JP2015503538A - 抗腫瘍アジュバント療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗腫瘍剤、好ましくは化学療法剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のための、アポトーシス促進性ペプチドに連結された細胞透過性ペプチドを含むキメラペプチド構築物に関する。

Description

本発明は、癌の処置におけるアジュバントとしての特定のカスパーゼ９フラグメントの使用に関する。

発明の背景：
アポトーシスは、遺伝的にプログラムされた細胞死であり、その脱制御は、いくつかある病理の中で特に癌と関連する。アポトーシスはＢｃｌ−２ファミリーメンバーおよびカスパーゼに依存していることが知られているが、最近のデータによって、セリン／スレオニンホスファターゼの２つの主要なファミリーであるＰＰ１およびＰＰ２Ａが、細胞生存または細胞死の決定に関与する重要な因子であることが示唆された。Ｓｅｒ／ＴｈｒｅホスファターゼＰＰ２Ａは、アポトーシスの誘導および防止の両方に関与し、ホスファターゼ作用の複雑な相互作用を示す。いくつかのホスファターゼは、最近、癌を含む種々の疾患の処置のための魅力的な標的となっている。しかしながら、ホスファターゼを標的とする臨床薬は、免疫抑制性シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６のみである。

国際特許出願ＷＯ２０１０／１１２４７１は、ＰＰ２Ａがカスパーゼ−９と相互作用すること、および、カスパーゼ−９タンパク質のＣ−末端部分からの特定の配列がＰＰ２Ａｃ結合ドメインであることを記載している。該配列は、マウスカスパーゼ−９に対してＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：１）として、およびヒトカスパーゼ−９に対してＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：２）として同定された。ＰＰ２Ａｃに対するこの結合ドメインは、マウスカスパーゼ−９（ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０５６５４８）のアミノ酸位置４０１−４１８、ヒトカスパーゼ−９（ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１２２０）のアミノ酸位置３６３−３８０に対応する。

このカスパーゼ−９ ＰＰＡ２ｃ−結合ドメインが、透過性ペプチドに融合されるとき（融合ペプチドＤＰＴ−Ｃ９およびＤＰＴ−Ｃ９ｈ）、ヒト細胞の生存を脱制御することができる治療分子となることがさらに証明された。

発明の概要：
本発明者らは、今回、これらのカスパーゼ−９フラグメントを化学療法またはホルモン療法に対するアジュバントとして使用したとき、腫瘍処置においてとりわけ効率的であったことを見出した。より具体的には、カスパーゼ−９フラグメントは、キメラペプチド構築物および化学療法またはホルモン療法と、腫瘍の併用処置の相乗効果を示し、用量、故に化学療法剤またはホルモンもしくはホルモンアナログの毒性副作用を減少させることを可能にさせる。

本発明は、抗腫瘍剤、好ましくは化学療法剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のための、アポトーシス促進性ペプチドに連結された細胞透過性ペプチドを含むキメラペプチド構築物であって、該アポトーシス促進性ペプチドは、配列
Ｙ−Ｘ_４ａ−ＥＴＬＤ−Ｘ_４ｂ−Ｉ−Ｘ_５−ＥＱＷＡ−Ｘ_６−Ｓ−Ｘ_７（配列番号：３）
［式中、
Ｘ_４ａはバリンまたはイソロイシンであり；
Ｘ_４ｂはアスパラギン酸またはグリシンであり；
Ｘ_５はフェニルアラニンまたはロイシンであり；
Ｘ_６はアルギニンまたはヒスチジンであり；
Ｘ_７は存在しない(vacant)か、またはグルタミン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸−ロイシンである］；または
１つ以上の化学修飾によって該アポトーシス促進性ペプチドから得られるタンパク質分解耐性のペプチド、または好ましくは１つ以上の保存的置換によって配列番号：３から得られる実質的に同種のペプチドを含む、キメラペプチド構築物を提供する。

好ましくは、該細胞透過性ペプチドは、
（配列番号：４）
［式中、Ｘ_１は存在しないか、リジン残基、またはバリン−リジンであり；
Ｘ_２は存在しないか、リジン残基、またはリジン−イソロイシンであり；
Ｘ_３は存在しないか、または１から４つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ψは任意のアミノ酸である］；
または１つ以上の化学修飾によって配列番号：４から得られるタンパク質分解耐性のペプチド、または１つ以上の保存的置換によって配列番号：４から得られる実質的に同種のペプチドであり得る。

本発明のさらなる対象は、抗腫瘍剤、好ましくは化学療法剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のための、本明細書に記載のキメラペプチド構築物をコードする核酸、または該核酸を含むベクターである。

発明の詳細な説明：
定義：
「患者」なる用語は、アポトーシス促進効果が望ましい処置を必要とするオス、メス、成体および幼体を含む、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物を示す。

本明細書において使用される「処置」または「療法」なる用語は治療および／または予防処置を含む。さらに特に、治療処置は、特定の障害の症状の何らかの緩和、改善および／または除去、減少および／または安定化（例えば、さらに進行した段階への進行の停止）、ならびに特定の障害の症状の進行の遅延を示す。

予防処置は、特定の障害の発症を停止すること、発症の危険性を減少させること、発病率を減少させること、発症を遅延させること、発症を減少させること、ならびに症状を発症するまでの時間を増加させることのいずれかを示す。

互換的に使用される、「透過性ペプチド」または「細胞透過性ペプチド」（または「ＣＰＰ」）または「シャトルペプチド」なる用語は、該ペプチドが実質的な膜損傷を引き起こすことなく細胞に移行することができ、他の分子に連結されているとき該他の分子のベクターとして使用することができることを意味する。該用語は、輸送ペプチド、担体ペプチド、またはペプチド形質導入ドメインとも称される陽イオン性細胞透過性ペプチドを示す。本明細書において示されるＣＰＰは、所定の細胞培養集団の細胞の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（この間の全ての整数を含む）内でＣＰＰに融合されたペプチドの細胞浸透を誘導する能力を有し、そして、全身投与時にインビボにて多数の組織内に高分子を移行させる。細胞透過性ペプチドはまた、適当な条件下で細胞との接触に置かれたとき、受動拡散よりも有意に良い状況において、外部環境から細胞質、オルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたは細胞核を含む細胞内環境に通過するペプチドを示し得る。該特性は、当業者により示される種々の方法により評価され得る。

１つ以上のアミノ酸残基が生物学的に類似の残基により置換されているとき、または、アミノ酸の８０％以上が同一である、または約９０％以上、好ましくは約９５％以上が類似（機能的に同一）であるとき、２つのアミノ酸配列は、「同種」、「実質的に同種」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似の、または同種の配列は、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）積み上げ(pileup)プログラム、または任意の当分野で知られているプログラム（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を使用するアラインメントにより同定される。好ましくは、これらの同種のペプチドは、環化を妨げるように、２つのシステイン残基を含まない。

本明細書において使用される「保存的置換」なる用語は、ペプチドの全体のコンホメーションおよび機能を変化させない、アミノ酸残基の別のアミノ酸残基での置き換え、限定はしないが、アミノ酸の同様の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、形状、疎水性、芳香族性、など）を有するアミノ酸での置き換えを示す。同様の特性を有するアミノ酸は当分野でよく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンは親水性−塩基性アミノ酸であり、交換可能であり得る。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置き換えられ得る。お互いに置換することができる中性親水性アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニンを含む。

「置換」または「修飾」に関して、本発明は、天然アミノ酸から改変または修飾されているアミノ酸を含む。

それ自体は、本発明の文脈において、保存的置換は、当分野で、１つのアミノ酸の、同様の特性を有するもう１つのアミノ酸での置換と認識されると理解されるべきである。保存的置換の例は、以下の表１に示されている：

あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表２に示されているとおりＬｅｈｎｉｎｇｅｒ、１９７５に記載されているとおりにグループ分けすることができる。

さらに別の代替として、典型的な保存的置換は、すぐ下の表３に示されている。

アポトーシス促進性ペプチド：
本発明は、カスパーゼ−９タンパク質のフラグメントであるアポトーシス促進性ペプチド、またはそれらの誘導体を使用する。

１つの態様において、アポトーシス促進性ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ_４ａ−ＥＴＬＤ−Ｘ_４ｂ−Ｉ−Ｘ_５−ＥＱＷＡ−Ｘ_６−Ｓ−Ｘ_７（配列番号：３）
［式中、
Ｘ_４ａはバリンまたはイソロイシンであり；
Ｘ_４ｂはアスパラギン酸またはグリシンであり；
Ｘ_５はフェニルアラニンまたはロイシンであり；
Ｘ_６はアルギニンまたはヒスチジンであり；
Ｘ_７は存在しないか、またはグルタミン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸−ロイシンである］；または
１つ以上の化学修飾によって該アポトーシス促進性ペプチドから得られるタンパク質分解耐性のペプチド、または好ましくは１つ以上の保存的置換によって配列番号：３から得られる実質的に同種のペプチドを含むか、または該配列または該ペプチドからなる。

このようなタンパク質分解耐性または同種のペプチドは、インビトロおよび／またはインビボにて細胞アポトーシスを誘導する。分子、例えばペプチドが細胞アポトーシスを誘導するか否かを決定するためのアッセイは、当分野でよく知られており、例えば、細胞を候補ペプチドとインキュベートすること、およびアポトーシスが該候補ペプチドにより誘導されるか否かを決定すること、例えば、細胞をＡｎｎｅｘｉｎ ＶおよびＰＩにより標識化し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ^＋およびＰＩ⁻である細胞をアポトーシス性細胞として同定することを含む。

好ましい態様において、
Ｘ_４ａはバリンであり；
Ｘ_４ｂはアスパラギン酸であり；
Ｘ_５はフェニルアラニンであり；
Ｘ_６はヒスチジンである。

細胞透過性ペプチド：
好ましい態様において、アポトーシス促進性ペプチドは、少なくとも１つの細胞透過性ペプチドと連結され、キメラペプチド構築物を形成する。

好ましくは、アポトーシス促進性ペプチドは、透過性ペプチドのＣ−末端に融合される。

特定の態様において、アポトーシス促進性ペプチドは、２、３またはそれ以上の透過性ペプチドに連結され得る。

好ましくは、細胞透過性ペプチドは：
ａ）
（配列番号：４）
［式中、Ｘ_１は存在しないか、リジン残基、またはバリン−リジンであり；
Ｘ_２は存在しないか、リジン残基、またはリジン−イソロイシンであり；
Ｘ_３は存在しないか、または１から４つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ψは任意のアミノ酸である］；
または１つ以上の化学修飾によって配列番号：４から得られるタンパク質分解耐性のペプチド、または実質的に同種のペプチド、とりわけ１つ以上の保存的置換によって配列番号：４から得られるペプチド、
ｂ）（ＲＱＫＲＬＩ）_３（配列番号：５）、（ＲＨＳＲＩＧ）_３（配列番号：６）、ＲＨＳＲＩＧＩＩＱＱＲＲＴＲＮＧ（配列番号：７）、ＲＨＳＲＩＧＶＴＲＱＲＲＡＲＮＧ（配列番号：８）、ＲＲＲＲＲＲＲＳＲＧＲＲＲＴＹ（配列番号：９）、または同種のペプチド；
ｃ）Ｔａｔペプチド、ポリアルギニンペプチド、ＨＡ２−Ｒ_９ペプチド、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎペプチド（Ａｎｔｅｎｎａ ｐｅｄｉａ）、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎペプチド、Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）ペプチド、マウロカルシン(maurocalcine)ペプチド、デカリジン(decalysine)ペプチド、ＨＩＶ−Ｔａｔ由来ＰＴＤ４ペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス移行(Translocation)モチーフ（ＰＴＭ）ペプチド、ｍＰｒＰ_１−２８ペプチド、ＰＯＤ、ｐＶＥＣ、ＥＢ１、Ｒａｔｈ、ＣＡＤＹ、Ｈｉｓｔａｔｉｎ ５、Ａｎｔｐペプチド、Ｃｙｔ^{８６−１０１}ペプチド
を含むか、または該配列または該ペプチドからなる。

１つの態様において、ａ）の細胞透過性ペプチドにおいて、Ｘ３は存在しない、すなわち細胞透過性ペプチドは
（配列番号：３７）である。

他の態様において、ａ）の細胞透過性ペプチドにおいて、Ｘ１はＶＫであり、Ｘ２はＫＩであり、Ｘ３は存在しない、すなわち細胞透過性ペプチドは
（配列番号：３８）である。

好ましくは
はアルギニン、リジン、アスパラギン、またはアラニンである。

したがって、細胞透過性ペプチドは、ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ（配列番号：３９）、ＶＫＫＫＫＩＫＡＥＩＫＩ（配列番号：４０）、ＶＫＫＫＫＩＫＫＥＩＫＩ（配列番号：４１）またはＶＫＫＫＫＩＫＮＥＩＫＩ（配列番号：４２）であり得る。

「Ｔａｔペプチド」に関して、それは、配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１０、Ｔａｔペプチド２）またはＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１１）を有するペプチドを意味する。

「ポリアルギニンペプチド」に関して、それは、少なくとも９つのアルギニンからなるペプチドを意味する。好ましくは、ポリアルギニンペプチドは、配列Ｒ_９（配列番号：１２）またはＲ_１１（配列番号：１３）を有するペプチドである。

「ＨＡ２−Ｒ_９ペプチド」に関して、それは、配列ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ−Ｒ_９（配列番号：１４）を有するペプチドを意味する。

「Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎペプチド」に関して、それは、配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号：１５）を有するペプチドを意味する。

「Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎペプチド」（「Ａｎｔｐペプチド」とも称される）に関して、それは、配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号：１６）を有するペプチドを意味する。

「Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）ペプチド」に関して、それは、ヒトヘパリン結合タンパク質および／または抗−ＤＮＡ抗体に由来するペプチドを意味する。

「マウロカルシンペプチド」に関して、それは、配列ＧＤＣＬＰＨＬＫＬＣＫＥＮＫＤＣＣＳＫＫＣＫＲＲＧＴＮＩＥＫＲＣＲ（配列番号：１７）を有するペプチドを意味する。

「デカリジンペプチド」に関して、それは、配列ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（Ｋ_１０）（配列番号：１８）を有するペプチドを意味する。

「ＨＩＶ−Ｔａｔ由来ＰＴＤ４ペプチド」に関して、それは、配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号：１９）を有するペプチドを意味する。

「Ｂ型肝炎ウイルス移行(Translocation)モチーフ（ＰＴＭ）ペプチド」に関して、それは、配列ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰ（配列番号：２０）を有するペプチドを意味する。

「ｍＰｒＰ_１−２８ペプチド」に関して、それは、配列ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ（配列番号：２１）を有するペプチドを意味する。

「ＰＯＤペプチド」に関して、それは、配列ＧＧＧ（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）_４（配列番号：２２）を有するペプチドを意味する。

「ｐＶＥＣペプチド」に関して、それは、配列ＬＬＩＩＬＲＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号：２３）を有するペプチドを意味する。

「ＥＢ１ペプチド」に関して、それは、配列ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫ（配列番号：２４）を有するペプチドを意味する。

「Ｒａｔｈペプチド」に関して、それは、配列ＴＰＷＷＲＬＷＴＫＷＨＨＫＲＲＤＬＰＲＫＰＥ（配列番号：２５）を有するペプチドを意味する。

「ＣＡＤＹペプチド」に関して、それは、配列ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡ（配列番号：２６）を有するペプチドを意味する。

「Ｈｉｓｔａｔｉｎ ５ペプチド」に関して、それは、配列ＤＳＨＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹ（配列番号：２７）を有するペプチドを意味する。

「Ｃｙｔ^{８６−１０１}ペプチド」に関して、それは、配列ＫＫＫＥＥＲＡＤＬＩＡＹＬＫＫＡ（配列番号：２８）を有するペプチドを意味する。

キメラ構築物：
本発明のキメラペプチド構築物は、インビトロおよび／またはインビボにて細胞アポトーシスを誘導する。特に、それは、乳癌の異種移植モデルにおいてアポトーシスを誘導する。

好ましくは、キメラペプチド構築物は、１７から８０アミノ酸、好ましくは２０から７０アミノ酸、さらに好ましくは２３から４０アミノ酸から成る長さを有し得る。

好ましい態様において、キメラペプチド構築物は：
ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：２９）
ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３０）
ＶＫＫＫＫＩＫＡＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：３１）
ＶＫＫＫＫＩＫＡＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３２）
ＶＫＫＫＫＩＫＫＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：３３）
ＶＫＫＫＫＩＫＫＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３４）
ＶＫＫＫＫＩＫＮＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：３５）または
ＶＫＫＫＫＩＫＮＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３６）
またはそれらから得られる同種もしくはタンパク質分解耐性のペプチドからなる群から選択される。

ペプチド調製：
本明細書に記載されているペプチドは、当業者に知られている標準合成方法、例えば化学合成または遺伝子組換えを使用して合成することができる。好ましい態様において、ペプチドは、縮合中にペプチド結合に関与する官能基を除いて、アミノ酸官能基を保護しながら、適当な順番にアミノ酸配列をすでに含むあらかじめ形成されたフラグメントの縮合、または以前に調製されたいくつかのフラグメントの縮合のいずれかによる、アミノ酸残基の段階的縮合により得られる。特に、ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより最初に記載された方法にしたがって合成することができる。

化学合成技術の例は、固相合成および液相合成である。固相合成として、例えば、合成されるべきペプチドのＣ−末端に対応するアミノ酸は、有機溶媒に不溶性である支持体に結合させ、アミノ基および適当な保護基で保護された側鎖官能基を有するアミノ酸をＣ−末端からＮ−末端の順序に１つずつ縮合する１つの反応、および樹脂(resin)に結合したアミノ酸またはペプチドのアミノ基の保護基を放出する１つの反応の交互反復により、かくしてペプチド鎖はこの様式において延長される。固相合成方法は、使用される保護基の型に依存して、ｔＢｏｃ方法およびＦｍｏｃ方法によって大きく分類される。一般的に使用される保護基は、アミノ基のためのｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４、４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２、３、６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）およびＣｌｚ−Ｂｚｌ（２、６−ジクロロベンジル）；グアニジノ基のためのＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２、５，７、８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）；ならびにヒドロキシル基のためのｔＢｕ（ｔ−ブチル）を含む。所望のペプチドの合成後、それを脱保護反応に付し、固体支持体から切り取る。このようなペプチドを切り取る反応は、Ｂｏｃ方法に対してフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸、およびＦｍｏｃ方法に対してＴＦＡで行われ得る。

あるいは、ペプチドは組換え技術を使用して合成され得る。この場合、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列、上記配列の１つに相補的であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、およびストリンジェント条件下で該ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を含むか、または該配列または該ポリヌクレオチドからなる核酸および／または遺伝的構築物。

本発明は、本明細書に定義されているポリヌクレオチド、および宿主細胞において本発明のペプチドの発現（例えば、転写および翻訳）を可能にする調節配列（例えば、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）からなるか、またはそれらを含む遺伝的構築物にさらに関する。

したがって、他の局面において、本発明は、本発明のペプチドを発現する（または適当な環境下で発現することができる）；および／または、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の遺伝的構築物を含む宿主または宿主細胞に関する。

ペプチドを生産する方法は、所望により、該ペプチドを精製する、該ペプチドを化学的に修飾する、および／または該ペプチドを医薬組成物に構築する工程を含み得る。

タンパク質分解に対するさらなる保護：
本明細書に記載されているペプチドのＮ−およびＣ−末端は、所望により、タンパク質分解に対して保護され得る。例えば、Ｎ−末端はアセチル基の形であってよく、および／またはＣ−末端はアミド基の形であってよい。タンパク質分解に対する耐性を示すペプチドの内部修飾もまた想定される、例えば、少なくとも−ＣＯＮＨ−ペプチド結合は、（ＣＨ２ＮＨ）還元結合、（ＮＨＣＯ）レトロ−インベルソ(retro-inverso)結合、（ＣＨ２−Ｏ）メチレン−オキシ結合、（ＣＨ２−Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合、（ＣＯ−ＣＨ２）セトメチレン(cetomethylene)結合、（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合）、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルセン(alcene)結合またはまた−ＣＨ＝ＣＨ−結合により修飾および置き換えされている。

例えば、ペプチドは、アセチル化、アシル化、アミド化、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリスチル化、酸化、リン酸化などにより修飾され得る。

本発明のペプチドは、タンパク質分解に対する耐性をペプチドに与えるＤ立体配置におけるアミノ酸から成り得る。それらはまた、分子内架橋により、例えば、Ｗａｌｅｎｓｋｙら、２００４に記載されているいわゆる「ステープル(staple)」技術にしたがって、少なくとも２つのアミノ酸残基をオレフィン側鎖、好ましくはＣ３−Ｃ８アルケニル鎖、好ましくはペンテン−２−イル鎖）で修飾し、次に、鎖の化学架橋により、安定化させられ得る。例えば、ｉおよびｉ＋４からｉ＋７における位置のアミノ酸を、反応性オレフィン残基を示す非天然アミノ酸により置換することができる。全てのこれらのタンパク質分解耐性の化学的に修飾されたペプチドは、本発明に包含される。

本発明の別の局面において、ペプチドは、尿クリアランスおよび使用される治療用量の減少ならびに血漿における半減期の増加のために、該ペプチドのＣ−末端またはリジン残基によって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、特に１５００または４０００ＭＷのＰＥＧと共有結合される。さらに他の態様において、ミクロスフェアを形成する薬物送達系のための生分解性および生体適合性ポリマー材料にペプチドを含めることにより、ペプチド半減期が増加される。ポリマーおよびコポリマーは、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）である（ＵＳ２００７／０１８４０１５、ＳｏｏｎＫａｐ Ｈａｈｎらにおいて説明されている）。

核酸
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、または該配列からなるポリヌクレオチドに関する。

本発明はさらに、本明細書に定義されているポリヌクレオチド、および宿主細胞において本発明のペプチドの発現（例えば、転写および翻訳）を可能にする調節配列（例えば、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）からなるか、またはそれらを含む遺伝的構築物にさらに関する。

本発明の遺伝的構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝的構築物はまた、目的とする宿主細胞または宿主生物の形質転換のために適当な形態、目的とする宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みのために適当な形態、または目的とする宿主生物において独立した複製、維持および／または遺伝のために適当な形態であり得る。例えば、本発明の遺伝的構築物は、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターまたはトランスポゾンの形であり得る。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち（例えば、適当な宿主細胞、宿主生物および／または発現系において）インビトロおよび／またはインビボにて発現のために提供することができるベクターであり得る。

非限定的であるが好ましい局面において、本発明の遺伝的構築物は、ｉ）本発明の少なくとも１つの核酸を含み；これは、ｉｉ）１つ以上の調節因子、例えば、プロモーターおよび所望により適当なターミネーター；および所望により、またｉｉｉ）遺伝的構築物の１つ以上のさらなる因子、例えば、３’−または５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、および／または形質転換または組み込み（の効率）を促進または増加させ得る因子に作動可能に連結されている。

特定の態様において、本発明の細胞透過性ペプチドをコードする核酸は、興味あるペプチドまたはタンパク質をコードする核酸と連結または融合される。興味あるペプチドは、本明細書に記載されているアポトーシス促進性ペプチドであり得る。さらに一般的には、それは、興味あるペプチドまたはタンパク質であり得、発現させる任意のペプチドまたはタンパク質、例えば、治療用ペプチドまたはポリペプチド、ならびに所望により任意の抗原性または免疫原性ペプチドであり得る。

核酸は、とりわけ、キメラペプチド構築物のエキソビボまたはインビボ感染および発現のために、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスまたはレンチウイルスによって運ばれ得る。

抗腫瘍アジュバント療法：
本明細書に定義されているキメラペプチド、または該ペプチドをコードする核酸は、抗腫瘍療法においてアジュバントとして有用である。

本発明のアジュバント療法は、何らかの持続性(persistent)顕微鏡的悪性腫瘍を根絶することにおいて、および／または再発を予防または遅延することにおいて役立つ。

さらに、キメラペプチド（または該ペプチドをコードする核酸）は、転移を予防または処置するために使用され得る。

したがって、必要とする患者における腫瘍の処置の方法であって、キメラペプチド構築物または該構築物をコードする核酸を抗腫瘍剤、好ましくは化学療法剤と共に該患者に投与することを含む方法を記載している。

「抗腫瘍剤」は、ＤＮＡ複製のインヒビター、例えば、ＤＮＡ結合剤、特にアルキル化または挿入薬物、抗代謝拮抗剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、またはトポイソメラーゼＩもしくはＩＩインヒビターでの、または抗分裂促進剤、例えば、アルカロイドでの慣用の細胞毒性化学療法を含む。それはまた、プロテアーゼ（キナーゼ、アロマターゼ、ＡＴＰａｓｅ）インヒビター、モノクローナル抗体またはホルモンもしくはホルモンアナログを含む。

好ましい態様において、抗腫瘍剤は任意の化学療法剤であってよく、パクリタキセル、ドセタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、他のプラチン、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、イホスファミド、ゲムシタビン、カペシタビン、ビノレルビン、トポテカン、イリノテカン、タモキシフェン、カンプトテシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ＥＭＰ、エトポシド、メトトレキサート(methotraxate)などを含む。

好ましくは、該薬剤はドキソルビシンまたはシクロホスファミド、またはそれらの組合せである。

他の好ましい態様において、該薬剤はドセタキセル、５−ＦＵまたはシスプラチンであり得る。

さらなる態様において、抗腫瘍剤は、プロゲストゲン、例えば、酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロン、アンドロゲン、例えば、フルオキシメステロン、またはエストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、またはソマトスタチンアナログ、例えば、オクトレオチド、ならびにゴナドトロピン−放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のアナログを含む、ホルモンまたはホルモンアナログであり得る。

本明細書に記載されているペプチド（または該ペプチドをコードする核酸）は、好ましくはヒト患者において腫瘍、特に癌腫瘍の処置のために有用である。

腫瘍は、癌、例えば、血液癌、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、または非血液癌、例えば、脳、類表皮（特に、肺、乳房、卵巣）、頭頸部（扁平上皮）、膀胱、胃、膵臓、頭、首、腎臓、前立腺、結腸直腸、食道または甲状腺癌、および黒色腫であり得る。

種々のタイプの癌は、限定はしないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫肉腫(lymphangioendothelio-sarcoma)、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌腫、気管支癌腫、腎細胞癌腫、肝臓癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽細胞腫、ブドウ膜黒色腫および乳癌を含み得る。

さらに特に、本明細書に記載されているペプチド（または該ペプチドをコードする核酸）は、ＰＰ１および／またはＰＰ２Ａの脱制御を示す、または、ＰＰ１およびＰＰ２Ａと相互作用し、これらによりコントロールされるアポトーシス性レギュレーターである抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２の過剰発現を示す癌の処置において有用である。

ヒトｂｃｌ−２遺伝子の高レベルの発現は、大部分の濾胞性Ｂ細胞リンパ腫および多数の大細胞型非ホジキンリンパ腫を含むｔ（１４；１８）染色体転座を有する全てのリンパ腫において見られる。ｂｃｌ−２遺伝子の高レベルの発現はまた、プレＢ細胞型のリンパ性白血病を含むｔ（１４；１８）染色体転座を有さない白血病、神経芽腫、鼻咽腔(nasophryngeal)癌腫、ならびに前立腺、乳房および大腸の多数の腺癌において見られる。とりわけｂｃｌ−２の過剰発現は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）において見られた（Dengら, 2009; Prickettら, 2004）。

したがって、好ましい態様において、癌腫瘍はリンパ腫、とりわけ白血病、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。

別の好ましい態様において、癌腫瘍は乳癌である。

好ましくは、該薬剤はドキソルビシンまたはシクロホスファミド、またはそれらの組合せであり、ヒト患者は乳癌に罹患している。

医薬組成物：
キメラペプチド（または該ペプチドをコードする核酸）は、静脈内、経口、経皮、皮下、粘膜、筋肉内、肺内、鼻腔内、非経口、経直腸、膣内および局所を含む任意の便利な経路により投与され得る。鼻腔内経路が、特に興味深いものである。

有利には、腫瘍内投与もまた予期される。

キメラペプチド（または該ペプチドをコードする核酸）は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される。

医薬組成物はまた、任意の他の活性成分、例えば、特に抗癌剤、例えば、ＤＮＡ複製のインヒビター、例えば、ＤＮＡ結合剤、特にアルキル化剤または挿入薬物、代謝拮抗剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、またはトポイソメラーゼＩもしくはＩＩインヒビターでの、または、抗分裂促進剤、例えば、アルカロイドでの慣用の細胞毒性化学療法を含み得る。

好ましい態様において、キメラペプチド（または該ペプチドをコードする核酸）は、エレクトロポレーションにより投与され得る。エレクトロパーミアビリゼーション(electropermeabilization)またはエレクトロインジェクションとしても知られているエレクトロポレーションは、特定の短い強度の電界の適用の結果として、細胞膜、細胞または組織を横切る細胞膜の透過化(permeabilization)である。一般的に、エレクトロポレーションは、化合物、好ましくは筋肉内または皮内経路を介して、化合物を注入すること、次にジェネレーターへ接続された電極の手段により一連の電気パルスを適用することからなる。注入ゾーンにおいて電界を適用するための条件は、現在、当業者によく知られており、特にＵＳ特許５４６８２２３に記載されている。当業者は、それぞれの場合にしたがって、これらの条件を適応することができる。電界は、０．１から１，０００ヘルツの振動数で１−５０００Ｖ／ｃｍの範囲において５０−２００マイクロ秒パルスの高強度の電界であり得る。一般的に、１ヘルツの振動数で１０００−１５００Ｖ／ｃｍの一連の８つの１００マイクロ秒パルスを適用する。

溶解または分散された活性成分を含む薬理学的組成物の調製は、当分野で良く理解されており、製剤に基づいて限定される必要はない。一般的に、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかと同じくらい注射可能に調製される；しかしながら、使用の前に液体にて、溶液のために適当な固体形態または懸濁液もまた、調製することができる。調製はまた、乳化することができる。特に、医薬組成物は、固体投与形態、例えば、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、糖衣錠または顆粒において製剤化され得る。

ビヒクルの選択およびビヒクル中の活性物質の含有量は、一般的に、活性化合物の溶解度および化学特性、特定の投与様式ならびに医薬的経験において観察される条件にしたがって決定される。滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクと組み合わせられた、例えば、賦形剤、例えば、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウムおよび崩壊剤、例えば、デンプン、アルギン酸および特定の複合珪酸塩は、錠剤を調製するために使用され得る。カプセルを調製するためには、ラクトースおよび高分子量のポリエチレングリコールを使用することが有利である。水性懸濁液が使用されるとき、それらは乳化剤または懸濁を促進する剤を含むことができる。希釈剤、例えば、スクロース、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロールおよびクロロホルムおよびそれらの混合物も使用され得る。

調製は、産物の制御または持続放出を提供し得る薬剤、例えば、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームにて、所望の分子の製剤化を含むことができる。

用量は、アポトーシス促進効果がなし遂げることができるように当業者により選択され、使用される投与経路および投与形態に依存する。単回または分割投与において対象に投与されるキメラペプチド（または該ペプチドをコードする核酸）の全１日用量は、例えば、１日あたり約０．００１から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ／日の量であり得る。約５ｍｇ／ｋｇの１日用量が好ましい。用量単位組成物は、１日用量を作り出すために使用され得るとき、そのかかる量のかかる約数を含み得る。しかしながら、特定の患者に対する特定の用量レベルは、体重、全般的健康状態、性別、食習慣、時および投与経路、吸収および排出率、他の薬物との組合せおよび処置される特定の疾患の重症度を含む種々の因子に依存すると理解されている。

プロトコール：
アジュバントペプチド（または該ペプチドをコードする核酸）および好ましくは化学療法剤である抗腫瘍剤は、同時投与（すなわち、単一の組成物または別々の組成物として同時に）、または連続投与（すなわち薬剤がアジュバントの前に投与される、逆もまた同様）のためのものである。

好ましい態様において、ペプチド構築物（または該ペプチドをコードする核酸）は、好ましくは化学療法剤である抗腫瘍剤での処置の最後に、または該処置の最後の後に投与されるためのものであり、それにより再発を予防する。

好ましい態様において、ペプチド構築物（または該ペプチドをコードする核酸）は、好ましくは化学療法剤である抗腫瘍剤が投与された約５から約３０日の期間の後、好ましくは約７から約２０日の期間の後に投与されるためのものである。

好ましくは、ペプチド構築物（または該ペプチドをコードする核酸）は、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間の期間、１日に１回投与される。

本発明のさらなる局面および利点は、以下の実験セクションに記載されており、これは、説明のためと考え、本出願の範囲を限定すると考えるべきでない。

図１は、ＢＣ１４６ヒト乳癌モデルの異種移植片を有するマウスにおける相対的腫瘍容量を示すグラフである。 図２Ａおよび２Ｂは、ＤＰＴ−Ｃ９ｈおよびドキソルビシンのインビトロでのアポトーシス性効果を示す。図２Ａ）ＭＤＡ ＭＢ２３１細胞を、２４時間、種々の用量のドキソルビシンの存在下で培養し、次に、アポトーシスをａｎｎｅｘｉｎ染色により概算した。図２Ｂ）細胞を、２４時間、ドキソルビシン、種々の用量のペプチドまたは両方の組合せの存在下で培養し、次に、アポトーシスをａｎｎｅｘｉｎ染色により概算した。 図３Ａおよび３Ｂは、ドセタキセル単独または、ＤＰＴ−Ｃ９ｈと組み合わせてのアポトーシス性効果を示す。図３Ａ）細胞を、２４時間、ある用量のドセタキセル（０．５μＭ）、種々の用量のペプチドまたは両方の組合せの存在下で培養した。この期間後、アポトーシスを上記のとおり概算した。図３Ｂ）細胞を、６１時間、種々の用量のドセタキセルおよび１つの単一用量のＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチド（１０μＭの存在下で培養した。細胞生存をＭＴＴ比色試験により概算した。 図４Ａおよび４Ｂは、５ＦＵおよびＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチド処置のインビトロ効果を示す。図４Ａ）ＭＤＡ ＭＢ２３１細胞を、２４時間、１０μＭの５ＦＵの存在下で培養し、次に、種々の用量のＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドを、追加の２４時間で加えた。この期間後、アポトーシスをａｎｎｅｘｉｎ染色により概算した。図４Ｂ）細胞を、６１時間、種々の用量の５ＦＵおよび１つの単一用量のＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチド（１０μＭ）の存在下で培養した。細胞生存をＭＴＴ比色試験により概算した。 図５Ａおよび５Ｂは、シスプラチン単独または、ＤＰＴ−Ｃ９ｈと組み合わせてのアポトーシス性効果を示す。図５Ａ）ＭＤＡ ＭＢ２３１細胞を、２４時間、１０μＭのシスプラチンの存在下で培養し、次に、種々の用量のＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドを、追加の２４時間で加えた。この期間または時間後、アポトーシスをａｎｎｅｘｉｎ染色により概算した。図５Ｂ）細胞を、６１時間、種々の用量のシスプラチンおよび１つの単一用量のＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチド（１０μＭ）の存在下で培養した。細胞生存をＭＴＴ比色試験により概算した。

実施例１：ＤＰＴ−Ｃ９ｈまたはＤＰＴ−Ｃ９および化学療法（シクロホスファミド−ドキソルビシン）での併用処置の効果
１．１．材料および方法
ペプチド合成および配列
ペプチドを、固相処理および標準Ｆｍｏｃ化学にて、自動多重(multiple)ペプチドシンセサイザーにおいて合成した。ペプチドの純度および組成を、逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析により確認した。
ＤＰＴ−Ｃ９ｈはＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：２９）である、
ＤＰＴ−Ｃ９はＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３０）である、

原発性ヒト腫瘍の異種移植片のインビボモデル
原発性ヒト異種移植片を、以前に記載されているとおりに得た（Marangoniら, 2007）。マウス乳癌腫瘍を、トランスジェニック Ｐｏｌｙｏｍａ Ｍｉｄｄｌｅ−Ｔ Ｍｏｕｓｅ ＰｙＭＴモデルを使用して得た。トランスジェニックマウスにおいて生じる自発的に増殖する乳房腫瘍を、薬理学的評価を可能にするためにｎｕｄｅ免疫欠損マウスに異種移植し、ｎｕｄｅマウスからｎｕｄｅマウスに連続的継代を維持した。

治療アッセイ
治療的実験アッセイにおいて、５から８週齢のＳｗｉｓｓ ｎｕ／ｎｕ メス マウスに、約１５ｍｍ３の容量を有する腫瘍フラグメントを皮下移植した。腫瘍が、２から６週後、移植部位で発達した。４０から２００ｍｍ^３の容量にて増殖する腫瘍を有するマウスを、個々に特定し、コントロールまたは処置群（それぞれの群において１０匹の動物）にランダムに割り当て、処置を１日目に開始した。マウスを週に２回体重を量った。腫瘍容量が倫理的限界として定義される２５００ｍｍ^３に到達したとき、腫瘍を有するマウスを殺す。腫瘍容量および抗腫瘍活性を、以前に報告されているとおり評価した（Nematiら 2009. Anti Cancer Drugs 20, pages 932-940）。

モデルおよび治療スケジュールにしたがって、水／グルコースで希釈されたＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチド（１から２５ｍｇ／ｋｇ）を、１週間に５から７日間腹腔内経路により与えた。ドキソルビシン（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびシクロホスファミド（Ｂａｘｔｅｒ）を、０．９％ ＮａＣｌに希釈し、１日目に２ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇのそれぞれの用量で腹腔内に投与した。

１．２． 結果
ＤＰＴ−Ｃ９ｈおよびＤＰＴ−Ｃ９は、原発性ヒトおよびマウス乳癌の異種移植片のインビボにおける腫瘍増殖阻害を誘導し、シクロホスファミド−ドキソルビシン化学療法によって相乗効果を与える。

ＤＰＴ−Ｃ９ｈの抗腫瘍効果を、乳癌を有するマウスモデルＢＣ５２およびＢＣ１４６において試験した。ＤＰＴ−Ｃ９ｈを、５週間１日に１回５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。処置の最後に、本発明者らは、ＤＰＴ−Ｃ９ｈが有意な腫瘍増殖阻害を誘導することを観察した（表４）。

マウスペプチドＤＰＴ−Ｃ９の抗腫瘍効果を、トランスジェニック ポリオーマ Ｍｉｄｄｌｅ−Ｔ マウスから得られた異種移植片マウス乳房腫瘍を有するヌードマウスにおいて分析した。ＰｙＭＴモデルをマウス特異的ＤＰＴ−Ｃ９ペプチドで処理し、これを５ｍｇ／ｋｇの用量で毎日腹腔内投与した。ＤＰＴ−Ｃ９もまた、有意な腫瘍増殖阻害を誘導する。

本発明者らは、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド化学療法とＤＰＴ−Ｃ９ｈの組合せ投与をさらに試験した。投与は同時または連続のいずれかであった：次に、化学療法誘導完全寛解に対応する段階である２０日目にＤＰＴ−Ｃ９ｈを投与した。本発明者らは、ＤＰＴ−Ｃ９ｈが化学療法単独よりもより良く腫瘍再発を遅延させることを観察した（表４、図１）。

実施例２：ＤＰＴ−Ｃ９ｈおよび化学療法（ドキソルビシン、ドセタキセル、５ＦＵおよびシスプラチン）での併用処置の効果
細胞死誘導に対する耐性が、癌の特徴として認識されている。本明細書において、非常に低い用量の化学療法をキメラペプチドＤＰＴ−Ｃ９ｈと組み合わせて、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、高い用量の化学療法の副作用を回避することを提案する。

２．１．材料および方法
細胞
ＭＤＡ ＭＢ２３１乳癌細胞系を、１０％のＦＣＳを補ったＤＭＥＭ培地において培養した。

ペプチド合成および配列
ペプチドＤＰＴ−Ｃ９ｈを、固相処理および標準Ｆｍｏｃ化学にて、自動多重ペプチドシンセサイザーにおいて合成した。ペプチドの純度および組成を、逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析により確認した。

アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ染色によるアポトーシスの検出
製造業者により述べられているＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの−ＦＩＴＣ）を使用して、アポトーシス性細胞を検出した。簡潔には、細胞を１ｘ結合バッファーで洗浄し、遠心し、２００μｌのＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ（０．１μｇ／ｍｌ）およびＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ）を含む１ｘ結合バッファーに再懸濁した。室温で暗下で１０分間インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により得られたデータをＣｅｌｌｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ ソフトウェアで分析した。

細胞毒性アッセイ
化学療法およびペプチドの細胞毒性をＭＴＴにより評価した。７２時間、細胞を種々の処置と接触させた。細胞を培養培地で濯ぎ、１００μｌの最終容量における１０μｌ ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で４時間インキュベートした。青色のホルマザン結晶の形成を顕微鏡により視覚化した。インキュベーションの期間後、１００μｌの１０ｍＭ ＨＣｌ中１０％ ＳＤＳをそれぞれのウェルに加え、プレートを一晩インキュベートした。吸光度を５７０および６２０ｎｍで測定し、未処置コントロールに対する生存細胞のパーセントを概算した。

２．２． 結果
ＤＰＴ−Ｃ９ｈはドキソルビシン、ドセタキセル、５ＦＵおよびシスプラチン化学療法と相乗効果を与える
ＤＰＴ−Ｃ９ｈおよび化学療法のアポトーシス性効果を、乳癌細胞系ＭＤＡＭＢ２３１において試験した。図２Ａは、細胞と２４時間接触にて、ドキソルビシン単独のアポトーシス性効果を示す。本発明者らは、ペプチドと組み合わせる低い用量のドキソルビシン、０．２５μＭを選択した。図２Ｂは、種々の用量のＤＰＴ−Ｃ９ｈと低い用量のドキソルビシンとの組合せのアポトーシス性効果を示す。両方の組合せは、試験されたペプチドの全ての用量で、アポトーシスに対する相乗効果を有する。

ＤＰＴ−Ｃ９ｈおよびドセタキセルの組み合わせ効果は図３Ａに示される。本発明者らは、低い用量のドセタキセルと１０および２５μＭのＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドとの相乗的アポトーシス性効果を観察した。種々の用量のドセタキセルおよび唯一の(unique)用量のペプチドで培養されたＭＤＡ ＭＢ２３１細胞の生存は、図３Ｂに示される。本発明者らは、ドセタキセルの存在下のみで維持される細胞と比較して、ドセタキセルおよびペプチドの存在下で培養された細胞の低い生存を観察する。

本発明者らは、ＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドおよび５ＦＵの組合せ効果をさらに分析した（図４Ａ）。本発明者らは、低いアポトーシス性用量の５ＦＵと２５または５０μＭのＤＰＴ−Ｃ９ｈとの組合せによる相乗的アポトーシス性効果を検出した。該効果は、両方の分子の組合せで検出された低い細胞生存と一致する（図４Ｂ）。

最後に、本発明者らは、シスプラチンおよびＤＰＴ−Ｃ９ｈペプチドの組合せ効果を分析した（図５Ａ）。同様に、本発明者らは、シスプラチンおよび漸増用量のＤＰＴ−Ｃ９ｈの併用処置の相乗的アポトーシス性効果を観察した。該効果はまた、シスプラチンがＤＰＴ−Ｃ９ｈと組み合わせられたとき、低いレベルの細胞生存と一致する（図５Ｂ）。

総合すれば、これらの結果は、低い用量の化学療法（ドキソルビシン、ドセタキセル、５ＦＵおよびシスプラチン）とペプチドＤＰＴ−Ｃ９ｈとの組合せの相乗的アポトーシス性効果を示す。

参考文献

Claims (18)

1. 抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のための、アポトーシス促進性ペプチドに連結された細胞透過性ペプチドを含むキメラペプチド構築物であって、該アポトーシス促進性ペプチドは、配列
   Ｙ−Ｘ_４ａ−ＥＴＬＤ−Ｘ_４ｂ−Ｉ−Ｘ_５−ＥＱＷＡ−Ｘ_６−Ｓ−Ｘ_７（配列番号：３）
   ［式中、
   Ｘ_４ａはバリンまたはイソロイシンであり；
   Ｘ_４ｂはアスパラギン酸またはグリシンであり；
   Ｘ_５はフェニルアラニンまたはロイシンであり；
   Ｘ_６はアルギニンまたはヒスチジンであり；
   Ｘ_７は存在しない(vacant)か、またはグルタミン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸−ロイシンである］；または
   １つ以上の化学修飾によって該アポトーシス促進性ペプチドから得られるタンパク質分解耐性のペプチド、または好ましくは１つ以上の保存的置換によって配列番号：３から得られる実質的に同種のペプチドを含む、キメラペプチド構築物。
2. Ｘ_４ａがバリンであり；
   Ｘ_４ｂがアスパラギン酸であり；
   Ｘ_５がフェニルアラニンであり；
   Ｘ_６がヒスチジンである、
   請求項１に記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
3. 請求項１または２に記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物であって、該細胞透過性ペプチドは、
   ａ）
   （配列番号：４）
   ［式中、Ｘ_１は存在しないか、リジン残基、またはバリン−リジンであり；
   Ｘ_２は存在しないか、リジン残基、またはリジン−イソロイシンであり；
   Ｘ_３は存在しないか、または１から４つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
   Ψは任意のアミノ酸である］；
   または１つ以上の化学修飾によって配列番号：４から得られるタンパク質分解耐性のペプチド、または１つ以上の保存的置換によって配列番号：４から得られる実質的に同種のペプチド、
   ｂ）（ＲＱＫＲＬＩ）_３（配列番号：５）、（ＲＨＳＲＩＧ）_３（配列番号：６）、ＲＨＳＲＩＧＩＩＱＱＲＲＴＲＮＧ（配列番号：７）、ＲＨＳＲＩＧＶＴＲＱＲＲＡＲＮＧ（配列番号：８）、ＲＲＲＲＲＲＲＳＲＧＲＲＲＴＹ（配列番号：９）、
   または
   ｃ）Ｔａｔペプチド、ポリアルギニンペプチド、ＨＡ２−Ｒ_９ペプチド、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎペプチド、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎペプチド、Ｖｅｃｔｏｃｅｌｌペプチド、マウロカルシンペプチド、デカリジンペプチド、ＨＩＶ−Ｔａｔ由来ＰＴＤ４ペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス移行(Translocation)モチーフ（ＰＴＭ）ペプチド、ｍＰｒＰ_１−２８ペプチド、ＰＯＤ、ｐＶＥＣ、ＥＢ１、Ｒａｔｈ、ＣＡＤＹ、Ｈｉｓｔａｔｉｎ ５、Ａｎｔｐペプチド、またはＣｙｔ^{８６−１０１}ペプチド
   から選択される、キメラペプチド構築物。
4. 該細胞透過性ペプチドが
   （配列番号：４）
   ［式中、Ψはアルギニン、アラニン、リジン、またはアスパラギンである］
   である、請求項３に記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
5. 請求項３または４に記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物であって、該細胞透過性ペプチドは、
   （配列番号：４）
   ［式中、Ψはアルギニン、アラニン、リジン、またはアスパラギンであり、
   Ｘ_１はバリン−リジンであり；
   Ｘ_２はリジン−イソロイシンであり；
   Ｘ_３は存在しない］
   である、キメラペプチド構築物。
6. 該細胞透過性ペプチドが、ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ（配列番号：３９）、ＶＫＫＫＫＩＫＡＥＩＫＩ（配列番号：４０）、ＶＫＫＫＫＩＫＫＥＩＫＩ（配列番号：４１）またはＶＫＫＫＫＩＫＮＥＩＫＩ（配列番号：４２）である、請求項５に記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
7. ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：２９）
   ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３０）
   ＶＫＫＫＫＩＫＡＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：３１）
   ＶＫＫＫＫＩＫＡＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３２）
   ＶＫＫＫＫＩＫＫＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：３３）
   ＶＫＫＫＫＩＫＫＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３４）
   ＶＫＫＫＫＩＫＮＥＩＫＩ−ＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬ（配列番号：３５）および
   ＶＫＫＫＫＩＫＮＥＩＫＩ−ＹＩＥＴＬＤＤＩＬＥＱＷＡＲＳＥＤＬ（配列番号：３６）からなる群から選択される、請求項６に記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
8. 腫瘍が、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ならびに、脳、肺、乳房、卵巣、頭頸部、膀胱、胃、膵臓、頭、首、腎臓、前立腺、結腸直腸、食道および甲状腺癌、ブドウ膜黒色腫および黒色腫からなる群から選択される癌である、請求項１から７のいずれかに記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
9. 抗腫瘍剤が同時または連続投与されるためのものである、請求項１から８のいずれかに記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
10. 抗腫瘍剤が化学療法剤である、請求項１から８のいずれかに記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
11. 抗腫瘍剤がドキソルビシンおよび／またはシクロホスファミドである化学療法剤である、請求項１０に記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
12. 抗腫瘍剤がドセタキセル、５−ＦＵまたはシスプラチンである化学療法剤である、請求項１０に記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
13. 腫瘍が乳癌である、請求項１１に記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
14. 化学療法剤が投与された約５から約３０日後、好ましくは約７から約２０日後に投与されるためのものである、請求項１から１３のいずれかに記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
15. 腫瘍の再発の予防において、請求項１から１４のいずれかに記載の抗腫瘍剤と組み合わせて使用するためのキメラペプチド構築物。
16. ヒト患者において、請求項１から１５のいずれかに記載の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のためのキメラペプチド構築物。
17. 好ましくは化学療法剤である抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍を処置することにおける使用のための、請求項１から７のいずれかに記載のキメラペプチド構築物をコードする核酸または該核酸を含むベクター。
18. ベクターがアデノウイルスまたはレンチウイルスベクターである、腫瘍を処置することにおける使用のための請求項１７に記載のベクター。