 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특이적 투여량 수준은 체중, 일반 건강 상태, 성별, 식사, 투여 시간 및 경로, 흡수 및 방출 속도, 다른 약물과의 조합, 및 치료하려는 특정 질환의 중증도를 비롯한 다양한 인자들에 의존할 것이라는 점이 이해될 것이다.
본 발명의 추가 측면들과 이점들은 하기의 실시예에 기재될 것이며, 이는 예시적으로 고려되어야 할 것이고 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
도 1은 Proteominer 분획법 및 Maldi-Tof에 의해 분석된 돌연변이 펩티드의 안정성을 보여주는 그래프이다. 각 피크의 세기 비(ratio of intensity)는 자신의 대조군에 비해 상대적으로 나타난다. R 잔기는 K (Mut1-DPT-C9h), N (Mut2-DPT-C9h) 또는 A (Mut3-DPT-C9h)로 돌연변이되었다. 원형: 대조 DPT-C9h 펩티드(서열번호 6), 사각형: Mut1-DPT-C9h, 삼각형: Mut2-DPT-C9h, 다이아몬드: Mut3-DPT-C9h.
도 2는 100μM의 대조 및 돌연변이 펩티드에 의해 24시간 동안 처리된 유방 암 세포주 HBCx-12A의 annexin-V-FITC 염색에 의한 아폽토시스 분석을 보여준다.
도 3은 Cy5DPT-C9h 및 Cy5Mut3DPT-C9h의 생체분포를 보여준다. 마우스는 루미날 유방 암 이종이식 HBCx-3에 의해 견갑골 사이에 그래프트되었다. 마우스는 5 mg/kg의 Cy5로 표지된 DPT-C9h 또는 Mut3DPT-C9h의 1회 복강내 주사를 맞았다. 대조군 마우스는 대조 부형제(글루코스 5%)를 수령하였다. 마우스는 주사한지 0 시간(주사하기 전) 내지 168 시간에서 이미징되었다. 종양들의 형광은 Living Image 소프트웨어를 이용하여 산출되고 정규화되었다.
실시예 1: 돌연변이된 비-분해성 DPT-C9h 투과성 펩티드의 설계 및 특징화
1.1. 재료 및 방법
펩티드 합성 및 서열
펩티드는 고체상 공정 및 표준 Fmoc 화학에 따라 자동화 멀티플 펩티드 합성기에서 합성되었다. 펩티드의 순도 및 조성은 역상 HPLC 및 아미노산 분석에 의해 확인되었다.
인간 혈청에서 펩티드 안정성 분석
펩티드 분해의 분석은 이미 개시된 바와 같은 Proteominer 및 Maldi-Tof에 의해 수행되었다.
1.2. 결과
DPT-C9h는 VKKKKIKREIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(서열번호 6)이다.
R 잔기는 K (Mut1-DPT-C9h), N (Mut2-DPT-C9h) 또는 A (Mut3-DPT-C9h)로 돌연변이되었다.
도 1에는, Mut3-DPC-C9h 펩티드가 인간 혈청과 24시간의 접촉시에 분해되지 않는다는 점이 나타나 있다. 또한, 다른 돌연변이체들은 대조 펩티드(DPT-C9h)에 비해 더 높은 안정성을 보여주었다.
실시예 2: 아폽토시스에 대한 돌연변이 DPT-C9h의 효과
2.1. 재료 및 방법
세포
인간 유방 암 HBCx-12A 세포주는 원발성 인간 암 이종이식으로부터 단리되었으며, 10%의 FCS가 보충된 RPMI 배지에서 배양되었다.
Annexin-V-FITC 염색에 의한 아폽토시스의 검출
아폽토시스 세포는 제조사의 지시에 따라 Annexin-V(-FITC, BD biosciences사제)를 이용하여 검출되었다. 요약하면, 세포들은 1x 결합 버퍼에서 세척되고, 원심분리되고, 그 후 Annexin V-FITC(0.1 μg/ml) 및 PI(0.5 μg/ml)를 함유하는 200μl의 1x 결합 버퍼에 재현탁되었다. 10분 동안 암실에서 실온에서 인큐베이션한 후에, 세포들은 유동세포분석법에 의해 분석되었다. FACSCalibur(BD biosciences)에 의해 획득된 데이터는 Cellquest Pro 소프트웨어로 분석되었다.
2.2. 결과
본 발명자들은 돌연변이된 펩티드가 아폽토시스 유도 능력을 보유하는지 여부를 이어서 분석하였다. 유방 암 세포주 HBCx-12A는 100μM의 대조 및 돌연변이 펩티드에 의해 24시간 동안 처리되었다. 아폽토시스는 annexin-V-FITC 염색에 의해 분석되었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 분석된 펩티드들은 유사한 수준의 아폽토시스를 유도한다. 세포주 HBC-x3 및 HBCx-17을 사용하였을 때, 동일한 결과가 관찰되었다.
실시예 3: 종양에서 Mut3DPT-C9h의 생체분포(biodistribution)
3.1. 재료 및 방법
펩티드 합성 및 서열
펩티드(DPT-C9h 및 Mut3DPT-C9h)가 전술한 바와 같이 합성되었다. 펩티드를 합성하는 동안 형광색소 Cy5가 첨가되었다.
형광 어세이
마우스는 펩티드 Cy5DPT-C9h 또는 Mut3DPT-C9h(5 mg/kg)로 IP(복강내)-주사되었으며, 이어서 주사한 후 다양한 시간에서 분석되었다.
형광 이미징은 IVIS 이미징 시스템(IVIS100, Caliper Life Sciences, USA)에 의해 수행되었다. 마우스는 분석시에 마취되었다. 이미징 획득 시간은 형광 신호에 따라 1초 내지 10초였다. 소프트웨어 Living Image V. 2.50(Caliper Life Sciences)을 사용하여 분석이 수행되었다.
3.2. 결과
유방 암 이종이식 모델에서 Mut3DPT-C9h 및 DPT-C9h의 생체분포
본 발명자들은 2개 펩티드의 생체분포를 분석하고 비교하는 것에 관심을 가졌다. 도 3은 유방 암 이종이식 모델에서 Cy5DPT-C9h 및 Cy5Mut3DPT-C9h의 생체분포를 보여준다. 마우스는 복강내(IP) 주사되었으며, 주사한 후 다른 시간에서 생체분포가 분석되었다.
도 3은, IP 주사한지 6시간 후에 본 발명자들이 종양에서 2개 펩티드를 검출할 수 있었다는 것을 보여준다. Cy5 Mut3DPT-C9h 검출의 최대 피크는 주사한지 23시간 후에 검출되며, 이 시간 이후에 형광 세기는 조금씩 감소한다. 마지막으로, Cy5Mut3DPT-C9h의 상당한 수준이 주사한지 168시간 후에 검출되었다. Cy5DPT-C9h 형광의 최대 수준은 주사한지 6시간 후에 검출되었으며, 이 시간 이후에 조금씩 감소하였다. Cy5DPT-C9h의 낮은 수준이 168시간의 처리에서 검출되었다.
이를 함께 고려하면, 상기 결과들은 Cy5-표지된 DPT-C9h 및 Cy5-표지된 Mut3DPT-C9h가 종양에 이른다는 것을 보여준다. 보다 중요하게는, Cy5-표지된 Mut3DPT-C9h는 원 펩티드 DPT-C9h보다 더 안정적인 것으로 나타났다.
돌연변이 펩티드 Mut3DPT-C9h는 원 펩티드(DPT-C9h)보다 더 유지된 종양 내 생체분포를 나타내는데, 그 이유는 DPT-C9h의 형광보다 더 긴 Cy5 형광색소의 형광을 검출할 수 있기 때문이었다.
이와 같이 새로운 성질은 투여 스케쥴 뿐만 아니라 주사되는 펩티드의 투여량을 감소시킬 수 있도록 해준다. 요약하면, 새로운 돌연변이체는 대조 펩티드에 비해 명백한 새로운 이점을 가지며, 이는 혈청 프로테아제에 의해 분해될 수 없기 때문에 새로운 특징을 갖는다.
참고문헌
Figure 112014070594442-pct00002
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS 6) INSTITUT CURIE <120> CELL-PENETRATING PEPTIDES <130> IP20142502FR <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is vacant, is a lysine residue, or valine-lysine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid residue that is different from arginine and is non-conservative with respect to arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is vacant, is a lysine residue, or lysine-isoleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is vacant or is an amino acid sequence of one to 4 amino acids <400> 1 Xaa Lys Lys Lys Ile Lys Xaa Glu Ile Xaa Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 2 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Ala Glu Ile Lys Ile 1 5 10 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is valine or isoleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is aspartic acid or glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is phenylalanine or leucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is arginine or histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is vacant or is glutamate, or glutamate-aspartate, or glutamate-aspartate-leucine <400> 3 Tyr Xaa Glu Thr Leu Asp Xaa Ile Xaa Glu Gln Trp Ala Xaa Ser Xaa 1 5 10 15 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 4 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Ala Glu Ile Lys Ile Tyr Val Glu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 5 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Ala Glu Ile Lys Ile Tyr Ile Glu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ile Leu Glu Gln Trp Ala Arg Ser Glu Asp Leu 20 25 30 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 6 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Arg Glu Ile Lys Ile Tyr Val Glu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu 20 25 30 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 7 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Arg Glu Ile Lys Ile 1 5 10 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 8 Asp Thr Leu Asp His Ile Arg Ala Leu Asp Arg Leu Gln Glu Val Pro 1 5 10 15 His Glu Gly Pro 20 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 9 Asp Thr Leu Asp His Ile Arg Ala Leu Asp Arg Leu Gln Glu Val Pro 1 5 10 15 His Glu Gly Pro 20 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 10 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Lys Glu Ile Lys Ile 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 11 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Asn Glu Ile Lys Ile 1 5 10 <210> 12 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 12 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Lys Glu Ile Lys Ile Tyr Val Glu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu 20 25 30 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 13 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Lys Glu Ile Lys Ile Tyr Ile Glu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ile Leu Glu Gln Trp Ala Arg Ser Glu Asp Leu 20 25 30 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 14 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Asn Glu Ile Lys Ile Tyr Val Glu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu 20 25 30 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cell penetrating peptide <400> 15 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Asn Glu Ile Lys Ile Tyr Ile Glu Thr 1 5 10 15 Leu Asp Asp Ile Leu Glu Gln Trp Ala Arg Ser Glu Asp Leu 20 25 30 <210> 16 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chimeric peptide <400> 16 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Ala Glu Ile Lys Ile Asp Thr Leu Asp 1 5 10 15 His Ile Arg Ala Leu Asp Arg Leu Gln Glu Val Pro His Glu Gly Pro 20 25 30 <210> 17 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chimeric peptide <400> 17 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Lys Glu Ile Lys Ile Asp Thr Leu Asp 1 5 10 15 His Ile Arg Ala Leu Asp Arg Leu Gln Glu Val Pro His Glu Gly Pro 20 25 30 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chimeric peptide <400> 18 Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Asn Glu Ile Lys Ile Asp Thr Leu Asp 1 5 10 15 His Ile Arg Ala Leu Asp Arg Leu Gln Glu Val Pro His Glu Gly Pro 20 25 30

Claims (18)

  1. 하기 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드:
    VKKKKIKAEIKI(서열번호 2), 또는
    VKKKKIKKEIKI(서열번호 10), 또는
    VKKKKIKNEIKI(서열번호 11).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드의 N-말단은 아세틸기의 형태이거나/형태이고,
    C-말단은 아미드기의 형태이거나/형태이고,
    상기 펩티드가 적어도 -CONH- 펩티드 결합이 (CH2NH) 감소된 결합, (NHCO) 레트로-인버소 결합, (CH2-O) 메틸렌-옥시 결합, (CH2-S) 티오메틸렌 결합, (CH2CH2) 카르바 결합, (CO-CH2) 세토메틸렌 결합, (CHOH-CH2) 히드록시에틸렌 결합), (N-N) 결합, E-알센(alcene) 결합 또는 -CH=CH- 결합에 의해 대체되고 개질되는 하나 이상의 내부 개질(internal modification)을 포함하는, 펩티드.
  3. 관심 분자에 커플링된 제1항의 펩티드를 세포 투과성 펩티드로서 포함하는 벡터로, 상기 관심 분자가 세포독성제, 항-바이러스제, 항-박테리아제, 및 항-기생충제로 구성된 군에서 선택되는 치료제인 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 프로-아폽토시스 펩티드에 융합된 제1항의 펩티드를 세포 투과성 펩티드로서 포함하는 키메라 펩티드 구축물로, 상기 펩티드 구축물이
    VKKKKIKAEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(서열번호 4),
    VKKKKIKAEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL(서열번호 5),
    VKKKKIKAEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(서열번호 16);
    VKKKKIKKEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(서열번호 17); 및
    VKKKKIKNEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(서열번호 18)로 이루어진 군에서 선택되는 것 임을 특징으로 하는, 키메라 펩티드 구축물.
  5. 제1항의 펩티드를 코딩하거나, 또는 제4항의 키메라 펩티드 구축물을 코딩하는, 서열을 포함하는 핵산.
  6. 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 제4항의 키메라 펩티드 구축물을 포함하는, 유방 암을 치료하기 위한 약학 조성물로,
    상기 키메라 펩티드 구축물이 VKKKKIKAEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(서열번호 4)인, 약학 조성물.
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