ES2251831T3 - Inhibidores de la activacion de nf-kb. - Google Patents

Inhibidores de la activacion de nf-kb.

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ES2251831T3 ES99924594T ES99924594T ES2251831T3 ES 2251831 T3 ES2251831 T3 ES 2251831T3 ES 99924594 T ES99924594 T ES 99924594T ES 99924594 T ES99924594 T ES 99924594T ES 2251831 T3 ES2251831 T3 ES 2251831T3
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Rudi Beyaert
Karen Heyninck
Walter Fiers
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Abstract

Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2, que es capaz de interactuar con la proteína A20 y/o modular y/o inhibir la activación de NF-B, y que no es el factor 1 asociado a Nef.

Description

Inhibidores de la activación de NF-\kappaB.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a nuevos inhibidores del factor nuclear kappa B (NF-\kappaB) que activa una ruta útil en el tratamiento de enfermedades relacionadas con NF-\kappaB y/o la mejora de tratamientos antitumorales.
La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican dichos inhibidores nuevos.
La invención se refiere además al uso de polipéptidos, derivados de estos inhibidores en el tratamiento de enfermedades y/o cánceres relacionados con NF-\kappaB.
Adicionalmente, la invención se refiere a preparaciones farmacéuticas, que comprenden los nuevos inhibidores o los polipéptidos derivados de estos inhibidores.
Antecedentes de la invención
NF-\kappaB es un factor de transcripción expresado de forma ubicua que controla la expresión de una gama diversa de genes implicados en la inflamación, respuesta inmunitaria, diferenciación linfoide, control de crecimiento y desarrollo. NF-\kappaB permanece en el citoplasma como un dímero inactivo compuesto de las subunidades p50 y p65, y está unido a una proteína inhibidora conocida como IkB. Ésta se fosforila y se degrada en respuesta a diversos estímulos del entorno, tales como citoquinas proinflamatorias, virus, lipopolisacáridos, oxidantes, luz UV y radiación ionizante. Esto permite que NF-\kappaB se transloque al núcleo donde inactiva genes que representan un papel clave en la regulación de las respuestas inmunitarias e inflamatorias, incluyendo genes que codifican citoquinas proinflamatorias (IL-1\beta, TNF, GM-CSF, IL-2, IL-6, IL-11, IL-17), quimioquinas (IL-8, RANTE, MIP-1\alpha, MCP-2), enzimas que generan mediadores de inflamación (NO sintetasa, ciclooxigenasa), receptores inmunitarios (receptor de IL-2) y moléculas de adhesión (ICAM-1, VCAM-1, E-selectina). Algunas de estas proteínas inducidas pueden activar por turnos al NF-\kappaB, llevando a la amplificación adicional y a la perpetuación de la respuesta inflamatoria. Recientemente, se ha demostrado que NF-\kappaB tiene una función antiapoptótica en ciertos tipos de células, lo más probablemente induciendo la expresión de genes antiapoptóticos. Esta función puede proteger a las células tumorales contra tratamientos anticancerígenos y abre la posibilidad de usar compuestos que inhiben el NF-\kappaB para sensibilizar a las células tumorales y para mejorar la eficacia del tratamiento anticancerígeno.
Debido a su función directa en la regulación de respuesta a citoquinas inflamatorias y a endotoxina, la activación de NF-\kappaB representa un importante papel en el desarrollo de diferentes enfermedades (Barnes y Karin, 1997): enfermedades inflamatorias crónicas tales como, artritis reumatoide, asma y enfermedad inflamatoria del intestino (Brand y col., 1996); enfermedades agudas, tales como choque séptico (Remick, 1995); enfermedad de Alzheimer donde las proteína \beta-amiloide activa NF-\kappaB (Behl y col., 1997); aterosclerosis, donde NF-\kappaB puede activarse mediante lípidos oxidados (Brand y col., 1997); enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico (Kaltschmidt y col., 1994); cáncer regulando por incremento ciertos oncogenes o previniendo la apoptosis (Luque y col., 1997). Además, NF-\kappaB también está implicado en la infección vírica ya que se activa mediante diferentes proteínas virales, tal como ocurre tras la infección con rinovirus, virus de la influenza, virus de Epstein-Barr, HTLV, citomegalovirus o adenovirus. Adicionalmente, varios virus tales como el VIH tiene sitios de unión a NF-\kappaB en sus regiones promotoras/potenciadoras (Mosialos, 1997).
Debido a la función potencial del NF-\kappaB en muchas de las enfermedades mencionadas anteriormente, el NF-\kappaB y sus reguladores han provocado mucho interés como dianas para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con NF-\kappaB. Los glucocorticoides son inhibidores eficaces de NF-\kappaB, pero tiene efectos secundarios endocrinos y metabólicos cuando se suministran sistemáticamente (Barnes y col., 1993). Los antioxidantes pueden representar otra clase de inhibidores de NF-\kappaB, pero los antioxidantes actualmente disponibles, tales como la acetil cisteína, son relativamente débiles e inespecíficos (Schreck y col., 1991). La aspirina y el salicilato sódico también inhiben la activación de NF-\kappaB, pero sólo a concentraciones relativamente elevadas (Kopp y Gosh, 1994). Hay varios inhibidores naturales de NF-\kappaB, tales como la gliotoxina, derivada de Aspergillus, pero estos compuestos son demasiado tóxicos para usarse como un fármaco (Pahl y col., 1996). Finalmente, puede haber inhibidores endógenos de NF-\kappaB, tales como la IL-10, que bloquea NF-\kappaB a través de un efecto sobre IkB (Wang y col., 1995). Sin embargo, no es deseable la inhibición total de NF-\kappaB en todos los tipos celulares durante períodos prolongados, ya que NF-\kappaB representa un papel crucial en la respuesta inmunitaria y en otras respuestas defensivas.
Recientemente, se ha demostrado que los factores asociados al receptor de TNF, TRAF2 y TRAF6, tienen un papel importante en la inducción de NF-\kappaB por TNF e IL1, ya que estos son reclutados hacia el receptor-TNF y el receptor IL-1, respectivamente (Rothe y col., 1995; Cao y col., 1996). La sobreexpresión de TRAF2 o TRAF6 activa NF-\kappaB, mientras que los mutantes negativos dominantes inhiben el TNF o IL-1 inducidos por la activación de NF-\kappaB en la mayoría de los tipos celulares. Recientemente, los estudios de anulación del gen de TRAF2 han demostrado que TRAF2 no se necesita en absoluto para la activación de NF-\kappaB, presumiblemente debido a la redundancia dentro de la familia TRAF (Yeh y col. 1997). Adicionalmente, la ruta de señalización inducida por TRAF para NF-\kappaB se resolvió mediante la identificación de la proteína NIK que interactúa con TRAF, la cual media en la activación de NF-\kappaB tras la estimulación de TNF e IL-1, mediante su asociación y activación de las IkB quinasas \alpha y \beta (IKK) (Malinin y col., 1997; Regnier y col., 1997; DiDonato y col., 1997; Zandi y col., 1997; Woronicz y col., 1997). Ésta última es parte de un gran complejo multiproteico de activación de NF-\kappaB y es responsable de la fosforilación de IkB, llevando a su posterior degradación y a la translocación del NF-\kappaB activo liberado al núcleo. Esto permite una inhibición más específica de la activación de NF-\kappaB por estímulos (incluyendo TNF e IL-1) que activan las rutas TRAF. En base a este principio, el documento WO 97/37016 describe el uso de NIK y de otras proteínas que interactúan con TRAF para la modulación de la actividad NF-\kappaB.
Otra proteína que puede asociarse con TRAF2 es la proteína con dedos de cinc A20 (Song y col., 1996). Ésta última está codificada por un gen de respuesta temprana inmediata inducido en líneas celulares diferentes tras la estimulación con TNF o IL-1 (Dixit y col., 1990). De manera interesante, la sobreexpresión de A20 bloquea la activación de NF-\kappaB inducida tanto por TNF como por IL-1 (Jaattela y col., 1996). Sin embargo, el mecanismo por el cual A20 bloquea la activación de NF-\kappaB es totalmente desconocido, pero al contrario que NIK, no parece que A20 actúe directamente sobre IkB y sigue, a este respecto, una ruta alternativa para modular la activación de NF-\kappaB.
De Valck y col. (1997) aislaron una proteína que se une a A20, denominada 14-3-3, usando el ensayo de dos híbridos de levadura y demostraron que la inhibición de NF-\kappaB era independiente de la unión de A20 a 14-3-3.
Propósitos y descripción de la invención
En la presente invención se muestra que, de forma inesperada, otras nuevas proteínas que interactúan con A20 pueden modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB.
La invención incluye una proteína funcional aislada que comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC Nº 2, o comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC Nº 3 o, como alternativa, comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC Nº 5.
Más específicamente dicha proteína funcional comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con los aminoácidos 54-647 de la ID SEC Nº 2, incluso más específicamente, dicha proteína funcional comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con los aminoácidos 390-647 de la ID SEC Nº 2 ó, como alternativa y/o comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con los aminoácidos 420-647 de la ID SEC Nº 2.
Homología, en este contexto, significa idéntico o similar a la secuencia de referencia, mientras que también se incluyen sustituciones/modificaciones obvias de cualquiera de los aminoácidos proporcionados. A este respecto, puede realizarse una homología de búsqueda con el programa BLAST-P (Herramienta de búsqueda de alineamiento local básico) bien conocido por una persona experta en la materia. Para la homología de secuencia de ácido nucleico correspondiente se hace referencia a los programas BLASTX y BLASTN conocidos en la técnica.
Un aspecto de la invención es ofrecer nuevos moduladores y/o inhibidores de las rutas de activación de NF-\kappaB inducida por TNF y/o IL-1.
Una importante realización de la invención es una proteína que comprende al menos los aminoácidos de la ID SEC Nº 2.
Otra realización de la invención es una proteína que comprende al menos los aminoácidos 54-647 de la ID SEC Nº 2, como se representa en la ID SEC Nº 3.
Una realización adicional de la invención es una proteína que comprende al menos los aminoácidos de la ID SEC Nº 5.
Un aspecto adicional de la invención es el uso de una proteína que comprende los aminoácidos 420-647 de la ID SEC Nº 2 para modular y/o inhibir la ruta relacionada con NF-\kappaB, especialmente las rutas inducidas por TNF y/o IL-1.
Además, la invención se refiere al uso de una proteína, que comprende la secuencia consenso mostrada en la ID SEC Nº 6 y/o ID SEC Nº 7, para modular y/o inhibir la ruta relacionada con NF-\kappaB, inducida por TNF y/o IL-1.
Otro aspecto de la invención es el uso de las proteínas mencionadas anteriormente en un procedimiento de selección para seleccionar compuestos que interfieren con la interacción de esta proteína o proteínas con otros componentes proteicos de la ruta relacionada con NF-\kappaB.
Otra realización de la invención es el uso de las proteínas mencionadas anteriormente, o el uso de los componentes proteicos seleccionados por el procedimiento mencionado anteriormente para sensibilizar células tumorales y/o mejorar el tratamiento anticancerígeno.
Como alternativa, la presente invención se refiere al procedimiento para identificar y obtener un activador o inhibidor de proteína o proteínas que interactúan con A20, que comprende las etapas de:
(a) combinar un compuesto de selección con una mezcla de reacción que contiene la proteína de la invención y un sistema de lectura capaz de interactuar con la proteína en condiciones adecuadas;
(b) mantener dicha mezcla de reacción en presencia del compuesto o una muestra que comprenda una pluralidad de compuestos en condiciones que permitan la interacción de la proteína con dicho sistema de lectura;
(c) identificar o verificar una muestra y un compuesto, respectivamente, que conduce a la supresión o activación del sistema de lectura.
La expresión "sistema de lectura" en el contexto de la presente invención significa una secuencia de ADN que, tras la transcripción y/o expresión en una célula, tejido u organismo, proporciona un fenotipo valorable y/o seleccionable. Estos sistemas de lectura son bien conocidos por los expertos en la materia y comprenden, por ejemplo, moléculas de ADN recombinante y genes de marcadores como se describe anteriormente.
La expresión "pluralidad de compuestos" en un procedimiento de la invención ha de entenderse como una pluralidad de sustancias que pueden ser idénticas o no.
Dichos compuestos o pluralidad de compuestos pueden estar comprendidos, por ejemplo, en muestras, por ejemplo por extractos celulares de animales o microorganismos. Además, dicho compuesto (o compuestos) pueden ser conocidos en la técnica, pero hasta ahora no conocidos por ser capaces de suprimir o activar proteínas que interactúan con A20. La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células o puede comprender un cultivo celular o tisular. Los expertos en la materia conocen equipos adecuados para el procedimiento de la invención y, por ejemplo, se describen de forma general en Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, tercera edición (1994). La pluralidad de compuestos puede añadirse, por ejemplo, a la mezcla de reacción, al medio de cultivo, o ser inyectados en la célula.
Si en el procedimiento de la invención se identifica una muestra que contiene un compuesto o una pluralidad de compuestos, entonces es posible aislar el compuesto a partir de la muestra original identificada por contener el compuesto capaz de suprimir o activar las proteínas que interactúan con A20, o se puede además subdividir la muestra original, por ejemplo, si consiste en una pluralidad de compuestos diferentes, para reducir así el número de sustancias diferentes por muestra y repetir el procedimiento con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente pueden realizarse varias veces, preferiblemente hasta que la muestra identificada según el procedimiento de la invención sólo comprenda un número limitado de sustancias, o sólo una sustancia. Preferiblemente, dicha muestra comprende sustancias con propiedades químicas y/o físicas similares, y más preferiblemente, dichas sustancias son idénticas. Los compuestos que se pueden analizar e identificar según un procedimiento de la invención pueden ser bibliotecas de expresión, por ejemplo, bibliotecas de expresión de ADNc, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, hormonas, peptidomiméticos, PNA o similares (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198 y referencias citadas supra).
Como alternativa, la invención también se refiere a una secuencia de ADN que codifica las proteínas aludidas o una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de tal proteína, seleccionada a partir del grupo que consiste en:
(a) secuencias de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos dada en la ID SEC Nº 2;
(b) secuencias de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos dada en la ID SEC Nº 1;
(c) secuencias de ADN que hibridan con la cadena complementaria de una secuencia de ADN como se define en (a) o (b) y que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN de (a) o (b);
(d) secuencias de ADN, la secuencia de nucleótidos de la cual degenera como consecuencia del código genético, en una secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADN como se define en una cualquiera de (a) a (c); y
(e) secuencias de ADN que codifican un fragmento de una proteína codificada por una secuencia de ADN de una cualquiera de (a) a (d).
De este modo, la invención consiste en moléculas de ADN, también denominadas secuencias de ácidos nucleicos, preferiblemente, una secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas mencionadas anteriormente con el 70-100% de homología con la secuencia de ADN representada en la ID SEC Nº 1, y/o una secuencia de ácido nucleico con el 70-100% de homología con la secuencia de ADN descrita en la ID SEC Nº 4.
En este contexto, homología significa que las respectivas moléculas de ácido nucleico o las proteínas codificadas son funcional y/o estructuralmente equivalentes. Las moléculas de ácido nucleico que son homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente y que derivan de dichas moléculas de ácido nucleico son, por ejemplo, variaciones de dichas moléculas de ácido nucleico que representan modificaciones que tienen la misma función biológica, en particular, que codifican proteínas con la misma o sustancialmente la misma función biológica. Pueden ser variaciones naturales, tales como secuencias de otras variedades o especies, o mutaciones. Estas mutaciones pueden producirse de forma natural o pueden obtenerse mediante técnicas de mutagénesis. Las variaciones alélicas pueden ser variaciones alélicas naturales, así como producidas de forma sintética o variantes por ingeniería genética.
Las proteínas codificadas por los diversos derivados y variantes de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente tienen características comunes similares, tales como actividad biológica, peso molecular, reactividad inmunológica, conformación, etc., así como propiedades físicas, tales como movilidad electroforética, comportamiento cromatográfico, coeficiente de sedimentación, pH óptimo, temperatura óptima, estabilidad, solubilidad, propiedades espectroscópicas, etc.
La presente invención también se refiere a vectores, en particular, plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usados convencionalmente en ingeniería genética que contienen una molécula de ácido nucleico según la invención. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la materia para construir diversos plásmidos y vectores; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.
De forma alternativa, las moléculas de ácido nucleico y los vectores de la invención pueden reconstituirse en liposomas para su suministro a células diana.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico presente en el vector está unida de forma operativa a (a) una secuencia o secuencias control que permiten la expresión de la molécula de ácido nucleico en células procarióticas y/o eucarióticas.
La expresión "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN reguladoras que son necesarias para influir en la expresión de las secuencias codificadoras a las cuales están ligadas. La naturaleza de estas secuencias control es diferente dependiendo del organismo hospedador. En procariotas, las secuencias control generalmente incluyen promotor, sitio de unión a ribosoma y terminadores. En eucariotas, las secuencias control generalmente incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. La expresión "secuencia control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes necesarios para la expresión y también puede incluir componentes adicionalmente ventajosos.
La expresión "unido de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos tienen una relación que les permite funcionar en la forma deseada. Una secuencia control "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora se liga de tal forma que se consigue la expresión de la secuencia codificadora en condiciones compatibles con las secuencias control. En el caso de que la secuencia control sea un promotor, es obvio para los expertos que se usa ácido nucleico de doble cadena.
De este modo, el vector de la invención es, preferiblemente, un vector de expresión. Un "vector de expresión" es una construcción que puede usarse para transformar una célula hospedadora seleccionada y mantener la expresión de una secuencia codificadora en el hospedador seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, vectores de clonación, vectores binarios o vectores de integración. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico preferiblemente en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en células procarióticas y/o eucarióticas son bien conocidos por los expertos en la materia.
La presente invención además se refiere a células hospedadoras que comprenden un vector como se describe anteriormente, o una molécula de ácido nucleico según la invención en la que la molécula de ácido nucleico es extraña para la célula hospedadora.
Por "extraña" se entiende que la molécula de ácido nucleico es heteróloga con respecto a la célula hospedadora, esto significa derivada de una célula u organismo con un fondo genómico diferente, o es homóloga con respecto a la célula hospedadora, pero se localiza en un ambiente genómico diferente al del equivalente natural de dicha molécula de ácido nucleico. Esto significa que, si la molécula de ácido nucleico es homóloga con respecto a la célula hospedadora, no se localiza en su localización natural en el genoma de dicha célula hospedadora, en particular está rodeada de genes diferentes. En este caso, la molécula de ácido nucleico puede estar o bajo el control de su propio promotor o bien bajo el control de un promotor heterólogo. El vector o molécula de ácido nucleico, según la invención, que está presente en la célula hospedadora puede estar integrado en el genoma de la célula hospedadora o puede mantenerse, de alguna forma, extracromosómicamente. A este respecto, se debe entender también que la molécula de ácido nucleico de la invención puede usarse para restablecer o crear un gen mutante a través de recombinación homóloga (Paszkowski (ed.), Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants, (Kluwer Academic Publishers 1994)).
La célula hospedadora puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica, tal como células bacterianas, de insecto, de hongos, vegetales o animales. Las células de hongos preferidas son, por ejemplo, las del género Saccharomyces, en particular las de la especie S. cerevisiae.
Otro tema de la invención es un procedimiento para preparar proteínas que interactúan con A20 cuyo método comprende el cultivo de células hospedadoras que, debido a la presencia de un vector o una molécula de ácido nucleico según la invención, son capaces de expresar esta proteína en condiciones que permiten la expresión de la proteína y, de este modo, la recuperación, a partir del cultivo, de la proteína producida de este modo.
El término "expresión" significa la producción de una proteína o secuencia nucleotídica en la célula. Sin embargo, dicho término también incluye la expresión de la proteína en un sistema acelular. Éste incluye la transcripción en un producto de ARN, la modificación postranscripcional y/o la traducción a un producto proteico o polipéptido a partir de un ADN que codifica este producto, así como posibles modificaciones postraduccionales. Dependiendo de las construcciones y condiciones específicas usadas, la proteína se puede recuperar a partir de las células, del medio de cultivo o de ambos. Para los expertos en la materia, es bien conocido que no sólo es posible expresar una proteína nativa, sino también expresar la proteína como polipéptidos de fusión o añadir secuencias señal que dirijan la proteína a compartimentos específicos de la células hospedadora, por ejemplo, asegurando la secreción del péptido al medio de cultivo, etc. Además, esta proteína y fragmentos de la misma pueden sintetizarse químicamente y/o modificarse según los procedimientos convencionales.
Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan en esta solicitud indistintamente. "Polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos (secuencia de aminoácidos) y no hace referencia a una longitud específica de la molécula. De este modo, en la definición de polipéptido se incluyen péptidos y oligopéptidos. Este término también se refiere o incluye modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. En la definición se incluye, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto naturales como no naturales.
La presente invención además se refiere a proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico según la invención o producidas u obtenidas mediante los procedimientos descritos anteriormente, y fragmentos funcionales y/o inmunológicamente activos de estas proteínas que interactúan con A20. Las proteínas y polipéptidos de la presente invención no se traducen necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico; los polipéptidos pueden generarse de cualquier manera, incluyendo, por ejemplo, síntesis química, expresión de un sistema de expresión recombinante o aislamiento a partir de un sistema viral adecuado. Los polipéptidos pueden incluir uno o más análogos de aminoácidos, aminoácidos fosforilados o aminoácidos no naturales. Se conocen en la técnica procedimientos para insertar análogos de aminoácidos en una secuencia. Los polipéptidos pueden incluir también una o más etiquetas, que son conocidas por los expertos en la materia. En este contexto, también se entiende que las proteínas según la invención pueden estar además modificadas por procedimientos convencionales conocidos en la técnica. También es posible proporcionar las proteínas según la presente invención para determinar qué fragmentos retienen la actividad biológica, concretamente, la forma procesada madura. Esto permite la construcción de proteínas quiméricas y de péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de la proteína de la invención, que es crucial para su actividad de unión. Las otras secuencias de aminoácidos funcionales pueden estar unidas físicamente mediante, por ejemplo, medios químicos a las proteínas de la invención o pueden fusionarse mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica.
La expresión "fragmento funcional de una secuencia" o "parte funcional de una secuencia" significa una secuencia truncada de la secuencia original de referencia. La secuencia truncada (secuencia de ácido nucleico o de proteína) puede variar en gran medida de longitud; siendo el tamaño mínimo una secuencia de tamaño suficiente para proporcionar una secuencia con al menos una función y/o actividad comparables a la de la secuencia original de referencia, mientras que el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo por lo general no es sustancialmente mayor que el necesario para proporcionar la actividad y/o función (o funciones) deseadas de la secuencia original. Típicamente, la secuencia de aminoácidos truncada oscilará desde aproximadamente 5 a aproximadamente 60 aminoácidos de longitud. Más típicamente, sin embargo, la secuencia tendrá un máximo de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, preferiblemente un máximo de aproximadamente 30 aminoácidos. Normalmente es deseable seleccionar secuencias de al menos aproximadamente 10, 12 ó 15 aminoácidos, hasta un máximo de aproximadamente 20 ó 25 aminoácidos.
Además, se pueden realizar simulaciones de plegamiento y rediseño por ordenador de los motivos estructurales de la proteína de la invención usando los programas de ordenador adecuados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). El modelado por ordenador del plegamiento de proteínas puede usarse para el análisis conformacional y energético de modelos detallados de péptidos y proteínas (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). En particular, pueden usarse los programas apropiados para la identificación de sitios interactivos de la proteína de la invención, su receptor, su ligando u otras proteínas de interacción mediante búsquedas asistidas por ordenador de secuencias de péptidos complementarios (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Otros sistemas de ordenador apropiados para el diseño de proteínas y de péptidos se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Los resultados obtenidos a partir del análisis por ordenador descrito anteriormente pueden usarse, por ejemplo, para la preparación de peptidomiméticos de la proteína de la invención o fragmentos de la misma. Estos análogos de pseudopéptidos de la secuencia natural de aminoácidos de la proteína pueden mimetizar muy eficazmente a la proteína parental (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por ejemplo, la incorporación de restos de aminoácidos no quirales fácilmente accesibles en una proteína de la invención o un fragmento de la misma da lugar a la sustitución de enlaces amida por unidades de polimetileno de una cadena alifática, proporcionando de este modo una estrategia conveniente para la construcción de un peptidomimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777). En la técnica anterior se han descrito análogos de peptidomiméticos superactivos de hormonas peptídicas pequeñas en otros sistemas (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). También pueden identificarse peptidomiméticos apropiados de la proteína de la presente invención mediante la síntesis de bibliotecas combinatorias peptidomiméticas a través de la sucesiva alquilación de amidas y el análisis, por ejemplo, de las propiedades de unión e inmunológicas de los compuestos resultantes. En la técnica anterior se describen procedimientos para la generación y uso de bibliotecas combinatorias peptidomiméticas, por ejemplo, en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234; y Domer, Bioorg. Med. Chem.4 (1996), 709-715.
Además, se puede usar una estructura tridimensional y/o cristalográfica de la proteína de la invención para el diseño de inhibidores peptidomiméticos de la actividad biológica de la proteína de la invención (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).
Además, la presente invención se refiere a anticuerpos que reconocen específicamente una proteína que interactúa con A20 según la invención o partes, es decir, fragmentos o epítopes específicos, de esta proteína. Los anticuerpos de la invención pueden usarse para identificar y aislar otras proteínas y genes que interactúan con A20 en cualquier organismo. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o anticuerpos sintéticos, así como fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, Fv o scFv, etc. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse, por ejemplo, mediante las técnicas que originalmente se describen en Köhler y Milstein, Nature 256 (1975), 495, y en Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, que comprende la fusión de células de mieloma de ratón con células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados. Además, se pueden obtener anticuerpos o fragmentos de estos a partir de los péptidos mencionados, usando procedimientos que se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Estos anticuerpos pueden usarse, por ejemplo, para la inmunoprecipitación e inmunolocalización de las proteínas según la invención, así como para el control de la síntesis de estas proteínas, por ejemplo, en organismos recombinantes, y para la identificación de compuestos que interactúan con la proteína según la invención. Por ejemplo, se puede usar la resonancia de plasmón superficial como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficacia de las selecciones de anticuerpos en fagos, que rinde un aumento elevado de afinidad a partir de una única biblioteca de anticuerpos en fagos que se unen a un epítope de la proteína de la invención (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). En mu-
chos casos, los fenómenos de unión de anticuerpos a antígenos son equivalentes a otras uniones ligando/anti-ligando.
La invención también se refiere a una composición de diagnóstico que comprende al menos una de las moléculas de ácido nucleico, vectores, proteínas, anticuerpos o compuestos mencionados anteriormente y, de forma opcional, medios adecuados para la detección.
Dichas composiciones diagnósticas pueden usarse para procedimientos de detección de la expresión de proteínas que interactúan con A20 relacionadas detectando la presencia del ARNm correspondiente que comprende el aislamiento del ARNm de una célula, poner en contacto el ARNm obtenido con una sonda que comprende una sonda de ácido nucleico como se describe anteriormente en condiciones de hibridación, detectar la presencia del ARNm que ha hibridado con la sonda y detectar así la expresión de la proteína en la célula. Los procedimientos adicionales para detectar la presencia de una proteína según la presente invención comprende técnicas inmunológicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo, ensayos de inmunoabsorción unido a enzima.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos, obtenido por los procedimientos de selección mencionados anteriormente, en una cantidad biológicamente activa, para el tratamiento de enfermedades relacionadas con NF-\kappaB, tales como trastornos respiratorios, en particular, el síndrome de dificultad respiratoria aguda, rechazo de aloinjerto, enfermedades inflamatorias crónicas, tales como artritis reumatoide, asma o enfermedad intestinal inflamatoria, y/o enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una o más de las proteínas mencionadas anteriormente, en una cantidad biológicamente activa, para el tratamiento de enfermedades relacionadas con NF-\kappaB, tales como trastornos respiratorios, en particular, el síndrome de dificultad respiratoria aguda, rechazo de aloinjerto, enfermedades inflamatorias crónicas, tales como artritis reumatoide, asma o enfermedad intestinal inflamatoria, y/o enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico.
La invención también trata sobre una composición farmacéutica que comprende una o más de las proteínas mencionadas anteriormente y/o uno o más de los compuestos mencionados anteriormente, en una cantidad biológicamente activa, para un tratamiento contra células tumorales sensibles.
Breve descripción de las figuras
Figura 1
Distribución tisular de transcritos ABIN. Una transferencia de tipo Northern de ARN poli(A)+ ARN(2 \mug por carril) de diversos tejidos murinos (Clontech) se incubó con una sonda del fragmento de ABIN clonado mediante análisis de dos híbridos cubriendo la secuencia C-terminal de ABIN (390-599). Los marcadores de tamaño del ARN se indican en kB. La expresión de la \beta-actina sirvió como control de la cantidad de ARN cargado.
Figura 2
A: Coinmunoprecipitación de A20 y ABIN tras la transfección transitoria de los plásmidos que codifican ABIN con una etiqueta-E y la proteína fluorescente verde (GFP), GFP-A20, GFP-A20(369-775), GFP-A20(1-368) o un vector de expresión vacío como control negativo en células 293T. La inmunoprecipitación (panel superior) se realizó con un anticuerpo anti-GFP y la detección por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-etiqueta-E. Para controlar los niveles de expresión de ABIN, se separaron alícuotas de 10 \mul de los lisados por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y detección por inmunotransferencia con anticuerpos anti-etiqueta-E (panel inferior).
B: Coinmunoprecipitación del fragmento C-terminal de ABIN carente de la posible estructura en cremallera de leucina con GFP-A20 tras la expresión transitoria en células 293T. La inmunoprecipitación y los niveles de expresión se detectaron como se describe para la ABIN de longitud completa y se muestran en los paneles superior e inferior, respectivamente.
Figura 3
Secuencias consenso, derivadas de la comparación de las secuencias de ABIN y ABIN2.
Figura 4
A: Efecto de ABIN o fragmentos de ABIN en la activación de NF-\kappaB inducida por TFN e IL-1\beta, medido por la actividad del gen indicador. Las células 293T se transfectaron transitoriamente con 100 ng de pUT651, 100 ng de pNFconluc y 100 ng del plásmido de expresión y se estimularon con hTNF (1000 UI/ml) o mIL1\beta (20 ng/ml) durante 6 horas. Como control, se transfectaron 100 ng de plásmidos que codifican GFP o GFP-A20.
B: Efecto de la transfección transitoria con cantidades subóptimas de plásmidos de expresión que codifican A20 (5 ng) y ABIN (20 ng) sobre la inducción de NF-\kappaB mediada por TNF en células 293T. En ambos experimentos, las desviaciones típicas eran inferiores al 10%.
Figura 5
Efecto de ABIN o fragmentos de ABIN en la activación de NF-\kappaB inducida por TPA, medido por la actividad del gen indicador. Las células 293T se transfectaron transitoriamente con 100 ng de pUT651, 100 ng de pNFconluc y 100 ng del plásmido de expresión y se estimularon con TPA (200 ng/ml) durante 6 horas. Como control, se transfectaron 100 ng de plásmidos que codifican GFP o GFP-A20.
Figura 6
Efecto de ABIN2 en la activación de NF-\kappaB inducida por TNF y TPA, medido por la actividad del gen indicador. Las células 293T se transfectaron transitoriamente con 100 ng de pUT651, 100 ng de pNFconluc y 600 ng del plásmido de expresión y se estimularon con hTNF (1000 UI/ml) o TPA (200 ng/ml) durante 6 horas. Como control, se transfectaron 600 ng de plásmido que codifica GFP o GFP-A20.
Figura 7
A: Efecto de ABIN de longitud completa sobre la activación de NF-\kappaB en células 293T inducidas mediante la sobreexpresión de TRADD, RIP, TRAF2, NIK o p65 tras la transfección de 300 ng de los plásmidos que las codifican, junto con 100 ng de pUT651, 100 ng de pNFconluc y 500 ng de pCAGGS-ABIN. Las células se lisaron 24 horas después de la transfección y se midieron las actividades luciferasa y \beta-galactosidasa.
B: Efecto de ABIN truncado que contiene la estructura en cremallera de leucina (ABIN(390-647)) sobre la activación de NF-\kappaB inducida por TRADD, RIP, TRAF2 o NIK. En ambos experimentos, las desviaciones típicas eran inferiores al 10%.
Figura 8
Efecto de mutaciones específicas de sitio en 2 regiones de ABIN sobre su unión con A20 y sobre su inhibición de la activación de NF-\kappaB.
A: Comparación de aminoácidos de dos secuencias homólogas encontradas en ABIN y ABIN2. Los aminoácidos idénticos se muestran en negrita. Como se muestra, las mutaciones específicas de sitio (subrayadas) dieron lugar a los mutantes ABIN-MUT1, ABIN-MUT2, ABIN-MUT3 y ABIN-MUT4.
B: Coinmunoprecipitación de ABIN mutado con A20 después de la expresión transitoria de estos genes en células 293T. Las células se transfectaron con el plásmido pCAGGS-GFP o con el pCAGGS-GFP/A20 junto con los plásmidos que codifican ABIN o sus mutantes específicos de sitio (ABIN-MUT1, ABIN-MUT2, ABIN-MUT3 o ABIN-MUT4). Los lisados de estas células se inmunoprecipitaron con un anticuerpo policlonal anti-GFP y se separaron en
SDS-PAGE. El análisis por inmunotransferencia se realizó con un anticuerpo monoclonal anti-etiqueta-E para buscar la coinmunoprecipitación de ABIN o de sus mutantes (panel superior). Los paneles inferiores muestran los niveles de expresión total de GFP, GFP/A20 y ABIN. En este caso, se separó una fracción del lisado total por SDS-PAGE y la expresión se detectó con anticuerpos anti-GFP o anti-etiqueta-E.
C: Efecto del ABIN mutado sobre la activación de NF-\kappaB inducida por TNF. Las células 293T se transfectaron transitoriamente con 100 ng de pUT651, 100 ng de pNFconluc y 200 ng del plásmido de expresión como se indica y se estimularon con TNF (100 UI/ml) durante 6 horas. Se analizaron las actividades luciferasa y \beta-galactosidasa en los extractos celulares y se representaron como luc/gal, que es representativo de la actividad NF-\kappaB. Cada valor es la media (N=3) con desviaciones típicas inferiores al 10%.
D: Efecto dominante negativo de ABIN-MUT2, ABIN-MUT3 y ABIN-MUT4 sobre la función inhibidora de NF-\kappaB de ABIN. Las células 293T se transfectaron transitoriamente con 100 ng de pUT651, 100 ng de pNFconluc y 200 ng pCAGGS-ABIN o un vector vacío. Además, se cotransfectaron 600 ng de los vectores de expresión que codificaban ABIN-MUT2, ABIN-MUT3, ABIN-MUT4 o un vector vacío, como se indica. Las células se estimularon con TNF (1000 UI/ml) durante 6 horas. Se analizaron las actividades luciferasa y \beta-galactosidasa de extractos celulares y se representó como luc/gal.
Definiciones
Las siguientes definiciones se proporcionan con el fin de ilustrar y definir más a fondo el significado y alcance de los diversos términos usados en la descripción actual.
Los términos "tratamiento", "tratando" o "tratar" significan cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, que incluye: (1) prevenir la enfermedad causante de los síntomas clínicos de la enfermedad no desarrollada; (2) inhibir la enfermedad deteniendo el desarrollo de los síntomas clínicos y/o (3) aliviar la enfermedad causando la regresión de síntomas clínicos.
La expresión "cantidad eficaz" significa una dosificación suficiente para proporcionar tratamiento para el estado de la enfermedad que está siendo tratada. Esto variará dependiendo del paciente, la enfermedad y el tratamiento que se esté efectuando.
"Capaz de interactuar" significa que una proteína puede formar un complejo con otra proteína, según puede medirse usando un sistema de dos híbridos de levadura, con coinmunoprecipitación o con sistemas equivalentes conocidos por los expertos en la materia.
Proteína o fragmento "funcional" significa una proteína o fragmento que es capaz de interactuar con la proteína A20 en dedo de cinc o con otra proteína de la ruta relacionada con NF-\kappaB.
"Proteína A20" ("A20") significa la proteína con dedo de cinc inducida por TNF, descrita por (Dixit y col., 1990; Opipari y col., 1990; Tewari y col., 1995) o un fragmento activo de la misma, tal como la parte que contiene el dedo de cinc (aminoácidos 387-790 de la A20 humana; aminoácidos 369-775 de la A20 murina).
Las expresiones "gen o genes", "polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia nucleotídica", "secuencia de ADN" o "molécula o moléculas de ácido nucleico" como se usa en este documento se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Estas expresiones se refieren sólo a la estructura primaria de la molécula. De este modo, la expresión incluye ADN de cadena doble y sencilla y ARN.
También incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, metilación, sustitución de las "caperuzas" de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo. Preferiblemente, la secuencia de ADN de la invención comprende una secuencia codificadora que codifica la proteína que interactúa con A20 definida anteriormente.
Una "secuencia codificadora" es una secuencia de nucleótidos que se transcribe a ARNm y/o se traduce en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan por un codon de inicio de la traducción en el extremo 5'-terminal y un codon de parada de la traducción en el extremo 3'-terminal. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no de forma limitante, ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos recombinantes o ADN genómico, mientras que, en ciertas circunstancias, también pueden estar presentes intrones.
"Secuencia consenso" significa una extensión de al menos 15 aminoácidos, que muestran el 50-100% de homología, preferiblemente entre el 70-100% de homología entre ABIN y ABIN2.
"Compuesto" significa cualquier compuesto químico o biológico, que incluye moléculas orgánicas o inorgánicas, simples o complejas, péptidos, peptidomiméticos, proteínas, anticuerpos, carbohidratos o ácidos nucleicos, que interfiere en la unión entre una proteína representada en las SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6 ó 7 con un compuesto de la ruta relacionada con NF-\kappaB, como A20.
Como se usa en este documento, el término "composición" se refiere a cualquier composición, tal como una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo una proteína funcional aislada según la presente invención, posiblemente en presencia de excipientes adecuados conocidos por los expertos y que, de este modo, pueden administrarse en forma de cualquier composición adecuada como se detalla a continuación, por cualquier procedimiento adecuado de administración dentro de los conocimientos de un experto. La ruta preferida de administración es la parenteral. En la administración parenteral, las composiciones de esta invención se formularán en forma de unidad de dosificación inyectable, tal como una solución, suspensión o emulsión, en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos excipientes son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Ejemplos de estos excipientes son la solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. También se pueden usar excipientes no acuosos, tales como aceites fijados y oleato de etilo. Un excipiente preferido es dextrosa al 5% en solución salina. El excipiente puede contener cantidades mínimas de aditivos, tales como sustancias que potencian la isotonicidad y estabilidad química, incluyendo tampones y conservantes.
La proteína funcional aislada de la invención se administra a una concentración que es terapéuticamente eficaz para prevenir el rechazo de aloinjerto, EICH, alergia y enfermedades autoinmunes. La dosificación y modo de administración dependerá del individuo. Generalmente, las composiciones se administran de modo que la proteína funcional aislada se da a una dosis de entre 1 \mug/kg y 10 mg/kg, más preferiblemente entre 10 \mug/kg y 5 mg/kg, lo más preferiblemente entre 0,1 y 2 mg/kg. Preferiblemente, se da como una dosis en forma de bolo. También puede usarse una infusión continua a tiempos cortos (durante 30 minutos). Las composiciones comprenden la proteína funcional aislada según la presente invención se pueden infundir como una dosis entre 5 y 20 \mug/kg/minuto, más preferiblemente entre 7 y 15 \mug/kg/minuto.
Según un caso específico, la "cantidad terapéuticamente eficaz" necesaria de la proteína funcional aislada, según la invención, se debe determinar como la cantidad suficiente para curar al paciente que necesite el tratamiento o al menos para detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado de salud general del paciente. Se pueden necesitar administraciones únicas o múltiples dependiendo de la dosificación y frecuencia según requiera y tolere el paciente.
Con respecto al uso de la proteína funcional aislada de la presente invención para prevenir el rechazo de aloinjerto, debe recalcarse que dichas proteínas de la presente invención o las composiciones que comprenden las mismas, deben administrarse antes, durante o después del trasplante del órgano según se desee para cada caso. En caso de que la proteína o las composiciones que comprenden la misma se administren directamente al hospedador, el tratamiento comenzará preferiblemente en el momento del trasplante y continuará después con el fin de prevenir la activación y diferenciación de las células T del hospedador contra el MHC del aloinjerto. En caso de que el órgano del donante sea perfundido ex vivo con la proteína funcional según la invención o las composiciones que comprenden la misma, el tratamiento ex vivo del órgano del donante comenzará antes del momento del trasplante del órgano con el fin de prevenir la activación y diferenciación de las células T del hospedador contra el MHC del aloinjerto.
La invención se explica con más detalle a continuación por medio de ejemplos sin restringir el alcance de la invención actual.
Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de los inhibidores nuevos
Los nuevos inhibidores de la ruta de NF-\kappaB se aislaron usando un análisis de dos híbridos de levadura, con la proteína A20 como cebo. El ensayo de dos híbridos de levadura se obtuvo de Clontech Laboratories (Palo Alto, CA). La selección de una biblioteca de ADNc de L929r2 con pAS2-A20 se describió previamente (De Valck y col., 1997). Se seleccionaron las colonias de levaduras que expresaban proteínas que interactuaban mediante el crecimiento en medio mínimo sin Triptófano, Leucina ni Histidina, en presencia de 3-amino-1,2,4-triazol 5 mM y mediante la selección de la actividad \beta-galactosidasa. El ADN del plásmido se extrajo a partir de las colonias positivas y los vectores pGAD424 que codifican las proteínas candidatas que interactúaban con A20 se recuperaron mediante la electroporación en la cepa HB101 de E. coli y el crecimiento en medio sin Leucina.
De 1,3 x 10^{6} transformantes, 11 clones expresaban proteínas que interactúan con A20, incluyendo la propia proteína A20 (De Valck y col., 1996) y la proteína 14-3-3 (De Valck y col., 1997). Tres clones contenían fragmentos C-terminales del mismo ADNc que codificaban una proteína desconocida que aquí se denomina "Inhibidor de la unión A20 para activación de NF-\kappaB" (ABIN) y 1 clon que contenía el fragmento C-terminal (1136 pb) de una proteína desconocida que aquí se denomina ABIN2.
Posteriormente, el ADNc de longitud completa de ABIN se aisló a partir de la biblioteca de ADNc de L929r2 mediante hibridación de colonias (De Valck y col., 1996) con un fragmento de ABIN (correspondiente a los aminoácidos 390-599) clonado mediante análisis de dos híbridos como sonda. Se aislaron varios ADNc y, en el ADNc más largo, se identificaron codones de parada en los tres marcos de lectura 5' de una potencial metionina de inicio. Se encontraron dos variantes diferentes de empalme de aproximadamente 2800 y 2600 nucleótidos de largo, con un marco de lectura abierto de 1941 y 1781 nucleótidos, respectivamente, que se iniciaban en dos metioninas diferentes (ABIN (1-647)
(ID SEC Nº 2) y ABIN (54-647) (ID SEC Nº 3)). Estos ADNc codifican proteínas de 72 y 68 kDa que contenían una hélice anfipática con 4 repeticiones consecutivas de una leucina seguida de 6 restos de aminoácidos al azar característicos de una estructura en cremallera de leucina.
El ADNc de longitud completa de ABIN2 se aisló a partir de corazón murino mediante 5' RACE (kit de síntesis SMART PCR cDNA, Clontech), usando un cebador 3' que hibridaba con un clon EST (572231) que se corresponde con el fragmento ABIN2 aislado mediante análisis de dos híbridos, pero con 507 nucleótidos extra en el extremo 5'. Se aisló un ADNc de 1967 nucleótidos de longitud, con un marco de lectura abierto de 1290 nucleótidos de largo, que codifica una proteína de 430 aminoácidos (ID SEC Nº 5).
Ejemplo 2 Patrón de expresión de ABIN y ABIN2
El análisis mediante transferencia de tipo Northern reveló que tanto ABIN como ABIN2 se expresan en todos los tejidos murinos analizados (corazón, cerebro, bazo, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, testículos: véase la Figura 1; sólo se muestran los datos para ABIN). ABIN se presenta como un ARNm de aproximadamente 2800 pb lo cual está de acuerdo con la longitud del ADNc de longitud completa clonado. A diferencia de A20, el ARNm de ABIN se expresa constitutivamente tanto en los subclones sensibles a TNF como en los resistentes a TNF derivados de la línea celular parental L929s, independientemente de la estimulación con TNF.
ABIN2 se presenta como un ARNm de aproximadamente 2000 pb lo cual está de acuerdo con la longitud del ADNc de longitud completa clonado.
Ejemplo 3 Estudio de la interacción de las proteínas y fragmentos proteicos de ABIN y ABIN2 con A20
Las ABIN(1-647) y ABIN(54-647) de longitud completa eran capaces de unirse a A20 en un ensayo de dos híbridos de levadura, confirmando la interacción original encontrada con los 3 fragmentos C-terminales ABIN(390-599), ABIN(249-647) y ABIN(312-647). Éste último contiene el posible motivo de interacción de proteína en cremallera de leucina (397-420).
Se realizaron análisis adicionales mediante coinmunoprecipitación. Los plásmidos eucarióticos para ABIN y sus fragmentos, así como para ABIN2, se hicieron insertando en marco el correspondiente fragmento de PCR con una etiqueta-E en el extremo N-terminal del plásmido de expresión de mamíferos pCAGGS (Niwa y col., 1991). También se clonaron en pCAGGS el ADNc que codifica la GFP(S65T) mutante y una proteína de fusión de GFP(S65T) con A20 murina.
Se pusieron 2 x 10^{6} células de riñones embrionarios humanos 293T en placas de Petri de 10 cm y se transfectaron de forma transitoria con los plásmidos adecuados mediante coprecipitación de ADN con fosfato cálcico. Veinticuatros horas después de la transfección, las células se lisaron en 500 \mul de tampón de lisis (Hepes 50 mM pH 7,6, NaCl 250 mM, Nonidet P-40 al 0,1% y EDTA 5 mM). Los lisados se incubaron con 5 \mul de anticuerpo de conejo anti-GFP (Clontech) y los complejos inmunes se inmovilizaron en proteína A-trisacril (Pierce). Ésta última se lavó dos veces con tampón de lisis y dos veces con tampón de lisis que contenía NaCl 1 M. Las proteínas coprecipitadas se separaron en SDS-PAGE y se revelaron por inmunotransferencia con un anticuerpo de ratón anti-etiqueta-E (Pharmacia).
La ABIN de longitud completa, así como el fragmento C-terminal carente del motivo en cremallera de leucina (ABIN(420-647)), seguía siendo capaz de coinmunoprecipitar con A20 en células 293T que se transfectaron de forma transitoria con un plásmido de expresión para la proteína quimérica GFP-A20 y ABIN de longitud completa o truncada con una etiqueta-E en el extremo N-terminal (Figura 2). La interacción de ABIN con A20 requería la parte de A20 que contenía el dedo de cinc del extremo C-terminal (A20(369-775)). Previamente, se demostró que este dominio era necesario para la dimerización de A20 y para la interacción de A20 con la proteína 14-3-3 (De Valck y col., 1996; De Valck y col., 1997). Por el contrario, se demostró previamente que la parte N-terminal de la A20 humana (A20(1-386)) interactúaba con TRAF2 (Song y col., 1996), sugiriendo que A20 actúa como una proteína adaptadora entre TRAF2 y ABIN. La interacción entre A20 y ABIN no estaba afectada por la estimulación con TNF.
Para caracterizar la distribución subcelular de ABIN, se transfectó de forma transitoria el ADNc de GFP-A20 y ABIN con la etiqueta-E en células 293T y se analizó su expresión por medio de la fluorescencia de GFP y por inmunofluorescencia a través del anticuerpo anti-etiqueta-E. Se sembraron 4 x 10^{5} células 293T sobre cubreobjetos en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 1 \mug de ADN plasmídico. Las células se fijaron sobre los cubreobjetos con paraformaldehido al 3%, 24 horas después de la transfección. Tras la permeabilización con Tritón X-100 al 1%, las células se incubaron durante 2 horas con un anticuerpo de ratón anti-etiqueta-E (1/1000) seguido de una segunda incubación con un anticuerpo anti-Ig de ratón conjugado con biotina (Amersham, 1/1000). Tras la consiguiente incubación con estreptavidina conjugada con Rojo Texas (Amersham), se pudo analizar la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia (Zeiss, Axiophot) usando un juego de filtros con excitación a 543 nm y emisión a 600 nm. En las mismas células, se pudo detectar la fluorescencia de GFP a una longitud de onda diferente, concretamente, absorción a 485 nm y emisión a 510 nm.
La ABIN colocalizaba con A20 en todo el citoplasma, tanto en células no estimuladas como estimuladas con TNF. Esta observación hace improbable la existencia de sucesos de redistribución reguladores.
Ejemplo 4 Análisis de la secuencia de los ADNc
El análisis de la secuencia de nucleótidos se realizó usando secuenciación cíclica en un secuenciador AB1373A (Applied Biosystems, Foster City, CA). La secuencia de ABIN de longitud completa se muestra en la ID SEC Nº 1; la secuencia de ABIN2 se muestra en la ID SEC Nº 4.
Las búsquedas de similitudes en la base de datos (BLAST) demostraron que ABIN es el homólogo murino del ADNc humano parcial que codifica una proteína con una función desconocida (número de acceso del Genbank D30755; Nagase y col., 1995). Además, la ABIN mostró homología con una proteína que interactúa parcialmente con Nef del virus de inmunodeficiencia humano (VIH), NIP40-1 (no la denominada Naf1=factor asociado a Nef 1; Fukushi y col., FEBS Letters, 442 (1999), 83-88). VIH-Nef contribuye sustancialmente a la patogénesis de la enfermedad aumentando la replicación viral y alterando notablemente la función de células T. De forma interesante, el efecto de Nef sobre la activación de células hospedadoras se ha explicado en parte por su interacción con proteínas celulares específicas implicadas en la transducción de señales (Harris, 1996) de lo que ABIN puede ser un
ejemplo.
No hay proteínas en la base de datos que sean claramente homólogas con ABIN2. Sin embargo, comparando ABIN2 con ABIN, se pueden definir dos regiones homólogas y derivar dos secuencias consenso (Figura 3, ID SEC Nº 6 y 7) que pueden ser importantes para la interacción de estas proteínas con A20, y/o para su función adicional en la transducción de señales.
Ejemplo 5 Papel de ABIN, fragmentos de ABIN y/o ABIN2 en la ruta de transducción inducida por TNF, IL-1 y/o TPA que conduce a la activación de NF-\kappaB, medido por la actividad del gen indicador
La construcción de los plásmidos de ABIN, fragmentos de ABIN y ABIN2 se realizó como se describe anteriormente. El plásmido pNFconluc, que codifica un gen indicador luciferasa dirigido por un promotor sensible a la mínima concentración de NF-\kappaB descrito por Kimura y col. (1986) y el plásmido pUT651, que codifica la \beta-galactosidasa, se obtuvieron de Eurogentec (Seraing, Bélgica). La actividad NF-\kappaB se determinó por la expresión dependiente de NF-\kappaB de un gen indicador luciferasa. Por tanto, las células 293T se sembraron en placas de 6 pocillos a 4 x 10^{5} células por pocillo y se transfectaron de forma transitoria por el procedimiento de coprecipitación de ADN con fosfato cálcico. Cada transfección contenía 800 ng de los plásmidos de expresión, así como 100 ng del plásmido pNFconluc como indicador y 100 ng del plásmido pUT651 como referencia de la eficacia de transfección. Veinticuatro horas después de la transfección, estas células se tripsinizaron y se sembraron en una placa de 24
pocillos.
Veinticuatro horas más tarde, las células se estimularon con hTNF a 1000 UI/ml, mIL1-\beta \alpha 20 ng/ml o TPA a 200 ng/ml (Sigma), o se dejaron sin tratar. Después de 6 horas de estimulación, las células se lisaron en 200 \mul de tampón de lisis y se analizaron las actividades luciferasa y \beta-galactosidasa como se describe en De Valck y col., 1997. GFP y GFP-A20 sirvieron como controles negativo y positivo, respectivamente.
De forma similar a A20, ambas variantes de empalme de ABIN eran capaces de bloquear en estas células la activación de NF-\kappaB inducida por TNF o IL-1, siendo ligeramente más eficaz la isoforma más corta con el extremo N-terminal truncado (Figura 4A). Además, el análisis de la estructura-función de mutantes de deleción de ABIN reveló que la actividad inhibidora de NF-\kappaB reside en los 228 aminoácidos C-terminales (ABIN(420-647)) que también son suficientes para la interacción con A20. Este último mutante ABIN ya no contenía la estructura en cremallera de leucina, que demuestra que este dominio proteico no está implicado en la interacción con A20 ni en la inhibición de NF-\kappaB (Figura 4A). La sobreexpresión de una combinación de dosis subóptimas de A20 y ABIN, que por sí mismas no eran suficientes para inhibir la activación de NF-\kappaB, disminuía considerablemente la activación de NF-\kappaB tras la estimulación con TNF (Figura 4B) o con IL-1. Esto sugiere que ABIN media en el efecto inhibidor de A20 sobre
NF-\kappaB.
La ABIN completa (1-647; ID SEC Nº 2), la variante de empalme más corta (54-647; ID SEC Nº 3) y el fragmento C-terminal (390-647) son también capaces de bloquear la activación de NF-\kappaB inducida por TPA (Figura 5).
Se obtuvieron resultados similares cuando en los ensayos se usó ABIN2 en lugar de ABIN o de fragmentos de ABIN (Figura 6).
Ejemplo 6 Efecto de ABIN y/o de fragmentos de ABIN en la activación de NF-\kappaB inducida por la sobreexpresión de TRADD, RIP, TRAF2, NIK o p65
Se construyeron vectores de expresión para ABIN y fragmentos de ABIN como se describe anteriormente. Los vectores de expresión que contienen TRAF2, NIK y p65 se han descrito previamente ((Malinin y col., 1997; Rothe y col., 1994; Vanden Berghe y col., 1998). Los fragmentos de PCR que codifican TRADD y RIP se clonaron en pCDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en marco con una etiqueta-E del extremo C-terminal. La transfección y el ensayo del indicador se realizaron como se describe anteriormente.
NF-\kappaB puede activarse en células 293T por el tratamiento con TNF, así como por la sobreexpresión de proteínas específicas del complejo TNF-receptor, que incluyen TRADD, RIP, TRAF2 y NIK (Rothe y col., 1995; Malinin y col., 1997; Hsu y col., 1995; Ting y col., 1996). Este último se asocia con el complejo IkB quinasa y lo activa, lo que lleva a la fosforilación de IkB. Esto es una señal para la ubiquitinación y degradación de IkB, liberando de este modo el NF-\kappaB que a continuación se transloca al núcleo. La cotransfección de los plásmidos de expresión que codifican estas proteínas asociadas a TNF-receptor junto con los plásmidos de expresión que codifican ABIN de longitud completa demostró que esta última inhibía completamente la activación de NF-\kappaB inducida por TRADD o por RIP, e inhibía parcialmente la activación de NF-\kappaB inducida por TRAF2. Por el contrario, no se observaron diferencias claras cuando se indujo por NIK la expresión del gen indicador dependiente de NF-\kappaB o más directamente por la sobreexpresión de la subunidad p65 de NF-\kappaB (Figura 7). Estos resultados sugieren que ABIN inhibe la activación de NF-\kappaB inducida por TNF a un nivel que precede las etapas de activación de la NIK-IkB quinasa, por ejemplo, a nivel de TRAF2 en el complejo TNF-receptor.
Como los miembros de la familia TRAF median en la activación de NF-\kappaB mediante otros estímulos, que incluyen IL-1, linfotoxina \beta, CD30 y CD40 (Rothe y col., 1995; Cao y col., 1996; Nakano y col., 1996; Aizawa y col., 1997; Ishada y col., 1996), ABIN podría tener el potencial para inhibir la activación de NF-\kappaB en respuesta a una amplia gama de inductores. Por tanto, es probable que los fármacos que mimetizan la actividad de ABIN tengan valor terapéutico en enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas, así como en cáncer y SIDA.
Ejemplo 7 Transfección celular, coinmunoprecipitación e inmunotransferencia
Se sembraron 2 x 10^{6} células de riñón embrionario humano 239T en placas de Petri de 10 cm y se transfectaron de forma transitoria mediante coprecipitación de ADN con fosfato cálcico. Veinticuatros horas después de la transfección, las células se lisaron en 500 \mul de tampón de lisis (Hepes 50 mM pH 7,6, NaCl 250 mM, Nonidet P-40 al 0,1% y EDTA 5 mM) Los lisados se incubaron con 5 \mul de anticuerpo de conejo anti-GFP (Clontech) y los complejos inmunes se inmovilizaron en proteína A-Trisacril (Pierce). Las proteínas coprecipitadas con NaCl 1M se separaron en SDS-PAGE y se analizaron por inmunotransferencia con un anticuerpo de ratón anti-etiqueta-E (Pharmacia).
Ejemplo 8 Ensayo de gen indicador dependiente de NF-\kappaB
La actividad NF-\kappaB se determinó por la expresión dependiente de NF-\kappaB de un gen indicador luciferasa. Por tanto, las células 293T se sembraron en placas de 6 pocillos a 4 x 10^{5} células por pocillo y se transfectaron de forma transitoria por el procedimiento de coprecipitación de ADN con fosfato cálcico. Cada transfección contenía 800 ng de los plásmidos de expresión específicos, así como 100 ng de plásmido pNFconluc y 100 ng de plásmido pUT651. Veinticuatro horas después de la transfección, estos transfectantes se tripsinizaron y se sembraron en una placa de 24 pocillos. Veinticuatro horas más tarde, las células se estimularon con hTNF a 1000 UI/ml o con IL-1 a 7000 UI/ml, o se dejaron sin tratar. Después de 6 horas de estimulación, las células se lisaron en 200 \mul de tampón de lisis y se analizaron las actividades luciferasa y \beta-galactosidasa. Los valores de luciferasa (luc) se normalizaron con los valores de \beta-galactosidasa (gal) y se representaron como luc/gal.
Ejemplo 9 Mutagénesis específica de sitio
La mutagénesis específica de sitio sobre ABIN se realizó mediante reacciones de PCR solapantes usando cebadores que contenían las mutaciones deseadas. Los cebadores utilizados fueron los cebadores de mutación 5'-GAATAC
CAGGAGGCGCAGATCCAGCGGCTCAATAAAGCTTTGGAGGAGGC-3' (ID SEC Nº 9), 5'-GTTGCTGAAA
GAGGACGTCAAAATCTTTGAAGAGG-3' (ID SEC Nº 10), 5'-GCAGGTAAAAATCTTTGAAGAGAATGCCCA
GAGGGAACG-3' (ID SEC Nº 11) y 5'-GCAGGTAAAAATCTTTGAAGAGCTTCCAGAGGGAACGGAGT GATG
CGCAACGCATGCCCG-3' (ID SEC Nº 12), un cebador sentido localizado en el codon de inicio y dos cebadores complementarios, uno que hibrida en la UTR 3' y otro en la región codificadora. El fragmento XhoI-BstEII de ABIN(54-647) de tipo silvestre en pCAGGS se intercambió con el mismo fragmento de los ADNc de ABIN mutados amplificados por PCR.
Ejemplo 10 La unión de ABIN con A20 no es suficiente para su potencial inhibidor de NF-\kappaB
Un ensayo de dos híbridos con A20 reveló otra nueva proteína que se una a A20 que también era capaz de inhibir la activación de NF-\kappaB tras su sobreexpresión. Las búsquedas en BLAST con esta nueva proteína, denominada ABIN-2, no revelaron homología con ninguna proteína conocida. Sin embargo, en la comparación de la secuencia proteica de ABIN-2 con ABIN, se identificaron dos cajas de 19 (AA 423-441) y 21 (AA 475-495) aminoácidos de longitud con 68% y 67% de homología, respectivamente (Figura 8). Por tanto, se analizó la contribución de estas regiones a la unión con A20 y al efecto inhibidor de NF-\kappaB de ABIN mediante mutagénesis dirigida a sitio de varios aminoácidos conservados (Figura 8A). El análisis por coinmunoprecipitación después de la sobreexpresión transitoria de GFP o de GFP/A20 junto con ABIN de tipo silvestre, o sus mutantes específicos de sitio (ABIN-MUT1, ABIN-MUT2, ABIN-MUT3 y ABIN-MUT4) en células 293T, demostró que todos estos mutantes seguían pudiendo unirse a A20 (Figura 8B). Por otro lado, los puntos de mutación en la segunda caja (ABIN-MUT2, ABIN-MUT3 y ABIN-MUT4) suprimía completamente la capacidad de ABIN para bloquear la activación de NF-\kappaB tras la estimulación de células 293T con TNF, aún cuando se transfectaron cantidades más elevadas de estos plásmidos de expresión. Por el contrario, la mutación en la primera caja (ABIN-MUT1) sólo disminuía ligeramente el efecto inhibidor de NF-\kappaB de ABIN (Figura 8C). Además, los puntos de mutación en el segundo motivo conservado interfería de forma dominante con el efecto inhibidor de NF-\kappaB de ABIN de tipo silvestre (Figura 8D). ABIN-MUT2 y ABIN-MUT3 muestran una función más potente como mutantes negativos dominantes de ABIN, comparado con ABIN-MUT4. En estos ensayos, se obtuvieron niveles de expresión comparables de los diferentes mutantes y del ABIN de tipo silvestre a juzgar por el análisis por inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-etiqueta-E. Estos resultados sugieren que la segunda región conservada está implicada en los efectos inhibidores de NF-\kappaB de ABIN y que la unión de ABIN con A20 como tal no es suficiente para inhibir la activación de NF-\kappaB.
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<110> VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUT VOOR BIOTECHNOL
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<120> NUEVOS INHIBIDORES DE LA ACTIVACIÓN DE NF-kappaB
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<130> V1-002-V017
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<140> PCT/BE99/00055
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<141> 05/05/1999
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<150> 98201472.2
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<151> 06/05/1998
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<160> 16
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 2812
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (117)..(2060)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (276)..(2060)
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<220>
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<221> intrón
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<222> (81)..(252)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 628
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<212> PROT
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<400> 2
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<211> 1967
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (83)..(1375)
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 411
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<212> PROT
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<213> Mus musculus 
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 19
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<212> PROT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos consenso 1
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<400> 6
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\sa{Glu Xaa Xaa Xaa Lys Glu Ile Xaa Arg Leu Asn Xaa Xaa Leu Glu Glu}
\sac{Xaa Xaa Ser}
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<210> 7
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<211> 21
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<212> PROT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos consenso 2
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<400> 7
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\sa{Leu Xaa Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Phe Xaa Xaa Glu Arg}
\sac{Xaa Asp Arg Glu Arg}
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<210> 8
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<211> 228
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<212> PROT
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<213> Mus musculus 
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 50
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de mutación
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskip
gaataccagg aggcgcagat ccagcggctc aataaagctt tggaggaggc 
\hfill
50 
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<210> 10
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de mutación
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskip
gttgctgaaa gaggacgtca aaatctttga agagg 
\hfill
35 
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<210> 11
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de mutación
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcaggtaaaa atctttgaag agaatgccca gagggaacg 
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39 
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<210> 12
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<211> 62
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de mutación
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<400> 12
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gcaggtaaaa atctttgaag aggacttcca gagggaacgg agtgatgcgc aacgcatgcc 
\hfill
60 
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\hskip-.1em\dddseqskip
cg 
\hfill
62 
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<210> 13
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<211> 19
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<212> PROT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: mutante ABIN-MUT1
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<400> 13
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\sa{Glu Tyr Gln Glu Ala Gln Ile Gln Arg Leu Asn Lys Ala Leu Glu Glu}
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<210> 14
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<211> 21
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<212> PROT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: mutante ABIN-MUT2
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<400> 14
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\sa{Leu Lys Glu Glu Val Lys Ile Phe Glu Glu Asp Phe Gln Arg Glu Arg}
\sac{Ser Asp Arg Glu Arg}
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<210> 15
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<211> 21
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<212> PROT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: mutante ABIN-MUT3
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<400> 15
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\sa{Leu Lys Gln Gln Val Lys Ile Phe Glu Glu Asn Ala Gln Arg Glu Arg}
\sac{Ser Asp Arg Glu Arg}
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<210> 16
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<211> 21
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<212> PROT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia: mutante ABIN-MUT4
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<400> 16
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\sa{Leu Lys Gln Gln Val Lys Ile Phe Glu Glu Asp Phe Gln Arg Glu Arg}
\sac{Ser Asp Ala Gln Arg}

Claims (16)

1. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2, que es capaz de interactuar con la proteína A20 y/o modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB, y que no es el factor 1 asociado a Nef.
2. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con los aminoácidos 54-647 de la SEQ ID NO: 2, como se representa en la SEQ ID NO: 3, que es capaz de interactuar con la proteína A20 y/o modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB.
3. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con los aminoácidos 420-647 de la SEQ ID NO: 2, como se representa en la SEQ ID NO: 8, que es capaz de interactuar con la proteína A20 y/o modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB.
4. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos con el 70-100% de homología con la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 5, que es capaz de interactuar con la proteína A20 y/o modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB.
5. Una proteína aislada según las reivindicaciones 1-4 que comprende la secuencia de aminoácidos consenso descrita en la SEQ ID NO: 6 y/o en la SEQ ID NO: 7.
6. Un ácido nucleico que codifica una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Un ácido nucleico según la reivindicación 6 con aproximadamente el 70-100% de homología con la secuencia de ADN representada en la SEQ ID NO: 1.
8. Un ácido nucleico según la reivindicación 6 con aproximadamente el 70-100% de homología con la secuencia de ADN representada en la SEQ ID NO: 4.
9. Una proteína aislada y/o un fragmento de la misma capaz de interactuar con la proteína A20 y/o modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso como un medicamento.
10. Uso de una proteína aislada y/o un fragmento de la misma capaz de interactuar con la proteína A20 y/o modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno respiratorio, rechazo del aloinjerto, una enfermedad inflamatoria crónica, choque séptico, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, cáncer y/o una enfermedad autoinmune.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicho trastorno respiratorio es el síndrome de dificultad respiratoria adulta, en el que dicha enfermedad inflamatoria crónica es artritis reumatoide, asma o enfermedad intestinal inflamatoria, y en el que dicha enfermedad autoinmune es lupus eritematoso sistémico.
12. Uso de una proteína funcional aislada y/o un fragmento de la misma capaz de interactuar con la proteína A20 y modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB según cualquiera de las reivindicaciones 10-11 en el que la proteína al menos comprende los aminoácidos 54-647, preferiblemente 390-647, de la SEQ ID NO: 2.
13. Uso de una proteína funcional y/o un fragmento de la misma, capaz de interactuar con la proteína A20 y/o modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB según la reivindicación 12, en el que la proteína comprende al menos los aminoácidos 420-647 de la SEQ ID NO: 2.
14. Uso de una proteína funcional según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y/o un fragmento de la misma capaz de interactuar con la proteína A20 y/o modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB para seleccionar compuestos que interfieren con la interacción de dicha proteína o proteínas con otros compuestos proteicos de la ruta relacionada con NF-\kappaB.
15. Un método de selección de compuestos que comprende el uso de una proteína según la reivindicación 14.
16. Una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas funcionales aisladas según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y/o fragmentos de las mismas, capaz de interactuar con la proteína A20 y modular y/o inhibir la activación de NF-\kappaB y un material vehículo farmacéuticamente aceptable.
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