JP2006507817A - 細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子の存在および/またはレベルを決定するための遺伝子レポーターアッセイ、キット、および細胞 - Google Patents
細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子の存在および/またはレベルを決定するための遺伝子レポーターアッセイ、キット、および細胞 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2002年10月4日に出願された米国仮特許第60/415,818号の優先権を主張し、その内容の全体が参照として本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子のサンプル中の存在および/またはレベルを決定するための遺伝子レポーターアッセイおよびキットに関する。本発明は、更に該アッセイで用いることができる細胞および該細胞を調製するための方法に関する。
細胞表面タンパク質により細胞外シグナルの細胞内伝達が可能になる。細胞表面タンパク質は真核および原核細胞に細胞外シグナルを検出し、そして最終的に細胞応答または協調する組織もしくは器官応答に至る様式で細胞内にこのようなシグナルを伝達するための手段を細胞に提供する。細胞表面タンパク質は、特異的細胞内経路を介して細胞外環境に関する情報を細胞内伝達することにより特定の刺激に対する適切な応答を誘起する。応答は即時的および一過性であり、緩慢でおよび持続性であり、またはその混合型でもよい。多様な膜表面タンパク質の配置のために、真核細胞はその環境に対して極めて鋭敏である
細胞表面局在レセプターは、細胞外シグナリング分子に結合するか、または細胞外環境を変化させ、そしてシグナル伝達経路を介してシグナルを伝達して細胞応答を起こす膜貫通タンパク質である。多くの細胞内経路の誘導の開始工程として、細胞表面レセプターは循環シグナル分子、例えばサイトカイン、成長因子、およびホルモン等に結合する。レセプターは、構造基盤で、または誘導される経路の特定の型に基づいて分類される。これらのレセプターのクラスの中で、サイトカインレセプターのクラスには成長因子に結合し、そして固有のチロシンキナーゼ活性を有するもの、例えばヘパリン結合成長因子(HBGF)レセプター、免疫グロブリンレセプタースーパーファミリー、ヘマトポエチン/サイトカインレセプタースーパーファミリー、神経成長因子レセプタースーパーファミリー、その他のレセプターチロシンまたはセリンキナーゼおよび、各々Gタンパク質結合レセプターおよびGタンパク質と称されるグアニンヌクレオチド結合制御タンパク質を介してエフェクタータンパク質に結合するものなどがある。
ヒトインターフェロン(IFN)は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列相同性に基づいて4つの異なる種:α、β、γ、およびωからなる相同ならせん状のサイトカインのファミリーである。I型IFN、α、β、およびωは、少なくとも12個の機能的なIFNα遺伝子、IFNω遺伝子、および更に遠縁のIFNβ遺伝子によりコードされる。II型IFNまたはIFNγは、非関連遺伝子によりコードされ、そして異なる細胞表面レセプター)に結合する(De Maeyerら(1988); Pestkaら、(1987); およびDiazら(1993)。
Gタンパク質膜貫通シグナリング経路は、3つのタンパク質:レセプター、Gタンパク質およびエフェクターからなる。Gタンパク質は、膜貫通シグナリング経路の中間物質であり、ヘテロ二量体であり、そしてα、β、およびγサブユニットからなる。Gタンパク質のファミリーの膜の中で、αサブユニットは異なっている。Gタンパク質の機能は、αサブユニットとGTPのサイクルとの関係により制御され、続いてGTPがGDPに加水分解され、そしてGDPが解離する。
ポリペプチド成長因子は、その生物学的機能が成長因子と細胞表面レセプターとの相互作用および続く遺伝子発現における変化により媒介される、細胞増殖および分化のモデュレーターである。成長因子は、特定のレセプターに結合し、そしてチロシンリン酸化およびc−fos mRNA合成を誘起するようである。加えて、少なくともいくつかの成長因子、例えば血小板誘導成長因子(Yehら(1987))およびヘパリン結合成長因子−2または塩基性線維芽細胞成長因子(Boucheら(1987))は核へ移行する。
先で論じたように、c−fos遺伝子の発現の誘導は、種々の細胞表面タンパク質の活性により開始される多くの応答経路に共通な事象である。
本発明の目的は、所望の細胞系を、意図される目的のために十分長い寿命を有する実質的に「1回使用」用の商業用細胞系にし、そして使用者がこの商業用細胞系を例えばアッセイにおいて使用するときはいつも、この使用者はこの商業用細胞系を供給者から購入しなければならないようにする方法を開発することである。
したがって、本発明は、レポーター遺伝子生成物の発現が、細胞外シグナルに応答して細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性により制御される、レポーター遺伝子構築物で形質転換された細胞を提供する。この本発明による細胞は、凍結温度を越える温度ではその能力を喪失する前にシグナル伝達活性を少なくとも約1時間維持するが、約30日を超えないように処理されている。このような処理された細胞は、細胞をある状態に維持することにより、または細胞分割を阻止することにより、その目的のために十分長い寿命を有する商業用の利点を獲得しており、その有用な寿命の終わりに、またはその使用の終わりにはすぐに、細胞は、例えばアポトーシスにより細胞死を起こす。
1)FBSの濃度。例えば解凍中または抗有糸分裂およびプロアポトーシス剤での処理の間、細胞を毒素から保護するための毒素吸収系として作用するので、FBSに加えて、大抵いずれの血清を用いることもできる。FBSの濃度が結果を変動させる可能性がある;
2)時間は可変である。細胞を遠心し、そして洗浄してビンブラスチンを除去する前のビンブラスチンへの暴露時間;
3)ビンブラスチンの処方は差異を生み出す。現在、Eli LllyによりVelbeのいう名称でフランスにおいて専売されている予め緩衝化された処方の可溶性ビンブラスチンを用いるのが好ましい。異なる処方は、わずかに異なるパラメーターの組み合わせが必要かもしれない;
4)ビンブラスチンの濃度;
5)ビンブラスチン処理の間の細胞濃度;
6)凍結保存剤の量または凍結保存剤の組み合わせ;
などがある。
処理されたPIL5細胞を用いるI型インターフェロンに対するルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイのプロトコール
マイクロタイターアッセイプレートの調製
1.10% ウシ胎児血清(FBS)含有RPMI 1640培地中約2×105〜7×105セル/mlの濃度でPIL5細胞を水中1mg/mlから希釈した1μg/ml ビンブラスチン(Eli Lllyより予め緩衝化された処方VELBEとして市販)の新鮮溶液で37℃で10分間、空気中5% CO2の環境下で処理する。便宜的にCO2インキュベーターを使用することができる。
2.PIL5細胞を800×gで、4℃で10分間遠心し、そして同一容量の10% FBS含有RPMI 1640培地で1回洗浄してビンブラスチンを除去する。
3.PIL5細胞を2×107セル/mlの濃度で40% ウシ胎児血清(FBS)および2.5% ジメチルスルホキシド+10% グリセロール含有RPMI 1640培地に再懸濁する。
4.細胞懸濁液を平底マイクロタイタープレートのウェルに分注してウェルあたり300,000セルにする(ウェルあたり細胞懸濁液25μlに等価)。
5.マイクロプレートを−80℃で凍結し、真空下、最上部カバーを用いてシールした。
6.続いてマイクロプレートを用時まで−20℃で保存することができる。
凍結保存アンプル/バイアルの調製
1.10% ウシ胎児血清(FBS)含有RPMI 1640培地中PIL5細胞を約2×105〜7×105セル/mlの濃度で水中1mg/mlから希釈した1μg/ml ビンブラスチン(Eli Lllyより予め緩衝化された処方VELBEとして市販)の新鮮溶液で37℃で10分間、空気中5% CO2の環境下で処理する。便宜的にCO2インキュベーターを使用することができる。
2.PIL5細胞を80×gで、4℃で10分間遠心し、そして同一容量の10% FBS含有RPMI 1640培地で1回洗浄してビンブラスチンを除去する。
3.PIL5細胞を2×107セル/mlの濃度で40% ウシ胎児血清(FBS)および2.5% ジメチルスルホキシド+10% グリセロール含有RPMI 1640培地に再懸濁する。
4.細胞懸濁液(1ml)を凍結保存バイアルに分注して−80%で凍結する。
5.続いて凍結保存バイアルを用時まで−20℃で保存することができる。
アッセイ手順
標準曲線の調製
1.サンプル調製物マイクロプレート(プレートA)から保護カバーを取り除く。
2.希釈物(血清不含RPMI 1640)100μlをサンプル調製物プレート(プレートA)のウェルA1〜A6およびB1〜B6に加える。
3.インターフェロン(IFN)参照調製物100μlを希釈物100μlの入ったプレートAのウェルのA1およびB1に加える。
4.マルチチャネルマイクロピペットを用いて、プレートAのウェルA1およびB1〜A6およびB6でIFN参照調製物の連続2倍希釈を行う。
サンプル調製
1.必要な場合、サンプル調製物プレート(プレートA)のウェルに希釈物100μlを加える。
2.サンプルの推定されるIFN力価が100 IU/ml以上である場合、希釈サンプルを試験すべきである。
3.サンプル調製物マイクロプレート(プレートA)のサンプルを適切に希釈する
アッセイ手順
1.最上部カバーを有する平らな表面で96ウェルPIL5アッセイマイクロプレート(プレートB)を急速に解凍する。便宜的に37℃の水浴設定を用いることができる。
2.最上部ラベルをそのままにするように注意して、保護カバーをハンドタオルペーパーで乾燥する。
3.PIL5アッセイマイクロプレート(プレートB)から保護カバーを注意深く取り外すが、最上部カバーはそのままにする。
4.マルチチャネルマイクロピペットを用いて、参照調製物の連続2倍希釈の各75μlをPIL5アッセイマイクロプレート(プレートB)のウェルA1およびB1からA6およびB6に加える。
5.希釈していない、または適切に希釈したサンプル各75μlをPILアッセイマイクロプレート(プレートA)に加える。
6.PIL5アッセイマイクロプレート(プレートB)を37℃で一晩、空気中5% CO2の環境下でインキュベートする。便宜的にCO2インキュベーターを使用することができる。
7.マルチチャネルマイクロピペットを用いて、LUCIT PLUS(Packard Biosciences,Inc.、現在は、PerkinElmer Life Sciences,Boston,マサチューセッツ州に統合されている、カタログ番号#6016961)100μlをPIL5アッセイマイクロプレート(プレートB)の各ウェルに加える。
8.マイクロプレート・ルミノメーター(LUMICOUNT,Packard)を用いてサンプルの発光を測定する。
国際単位の計算
1.マイクロソフト(登録商標)・エクセルを用いてHuIFN−α(G−023−901−527)のNIH国際標準品IFN参照調製物の各希釈物に対する発光の読みの平均から標準曲線をプロットする。
2.標準曲線を表す方程式は、エクセル関数「曲線の補間」を用い、オプション「指数曲線」を用いて得られる。次いでこの方程式を用いて国際単位(IU)で表される各サンプルのIFN力価を計算する。
提供する。この商品化方法は、凍結温度以上で30日を越えずに細胞が、所望の生物学的活性を維持するように細胞を処理すること、そして次に処理された細胞を、解凍後に必要とされる生物学的活性を再開するような温度および条件下で凍結することに関係する。限定された時間利用可能であるが、多重使用のために増殖および無期限に維持することはできない凍結されて処理された細胞は、続いて販売されるかまたは分注される。処理された細胞が、凍結温度を越える温度で所望の生物学的活性を少なくとも8時間維持するが約30日を越えないような十分な量および十分な時間細胞を抗有糸分裂およびプロアポトーシス剤で処理するのが好ましい。細胞が凍結する温度が約−80℃であり、そして凍結に先立って、細胞を、凍結保存剤、好ましくは2.5% DMSO+10% グリセロールを含有する40% FBS含有RPMI 1640培地に再懸濁するのが好ましい。
PIL5細胞を漸増量のγ線照射(0.32〜25Gy)に付し、そして次に、その後種々の時間でI型インターフェロンの漸増量を検出するその能力に関して試験した。予備実験の結果により、0.32〜12Gyまでのγ線照射の4日後まで37℃でインキュベーションした場合、PIL5細胞は完全なIFN活性を保持し(図4)、そして6〜25 Gyまでのγ線照射に暴露された細胞集団の100%でアポトーシスが誘起される(図3)ことが示された。したがって、これらの結果により適用された実験アプローチが確認され、そして細胞を6〜12Gyの範囲内のγ線分割照射に暴露することによりPIL5遺伝子レポーターアッセイの可能性のある寿命が4日を越えて有意に延長されるが、細胞集団の100%(または6Gyでほぼ100%)アポトーシスが誘起されることが示唆された(図5および表3)。
PIL5細胞を実際に、6Gyのγ線照射に暴露後、10% ウシ胎児血清含有RPMI 1640培地中、室温で13日まで保存でき、そして依然完全なIFN感受性を保持することが一連の実験の結果により確立された(図6)。ルシフェラーゼ活性を検定する前に、PIL5細胞を続いて被験サンプルまたはIFN標準物質と共に37℃でインキュベートすることが条件である。対照的に、10% ウシ胎児血清含有RPMI 1640培地中4℃でPIL5細胞をインキュベートし、続いて細胞を6Gyのγ線照射に暴露することにより細胞死を誘起したことが予想外に見出された。これは4℃で8日間だけインキュベートした後に、IFN感受性の著明な喪失を招いた(図7)。
更なる一連の実験では、そのシグナリングがγ線照射によるアポトーシスの誘起に対抗することが既知である血清成長因子への細胞の暴露を変調させるために培養培地の血清含量を1〜10%の間で変動させた。これらの実験の結果により、PIL5細胞を1% ウシ胎児血清(図8でFBSとして示す)含有培養培地中でインキュベートする場合、10% 血清含有培養培地中よりもPIL5細胞におけるアポトーシスの誘起が更に迅速であることが示された(図8)。更に、10〜20%までの血清濃度の上昇は細胞生存性には有意に影響しなかった。
このPIL5 IFN遺伝子レポーターアッセイの感受性は、単純にアッセイに用いるPIL5細胞数を増やすことにより有意に上昇させることができると予測された。このようなPIL5遺伝子レポーターアッセイの超高感度(SHS)版には、生物学的液体、例えば脳脊髄液中の非常に低レベルのIFNを決定するための広範な適用が見出される。したがって、10% ウシ胎児血清含有培養培地中室温で、0.1〜1.0×106セル/mlの濃度でPIL5細胞をインキュベートした後、6Gyのγ線照射に暴露し、そして次に、その後種々の時間でIFNαの漸増量を検出するその能力に関して試験した。これらの実験の結果により、インターフェロン感受性は実際に最初は増加したが、高細胞密度でのPIL5細胞のインキュベーションにより、0.1×106セル/mlの濃度におけるよりも更に急速に、最も好ましくは培養培地中の成長因子の枯渇または毒性代謝物の生成のために、細胞死が誘起されることが示された(図9)。
PIL5 IFNアッセイの寿命を延長させる試みにおいて、PIL5細胞を6Gyのγ線照射に付し、そして次に、アポトーシスの誘起を変調させるために漸増濃度(0、0.1、1.0、10、および100μM)のアウリントリカルボン酸またはフェニルアルシンで処理した。次いで、その後(0、5、10、15、20日等)様々な時間でIFN感受性に関して細胞を試験した。
10% ウシ胎児血清(FBS)含有RPMI 1640培地中、2×106セル/mlの濃度でPIL5細胞を懸濁し、そして100μM ビンブラスチンの存在下、37℃で1.0時間インキュベートした。次いで細胞を800xgで10分間遠心し、同一容量の10% FBS含有RPMI 1640培地で1回洗浄してビンブラスチンを除去し、そして40% ウシ胎児血清、10% グリセロールおよび2.5% ジメチルスルホキシド(DMSO)含有RPMI 1640培地に再懸濁した。次いで細胞懸濁液(25μlの容量中105セル)をマイクロタイタープレート(CulturePlate-96、Packard Biosciences, Inc.、現在はPerkinElmer Life Sciences, Boston、マサチューセッツ州に統合されている)のウェルに分注し、そして用時まで−20℃で保存した。次いで凍結細胞の入ったマイクロタイタープレートを−20℃のフリーザーから取り出し、好ましくは事前に37℃に設定された水浴を用いて急速に解凍し、そして試験されるサンプル75μl、または血清不含のIFN標準物質、または血清不含の陰性対照サンプルをマイクロタイタープレートのウェルに添加し、そして37℃で一晩インキュベートした。LUCLIT PLUS(Packard Biosciences, Inc.、カタログ番号#6016961、米国特許第5,283,179号;第5,641,641号;第5,650,289号;および第5,814,471号)またはルシフェリン(D−(−)−2−(6′−ヒドロキシ−2′−ベンゾチアゾリル)−Δ2−チアゾリン−4−カルボン酸)を含有する類似の試薬100μl、ATP、バッファー、Mg+2、および好ましくはルシフェラーゼの活性を増強するコエンザイムA frおよびルシフェラーゼを安定化するチオール試薬/スルフヒドリル化合物をマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、そしてプレート・リーディング・ルミノメーター(LUMICOUNT、Packard Biosciences, Inc.)でサンプルを読んだ。100μMビンブラスチンでの処理および−20℃での凍結の1か月後、PIL5細胞が、完全なIFN活性を保持することが見出された(図11)。この研究の結果により、IFN感受性を喪失せずに−20℃で少なくとも1か月の一般的な寿命を有する商業用の生存キット形式のPIL5 IFN遺伝子レポーターアッセイの開発のための方法が確立された。
Claims (69)
- 細胞外シグナルに応答して細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性により制御される、1つ以上の転写調節エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むレポーター遺伝子構築物で形質転換された細胞であって、上記シグナル伝達活性を喪失する前に凍結温度を越える温度で上記シグナル伝達活性を少なくとも約1時間維持するが、約30日を超えず維持するように、処理されている細胞。
- 細胞が凍結される実質直前に、前記処理が行われている、凍結状態にある請求項1記載の細胞。
- 前記細胞が、前記シグナル伝達活性を喪失する前に凍結温度を越える温度では前記シグナル伝達活性を少なくとも約1時間維持するが、約30日を超えず維持するように、抗有糸分裂およびプロアポトーシス剤で処理され、そして次に凍結保存剤を含有する溶液中に再懸濁されている、請求項2記載の細胞。
- 前記処理された細胞が、処理され、そして次に凍結保存剤を含有する溶液中に再懸濁された実質的に直後に約−80℃で凍結されている、請求項3記載の細胞。
- 前記凍結保存剤が、ジメチルスルホキシド(DMSO)であり、そして前記溶液が10% DMSOを含有する、請求項4記載の細胞。
- 前記凍結保存剤が、2.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)および10% グリセロールの組み合わせである、請求項4記載の細胞。
- 前記抗有糸分裂およびプロアポトーシス剤が、ビンブラスチンである、請求項3記載の細胞。
- 前記抗有糸分裂およびプロアポトーシス剤が、5−フルオロウラシルである、請求項3記載の細胞。
- 前記細胞が、前記該シグナル伝達活性を喪失する前に凍結温度を越える温度では前記シグナル伝達活性を少なくとも約1時間維持するが、約30日を超えず維持するように、強度および十分な時間γ線で照射されている、請求項1記載の細胞。
- 前記凍結温度を越える温度が、室温である、請求項9記載の細胞。
- γ線の前記強度および時間が、6〜12Gyである、請求項9記載の細胞。
- 前記細胞表面タンパク質が、細胞表面レセプターである、請求項1記載の細胞。
- 前記細胞表面レセプターが、サイトカインレセプター、成長因子レセプター、ホルモンレセプター、神経レセプター、T細胞レセプター、抗原レセプター、および補体レセプターから選択される、請求項12記載の細胞。
- 前記細胞表面レセプターが、I型インターフェロンレセプターであり、そして前記細胞外シグナルが、I型インターフェロンにより提供される、請求項12記載の細胞。
- 前記1つ以上の転写調節エレメントが、インターフェロン刺激応答エレメント(ISRE)を含む、請求項14記載の細胞。
- 前記ISREが、配列番号5のヌクレオチド配列を含む、請求項15記載の細胞。
- 前記細胞表面レセプターが、II型インターフェロンレセプターであり、そして前記細胞外シグナルがII型インターフェロンにより提供される、請求項12記載の細胞。
- 前記1つ以上の転写調節エレメントが、ガンマ活性化配列(GAS)を含む、請求項17記載の細胞。
- 前記細胞表面レセプターが、インターフェロンレセプターであり、そして前記細胞外シグナルが、I型インターフェロンおよび/またはII型インターフェロンにより提供される、請求項12記載の細胞。
- 前記1つ以上の転写調節エレメントが、インターフェロン刺激応答エレメント(ISRE)およびガンマ活性化配列(GAS)を含む、請求項19記載の細胞。
- 前記レポーター遺伝子産物が、ホタルルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、クラゲエクオリン、強化グリーン蛍光タンパク質(EGFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、dsRED、β−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼからなる群より選択される、請求項1記載の細胞。
- 前記レポーター遺伝子産物が、ホタルルシフェラーゼである、請求項1記載の細胞。
- 前記レポーター遺伝子産物が、強化グリーン蛍光タンパク質(EGFP)である、請求項1記載の細胞。
- 前記レポーター遺伝子産物が、クラゲエクオリンである、請求項1記載の細胞。
- 哺乳動物または鳥類細胞である、請求項1記載の細胞。
- ヒト細胞である、請求項25記載の細胞。
- ヒト前単球細胞である、請求項26記載の細胞。
- PIL5細胞である、請求項27記載の細胞。
- 細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子のサンプルのレベルを決定するためのキットであって、
複数のウェルを有する試験装置と;
請求項1記載の複数の細胞を含有する試薬と;
を含むキット。 - 前記試験装置が、マイクロタイタープレートである、請求項29記載のキット。
- 前記試薬が、前記試験装置のウェルに分注されている、請求項29記載のキット。
- 細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子のサンプル中のレベルを決定するためのキットを使用するための指示書のセットを更に含む、請求項29記載のキット。
- 細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子が、I型インターフェロン、II型インターフェロン、または両者である、請求項29記載のキット。
- 細胞外シグナルに応答して細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性により制御される、1つ以上の転写調節エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むレポーター遺伝子構築物で形質転換された凍結細胞であって、実質的に凍結の直前に、細胞死を起こす前に凍結温度を越える温度では上記細胞シグナル伝達活性を少なくとも約1時間維持するが、約30日を超えず維持する、ように処理されている凍結細胞。
- レポーター遺伝子構築物で形質転換され、そして約30日以内にシグナル伝達活性を喪失する細胞を調製するための方法であって、下記:
細胞外シグナルに応答して細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性により制御される、1つ以上の転写調節エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むレポーター遺伝子構築物で細胞を形質転換する工程と;
該シグナル伝達活性を喪失前に凍結温度を越える温度では該シグナル伝達活性を少なくとも約1時間維持するが、約30日を超えず維持するように上記形質転換された細胞を処理する工程と;
を含む方法。 - 該細胞が、哺乳動物または鳥類細胞である、請求項35記載の方法。
- 該細胞が、ヒト細胞である、請求項35記載の方法。
- 該ヒト細胞が、ヒト前単球細胞である、請求項37記載の方法。
- 該細胞表面タンパク質が、細胞表面レセプターである、請求項35記載の方法。
- 該細胞表面レセプターが、I型インターフェロンレセプターであり、そして該細胞外シグナルがI型インターフェロンである、請求項39記載の方法。
- 該レポーター遺伝子生産物が、ホタルルシフェラーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、クラゲエクオリン、強化グリーン蛍光タンパク質(EGFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、dsRED、β−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼからなる群より選択される、請求項35記載の方法。
- 解凍後にシグナル伝達を再開するような温度および条件下で、該処理された細胞を凍結する工程を更に含む、請求項35記載の方法。
- 前記処理する工程が、照射された細胞が凍結温度を越える温度では細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を少なくとも7日間維持するが、約30日を超えず維持し、この期間の後、照射された細胞が即座に細胞死を起こすような強度および十分な時間形質転換された細胞をγ線で照射する工程を含む、請求項35記載の方法。
- 前記照射する工程で、形質転換された細胞を約6〜12Gyのγ線で照射する、請求項43記載の方法。
- 凍結温度を越える温度が、室温である、請求項43記載の方法。
- 細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子のサンプル中の存在および/またはレベルを決定するための方法であって、下記:
請求項43記載の方法にしたがって細胞を調製する工程と;
細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化し、そして細胞外シグナルとして提供される分子の存在および/またはレベルを決定しようとするサンプルと共に調製された細胞をインキュベーションする工程と;
レポーター遺伝子産物の発現のレベルを決定し、それにより細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子のサンプル中の存在および/またはレベルを決定する工程と;
を含む方法。 - 該細胞表面タンパク質が、細胞表面レセプターである、請求項46記載の方法。
- 該細胞表面レセプターが、I型インターフェロンレセプターであり、そして該細胞外シグナルが、I型インターフェロンである、請求項47記載の方法。
- 前記処理する工程が、作用物質で処理した後、処理された細胞が、凍結温度を越える温度では少なくとも1時間細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を維持するが約30日を超えず維持し、その期間の後処理された細胞が即座に細胞死を起こすように、形質転換された細胞を十分な量および十分な時間抗有糸分裂およびプロアポトーシス性の上記作用物質で処理する工程を含む、請求項35記載の方法。
- 解凍後にシグナル伝達を再開するような温度および条件下で、該処理された細胞を凍結する工程を更に含む、請求項49記載の方法。
- 前記凍結する工程を約−20℃〜約−200℃の範囲の温度で実施し、続いて細胞を約−20℃の温度で保存する、請求項50記載の方法。
- 前記凍結する工程を約−80℃の温度で実施する、請求項50記載の方法。
- 前記凍結する工程の前に、凍結保存剤を含有する溶液中に、該処理された細胞を再懸濁する工程を更に含む、請求項50記載の方法。
- 該凍結保存剤が、DMSOおよびグリセロールの組み合わせであり、そして溶液が2.5% DMSOおよび10% グリセロールを含有する、請求項53記載の方法。
- 該溶液が、RPMI培地および40% ウシ胎児血清を含む、請求項53記載の方法。
- 該抗有糸分裂およびプロアポトーシス剤が、ビンブラスチンである、請求項49記載の方法。
- 該抗有糸分裂およびプロアポトーシス剤が、5−フルオロウラシルである、請求項49記載の方法。
- 細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子のサンプル中の存在および/またはレベルを決定するための方法であって、
請求項50記載の方法にしたがって凍結細胞を調製する工程と;
凍結細胞を解凍する工程と;
細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化し、そして細胞外シグナルとして提供される分子の存在および/またはレベルを決定しようとするサンプルと共に解凍した細胞をインキュベートする工程と;
レポーター遺伝子産物の発現のレベルを決定し、それにより細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性を活性化する分子のサンプル中の存在および/またはレベルを決定する工程と;
を含む方法。 - 該細胞表面タンパク質が、細胞表面レセプターである、請求項58記載の方法。
- 該細胞表面レセプターが、I型インターフェロンレセプターであり、そして該細胞外シグナルがI型インターフェロンである、請求項59記載の方法。
- 所望の生物学的活性を有する細胞を商品化するための方法であって、
細胞が凍結温度を越える温度で約30日を越えずに所望の生物学的活性を維持するように細胞を処理する工程と;
解凍後に必要な生物学的活性を再開するような温度および条件下で、該処理された細胞を凍結する工程と;
該凍結され、処理された細胞を販売または流通させ、それにより該細胞が、限定された時間利用可能であるが、多回使用のために無期限に増殖および維持することができない工程と;
を含む方法。 - 前記処理する工程が、凍結温度を越える温度では細胞が所望の生物学的活性を少なくとも8時間維持するが、約30日を越えないように細胞を処理する工程とを含む、請求項61記載の方法。
- 該処理された細胞を、該凍結する工程の前に、凍結保存剤の入った溶液中に懸濁する工程を更に含む、請求項62記載の方法。
- 該凍結保存剤が、DMSOおよびグリセロールの組み合わせであり、そして該溶液が2.5% DMSOおよび10% グリセロールを含有する、請求項63記載の方法。
- 該溶液が、RPMI培地および40% ウシ胎児血清を含む、請求項63記載の方法。
- 前記処理する工程で、細胞を、抗有糸分裂およびプロアポトーシス性である作用物質で、細胞が凍結温度を越える温度では所望の生物学的活性を少なくとも8時間維持するが、約30日を越えず維持するような十分な量および十分な時間処理する、請求項62記載の方法。
- 前記凍結する工程で、温度が約−80℃である、請求項61記載の方法。
- 該抗有糸分裂およびプロアポトーシス剤が、ビンブラスチンである、請求項66記載の方法。
- 該抗有糸分裂およびプロアポトーシス剤が、5−フルオロウラシルである、請求項66記載の方法。
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