FR2885368A1 - Systemes et procedes de regeneration cellulaire et utilisations de telles cellules regenerees - Google Patents

Abstract

Système de régénération génétique de cellules différenciées, comprenant : - au moins une cellule différenciée,- des moyens de reprogrammation cellulaire, comprenant au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG), pouvant être un ovocyte ou une cellule embryonnaire, de préférence d'origine non humaine,- des moyens pour supprimer, de préférence complètement, le noyau de la au moins une CRG,- des moyens pour prélever et transférer le noyau d'une cellule différenciée dans une CRG respective,- des moyens pour extraire de la CRG, le noyau transféré de la cellule différenciée avant la fin de sa première mitose,- des moyens pour introduire le noyau de la cellule différenciée extrait dans une cellule réceptrice différenciée, de préférence souche ou embryonnaire, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue, ladite cellule réceptrice étant alors une cellule régénérée apte à se multiplier, destinée à être positionnée au sein d'un tissu à régénérer génétiquement.

Description

La présente invention concerne un système et des procédés destinés à

régénérer des cellules. Un tel système et de tels procédés sont particulièrement utiles dans le domaine de la thérapie cellulaire, notamment pour la réalisation d'autogreffes à partir de cellules différenciées ou souches.

Les thérapies cellulaires, et en particulier les autogreffes, sont à ce jour pratiquées dans l'optique de réparer un tissu endommagé souffrant d'un déficit cellulaire ou nécrosé (par exemple suite à la prise d'un traitement thérapeutique à effets secondaires ou suite à la survenue d'une maladie). Cette technique consiste généralement à prélever quelques cellules saines du tissu concerné, à mettre en culture de multiplication cellulaire ces cellules afin de constituer un stock ou tissu de cellules et de réimplanter ces cellules dans le tissu à traiter. Ces cellules reprogrammées peuvent permettre alors au tissu concerné de recouvrir ses capacités morphologiques et fonctionnelles d'origine.

Par exemple, cette technique est employée pour la réparation du cartilage articulaire. Le cartilage articulaire présente un potentiel de réparation limité et les lésions d'un certain volume ne cicatrisent que rarement. Afin de réparer de telles lésions et prévenir l'apparition de l'arthrose chez les malades, des chondrocytes, baignant dans une matrice extracellulaire, sont prélevés, débarrassés de la matrice par exemple par digestion enzymatique puis mis en culture, généralement sur des sérums de veau foetal ou de préférence dans du sérum du patient, et dans des matrices tridimensionnelles (par exemple une matrice d'agarose ou de collagène). Une telle mise en culture permet alors aux cellules prélevées de se multiplier par division mitotique et aboutit alors à l'obtention de millions de chondrocytes. Ces chondrocytes peuvent ensuite être réimplantés dans le tissu cartilagineux afin de restaurer les cellules et le cartilage déficitaire.

Toutefois, l'inconvénient de ces techniques de multiplication est que généralement les cellules prélevées sont des cellules ayant déjà subi de nombreuses divisions mitotiques. Or, la culture de cellules pour leur multiplication provoque une diminution légère des télomères à chaque mitose et cette multiplication se fait souvent sur des cellules déjà vieillies, proches de leur fin de vie et de leur fin de fonctions, et dont l'ADN est en outre susceptible d'être altéré. Notamment, il est connu que le vieillissement cellulaire se traduit par un rongement progressif des télomères (extrémité des chromosomes). Or, ces télomères conditionnent le nombre restant de divisions mitotiques. Ainsi, le fait de cultiver des cellules mères ayant déjà subi de nombreuses mitoses peut donner lieu à une importante colonie de cellules filles vieillies et à survie raccourcie pouvant présenter par ailleurs des altérations de fonctionnalité génique.

Le but de la présente invention est de fournir un système et des procédés de thérapies cellulaires surmontant les inconvénients susmentionnés.

En particulier, la présente invention a pour but de fournir un système et des procédés de manipulations cellulaires permettant une production rapide et de masse de cellules saines et régénérées présentant des fonctionnalités géniques capables d'être rajeunies à un degré désiré.

La présente invention a encore pour but de fournir un système et des procédés de traitement cellulaire aboutissant à la fois a une reconstitution d'un tissu autologue manquant et à un rajeunissement génétique du tissu dans lequel les cellules ont été implantées.

Selon un premier aspect, la présente invention a donc pour objet un système de régénération génétique de cellules, notamment des cellules différenciées, pouvant comprendre: - au moins une cellule différenciée, des moyens de reprogrammation cellulaire, comprenant au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG), pouvant être un ovocyte ou une cellule embryonnaire, de préférence d'origine non humaine, - des moyens pour supprimer, de préférence complètement, le noyau de la au moins une CRG, des moyens pour prélever et transférer le noyau d'une cellule plus ou moins différenciée dans une CRG respective, - des moyens pour extraire de la CRG, le noyau transféré de la cellule différenciée avant la fin de sa première mitose, - des moyens pour introduire le noyau de la cellule différenciée extrait dans une cellule réceptrice, notamment différenciée, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue, ladite cellule réceptrice étant alors une cellule régénérée apte à se multiplier, le tissu résultant étant destiné à être positionné au sein d'un tissu à régénérer.

Avantageusement, le système comprend en outre: - des moyens pour prélever au moins un chromosome déterminé sur le noyau d'origine de la CRG extrait de ladite CRG, - des moyens pour implanter ce ou ces chromosome(s) dans le noyau de la cellule différenciée transféré dans ladite CRG.

Avantageusement, ledit système comprend en outre des moyens pour supprimer du noyau de la cellule différenciée transféré dans ladite CRG, le ou les chromosomes correspondants au(x) chromosomes prélevé(s) sur le noyau d'origine de la CRG. Ceci est le cas lorsque la CRG est homologue, de préférence lorsque le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) est toléré ou devient tolérable après sa différenciation partielle par le receveur.

Avantageusement, le noyau de la cellule différenciée à transférer dans la CRG est prélevé à un stade précoce de sa première mitose.

Avantageusement, le noyau de la cellule différenciée est prélevé au stade de la prophase ou au début de la pro-métaphase.

Avantageusement, le noyau de la cellule différenciée transféré dans la CRG est extrait de la CRG au stade de la pro-métaphase, de la métaphase, de l'anaphase et/ou au début de la télophase.

Avantageusement, ledit système comporte des moyens de multiplication cellulaire in vitro des cellules régénérées, comprenant un cadre support recevant un bain nourricier contenant lesdites cellules régénérées en culture, ledit cadre support pouvant être soumis, notamment pour des ostéoblastes, à des mouvements et/ou forces mécaniques pendant ladite multiplication.

Avantageusement, ledit cadre support comporte au moins un côté mobile dans un plan, de préférence au moins deux côtés mobiles dans deux plans différents et notamment apte à réaliser une rotation motrice tridimensionnelle.

Avantageusement, ledit système comprend des moyens de support mécaniques et/ou biologiques de croissance in vitro des cellules régénérées, tel qu'un implant ayant une surface non lisse très agrandie adaptée à cet effet, lesdits moyens de support étant aptes à être positionnés dans le tissu à régénérer, lesdites cellules régénérées formant alors un ciment cellulaire, qui est avantageusement solide, légèrement viscoélastique en face des efforts brusques et violents, et plus rigide en face des sollicitations mécaniques plus progressives (qualité d'amortissement) épousant fermement la surface osseuse de l'implant, entre ledit tissu à régénérer et lesdits moyens de support.

Avantageusement, lesdits moyens de support de croissance des cellules régénérées comportent un implant osseux artificiel ou biologique.

Avantageusement, ledit système comprend des moyens d'injection et/ou d'implantation, tels que par endoscopie, des cellules régénérées apte à distribuer lesdites cellules au sein d'un tissu à régénérer.

Avantageusement, le système est adapté à la régénération de cellules différenciées telles que des cellules cardiaques, rénales, osseuses, dentaires, cartilagineuses, pancréatiques, hépatiques, nerveuses, prostatiques, hématopoïétiques, immunitaires, pulmonaires, artérielles, intestinales et/ou dermiques.

Selon d'autres aspects, la présente invention a aussi pour objet des procédés de fabrication de cellules régénérées destinées au traitement de l'arthrose, au traitement de maladies immunitaires, et notamment de maladies auto-immune, à régénérer un tissu cardiaque lésé ayant par exemple subi un infarctus du myocarde, à régénérer un tissu cancéreux ayant fait l'objet d'un traitement anti-cancéreux destructeur, au traitement du diabète, à assurer une histocompatibilité d'un tissu à greffer, au traitement d'une hépatite au traitement d'un ulcère ou de toute lésion ou anomalie cutanée irréversible, au traitement de l'ostéoporose, et/ou au maintien d'un implant dans un os ou dans une articulation.

Avantageusement, l'étape de prélèvement et de transfert du noyau de la cellule différenciée comprend de prélever et de transférer, outre le noyau, au moins une partie du cytoplasme contenu dans la cellule différenciée, afin de retrouver dans la CRG quelques composants cytoplasmiques initialement présents dans la cellule différenciée tels que le réticulum endoplasmique, l'appareil de golgy, les ribosomes et/ou les mitochondries.

Avantageusement, au moins une partie de l'ADN, tel qu'une séquence d'ADN, recombiné ou non, contenu dans le noyau de la cellule différenciée à transférer, a déjà préalablement subi au moins une régénération génétique selon l'invention.

Avantageusement, un segment d'ADN d'origine végétal codant pour une molécule particulière telle que la vitamine C, la vitamine E ou l'acide Folique, est inséré dans l'ADN contenu dans le noyau de ladite cellule régénérée.

Avantageusement, l'insertion du segment d'ADN d'origine végétal est mise en oeuvre en prophase, en anaphase, en télophase ou durant une interphase.

Avantageusement, la CRG de transfert du noyau de la cellule différenciée résulte de la fusion ou de l'accolement membranaire de plusieurs CRG de préférence avec leur cytoplasme, de préférence autologues.

Avantageusement, cette fusion ou cet accolement est mis en oeuvre au moyen d'un rayon laser, de préférence de diamètre inférieur à environ 0, 01 mm, avantageusement d'environ 0,001 mm, au moyen d'un rayon lumineux chauffant ou au moyen d'un collant biologique.

Selon encore d'autres aspects, la présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule différenciée pour la fabrication d'au moins une cellule différenciée régénérée apte à être réimplantée pour traiter diverses pathologies, maladies, et/ou insuffisances, comprenant les étapes suivantes: - fournir au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG), pouvant être un ovocyte ou une cellule embryonnaire, de préférence d'origine non humaine, - fournir au moins une cellule différenciée, supprimer, de préférence complètement, le noyau de la CRG, - prélever et transférer le noyau d'une cellule différenciée dans la CRG, - extraire le noyau de la cellule différenciée transférée dans la CRG, 30 avant la fin de sa première mitose, - introduire le noyau de la cellule différenciée extrait dans une cellule différenciée, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue, de manière à former une cellule différenciée régénérée, - multiplier ladite cellule différenciée régénérée, -implanter les cellules différenciées multipliées dans un tissu, afin de régénérer au moins partiellement ce tissu.

Avantageusement, la cellule différenciée est un chondrocyte afm de régénérer un cartilage.

Avantageusement, la cellule différenciée est une cellule immunitaire afin de reconstituer une souche vigoureuse de cellules immunitaires régénérées.

Avantageusement, la cellule différenciée est une cellule myocardique afin de régénérer le myocarde.

Avantageusement, la cellule différenciée est une cellule saine issue d'un tissu à soumettre à un traitement anti-cancéreux afm de régénérer un 20 tissu après la fin du traitement anti-cancéreux.

Avantageusement, la cellule différenciée est une cellule (3 ou a de Langerhans afin de reconstituer un stock de cellules ou a rajeunies et à fonction endocrine normalisée, et d'accroître la quantité d'insuline et/ou de glucagon produite.

Avantageusement, la cellule différenciée est une cellule d'un receveur pour la fabrication d'une couche de cellules histocompatibles afin que le système immunitaire du receveur reconnaisse les molécules portées à la surface d'un greffon en tant que cellules ne provoquant pas de rejet immunitaire.

Avantageusement, la cellule différenciée est un hépatocyte afin de régénérer le tissu hépatique.

Avantageusement, la cellule différenciée est une unité épidermo-dermique de tissu autologue rajeuni afin de régénérer un tissu ulcéré.

Avantageusement, la cellule différenciée est un ostéoblaste afin de régénérer un os victime d'ostéoporose.

Avantageusement, la cellule différenciée est une cellule osseuse afin de former un ciment cellulaire, solidarisant un implant dans un os.

Avantageusement, la cellule différenciée est une cellule épidermique et/ou dermique afin de fabriquer un extrait de cellules régénérées pour rétablir les fonctions de réparation de l'ADN épidermique et/ou dermique. Dans ce cas, l'extrait de cellules peut être utilisé par application externe cutanée ou par injection sous-cutanée, intradermique ou intra épidermique.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront plus clairement au cours de la description détaillée suivante, de plusieurs modes de réalisation et variantes de l'invention.

La présente invention concerne notamment un système et des procédés s'appliquant au domaine de la thérapie et/ou réparation et/ou amélioration cellulaire destinés à ouvrir de nombreuses perspectives pour la lutte contre un grand nombre de maladies mais également contre la sénescence des tissus dûe dans une très large mesure à la perte de leur capacité fonctionnelle et morphologique de prolifération et de régénération. En particulier, la présente invention a pour objet un système et des procédés aptes à régénérer des cellules d'un tissu c'est-à- dire à entraîner un véritable rajeunissement de ces cellules. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu adéquat de manière à créer un stock ou tissu de cellules régénérées capables d'être implantées dans le tissu considéré.

Plus précisément, les systèmes et les procédés selon l'invention consistent à transférer un noyau d'une cellule différenciée dans des moyens de reprogrammation cellulaire. Ces moyens peuvent comprendre au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG) (ovocyte, cellule souche telle qu'une cellule embryonnaire, ou un récipient cellulaire reconstitué à partir de ces cellules, etc.) et à extraire ce noyau avant la fin de sa première mitose.

Autrement dit, l'invention consiste à laisser le noyau dans l'ovocyte pendant un temps n'excédant pas la télophase du noyau, c'est-à-dire à extraire le noyau avant sa division en deux cellules. L'inventeur a observé que cette introduction temporaire d'un noyau dans l'ovocyte aboutit à un allongement très rapide et important des télomères, synonyme de rajeunissement du matériel chromosomique. Le noyau régénéré est alors introduit dans une cellule réceptrice différenciée, souche ou embryonnaire, de préférence énuclée, de préférence autologue, dans laquelle la division mitotique pourra se poursuivre et ainsi aboutir à la naissance de deux cellules filles dont le matériel nucléique est régénéré. Ensuite, ces cellules pourront être soumises à une culture de multiplication et atteindre des quantités telles qu'au moins des millions de cellules différenciées aptes à être implantées au niveau du tissu d'origine concerné.

Tout d'abord, il est à noter que l'ovocyte utilisé peut tout à fait être un ovocyte d'animal et d'ailleurs sera de préférence un ovocyte non humain pour des raisons éthiques. Par exemple, un ovocyte de lapin ou de mouton peut être utilisé. En outre, étant donné la rareté des ovocytes humains ou mammifères, on peut envisager de rendre un ovocyte multipare en lui introduisant un nouveau noyau après avoir retiré délicatement le premier noyau en mitose partielle. Cette multiparité par inoculation intra ovocytaire consécutive peut avoir sur le matériel nucléaire un effet de dédifférenciation différent de celui obtenu lors de la première introduction du noyau ou des chromosomes ou gènes de ce même ovocyte. On peut également introduire dans l'ovocyte, un noyau, qui soit par exemple en mitose spontanée ou provoquée partielle, ou par ailleurs des chromosomes ou gènes ou parties de noyaux à traiter dans une cellule de type embryonnaire. On peut aussi utiliser des cellules de type embryonnaires qui sont artificiellement activées par des protéines ou des peptides de signalisation génétique ou d'activation ou régulation cellulaire, constituant un environnement capable d'induire une certaine reprogrammation génétique de voisinage. Ainsi, le retrait du noyau de la cellule différenciée initiale peut se faire de façon avantageuse en métaphase ou bien, en pro-métaphase, en anaphase, ou en début de télophase selon le degré de dédifférenciation souhaité. Afin d'observer la période mitotique en cours, des moyens optiques, tels qu'un microscope, peuvent êtres utilisés. Si une cellule embryonnaire est ensuite utilisée, elle sera alors de préférence du même tissue, par exemple, cartilagineuse, myocardique, etc., de préférence partiellement dénoyautée et cultivable in vitro, in vivo ou in situ. Cette ou ces cellule(s) seront cultivées pour multiplication de préférence un temps suffisant in vivo dans des tissus embryonnaires pour obtenir une dédifférenciation partielle. Les noyaux ainsi traités peuvent être laissés, soit dans les cellules de type embryonnaire pour constituer un tissu greffable dans l'organisme de provenance du noyau, soit extrait de leurs cellules réceptrices pour devenir inducteur de régénération cellulaire locale infra ou transmembranaire au niveau d'un tissu différencié, de préférence autologue et identique. L'implantation du noyau ou partie nucléaire peut également se faire à l'intérieur d'une cellule souche, de préférence de type embryonnaire ou foetal.

De telles cellules partiellement et sélectivement dédifférenciées peuvent ensuite être introduites dans des cellules différenciées, tels que des chondrocytes, des cellules à fonction immunitaires, des cellules cardiaques, des cellules issues de tissus ayant subit un traitement anticancéreux, des cellules R et a des îlots de Langherans, des cellules de même origine qu'un greffon à transplanter, des hépatocytes, etc., afin de régénérer le tissu correspondant. Une telle invention peut ainsi être appliquée sans limitation à la régénération de toute cellule assez différenciée, telle que des cellules cardiaques, rénales, osseuses, cartilagineuses, cutanées, pancréatiques, hépatiques, nerveuses, prostatiques, glandulaires, hématopoïétiques, nerveuses, vasculaires, etc. A partir d'un certain degré de dédifférenciation, ces cellules perdent leur pouvoir immunogène et peuvent parfois être utilisées pour régénérer des tissus non autologues. Cette fonction comporte aussi la capacité de ces cellules génétiquement activées d'agir à distance par sécrétion, libération ou induction de peptides et/ou protéines de signalisation génétique, notamment, par molécules biochimiques spécifiques. Cette activation génétique trans-membranaire et/ou trans-humorale donne la capacité à ces cellules de stimuler activement et continuellement d'autres cellules.

Le système et les procédés de régénération cellulaires mis en oeuvre comportent de préférence trois stades successifs, à savoir une préparation du matériel nucléaire, une reprogrammation génétique et une multiplication en culture.

La préparation du matériel nucléaire consiste à prélever le noyau de la cellule assez différenciée de préférence avec plus ou moins de cytoplasme afin de conserver si possible les composants cytoplasmiques, tels que les mitochondries, les ribosomes, le réticulum endoplasmique, l'appareil de Golgi, les lysosomes, les péroxysomes, etc., de la cellule différenciée initiale au niveau de l'ovocyte accueillant ce prélèvement. Cette étape permet d'assurer une reprogramation synchrone des diverses structures vitales autour du noyau et une conservation probable du champ morphogénétique cellulaire. Par ailleurs, il est possible que certains constituants du matériel nucléaire tels que les chromosomes, un ensemble de gènes, un ou plusieurs gènes isolés (naturels, recombinés, semi synthétiques ou synthétiques) aient été préalablement soumis à un tel procédé de régénération. De cette façon, certains éléments de la préparation auront un âge biologique différent. En outre, il peut être prévu d'accoler un segment d'ADN végétal, codant par exemple pour la vitamine C, E, l'acide folique, etc. à un gène ou un chromosome par exemple lors de la métaphase ou à la membrane nucléaire à l'anaphase, à la télophase ou à une interphase correspondante.

Le récipient membrano-cytoplasmique (ovocyte) pour traiter les éléments cytoplasmiques de reprogrammation peut se révéler parfois trop petit pour les éléments cellulaires que l'on désire traiter. A titre d'exemple, on peut penser au traitement simultané d'un noyau avec une partie de son cytoplasme, ou de plusieurs noyaux tels que dans un néphron, une cellule musculaire, une cellule autorythmique myocardique, un follicule pileux, une unité épidermique de mélanisation, une unité épiderme-derme, une unité glandulaire, une unité hépatobiliaire, une unité fonctionnelle rétinienne (tel qu'un épithélium pigmenté : cônes, bâtonnets, cellules bipolaires, cellules horizontales et cellules de Müller), une unité vasculaire (cellule endothéliale et myoartérielle), une unité hématopoïétique, une unité neuro-glio-dendritique, une unité ovarienne de follicules de Graaf, etc. Afin de régénérer une unité à plusieurs noyaux par un système ou un procédé de régénération selon l'invention, il peut être nécessaire de disposer d'un récipient membrano-cytoplasmique agrandi à fonction ovocytaire préservé (RAF). Un tel R.AF peut être réalisé par collage des membranes respectives de plusieurs ovocytes de préférence homo ou autologue de mammifères, par exemple par micromanipulations manuelles ou robotiques, en préservant chaque cytoplasme respectif au sein de leur membrane respective et en créant un volume du type sphérique, ovoïde ou cylindrique. Une telle manipulation exige de préserver l'environnement vital pour chaque ovocyte. Cet accolement membranaire peut par exemple être réalisé au moyen d'un rayon laser d'un diamètre inférieur à environ 0,01 mm, de préférence de l'ordre de 0,001 mm, d'un petit rayon lumineux chauffant, d'un collant biologique, etc. La multiplication in vitro est précédée par l'introduction du matériel nucléo-cytoplasmique dans une cellule énuclée et à vitalité au moins récupérable. Les techniques actuelles de multiplication permettent, par exemple, en deux semaines d'obtenir un demi milliard de cellules à partir d'une dizaine.

Dans le cas présent, l'inventeur a observé que le procédé de régénération selon l'invention assure un accroissement rapide et important de la longueur des télomères en moins d'une journée permettant ainsi de contrebalancer leur irrémédiable raccourcissement résultant des si nombreuses réplications successives. Cette multiplication peut également se faire in vivo mais est généralement beaucoup plus lente et nécessite souvent un amorçage suffisant in vitro. Ceci diminue la quantité de cellules nécessaires ainsi que le rongement important des télomères et permet probablement une meilleure adaptation fonctionnelle ainsi qu'une plus grande influence génétique à distance.

Le procédé de régénération selon l'invention est notamment approprié pour les maladies caractérisées par un déficit cellulaire (diabète, infarctus du myocarde, hépatite, ou encore maladies génétiques responsable d'une déficience immunologique) ainsi que pour les cancers survenant après un certain age, tel que celui de la prostate et des seins (par exemple lorsque le tissu a été détruit suite au traitement appliqué).

Cette régénération cellulaire est applicable à de nombreux types cellulaires et peut donc créer des tissus de régénération contrôlée permettant de soigner de nombreuses lésions organiques et tissulaires. Ainsi, par exemple, en prélevant, sous contrôle échographique, par une aiguille trans-rectale ou transdermique, ou par une sonde endoscopique, des cellules prostatiques qui seront totalement ou partiellement clonées et en les réimplantant par exemple dans la prostate, ce rajeunissement cellulaire inducteur par des protéines de signalisations pourra, dans certains cas, s'opposer au développement d'un cancer local, freiner son extension ou même détruire toutes les métastases. Ainsi également, une rétine ophtalmique autologue, voire homologue, dont une unité cellulaire fonctionnelle, par exemple constituée de quelques cellules de l'épithélium pigmenté, de cônes, de bâtonnets, de cellules bi-polaires et/ou de cellules de Muller, qui a été prélevée et régénérée, pourra avoir un grand intérêt en cas de DMLA, et l'insuffisance rénale grave pourra être combattue par l'implantation de cellules partiellement dédifférenciées obtenues, après transfert dans puis hors d'ovocytes, de noyaux de différentes cellules de néphron, de l'arthrose, et l'arthrose soulagée par l'implantation de chondrocytes provenant d'une régénération cellulaire en va de même pour des surfaces cutanées et notamment pour régénérer une chevelure normale, par exemple en transférant dans un ou plusieurs ovocyte(s) de préférence un ou des noyaux ou parties de noyaux de cellules de follicule pileux, de mélanocytes et de kératinocytes, pour une régénération de la chevelure et/ou de sa couleur. Encore une autre application de l'invention peut consister à renforcer ou recréer les fonctions thymiques par rajeunissement génétique de cellules thymiques homologues ou si possible autologues suffisamment dédifférenciées pour réanimer activement les fonctions protectrices du corps.

Diverses applications du système et du procédé selon l'invention vont maintenant être décrites de façon plus détaillée. L'ensemble des étapes nécessaires à la régénération cellulaire ne sera par la suite pas répété, le principe d'ensemble restant le même et pouvant être adapté à chaque cas par l'homme du métier.

Une application biomédicale particulièrement préférée pour ce procédé de régénération de cellules concerne de manière générale les maladies dégénératives des articulations (arthrose). Les chondrocytes des cartilages, qui souvent dégénèrent avec l'âge, peuvent être prélevés par biopsie, endoscopie, intervention chirurgicale locale ou arthroscopie et séparés de leur cartilage environnant. Leur noyau peut être alors soumis au procédé de régénération selon l'invention. Après multiplication, la réimplantation des cellules régénérées dans l'articulation d'origine doit se faire de préférence à proximité, mais en dehors des surfaces de la cavité articulaire mobile qui supporte les charges mécaniques afin d'éviter toute anfractuosité au niveau de ses surfaces mobiles. Parfois, un défaut d'alimentation sanguine indirecte des chondrocytes, qui se fait majoritairement par imbibition, doit être corrigé. On peut alors envisager la greffe autour ou pénétrant dans le cartilage périphérique par rapport àla cavité articulaire, d'un tissu fonctionnel vasculaire autologue comprenant petite artère artériole capillaire veinule -et petite veine, ces unités fonctionnelles vasculaires, peuvent avantageusement provenir d'une culture cellulaire autologue post-procédé de régénération selon l'invention. Les chondrocytes post- procédé de régénération vont progressivement reconstituer un cartilage plus épais, lisse et bien lubrifié.

L'ostéoporose est une maladie dégénérative du tissu osseux survenant avec l'âge. Pour lutter contre cette maladie, il convient de procéder à la régénération d'ostéoblastes autologues et de les réimplanter, de préférence, à plusieurs niveaux de l'os. Les ostéoblastes sont de préférence multipliés en culture avec des sollicitations géométriques artificielles, en particulier en imposant des contraintes mécaniques, par exemple à l'aide d'un cadre support. Ce cadre support peut comporter au moins un côté mobile pour des mouvements dans un plan. Avantageusement, on utilise deux côtés mobiles dans le cadre de support de culture et/ou la possibilité de réaliser des rotations motrices tridimensionnelles. Au niveau du col du fémur, par exemple, on peut effectuer aisément, sous anesthésie locale, des biopsies espacées en introduisant un trocart à travers le massif trochantérien du fémur qui se trouve proche de la peau. Le traitement des ostéoblastes ainsi recueillis suite au procédé de régénération de cellules et la réimplantation de ces cellules rajeunies, par exemple, par la même voie transtrochantérienne, pourra permettre la création locale d'un remodelage osseux qui réalise ainsi alors un renforcement fondamental des travées osseuses de sustentation dans la direction des contraintes mécaniques du col et de la tête fémorale vers le haut ainsi que vers le bas en direction du corps du fémur. Au niveau des vertèbres, principales victimes de l'ostéoporose par fracture et aplatissement, un procédé équivalent de régénération des cellules à celui du fémur peut être mis en oeuvre, notamment en association avec des fixateurs et articulations artificielles développés par l'inventeur dans les brevets US-6,835,207 et US-6,692,495.

La présente invention peut également être appliquée à des sujets ayant subi des inflammations graves, notamment par affaiblissements réactionnels des différents lymphocytes producteurs d'anticorps et de cytokines pro et anti- inflammatoires. Le procédé de régénération selon l'invention peut alors permettre de raviver ces lymphocytes en nombre et en fonction. Pour se faire, ces lymphocytes peuvent être soumis au procédé selon l'invention en plaçant un noyau lymphocytaire dans un ovocyte en présence ou non de traces d'antigènes infectant dans le cytoplasme ovocytaire. En absence de traces d'antigènes infectant placés dans le cytoplasme ovocytaire, les lymphocytes seront rajeunis et multipliés et ensuite réimplantés dans l'organisme où ils auront déjà mémorisé les antigènes dangereux et produire ou faire produire ensuite les anticorps correspondant en quantité importante. Dans le cas où des antigènes sont placés dans le cytoplasme de la CRG, la présence d'antigènes spécifiques lors du procédé de régénération cellulaire peut permettre de mémoriser ou extérioriser les antigènes sur les membranes cellulaires et d'optimiser la réaction de production des anticorps par leur apparition immédiate au fur et à mesure de la réapparition des fonctions lymphocytaires rajeunies.

La présente invention peut également être appliquée aux ulcères. Les ulcères chroniques, notamment au niveau des jambes, mettent souvent très longtemps avant de cicatriser, et cette cicatrisation laisse bien souvent une séquelle cutanée et sous-cutanée importante. D'autres ulcères ne cicatrisent même jamais. Dans ce cas, il convient de traiter par le procédé de régénération selon l'invention au moins une unité fonctionnelle épidermo-dermique du patient prélevée au niveau de la peau saine et, après multiplication, de les implanter au niveau de l'ulcère. L'implantation peut se faire directement au niveau de l'ulcère lorsqu'une irrigation sanguine locale suffisante existe sans infection grave soit, dans la négative, être réalisée autour de l'ulcère en région cutanée saine. Afin de réaliser par exemple une telle unité fonctionnelle épidermo-dermique en reprogrammation simultanée, la (ou les) CRG destiné à accueillir cette unité peut être assez volumineux et donc peut être par exemple agrandie artificiellement via la méthode précédemment décrite. Au niveau épidermique, la cellule peut par exemple être choisie parmi une cellule de kératinocyte, de Langerhans, de Merkel et/ou de mélanocyte, prise seule ou en combinaison tandis qu'au niveau dermique, des fibroblastes cutanés peuvent être prélevés. Les cellules de l'épiderme et du derme peuvent être placées dans des ovocytes distincts. Le procédé de régénération selon l'invention doit de préférence se dérouler dans une période de temps assez courte afin de ne pas produire des cellules trop proches de l'état embryonnaire. En effet, de telles cellules risqueraient l'inconvénient d'être trop différentes structurellement et fonctionnellement des tissus récepteurs. Les cellules épidermo-dermiques recueillies après régénération devront dans la mesure du possible être positionnées et fixées dans le bain de culture dans une conformation réciproque proche de celle naturellement observée, de façon à simplifier l'implantation de la couche tissulaire régénérée sur la peau réceptrice. Lors de la culture des cellules régénérées, il peut être possible de réarranger la position respective des différentes catégories de cellules, voire même de cultiver plusieurs variantes d'assemblage destinées à des greffes à des emplacements distincts.

Il est aussi connu qu'avec Page, les défauts de recopiage de l'ADN deviennent plus importants et que les mécanismes naturels de réparation de ces défauts deviennent moins efficaces. Afin de parer à cette insuffisance, un dispositif de l'invention peut prévoir de prélever localement de l'épiderme et/ou du derme lésé, de le traiter par la régénération selon l'invention, et ensuite de fabriquer à partir de ce tissu régénéré génétiquement un extrait de ces cellules, qui pourra être fixé par exemple dans une crème (ou similaire) pour une application externe cutanée. Cet extrait pourra aussi être utilisé pour créer une solution injectable en sous-cutané, intradermique ou intra épidermique. Il devient ainsi possible de rétablir les fonctions de réparation de l'ADN épidermique et/ou dermique.

La régénération de zones tissulaires nécrosées, fibrosées ou inactives constitue également une application de la présente invention. De telles zones tissulaires lésées apparaissent par exemple, au niveau d'un myocarde suite à un infarctus ou par exemple au niveau d'un organe ayant développé une tumeur visée par un traitement anti-cancéreux destructeur.

La présente invention peut également aider à la détermination du mécanisme responsable d'un trouble de l'état de santé d'un mammifère. En effet, la cause première d'une atteinte de l'équilibre vital est parfois difficile à trouver. Il est alors possible d'effectuer une régénération cellulaire d'au moins une cellule des tissus suspects et si les tissus reprogrammés résultants diffèrent du tissu normal dans sa composition intracellulaire ou dans ses sécrétions de protéines et de peptides d'une manière critique ou spécifique la responsabilité causale intrinsèque de ce tissu est démontrable. A titre d'exemple on peut citer chez certains diabétiques dont la pathologie a un âge avancé qu'une régénération cellulaire d'une cellule pancréatique de Langerhans, prélevée par exemple par endoscope, va montrer une sécrétion provoquée d'insuline ou de glucagon normale contrairement aux cellules équivalentes non soumises à la régénération cellulaire. L'origine des états pathologiques apparaissant après un certain âge est susceptible d'être révélée par la comparaison fonctionnelle du tissu suspect existant ou présent par rapport à son ancêtre tissulaire artificiellement reconstitué par une régénération cellulaire.

La présente invention est également utile pour des maladies se caractérisant par un déficit cellulaire. En particulier, la présente invention peut permettre une régénération et multiplication de cellules f3 et a d'îlots de Langherans qui peuvent être réimplantées dans le pancréas de manière à rétablir la sécrétion d'insuline ou de glucagon au niveau d'un organisme d'un sujet. Dans certains cas de destruction du tissu hépatique (tel que cancer ou cirrhose), l'implantation d'hépatocytes régénérés au niveau du foie peut assurer une guérison de troubles hépatiques.

Encore une autre application de la présente invention est, par exemple, le maintien d'un implant dans un os à l'aide d'une enveloppe de cellules régénérées. Cette application comprend de régénérer des cellules osseuses, en particulier des ostéoblastes, de préférence prélevées à un stade précoce de leur mitose spontanée ou provoquée dans une CRG puis de placer ces ostéoblastes régénérés avant la fin de leur mitose dans une cellule réceptrice de préférence d'ostéoblaste, de cultiver les ostéoblastes dans un milieu de culture adéquat afin d'en obtenir un nombre et un comportement mécanique appropriés puis de répartir les ostéoblastes sous forme de manchon ou d'enveloppe entre un implant osseux artificiel et l'os. La couche d'ostéoblastes régénérés assure alors une bonne solidarisation de l'implant osseux et de l'os par la poussée ostéoblastique, et renforce ainsi le maintien de l'implant dans l'os. De plus, l'utilisation de telles cellules régénérées assure le maintien à long terme de l'implant dans l'os et présente une efficacité durable et accrue par rapport aux crèmes protéiques à base de différents BMP (Bone Morphogenic Proteins) habituellement mises en oeuvre.

Une autre utilisation possible de la présente invention est d'assurer une bonne histocompatibilité entre un greffon d'un donneur et le système immunitaire d'un receveur. Pour ce faire, une cellule saine de l'organe à greffer du receveur peut être prélevée et régénérée selon le processus décrit puis être transférée dans une cellule réceptrice adéquate de manière à entraîner la prolifération de ces cellules. Ces cellules peuvent alors ensuite être placées autour du greffon du donneur de manière à ce que le système immunitaire du receveur reconnaisse les molécules critiques portées à la surface du greffon comme molécules du soi et n'engendre ainsi pas de réaction immunitaire en présence du greffon. La création d'histocompatibilité peut notamment être réalisée des manières suivantes: 1) Echange de chromosomes ou de segments de chromosomes par micromanipulation génétique durant une phase choisie de la mitose, ce qui est à ce jour difficile à réaliser car leur micromanipulation n'est pas encore suffisamment précise; la nanomécanique permet actuellement de réaliser des instruments à l'échelle chromosomique pour réaliser par exemple des ponctions, des greffes, des aspirations et des rotations; un progrès à ce niveau est tout à fait envisageable dans un futur proche.

2) Destruction sélective d'un segment de chromosome porteur des gènes responsables de l'incompatibilité tissulaire, par exemple durant une phase ou interphase de mitose, à l'aide d'un rayon laser de diamètre d'environ 0,0001 mm, entouré d'un cylindre de rayons plus larges de lumière visible permettant de guider le rayon laser par simple contrôle optique microscopique, qui peut être avantageusement robotisé ; cette destruction segmentaire de chromosome peut toutefois parfois être mal tolérée par certaines cellules résultantes.

La présente invention présente également un intérêt tout particulier dans le domaine de la stomatologie dentaire. L'absence dentaire doit souvent être compensée par des implants métalliques céramiques, plastiques etc. Ces implants exigent une base de soutien osseux maxillaire suffisante afin d'assurer la fixation solide de l'implant. En cas d'insuffisance de la quantité ou de la qualité de la région sollicitée du maxillaire il est avantageux de prélever, par exemple par voie buccale, quelques cellules de ce lieu de l'os, de les soumettre à une régénération cellulaire et à une multiplication adéquate afin de disposer d'une petite greffe osseuse locale qui non seulement va fournir un socle osseux solide mais qui pourra par exemple, par la voie des protéines de signalisations, des cytokines locales et des molécules de régulation de l'activité cellulaire et celles des expressions génétiques, renforcer progressivement l'ensemble de l'arcade maxillaire.

Un autre exemple d'application du procédé de régénération cellulaire selon l'invention concerne les fractures et la chirurgie osseuse. Certaines fractures et malformations osseuses exigent une intervention chirurgicale nécessitant parfois de disposer d'une masse osseuse supplémentaire greffable et solide. Ceci peut être obtenu par régénération cellulaire des cellules locales avec multiplication chaque fois que la chirurgie peut être retardée d'au moins deux semaines. Cela est notamment le cas des interventions pseudarthroses, déformations osseuses vertébrales dégénératives, arthrites ou arthroses déformantes. La multiplication cellulaire in vitro des cellules d'ostéoblastes est à réaliser de préférence en tenant compte, dès leur culture, des contraintes mécaniques qu'elles doivent supporter, par exemple après leur implantation dans le fémur, le maxillaire, les vertèbres, etc. En pratique, il s'agit d'organiser cette culture cellulaire si possible confluente dans un bain nourricier classique, mais à l'intérieur d'un cadre support dont au moins un côté est mobile dans un plan, ou dans deux plans simultanément, ce qui rend une rotation motrice possible. Les mouvements et forces mécaniques périodiquement imposés au tissu en croissance dans sa solution nourricière adaptée seront d'une amplitude, soudaineté et force progressivement croissante, mais toujours dans une orientation principale similaire afin de provoquer des structures minérales et trabiculaires dans la bonne direction. Les lignes de forces et de résistances mécaniques de ces structures, dans une ou plusieurs directions, correspondent aux forces, amortissements et viscoélasticités que le tissu osseux régénéré devra supporter après son implantation. L'inventeur a développé un fixateur vertébral ajustable original (US-6, 835,207) et un disque vertébral ajustable original (US-6,692,495) qui, tous les deux peuvent avantageusement être combinés avec du tissu vertébral résultant d'une régénération cellulaire, et par exemple servir de socle pour les vis pédiculaires de fixation.

Claims (22)

Revendications

1.- Système de régénération génétique de cellules différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins une cellule différenciée, des moyens de reprogrammation cellulaire, comprenant au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG), formée d'un ovocyte ou d'une cellule embryonnaire, - des moyens pour supprimer, de préférence complètement, le noyau de la au moins une CRG, - des moyens pour prélever et transférer le noyau d'une cellule différenciée dans une CRG respective, - des moyens pour extraire de la CRG, le noyau transféré de la cellule différenciée avant la fin de sa première mitose, - des moyens pour introduire le noyau de la cellule différenciée extrait dans une cellule réceptrice différenciée, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue, ladite cellule réceptrice étant alors une cellule régénérée apte à se multiplier, le tissu résultant étant destiné à être positionné au sein d'un tissu à régénérer.

2.- Système selon la revendication 1, comprenant en outre: - des moyens pour prélever au moins un chromosome déterminé sur le noyau d'origine de la CRG extrait de ladite CRG, - des moyens pour implanter ce ou ces chromosome(s) dans le noyau de la cellule différenciée transféré dans ladite CRG.

3.- Système selon la revendication 2, comprenant en outre des moyens pour supprimer du noyau de la cellule différenciée transféré dans ladite CRG, le ou les chromosomes correspondants au(x) chromosomes prélevé(s) sur le noyau d'origine de la CRG.

2885368 23 4.- Système selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le noyau de la cellule différenciée à transférer dans la CRG est prélevé à un stade précoce de sa première mitose.

5.- Système selon la revendication 4, dans lequel le noyau de la cellule différenciée est prélevé au stade de la prophase ou au début de la prométaphase.

6.- Système selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le noyau de la cellule différenciée transféré dans la CRG est extrait de la CRG au stade de la pro-métaphase, de la métaphase, de l'anaphase et/ou au début de la télophase.

7.- Système selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant des moyens de multiplication cellulaire in vitro des cellules régénérées, comprenant un cadre support recevant un bain nourricier contenant lesdites cellules régénérées en culture, ledit cadre support étant soumis à des mouvements et/ou forces mécaniques pendant ladite multiplication.

8.- Système selon la revendications 7, dans lequel ledit cadre support comporte au moins un côté mobile dans un plan, de préférence au moins deux côtés mobiles dans deux plans différents et notamment apte à réaliser une rotation motrice tridimensionnelle.

9.- Système selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant des moyens de support mécaniques et/ou biologiques de croissance in vitro des cellules régénérées, tel qu'un implant ayant une surface non lisse très agrandie adaptée à cet effet, lesdits moyens de support étant aptes à être positionnés dans le tissu à régénérer, lesdites cellules régénérées formant alors un ciment cellulaire entre ledit tissu à régénérer et lesdits moyens de support.

2885368 24 10.- Système selon la revendication 9, dans lequel lesdits moyens de support de croissance des cellules régénérées comportent un implant osseux artificiel ou biologique.

11.- Système selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant des moyens d'injection et/ou d'implantation, tels que par endoscopie, des cellules régénérées apte à distribuer lesdites cellules au sein d'un tissu à régénérer.

12.- Système selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le système est adapté à la régénération de cellules différenciées telles que des cellules cardiaques, rénales, osseuses, dentaires, cartilagineuses, pancréatiques, hépatiques, nerveuses, prostatiques, hématopoïétiques, immunitaires, pulmonaires, artérielles, intestinales et/ou dermiques.

13.- Procédé de régénération génétique, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins un cellule différenciée pour la fabrication d'au moins une cellule différenciée régénérée apte à être réimplantée pour traiter diverses pathologies, maladies, et/ou insuffisances tissulaires, comprenant les étapes suivantes: - fournir au moins une cellule de reprogrammation génétique (CRG), formée d'un ovocyte ou d'une cellule embryonnaire, fournir au moins une cellule différenciée, supprimer, de préférence complètement, le noyau de la CRG, prélever et transférer le noyau d'une cellule différenciée dans la CRG, extraire le noyau de la cellule différenciée transférée dans la CRG, 30 avant la fin de sa première mitose, 2885368 25 - introduire le noyau de la cellule différenciée extrait dans une cellule différenciée, de préférence vidée de son noyau, de préférence autologue, de manière à former une cellule différenciée régénérée, - multiplier ladite cellule différenciée régénérée.

14.- Procédé selon la revendication 13, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins un chondrocyte pour la fabrication de chondrocytes régénérés aptes à être implantés, de préférence par endoscopie, ponction transcutanée sous contrôle échographique, ou arthroscopie, dans un cartilage osseux ou articulaire préparé à cet effet, en particulier hors de sa surface articulaire, pour traiter une arthrose en régénérant ledit cartilage.

15.- Procédé selon la revendication 13, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule cardiaque pour la fabrication d'un tissu cardiaque régénérée apte à être implantée dans le tissu myocardique pour régénérer une zone lésée suite à un infarctus du myocarde.

16.- Procédé selon la revendication 13, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule saine issue d'un tissu à soumettre à un traitement anti-cancéreux, pour la fabrication de cellules saines régénérées aptes à être implantées dans le tissu visé par le traitement anti-cancéreux pour régénérer ledit tissu après la fin du traitement anti-cancéreux.

17.- Procédé selon la revendication 13, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule [3 et/ou a de Langerhans pour la fabrication de cellules régénérées aptes à 30 être implantées dans l'organisme, notamment en sous-cutané, et/ou dans le pancréas, afin de reconstituer un stock de cellules [3 et/ou a rajeunies et à 2885368 26 fonction endocrine normalisée, et d'accroître la quantité d'insuline et/ou de glucagon produite, pour régénérer la fonction de sécrétion d'insuline et/ou de glucagon.

18.- Procédé selon la revendication 13, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une unité épidermo-dermique de tissu autologue rajeuni, notamment pour la fabrication d'unités épidermo-dermique fonctionnelles régénérées aptes à être implantées dans un tissu ulcéré pour le traitement d'un ulcère ou de toute lésion ou anomalie cutanée irréversible.

19.- Procédé selon la revendication 13, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins un ostéoblaste pour la fabrication d'ostéoblastes régénérés aptes à être implantés dans un os victime d'ostéoporose pour régénérer ledit os.

20.- Procédé selon la revendication 13, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule osseuse pour la fabrication de cellules osseuses régénérées aptes à être implantées dans un os recevant un implant pour favoriser la solidarisation dudit implant dans ledit os, en formant au cours de leur croissance un ciment cellulaire, solidarisant l'os et l'implant.

21.- Procédé selon la revendication 13, comprenant l'utilisation d'au moins une cellule de reprogrammation génétique et d'au moins une cellule épidermique et/ou dermique pour la fabrication d'extrait de cellules épidermiques et/ou dermiques régénérées pour traiter l'épiderme et/ou le derme lésé et rétablir ses fonctions de réparation de l'ADN épidermique et/ou dermique.

22.- Procédé selon la revendication 21, dans laquelle l'extrait de cellules est fixé dans une crème pour une application externe cutanée.

2885368 27 23.- Procédé selon la revendication 21, dans laquelle l'extrait de cellules est réalisé sous la forme d'une solution injectable en sous-cutané, en intradermique ou en intra épidermique.

24.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 23, dans lequel ladite multiplication cellulaire in vitro des cellules régénérées est réalisée au moyen d'un cadre support recevant un bain nourricier contenant lesdites cellules régénérées en culture, ledit cadre support étant soumis à des mouvements et/ou forces mécaniques pendant ladite multiplication.

25.- Procédé selon la revendication 24, dans lequel ledit cadre support comporte au moins un côté mobile dans un plan, de préférence au moins deux côtés mobiles dans deux plans différents et notamment apte à réaliser une rotation motrice tridimensionnelle.