ES2256851T3 - Gen de la poliquistosis renal. - Google Patents

Abstract

SE HA IDENTIFICADO EL GEN HUMANO PKD1, RESPONSABLE DE LA POLIQUISTOSIS RENAL AUTOSOMICA DOMINANTE (APKD), O POLIQUISTOSIS DEL ADULTO. SE DESCRIBEN ASIMISMO LA SECUENCIA GENOMICA Y EL ADNC DEL EXTREMO 5'' DEL GEN PKD1.

Description

Gen de la poliquistosis renal.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al diagnóstico y al tratamiento de la poliquistosis renal en seres humanos, utilizando secuencias de ADN derivadas del gen PKD1 humano y la proteína o proteínas codificadas por ese gen.

Antecedentes de la invención

La poliquistosis renal autosómica dominante (APKD), también denominada poliquistosis renal del adulto, es uno de los trastornos hereditarios más comunes en los adultos, que afecta aproximadamente a un individuo de cada mil. La prevalencia en los Estados Unidos es superior a 500.000, detectándose de 6.000 a 7.000 nuevos casos cada año (Striker et al., Am. J. Nephrol., 6: 161-164, 1986; Iglesias et al., Am. J. Kid. Dis., 2: 630-639, 1983). La enfermedad se considera que es un trastorno sistémico, caracterizado por la formación de quistes en los órganos ductales tales como el riñón, el hígado y el páncreas, así como por anomalías gastrointestinales, cardiovasculares y musculoesqueléticas, incluyendo diverticulitis colónica, verticulitis, aneurismas cerebrales saculados, hernias, y prolapso de la válvula mitral (Gabow et al., Adv. Nephrol, 18: 19-32, 1989; Gabow, New Eng. J. Med. , 329: 332-342, 1993).

Sin embargo, el síntoma más prevalente y obvio de la APKD, es la formación de quistes en el riñón, que dan como resultado un aumento de tamaño extremado de los riñones y una disminución en la capacidad de concentración por parte del riñón. La hipertensión y las anomalías endocrinas también son comunes en los pacientes con APKD, apareciendo incluso antes de los síntomas de insuficiencia renal. En aproximadamente la mitad de los pacientes con APKD, la enfermedad progresa hasta enfermedad renal en fase terminal; en consecuencia, la APKD es responsable del 4 - 8% de los casos de diálisis y trasplante renal en los Estados Unidos y en Europa (Proc. European Dialysis and Transplant Assn., Robinson y Hawkins, eds., 17: 20, 1981). Por tanto, se necesitan en la técnica herramientas terapéuticas y de diagnóstico para reducir la incidencia y la gravedad de esta enfermedad.

La APKD muestra un patrón de transmisión típico en la herencia autosómica dominante, es decir, cada descendencia de un individuo afectado tiene un 50% de posibilidades de heredar el gen causal. Estudios de ligamiento indicaron que un gen causal está presente en el brazo corto del cromosoma 16, cerca del grupo de la \alpha-globina; este locus se designó PKD1 (Reeders et al., Nature, 317:542, 1985.) Aunque existen otros genes asociados con la PKD, tales como por ejemplo, PKD2, los defectos de PKD1 parecen producir APKD en aproximadamente el 85 - 90% de las familias afectadas (Parfrey et al., New Eng. J. Med., 323: 1085-1090, 1990; Peters et al., Contrib. Nephrol., 97: 128-139,
1992).

El gen PKD1 se ha localizado en la posición cromosómica 16p13.3. Utilizando análisis de ligamiento extensivo, junto con la identificación de nuevos marcadores y análisis de enzimas de restricción, el gen se ha localizado adicionalmente en un intervalo de aproximadamente 600 kb entre los marcadores ATPL y CMM65 (D16S84). La región es rica en islas CpG (citidina fosfato guanosina) que se cree que flanquean secuencias transcritas, y se ha calculado que este intervalo contiene al menos 20 genes. La localización precisa del gen PKD1 se ubicó mediante el hallazgo de una familia con PKD, cuyos miembros afectados portaban una translocación que afecta al transcrito de ARN de 14 kb asociado con esta región, tal como se informa en European PKD Consortium, Cell, 77: 881, 1994. Este artículo describe aproximadamente 5 kb de secuencia de ADN correspondiente al extremo 3' de la supuesta secuencia de ADNc de PKD1.

Los documentos WO 95/18225 y WO 95/34649 se refieren al gen de la poliquistosis renal 1 y a los usos del mismo y se identifican según el artículo 54(3) CPE. Las publicaciones describen el ADNc parcial del primer tercio del gen PKD1, pero no la secuencia genómica. El European Polycystic Kidney Disease Consortium (Consorcio Europeo de Poliquistosis Renal) informó de que el gen de la poliquistosis renal 1 codifica para un transcrito de 14 kb y se encuentra dentro de una región duplicada en el cromosoma 16 (Cell 77: 881, 1994). Wunderle et al (Cell 77: 785, 1994) facilitaron una minirrevisión de este informe. Germino et al (Kidney Int. 43, supl. 39: S-20-S-25, 1994) informaron de un enfoque de clonación posicional para el gen de la poliquistosis renal dominante, PKD1.

Pese al conocimiento de la secuencia parcial del ADNc de PKD1 en 3', sigue habiendo varios impedimentos significativos que evitan la determinación de la secuencia completa del gen PKD1. En su mayor parte, estos impedimentos surgen de la compleja organización del locus de PKD1. Un obstáculo importante es que las secuencias relacionadas con el transcrito de PKD1 están duplicadas al menos tres veces en el cromosoma 16 cerca del locus de PKD1, formando homólogos de PKD1. Otro obstáculo es que el intervalo genómico de PKD1 también contiene elementos de repetición que están presentes en otras regiones genómicas. Ambos tipos de duplicaciones de secuencia interfieren con las técnicas de "paseo cromosómico" que se emplean ampliamente para la identificación del ADN genómico. Esto se debe a que estas técnicas se basan en la hibridación para identificar clones que contienen fragmentos solapantes de ADN genómico, por tanto, hay una alta posibilidad de "pasear" en los clones derivados de homólogos de PKD1, en lugar de los clones derivados del gen PKD1 auténtico. De manera similar, las duplicaciones de PKD1 y las repeticiones específicas del cromosoma 16 también interfieren con la determinación inequívoca de una secuencia de ADNc completa que codifique para la proteína PKD1. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de secuencias de ADNc y genómicas correspondientes al gen PKD1 auténtico. Esto incluye la identificación de segmentos de estas secuencias que son únicos para la PKD1 expresada y no están presentes en las secuencias homólogas duplicadas también presentes en el cromosoma 16.

Sumario de la invención

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un gen PKD1 humano aislado, que comprende la secuencia de ADN expuesta en la figura 1.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un vector recombinante que comprende la secuencia de ADN del primer aspecto. El vector puede comprender además un elemento regulador de la transcripción unido operativamente a dicha secuencia de ADN de PKD1, pudiendo dicho elemento dirigir la expresión de los genes de células procariotas o eucariotas y sus virus o combinaciones de los mismos.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una célula que comprende el vector del segundo aspecto.

Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para producir la proteína PKD1, que comprende:

(a) cultivar la célula del tercer aspecto en un medio y en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, y

(b) aislar dicha proteína expresada.

Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona un gen PKD1 humano aislado, tal como se define en el primer aspecto, que consiste en la secuencia de ADN expuesta en la figura 1.

Según un sexto aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende:

5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'

Idóneamente, el ácido nucleico aislado de este aspecto de la invención puede consistir en:

5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'

Según un séptimo aspecto de la invención, se proporciona un método diagnóstico para seleccionar sujetos humanos para identificar portadores de PKD1, que comprende someter a ensayo para determinar la presencia de genes PKD1 mutantes en una muestra de material biológico obtenida de dicho sujeto. En tal método, el material biológico puede comprender ácido nucleico y dicho ensayo puede comprender:

(a) amplificar selectivamente la secuencia del gen PKD1 de la figura 1, a partir de dicho material biológico; y

(b) detectar la presencia de genes PKD1 utilizando un método analítico seleccionado del grupo que consiste en: digestión con enzimas de restricción, secuenciación directa de ADN, hibridación con oligonucleótidos específicos de secuencia, análisis de polimorfismo conformacional de cadena sencilla, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DDGE), electroforesis en gel bidimensional y combinaciones de los mismos.

De manera adecuada, el ácido nucleico puede comprender ARN, y dicho método puede comprender además transcribir selectivamente dicho ARN de PKD1 antes de dicha etapa de amplificación. También puede preferirse que la amplificación se realice en presencia de un oligonucleótido que comprende:

5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'

Según un octavo aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo aislado dirigido contra un péptido con la secuencia LRAKNKVHPSST.

Según un noveno aspecto de la invención, se proporciona el uso de un gen PKD1 humano de la figura 1 en la preparación de un agente para tratar un estado de enfermedad que tiene las características de la APKD. En tal caso, el gen PKD1 puede comprender la secuencia de ADN de la figura 1.

Según un décimo aspecto de la invención, se proporciona una composición para tratar un estado de enfermedad que tiene las características de la APKD, comprendiendo dicha composición un gen PKD1 humano aislado que tiene la secuencia de ADN de la figura 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tal composición puede comprender además un vector en el que se incorpora dicho gen PKD1.

\newpage

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A - 1EE muestran la secuencia de ADN de 53.577 bases que comprende el gen PKD1 humano normal.

La figura 2 muestra la secuencia de ADN parcial de 894 bases dentro de la región 5' del ADNc de PKD1 humano normal.

La figura 3A muestra una comparación de la secuencia de ADN de la región 5' de los ADNc derivados del gen PKD1 auténtico y de los homólogos de PKD1. Debe introducirse un hueco de 29 pares de bases en la secuencia del gen auténtico para alinear las dos secuencias. Además, el ADNc de PKD1 auténtico y el ADNc homólogo de PKD1 difieren en la posición 418 de esta figura. La figura 3B muestra la secuencia de ADN de un oligonucleótido que puede utilizarse para discriminar entre la secuencia de PKD1 auténtico y los homólogos de PKD1. El asterisco indica una modificación de bloqueo de la polimerización.

La figura 4 muestra la región del cromosoma 16 que contenía el locus de PKD1. El panel superior muestra los sitios de restricción NotI, así como los marcadores genéticos identificados previamente en esta región. El panel inferior muestra los clones de P1 que cubren esta región.

La figura 5 muestra un mapa de restricción de un clon P1 denominado 91.8B, que contiene el gen PKD1 auténtico.

La figura 6 muestra una comparación entre una secuencia de ADNc de PDK1 parcial notificada previamente y la secuencia notificada en el presente documento. La secuencia superior es la notificada para el ADNc, mientras que la secuencia inferior es la secuencia genómica de la presente invención. Las discrepancias están destacadas mediante letra minúscula en la secuencia de ADNc y mediante recuadros en la secuencia genómica.

La figura 7 muestra una ilustración de la estructura genómica de PKD1 tal como se pronostica mediante GRAIL2. Los exones pronosticados se representan como recuadros a lo largo de la secuencia genómica. El ADNc notificado está en la parte superior derecha. La posición de la región rica en GC de 2,5 kb se indica mediante el recuadro rayado en la parte inferior.

La figura 8 muestra regiones de homología en el gen PKD1 entre secuencias codificadas por los exones pronosticados por GRAIL2 y las proteínas presentes en las bases de datos SwissProt y PIR. Las posiciones en las que las secuencias de PKD1 se corresponden con la secuencia consenso están sombreadas.

La figura 9 muestra los resultados del atrapamiento de exones dentro del locus de PKD1.

Descripción detallada de la invención Definiciones

1. "APKD", tal como se utiliza en el presente documento significa poliquistosis renal del adulto, que se caracteriza por el desarrollo de quistes renales y, en última instancia, insuficiencia renal, y puede implicar, alternativamente o además, quistes en otros órganos que incluyen hígado y bazo, así como anomalías gastrointestinales, cardiovasculares y musculoesqueléticas.

2. El término "gen PKD1" se refiere a una secuencia genómica de ADN que mapea para la posición cromosómica 16p13.3 y da lugar a una molécula de ARN mensajero que codifica para la proteína PKD1. El gen PKD1 engloba la secuencia mostrada en la figura 1, que incluye intrones y supuestas secuencias reguladoras. El término "auténtico" se utiliza en el presente documento para indicar la secuencia genómica en esta localización, así como las secuencias derivadas de la misma, y sirve para distinguir estas secuencias auténticas de los "homólogos de PKD1" (véase más adelante.)

3. "ADN complementario (ADNc) de PKD1" se define en el presente documento como una molécula de ADN sin intrones de cadena sencilla o cadena doble que se deriva del gen PKD1 auténtico y cuya secuencia, o complemento de la misma, codifica para la proteína PKD1.

4. Un gen PKD1 "normal" se define en el presente documento como un gen PKD1, cuya expresión alterada, defectuosa o no funcional conduce a poliquistosis renal del adulto. Un gen PKD1 normal no está asociado con la enfermedad y, por tanto, se considera que es una versión de tipo natural del gen. En esta categoría se incluyen las variantes alélicas en el gen PKD1, también denominados polimorfismos alélicos, es decir, versiones alternativas del gen PKD1, no asociadas con la enfermedad, que puede representarse en cualquier frecuencia en la población. También se incluyen las alteraciones en la secuencia de ADN, ya se produzcan por recombinación o de manera natural, que no tienen un efecto evidente sobre la expresión o la función del producto del gen PKD1.

5. Un gen PKD1 "mutante" se define en el presente documento como un gen PKD1 cuya secuencia se ha modificado mediante transiciones, transversiones, deleciones, inserciones u otras modificaciones con respecto al gen PKD1 normal, modificaciones que producen cambios detectables en la expresión o la función del producto del gen PKD1, incluyendo la producción de la enfermedad. Las modificaciones pueden suponer desde uno hasta varios miles de nucleótidos, y dar como resultado uno o más de una variedad de cambios en la expresión del gen PKD1, tal como, por ejemplo, el aumento o la disminución de las tasas de expresión, o la expresión de un transcrito de ARN o producto proteico defectuosos. Los genes PKD1 mutantes engloban aquellos genes cuya presencia en una o más copias en el genoma de un individuo humano está asociada con APKD.

6. Un "homólogo de PKD1" es una secuencia que está estrechamente relacionada con PKD1, pero que no codifica para el producto del gen PKD1 auténtico expresado. Los presentes inventores han identificado y secuenciado varios ejemplos de tales homólogos que mapean para la localización cromosómica 16p13.1.

7. Un "portador de PKD1" se define en el presente documento como un individuo que porta al menos una copia de un gen PKD1 mutante que produce la enfermedad. Dado que la enfermedad generalmente muestra un patrón de transmisión autosómico dominante, los portadores de PKD1 tienen una alta probabilidad de desarrollar algún síntoma de PKD. Por tanto, es probable que un portador de PKD1 sea un "paciente de PKD".

8. Tal como se denomina en el presente documento, un "cóntigo" es un tramo continuo de ADN o secuencia de ADN, que puede representarse mediante clones o secuencias múltiples, solapantes.

9. Tal como se denomina en el presente documento, un "cósmido" es un plásmido de ADN que puede replicarse en células bacterianas y que alberga grandes insertos de ADN de desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 45 kb de longitud.

10. El término "clones de P1" se refiere a ADN genómicos clonados en vectores basados en los mecanismos de replicación del fago P1. Estos vectores generalmente albergan insertos de aproximadamente 70 a aproximadamente 105 kb (Pierce et al., Proc. Notl. Acad. Sci., USA, 89: 2056-2060, 1992).

11. Tal como se usa en el presente documento, el término "atrapamiento de exones" se refiere a un método para aislar secuencias genómicas de ADN que están flanqueadas por sitios de corte y empalme donador y aceptor para el procesamiento del ARN.

12. El término "análisis de polimorfismo conformacional de cadena sencilla" (SSCP) se refiere a un método para detectar diferencias de secuencia entre dos ADN, comprendiendo la hibridación de las dos especies con detección de apareamiento erróneo posterior mediante electroforesis en gel. (Ravnik-Glavac et al., Hum. Mol. Genet., 3: 801, 1994.)

13. "Escisión HOT" se define en el presente documento como un método para detectar diferencias de secuencia entre dos ADN, que comprenden la hibridación de las dos especies con detección de apareamiento erróneo posterior mediante escisión química (Cotton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397, 1988).

14. "Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante" (DDGE) se refiere a un método para resolver dos fragmentos de ADN de longitud idéntica partiendo de la base de las diferencias de secuencia de tan sólo un único cambio de un par de bases, utilizando electroforesis a través de un gel que contiene diversas concentraciones de agente desnaturalizante (Guldberg et al., Nuc. Acids Res., 22: 880, 1994.)

15. Tal como se usa en el presente documento, "oligonucleótidos específicos de secuencia" se refiere a conjuntos relacionados de oligonucleóticos que pueden utilizarse para detectar mutaciones o variaciones alélicas en el gen PKD1.

16. Tal como se usa en el presente documento, "oligonucleótidos específicos de PKD1" se refiere a oligonucleótidos que hibridan con secuencias presentes en el gen PKD1 auténtico expresado y no con homólogos de PKD1 u otras secuencias.

17. "Amplificación" de ADN, tal como se usa en el presente documento, indica una reacción que sirve para aumentar la concentración de una secuencia de ADN particular dentro de una mezcla de secuencias de ADN. La amplificación puede llevarse a cabo utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki et al., Science, 239: 487, 1988), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación basada en ácidos nucleicos específicos (NSBA), o cualquier método conocido en la técnica.

18. "RT-PCR", tal como se usa en el presente documento, se refiere a reacción en cadena de la polimerasa y transcripción inversa acopladas. Este método de amplificación utiliza una etapa inicial en la que se usa un oligonucleótido específico, oligo dT, o una mezcla de cebadores aleatorios para cebar la transcripción inversa del ARN en ADNc de cadena sencilla; este ADNc se amplifica entonces usando técnicas de amplificación convencionales, por ejemplo, PCR.

19. Un gen PKD1 o ADNc de PKD1, ya sea normal o mutante, correspondiente a una secuencia particular, se entiende que incluye alteraciones en la secuencia particular que no cambian las propiedades inherentes de la secuencia. Se entenderá que pueden añadirse nucleótidos adicionales a los extremos terminales 5' y/o 3' del gen PKD1 mostrado en la figura 1, o el ADNc de PKD1 mostrado en la figura 2, como parte de las manipulaciones del ADN recombinante de rutina. Además, también pueden adaptarse sustituciones conservativas de ADN, es decir, cambios en la secuencia de la región que codifica para la proteína que no cambian la secuencia de aminoácidos codificados.

La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, engloba el gen humano para PKD1. Las mutaciones en este gen están asociadas con la aparición de poliquistosis renal del adulto. En la figura 1 se muestra una versión "normal" de la secuencia genómica, correspondiente a 53.577 bases del extremo 5' del gen PKD1.

La secuencia del gen PKD1 se determinó utilizando la estrategia descrita en el ejemplo 1. Brevemente, se ensamblaron una serie de clones de ADN de P1 y de cósmido que contenían secuencias solapantes de ADN genómico humano que colectivamente cubren un segmento de 750 kilobases del cromosoma 16 que se sabe que contiene el locus de PKD1. Para identificar las secuencias transcritas dentro de este segmento de 750 kb, incluyendo aquellas secuencias que codifican para PKD1, se emplearon tanto técnicas de atrapamiento de exones como de selección de ADNc. Al mismo tiempo, se llevó a cabo la secuenciación directa del ADN de las secuencias de ADN humano contenidas en los clones genómicos, utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Éstas incluyen el aislamiento de subclones del cósmido o los clones de P1 particulares. Se crearon deleciones anidadas a partir de los subclones seleccionados, y las deleciones anidadas se sometieron entonces a secuenciación directa de ADN utilizando un secuenciador automático ALF^{MR} (Pharmacia, Uppsala, Suecia).

En la figura 2 se muestra una secuencia parcial de ADNc de PKD1. Este fragmento de ADNc en 5', que comprende 894 bases, abarca los nucleótidos 4378 a 5271 de la secuencia mostrada en la figura 1.

La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, engloba oligonucleótidos aislados correspondientes a secuencias dentro del gen PKD1, o dentro del ADNc de PKD1, que solas o juntas, pueden utilizarse para discriminar entre el gen PKD1 auténtico expresado y los homólogos de PKD1 u otras secuencias repetidas. Estos oligonucleótidos pueden ser de desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 18 nucleótidos, pueden ser de cadena sencilla o doble, y pueden marcarse o modificarse, tal como se describe más adelante. Un ejemplo de un oligonucleótido que puede usarse de esta manera se muestra en la figura 3B. La función de discriminación de este oligonucleótido se basa en una comparación de la secuencia del gen PKD1 auténtico con tres ADNc derivados de los homólogos de PKD1, lo que reveló que los ADNc homólogos contienen una inserción de 29 pb en relación con la secuencia de PKD1 auténtico (figura 3A). El oligonucleótido mostrado en la figura 3B está modificado en su extremo 3' terminal, de manera que no soporta reacciones de polimerización, y está diseñado para que hibride específicamente con la secuencia homóloga y no con la secuencia de PKD1 auténtico. Cuando este oligonucleótidos se incluye en las reacciones de amplificación, evita selectivamente la amplificación de las secuencias homólogas de PKD1. De esta manera, las secuencias de PKD1 auténtico se amplifican selectivamente y los homólogos de PKD1, no. Estos oligonucleótidos o sus equivalentes funcionales proporcionan, por tanto, una base para pruebas para determinar la presencia de mutaciones en el gen PKD1 auténtico en un paciente humano (véase el ejemplo 3, más adelante).

La presente invención proporciona un gen PKD1 humano aislado que comprende la secuencia de ADN mostrada en la figura 1.

Las secuencias particulares pueden representar alelos "normales" de PKD1, incluyendo variantes alélicas, o alelos "mutantes", que están asociados con los síntomas de la enfermedad. Las secuencias derivadas de PKD1 también pueden estar asociadas con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, potenciadores ("enhancers"), elementos de respuesta, secuencias señal, secuencias de poliadenilación, y similares. Además, los ácidos nucleicos pueden modificarse para alterar la estabilidad, solubilidad, afinidad de unión, y especificidad. Por ejemplo, las secuencias derivadas de PKD1 pueden metilarse selectivamente.

El ADN puede comprender oligonucleótidos antisentido, y puede incluir además derivados de metilfosfonato, fosforoamidato y fosforotioato resistentes a nucleasas, así como "ácido nucleico proteico" (PNA) formado conjugando las bases con una estructura principal de aminoácidos descrita en Nielsen et al., 1991, Science, 254: 1497. El ADN puede derivatizarse mediante la unión del nucleótido \alpha-anómero o mediante la formación de un enlace metil o etil fosfortriéster o alquil fosforamidato. Además las secuencias de ácido nucleico de la presente invención también pueden modificarse como un marcador que puede proporcionar una señal detectable, bien directa o indirectamente. Ejemplos de marcadores incluyen radiosiótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares.

En general, las manipulaciones de ácido nucleico según la presente invención usan métodos que se conocen bien en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª Ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor), o Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith y Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY, NY, 1992).

La invención también proporciona vectores que comprenden una secuencia de ADN, tal como se define en las reivindicaciones. Se han descrito un gran número de vectores, incluyendo vectores plásmidos y fúngicos, para la expresión en una variedad de huéspedes eucariotas y procariotas, y pueden usarse para la terapia génica, así como para la simple expresión de proteínas. Ventajosamente, los vectores también pueden incluir un promotor operativamente unido a la parte que codifica para PKD1.

La PKD1 codificada puede expresarse utilizando cualquier vector adecuado, tal como pREP4, pREP8 o pCEP4 (In Vitrogen, San Diego, CA), y cualquier célula huésped adecuada, utilizando métodos descritos o citados en el presente documento, o en cualquier caso conocidos por los expertos en la técnica pertinente. La elección particular del vector / huésped no es crítica para el funcionamiento de la invención.

Los vectores de clonación recombinantes a menudo incluirán uno o más sistemas de replicación para clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión. Las secuencias que codifican para PKD1 insertadas pueden sintetizarse, aislarse a partir de fuentes naturales, o prepararse como híbridos, por ejemplo. El ligamiento de las secuencias que codifican para PKD1 a los elementos reguladores de la transcripción y/u otras secuencias que codifican para aminoácidos puede lograrse mediante métodos conocidos. Las células huésped adecuadas pueden transformarse / transfectarse / infectarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo electroporación, captación de ADN mediada por CaCl_{2}, infección fúngica, microinyección, microproyectil u otros métodos establecidos.

Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, arqueobacterias, hongos, especialmente levaduras, y células vegetales y animales, especialmente células de mamíferos. De particular interés son E. coli, B. subtilis, Saccharomvces cerevisiae, células SF9, células C129, células 293, Neurospora, y células CHO, células COS, células HeLa y líneas celulares linfoides y mieloides inmortalizadas de mamífero. Los sistemas de replicación preferidos incluyen M13, ColE1, SV40, baculovirus, lambda, adenovirus, cromosomas artificiales, y similares. Se han aislado un gran número de regiones reguladoras del inicio y la terminación de la transcripción y han demostrado ser eficaces en la transcripción y la traducción de las proteínas heterólogas en los diversos huéspedes. Ejemplos de estas regiones, métodos de aislamiento, manera de manipulación y similares, se conocen en la técnica. En las condiciones de expresión apropiadas las células huésped pueden utilizarse como una fuente de PKD1 producida de manera recombinante.

Esta invención también contempla el uso de organismos uni o multicelulares cuyo genoma se ha transfectado o transformado mediante la introducción de secuencias que codifican para PKD1 mediante cualquier método adecuado, con el fin de obtener la proteína PKD1 producida de manera recombinante o péptidos derivados de la misma.

Los ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de PKD1 también pueden incorporarse en el genoma de las células del receptor mediante acontecimientos de recombinación. Por ejemplo, una secuencia de este tipo puede microinyertase en una célula y realizar así la recombinación homóloga en el sitio de un gen endógeno que codifica para PKD1, un análogo o pseudogén del mismo, o una secuencia con una identidad sustancial con un gen que codifica para PKD1. También pueden utilizarse otros métodos basados en recombinación, tales como recombinaciones no homólogas o deleción de genes endógenos mediante recombinación homóloga, especialmente en células pluripotentes.

El (los) polipéptidos puede(n) producirse en una célula heteróloga mediante métodos de ADN recombinante, tal como se describió anteriormente. Pueden usarse métodos de purificación de proteínas habituales para aislar polipéptidos relacionados con PKD1, incluyendo paro sin limitarse a extracción con detergentes y métodos cromatográficos incluyendo cromatografía de tamiz molecular, intercambio iónico y afinidad usando anticuerpos o ligandos específicos para PKD1. Cuando el polipéptido de PKD1 que va a purificarse se produce en un sistema recombinante, el vector de expresión recombinante puede comprender secuencias adicionales que codifican para los aminoácidos de los extremos amino-terminal y carboxilo-terminal; esos aminoácidos extra actúan como "marcadores" para la purificación por inmunoafinidad utilizando anticuerpos inmovilizados o para la purificación por afinidad utilizando ligandos inmovilizados.

Pueden derivarse péptidos que comprenden secuencias específicas de PKD1 de los polipéptidos de PKD1 aislados más grandes descritos anteriormente, utilizando escisiones proteolíticas mediante, por ejemplo, proteasas tales como tripsina y tratamientos químicos, tales como bromuro de cianógeno que se conocen bien en la técnica.

Los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales o monoclonales, pueden producirse en respuesta al polipéptido de PKD1 natural o a péptidos sintéticos, tal como se describió anteriormente. Tales anticuerpos pueden obtenerse convenientemente utilizando los métodos y las composiciones descritas en Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, otras referencias citadas en el presente documento, así como tecnologías inmunológicas y de hibridoma conocidas por los expertos en la técnica. Cuando se usan péptidos derivados de PKD1 naturales o sintéticos para inducir una respuesta inmunitaria específica de PKD1, los péptidos pueden acoplarse convenientemente a un vehículo adecuado, tal como KLH y administrarse en un adyuvante adecuado, tal como el de Freunds. Preferiblemente, los péptidos seleccionados están acoplados a un vehículo con núcleo de lisina, sustancialmente según los métodos de Tam, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 5409-5413, 1988. Los anticuerpos resultantes pueden modificarse hasta una forma monovalente, tal como, por ejemplo, Fab, Fab_{2}, FAB' o FV. También pueden prepararse anticuerpos anti-idiotípicos utilizando métodos conocidos.

Los polipéptidos de PKD1 normales o mutantes se utilizan para inmunizar ratones, tras lo cual se extraen sus bazos y los esplenocitos se utilizan para formar híbridos celulares con células de mieloma y para obtener clones y células que secretan anticuerpos según técnicas que son habituales en la técnica. Los anticuerpos monoclonales resultantes se seleccionan para que se unan específicamente a las proteínas PKD1 o a los péptidos relacionados con PKD1.

En otra realización, los anticuerpos se seleccionan para que se unan selectivamente a secuencias de PKD1 normal o mutante. Los anticuerpos que distinguen entre las formas normal y mutante de PKD1 pueden usarse en pruebas diagnósticas (véase más adelante) empleando los inmunoensayos enzimáticos ELISA, EMIT, CEDIA, SLIFA, y similares. También pueden utilizarse los anticuerpos anti-PKD1 para llevar a cabo estudios de localización subcelulares e histoquímicos. Finalmente, pueden utilizarse anticuerpos para bloquear la función del polipéptido de PKD1, ya sea normal o mutante, o para realizar estudios de diseño de fármacos racionales para identificar y probar inhibidores de la función (por ejemplo, utilizando un enfoque de anticuerpo anti-idiotípico).

Identificación de mutaciones que producen enfermedad en PKD1

En un modo de puesta en práctica de la presente invención, el gen PKD1 aislado y secuenciado se utiliza para identificar previamente las versiones desconocidas o mutantes del gen PKD1. En primer lugar, los sujetos humanos con poliquistosis renal heredada se identifican mediante pruebas clínicas, estudios genealógicos y análisis de unión, utilizando los criterios diagnósticos y procedimientos de anamnesis habituales, y se obtienen muestras de ADN o ARN de los sujetos (véase más adelante).

Se emplean entonces una variedad de técnicas para ubicar con exactitud nuevas secuencias mutantes. En primer lugar el ADN de PKD1 puede someterse a secuenciación directa de ADN, utilizando métodos que son habituales en la técnica. Además, pueden detectarse deleciones utilizando un ensayo basado en la PCR, en las que se utilizan pares de oligonucleótidos para cebar las reacciones de amplificación y los tamaños de los productos de amplificación se comparan con los de los productos control. Otras técnicas útiles incluyen el análisis de polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP), la escisión HOT, la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante y la electroforesis en gel bidimensional.

Un factor desconcertante y que causa dificultades en la detección de una mutación de PKD1 es la presencia de homólogos de PKD1 en varios sitios en el cromosoma 16 próximos al gen transcrito. En el análisis de mutaciones en PKD1, es crítico distinguir entre las secuencias derivadas del gen PKD1 auténtico y las secuencias derivadas de cualquiera de los homólogos. Por tanto, una importante característica de la presente invención es la provisión de cebadores de oligonucleótidos que discriminen entre el PKD1 auténtico y los homólogos. Una comparación detallada de las secuencias del gen PKD1 auténtico y de los homólogos permite el diseño de cebadores que discriminan entre el gen PKD1 o el ADNc auténticos o los homólogos. Los cebadores que cumplan con este criterio, tales como los descritos en la figura 3B, pueden utilizarse junto con cualquiera de los métodos analíticos descritos más adelante.

Para SSCP, se diseñan cebadores que amplifican productos de ADN de aproximadamente 250 - 300 pb de longitud a través de segmentos no duplicados del gen PKD1. Para cada producto de amplificación, se utiliza un sistema de gel y dos condiciones para correr en él. Cada producto de amplificación se aplica a un gel de poliacrilamida al 10% que contiene glicerol al 10%. Se someten alícuotas separadas de cada amplímero a electroforesis a 8 W a temperatura ambiente durante 16 horas y a 30 W a 4ºC durante 5,4 horas. Se demostró previamente que estas condiciones identifican el 98% de las mutaciones conocidas en el gen CFTR (Ravnik-Glavac et al., Hum. Mol. Genet., 3: 801, 1994.)

Para la escisión "HOT", se llevaron a cabo las reacciones de amplificación utilizando cebadores específicos de PKD1 radiomarcados. Cada producto de amplificación radiomarcado se mezcla entonces con un exceso molar de 10 veces a 100 veces de productos de amplificación no marcados producidos utilizando cebadores idénticos y ADN de sujetos afectados o no afectados por APKD. Entonces se realiza la formación de heterodúplex, escisión química y análisis en gel tal como está descrito (Cotton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397, 1988). Las bandas en el gel que son más pequeñas que el homodúplex resultan de la escisión química de los heterodúplex en los apareamientos erróneos de pares de bases que incluyen citidina o timidina. Una vez que se ha identificado una mutación mediante este procedimiento, se determina la localización exacta del (de los) apareamiento(s) erróneo(s) mediante secuenciación directa de ADN.

También se identificaron mutaciones mediante DDGE de "amplio espectro" (Guldbereg et al., Nuc. Acid Res. 22: 880, 1994). El uso de cebadores de PCR con abrazadera GC y un gradiente desnaturalizante muy amplio permite la detección eficaz de secuencias mutantes. Este método puede combinarse también con fraccionamiento por tamaños no desnaturalizante en un sistema bidimensional. Se utiliza un aparato que permite la electroforesis bidimensional automática, y la segunda dimensión aumenta considerablemente la resolución de las mutaciones.

Tras detectarse la presencia de una mutación mediante cualquiera de las técnicas anteriores, se identifica la alteración del ácido nucleico específica que comprende la mutación mediante análisis directo de la secuencia de ADN. De esta manera, pueden definirse las mutaciones de PKD1 no identificadas previamente.

Una vez que se define una mutación de PKD1 no identificada previamente, pueden concebirse métodos para detectar la mutación particular en otros individuos afectados, utilizando una variedad de métodos que son habituales en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse sondas de oligonucleótido que permitan la detección y discriminación de la mutación particular. Se entenderá que tales sondas pueden comprender o bien la propia secuencia mutante o bien, alternativamente, pueden flanquear la secuencia mutante. Además, la secuencia de oligonucleótido puede utilizare para diseñar un inmunógeno peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos mutante. Estos péptidos se utilizan entonces para producir anticuerpos que distinguen entre los polipéptidos de PKD1 normal y mutante.

Pruebas diagnósticas para determinar mutaciones de PKD1

Los genes PKD1 mutantes, ya se identifiquen mediante los métodos descritos anteriormente o por otros medios, encuentran uso en el diseño y funcionamiento de pruebas diagnósticas. Las pruebas que detectan la presencia de genes PKD1 mutantes, incluyendo las descritas a continuación y en el ejemplo 3, pueden aplicarse de la siguiente manera:

(1) Para determinar la idoneidad de un donante para trasplantes renales. En general, es deseable utilizar un pariente cercano del receptor del trasplante. Cuando el receptor es un paciente que padece APKD familiar, es importante determinar que el pariente donante no porta también el gen PKD1 mutante familiar.

(2) Para seleccionar individuos de alto riesgo en familias afectadas por APKD. Pueden identificarse los individuos presintomáticos que tienen una alta probabilidad de desarrollar APKD, permitiendo monitorizarlos y aprovecharse de terapias preventivas.

(3) Para dirigir a pacientes hipertensos a tratamiento antihipertensor. La hipertensión también está relacionada con APKD. Puede utilizarse la selección de pacientes hipertensos para determinar la presencia de genes PKD1 mutantes, para identificar pacientes para la regulación preventiva de la tensión arterial para prevenir un posterior daño renal.

(4) Para realizar selección prenatal. La mayor parte del PKD asociado a PKD1 es del tipo de inicio en el adulto. En un pequeño subconjunto de familias que portan una mutación en genes PKD1, sin embargo, el inicio juvenil es común y significa una forma más grave de la enfermedad. En estas familias, la selección prenatal puede ser útil para fines de orientación genética.

En general, las pruebas diagnósticas según la presente invención suponen obtener una muestra biológica de un sujeto y seleccionar la muestra, utilizando todo o parte del gen PKD1 de esta invención, para determinar la presencia de una o más versiones mutantes del gen PKD1 o su producto proteico. El sujeto puede ser un feto in utero, o un paciente humano de cualquier edad.

En una realización, se obtiene una muestra de ADN genómico de un sujeto humano y se somete a ensayo para determinar la presencia de una o más mutaciones de PKD1 asociadas a enfermedad. Este ADN puede obtenerse de cualquier fuente celular o líquido corporal. Ejemplos no limitantes de fuentes celulares disponibles en la práctica clínica incluyen células sanguíneas, células bucales, células cervicovaginales, células epiteliales de la orina, células fetales o cualquier célula presente en tejido obtenido mediante biopsia. Los líquidos corporales incluyen sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, y exudados de tejido en el sitio de infección o inflamación. Se extrae el ADN de la fuente celular o líquido corporal utilizando cualquiera de los numerosos métodos que son habituales en la técnica. Se entenderá que el método particular utilizado para extraer ADN dependerá de la naturaleza de la fuente. La cantidad mínima de ADN que ha de extraerse para su uso en la presente invención es de aproximadamente 25 pg (correspondiente a aproximadamente 5 equivalentes celulares de un tamaño de genoma de 4 x 10^{9} pares de bases).

En esta realización, el ensayo utilizado para detectar la presencia de mutaciones puede comprender digestión con enzimas de restricción, secuenciación directa de ADN, hibridación con oligonucleótidos específicos de secuencia, amplificación mediante PCR, análisis de polimorfismo conformacional de cadena sencilla, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DDGE), electroforesis en gel bidimensional y combinaciones de los mismos.

En una realización preferida, se aísla ARN de una célula o tejido que expresa PKD1, preferiblemente linfocitos, utilizando técnicas habituales que incluyen sistemas automáticos tales como los comercializados por Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA). El ARN se somete entonces a amplificación por PCR y transcripción inversa acopladas (RT-PCR). El ADN resultante puede entonces seleccionarse para determinar la presencia de secuencias mutantes mediante cualquiera de los métodos expuestos anteriormente (véase el ejemplo 3 a continuación).

Tal como se trató anteriormente, cualquier método de selección basado en ácidos nucleicos para determinar mutaciones de PKD1 debe poder discriminar entre el gen PKD1 auténtico presente en la localización cromosómica 16p13.3 y homólogos de PKD1 presentes en 16p13.1 y otras localizaciones. Los oligonucleótidos mostrados en la figura 3 son ejemplos de cebadores que discriminan entre las secuencias auténtica y homólogas, y estos oligonucleótidos o sus equivalentes forman una parte importante de cualquiera de tales pruebas diagnósticas. Además los nucleótidos 43.818 a 52.882 de la secuencia de PKD1 de la figura 1 representan una secuencia que es única para el gen PKD1 auténtico y no está presente en los homólogos. Por tanto, los oligonucleótidos derivados de esta región pueden utilizarse en un método de selección para garantizar que se detecta el gen PKD1 auténtico y no los homólogos.

En otra realización, en ensayo utilizado para detectar la presencia de un gen PKD1 mutante supone pruebas para determinar productos génicos mutantes mediante un ensayo inmunológico, utilizando uno de los muchos métodos conocidos en la técnica, tales como por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA, inmunofluorescencia y similares. En esta realización, la muestra biológica se deriva preferiblemente de un tejido que expresa PKD1 tal como el riñón. El polipéptido de PKD1 puede extraerse de la muestra. Alternativamente, la muestra puede tratarse para permitir la detección o visualización de anticuerpos unidos específicamente in situ tal como se produce, por ejemplo, en crioseccionamiento seguido por tinción inmunofluorescente.

Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, pueden producirse contra la proteína PKD1 intacta o péptidos naturales o sintéticos derivados de PKD1. En una realización preferida, los anticuerpos discriminan entre secuencias de PKD1 "normales" y "mutantes" y tienen una afinidad suficientemente alta por polipéptidos de PKD1 de modo que pueden utilizarse en ensayos de rutina.

Se entenderá que el método particular o combinación de métodos utilizado dependerá de la aplicación particular. Por ejemplo, los métodos de selección de alto rendimiento suponen preferiblemente la extracción de ADN o ARN de un tejido fácilmente disponible, seguido por la amplificación de las secuencias de PKD1 particulares e hibridación de los productos de amplificación con un panel de oligonucleótidos específicos.

Aplicaciones terapéuticas

La presente invención engloba el uso de un gen PKD1 humano para la figura 1, en el tratamiento de PKD utilizando los métodos y las composiciones descritos en el presente documento. Puede administrarse todo o parte del gen PKD1 normalmente descrito anteriormente a células renales u otras células afectadas utilizando una variedad de métodos conocidos, incluyendo por ejemplo liposomas, vectores virales, virus recombinantes, y similares. El gen puede incorporarse en vectores de ADN que comprenden adicionalmente elementos reguladores específicos del tejido, que permiten la expresión de PKD1 de una manera específica del tejido. Este enfoque es factible en un alelo de PKD1 mutante particular, cuando está presente en una única copia, simplemente hace que disminuya el nivel de la proteína PKD1 por debajo de un nivel umbral necesario para la función normal, en este caso el aumento de la dosificación génica mediante el complemento con copias normales adicionales del gen PKD1 debe corregir el defecto funcional.

Alternativamente, puede desearse limitar la expresión de un gen PKD1 mutante, utilizando por ejemplo, secuencias antisentido. En esta realización, pueden administrarse oligonucleótidos antisentido a células renales u otras.

Para usos terapéuticos, puede administrarse ADN relacionado con PKD1 de cualquier manera conveniente, por ejemplo, por vía parenteral en un vehículo fisiológicamente aceptable tal como solución salina tamponada con fosfato, solución salina, agua desionizada, o similares. Normalmente, las composiciones se añaden a un líquido fisiológico retenido tal como sangre o líquido sinovial. La cantidad administrada se determinará empíricamente utilizando la experimentación de rutina. Pueden incluirse otros aditivos, tales como estabilizantes, bactericidas y similares, en cantidades convencionales.

Los usos de un gen PKD1 humano de la figura 1 también pueden englobar los usos en el tratamiento de APKD mediante sustitución de proteínas. En una realización, la proteína producida por células huésped transformada o transfectadas con ADN que codifica para el polipéptido de PKD1 de la presente invención se introduce en las células de un individuo que padece de expresión alterada, defectuosa o no funcional del gen PKD1. Este enfoque aumenta la ausencia de proteína PKD1, o la presencia de una proteína PKD1 defectuosa, añadiendo proteína PKD1 funcional. La proteína PKD1 utilizada en el aumento puede comprender un fragmento o fracción subcelular, o puede estar parcial o sustancialmente purificada. En cualquier caso, se formula la proteína PKD1 en un vehículo apropiado, tal como por ejemplo, liposomas, que pueden incluir adicionalmente vehículos, excipientes, estabilizantes convencionales y similares.

Se entenderá que las composiciones terapéuticas de la presente invención no necesitan constituir en sí mismas una cantidad eficaz, puesto que tales cantidades eficaces pueden alcanzarse administrando una pluralidad de tales composiciones terapéuticas.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1 Clonación y secuenciación del gen PKD1 humano A. Métodos

Se subclonaron fragmentos de restricción ordenados en, o bien pBLUEscript (Stratagene, La Jolla, CA) o bien pGEM (Promega, Madison, WI). Se purificaron los plásmidos mediante centrifugación en densidad con CsCl en presencia de bromuro de etidio. Se generaron deleciones anidadas a partir de cada plásmido utilizando ExoIII (Henikoff, S., Methods Enzymol. 155:156-165, 1987) y reactivos enzimáticos adicionales proporcionados por el kit Erase-A-Base (Promega, Madison, WI). Los clones anidados resultantes se analizaron electroforéticamente tras la digestión con la enzima de restricción apropiada y se ordenaron en un conjunto anidado de moldes para secuenciación. Se identificó una serie de mosaico mínima de plásmidos, cada uno difiriendo en aproximadamente 250 pb de los clones flanqueantes, y se utilizó para la secuenciación.

Se prepararon ADN de plásmido para la secuenciación en una de dos maneras. Inicialmente, todos los clones de interés se cultivaron en 2 ml de Super Broth (Tartof et al., BRL Focus 9:12, 1987) durante 20 horas a 37ºC. Se procesaron conjuntos de 12 - 24 simultáneamente utilizando un procedimiento con SDS alcalino modificado seguido por cromatografía de intercambio iónico tal como se describe por el fabricante (Easy-Prep, Pharmacia, Piscataway, NJ). Los rendimientos de ADN de plásmido oscilaron desde 2,5 hasta 25 \mug. Los clones con escaso crecimiento o aquellos cuyos plásmidos generaron una secuencia de calidad inaceptable, se volvieron a cultivar en 100 mL de caldo de Luria y se aisló el ADN de plásmido utilizando columnas Qiagen (Qiagen, San Diego, CA).

Se realizaron reacciones de secuenciación didesoxi en clones de deleción utilizando el kit de secuenciación Auto-Read (Pharmacia, Piscataway, NJ) y cebadores de vector marcado con fluoresceína (M13 universal, M13 inverso, T3, T7 y SP6). Se separaron los productos de reacción sobre geles de acrilamida desnaturalizantes al 6% utilizando el secuenciador de ADN ALF (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se realizó la secuenciación de la segunda hebra utilizando o bien un conjunto opuesto de deleciones anidadas o bien paseo con cebador ("primer walking"). Para el paseo con cebador, se adquirieron los 17meros acostumbrados, escalonados cada 250 pb, de un proveedor comercial (Protogene, Palo Alto, CA). Los ADN de molde preparados mediante Qiagen o gradientes de densidad de CsCl se secuenciaron utilizando los 17meros no marcados mediante inclusión de mezcla de marcaje de flúor-dATP en las reacciones de secuenciación tal como se describe por el fabricante (Pharmacia, Piscataway, NJ). En todos los casos, excepto en la región rica en GC de 2,5 kb, se rescató ADN de cadena sencilla de los clones de deleción utilizando el fago cooperador VCSM13 (Stratagene) esencialmente tal como se describe por el fabricante. Los moldes de cadena sencilla de la región rica en GC de 2,5 kb se secuenciaron utilizando cebador universal marcado con fluoresceína y el kit de secuenciación de ciclo de lectura largo Sequiterm (Epicentre Technologies, Madison, WI) (Zimmerman et al., Biotechniques 17:303-307, 1994). Todos los datos de secuenciación procesados se transfirieron a un ordenador Macintosh Quadra 700 y se ensamblaron utilizando el programa de ensamblaje de secuenciación SEQUENCHER (Gene Codes, Ann Arbor, MI). Para las diferencias que no pudieran resolverse examinando los cromatogramas, o bien se volvieron a secuenciar los moldes o bien se diseñaron cebadores próximos a la ambigüedad y se utilizaron para la resolución de la diferencia de la secuencia. Se realizó la secuenciación de ciclo utilizando el kit de secuenciación de ciclo Sequiterm tal como se describe por el fabricante (Epicentre Technologies, Madison, WI). Se separaron los productos de reacción sobre geles de acrilamida desnaturalizantes y posteriormente se detectaron mediante autorradiografía.

B. Estrategia de secuenciación

En la figura 4 (panel superior) se muestra una región de 700 kpb del cromosoma 16 que contiene el locus de PKD1. Se ensambló un cóntigo que cubre esta región desde los clones P1 solapantes (mostrados en el panel intermedio). El cóntigo se ensambló mediante paseo cromosómico unidireccional desde los extremos del intervalo (ATPL y D16S84) y paseo bidireccional desde varios locus internos (D16S139 y K68). Uno de los clones, 91.8B, parece abarcar el intervalo de PKD1 completo e incluye los cósmidos cDEB11, cGGG10.2 y partes sustanciales de los cósmidos 2H2 y 325A11 (Stallings, R. L. et al., Genomics 13: 1031, 1992). Este clon P1 (mostrado esquemáticamente en la figura 5) se utilizó como un segundo molde genómico para confirmar discrepancias entre la secuencia de ADNc publicada y la secuencia genómica derivada del cósmido.

Los experimentos preliminares revelaron la presencia de múltiples elementos repetitivos en el cósmido cGGG10.2. Por tanto, se utilizó un enfoque ordenado basado en deleciones anidadas, en lugar de subclonación aleatoria, para secuenciar el gen PKD-1. Se subclonaron los fragmentos de restricción derivados de los insertos de cGGG10.2 y cDEB11 en plásmidos de alto número de copias como etapa preliminar para la generación de deleciones anidadas. Se prepararon deleciones unidireccionales y se secuenciaron, utilizando el sistema de secuenciación automática ALF^{MR} (Pharmacia, Uppsala, Suecia).

Las longitudes de lectura promediaron 350 nucleótidos, teniendo en común series superiores a 500 nucleótidos. Esta estrategia permitió la secuenciación rápida y precisa de 53.577 nucleótidos de la secuencia del gen lineal utilizando 1.200 reacciones de secuenciación. Basado en este análisis, la redundancia en veces acumuladas es de aproximadamente 7 veces. Los intervalos de redundancia mínima (3 veces) mostraron una perfecta identidad de secuencia entre moldes solapantes. La única excepción para completar la secuenciación de cadena doble fue la región rica en GC de 2,5 kb en el fragmento BamH1-SacI de 4 kb y una región rica en GC de 150 pb colindante en el fragmento Sac1-BamH1 adyacente. Estos segmentos sólo se secuenciaron en la cadena no codificante debido a las complicaciones que surgen de la naturaleza repetitiva de las secuencias en esta región.

De esta manera, se obtuvo la secuencia genómica de ADN de PKD1 mostrada en la figura 1.

C. Estructura primaria del locus de PKD1

La secuencia primaria del intervalo que engloba el gen PKD1 es de 53.577 pb de longitud. El locus es rico en GC (62,4%) con una razón de dinucleótido CpG/GpC de 0,485. La comparación de esta secuencia con la secuencia de ADNc parcial notificada anteriormente reveló diferencias en tres localizaciones (figura 6). La primera diferencia y más significativa es la presencia de dos residuos de citosina adicionales en la cadena positiva en la posición 4566 de la secuencia notificada. Esta diferencia de secuencia se confirmó utilizando la secuencia derivada del ADNc que se origina a partir de un individuo diferente. Además, se hibridaron oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) homólogos a la secuencia notificada o a la presente secuencia, con los clones de ADNc y genómicos. En todos los casos, el análisis de transferencia puntual ("dot-blot") utilizando condiciones de discriminación de base única mostró que sólo los ASO que contienen los residuos de citosina adicionales se hibridaron a todos los ADN clonados. La presencia de estos dos residuos de citosina dio como resultado un desplazamiento del marco en la secuencia que codifica para la proteína pronosticada, que conduce a la sustitución de 92 aminoácidos del extremo carboxi-terminal por un extremo carboxilo novedoso de 12 aminoácidos. Siete de los doce aminoácidos del nuevo extremo carboxilo están cargados o son polares. Se localizan diferencias de secuencia adicionales en las posiciones 3639-3640 y 3708-3709 de la secuencia publicada (figura 6). Un par de dinucleótido GC está presente en cada una de estas posiciones en la presente secuencia, mientras que se encuentra un par GC en la secuencia notificada. En cada caso, residuos de histidina y valina sustituirían los residuos de glutamina y leucina anteriormente pronosticados, respectivamente. No está claro
en este momento si estas últimas diferencias representan una variación alélica o errores en la secuencia notificada.

Está claro que la secuencia de ADNc anteriormente notificada proporciona una secuencia imprecisa con un marco de lectura incorrecto. Cualquier proteína codificada por la secuencia parcial anterior sería, por tanto, defectuosa y no sugeriría de ninguna manera proteínas codificadas por la secuencia de la presente invención, o de hecho la propia secuencia. Se deduce que el empleo de la secuencia anterior, o de las proteínas codificadas por la misma, en usos terapéuticos o de diagnóstico no sería satisfactorio.

Se analizó la secuencia completa para determinar elementos transcripcionales e islas CpG utilizando el servidor de cliente GRAIL2 (Uberbacher, E. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11261, 1991) y XGrail (Shah et al., User's Guide to GRAIL and GENQUEST, Client-Server Systems, disponible mediante ftp anónima para arthur.epm.omi.gov (128.219.9.76) del directorio pub/grail o pub/xgenquest, como archivo manual.grail-genquest, 1994). Se identificaron diez islas CpG (figura 7). Se pronosticaron cuarenta y ocho exones en la cadena codificante por el programa GRAIL. La calidad de 39 de los 48 exones fue "excelente", seis se consideraron "buenos" y tres se juzgaron "marginales". Estos datos se analizaron utilizando a característica gene model (modelo génico) de GRAIL2. El modelo génico final contenía 46 exones. Cuando se examinó la precisión del modelo génico mediante comparación con el ADNc publicado, se pronoticaron en el modelo 22 de 23 exones en el ADNc publicado. De los 22 exones presentes en el modelo génico, 16 se cortaron y empalmaron correctamente, cuatro estaban contenidos completamente en el modelo pero utilizaron un sitio incorrecto de corte y empalme en 5' o 3' y en un caso dos exones se combinaron en un único exón en el modelo (fallando el programa en la eliminación de un pequeño intrón). Sólo uno de los exones deducidos en el ADNc publicado estaba ausente del modelo génico.

D. Identificación de las regiones codificantes de la proteína

Los exones pronosticados por el programa GRAIL2 con una puntuación de "excelente" se utilizaron para buscar en las bases de datos SwisProt y PIR utilizando el programa BLASTP. Se pronosticó que los exones 3 y 4 del modelo génico codifican para péptidos con homología con varias proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina (LRR) que participan en las interacciones proteína-proteína (figura 8). Además de las propias LRR, las secuencias flanqueantes del extremo amino y carboxilo para las LRR también pueden conservarse en proteínas de la familia de glucoproteína rica en leucina (LRG), ya sea individual o conjuntamente. El exón 3 codifica para los residuos homólogos a las LRR de la glucoproteína \alpha2 rica en leucina, miembros del complejo GP1b.IX que comprende el receptor del factor de von Willebrand, así como las proteínas de Drosophila chaoptina, toll y slit. Estas últimas están implicadas en la adhesión, polaridad dorsoventral y morfogénesis, respectivamente. Se encontró que las secuencias pronosticadas por GRAIL2 que van a estar codificadas por el exón 4 tienen homología con el extremo carboxi-terminal de la región conservada para las LRR en todas las proteínas anteriores excepto chaoptina, que carece de esta región conservada. También se observó homología entre las secuencias codificadas por el exón 4 y el protooncogén trk, que codifica para un receptor para el factor de crecimiento nervioso. El examen adicional del péptido de PKD1 pronosticado reveló regiones adicionales de homología más débil con regiones conservadas de dominio de la tirosina cinasa trk. Ninguno de los exones más próximos en el modelo génico parece codificar para un péptido con homología con la región flanqueante del extremo amino conservada, observado en un subconjunto de las proteínas que contienen LRR.

El atrapamiento de exones, RT-PCR y análisis de inmunotranferencia de tipo Northern revelaron que los exones 3 y 4 pronosticados por GRAIL2 están presentes en las secuencias expresadas. Durante los experimentos de atrapamiento de exones iniciales utilizando clones de plásmido y P1 genómico desde el locus PKD1, se identificó un atrapamiento de exones que contenía ambos de estos exones. En experimentos separados, la presencia del motivo flanqueante del extremo carboxilo de LRR en las secuencias transcritas se confirmó mediante RT-PCR utilizando como molde ARN de riñón fetal y de cerebro de adulto. En la inmunotransferencia de tipo Northern, un fragmento de RT-PCR que contenía este motivo detectó el transcrito de PKD1 de 14 kb y otros transcritos varios de 21 kb, 17 kb y 8,5 kb.

También se observó una región de homología entre el péptido pronosticado por GRAIL2 y los productos génicos humanos gp100/Pmel17, así como con RPE1 bovino. El gen gp100/Pmel 17 codifica para dos productos de corte y empalme alternativamente (gp 10 y Pmel17) que difieren sólo en 7 aminoácidos. El examen más riguroso indicó que esta región de homología estaba presente en secuencias codificadas por tres exones separados pronosticados por GRAIL; sin embargo, sólo el exón que contiene la primera copia del motivo está contenido completamente dentro del modelo génico final.

Los exones 9, 22 y 28 pronosticados por GRAIL2, en el sentido de 5' del ADNc en 3', mostró una fuerte homología con EST T03080 (85%, 255 pb), EST T04943 (98%, 189 pb) y EST T05931 (94%, 233 pb). Además, los nucleótidos 10378-10625 del intrón 1 pronosticado por GRAIL mostró una fuerte homología con una región del gen Apo CII (81%, 263 pb).

E. Secuencias repetidas

Se buscó el locus de PKD1 para las clases conocidas de ADN repetitivo mediante comparación con FASTA frente a la base de datos de repeticiones de Jurka et al. (J. Mol. Evol. 35: 286-291, 1992). Esta búsqueda identificó 23 repeticiones Alu pero no otros elementos repetitivos. Las repeticiones Alu se organizaron en tres grupos de cuatro o más repeticiones Alu, tres grupos de dos repeticiones Alu y dos repeticiones Alu como singlete (figura 7). La densidad media de repeticiones Alu por kb es de 0,4. Los tres grupos de cuatro o más repeticiones Alu se situaron dentro de los primeros 20.000 nucleótidos (0,85 Alu por kb) y están predominantemente en la cadena inversa (15 de 17). Los intervalos 20.000 - 40.000 y 47.000 - 54.000 carecen de repeticiones Alu.

El intervalo de la secuencia contenía dos repeticiones de dinucleótido (> (TG)8) y una repetición de tetranucleótido sencilla ((TTTA)6). Las repeticiones de dinucleótido TG están presentes en las posiciones 209-224 y 52.693-52.708. La repetición de tetranucleótido se sitúa en la posición 7795-7810. No se identificaron repeticiones de trinucleótido > 5. Sólo se sabe que la repetición TG8 es polimórfica.

Además de los elementos repetitivos más habituales, el gen PKD1 contiene varios tipos de secuencias repetidas que o bien no aparecen en las bases de datos existentes, o bien no aparecen en la forma de extremo observada en este locus. La repetición más sorprendente es un segmento de 2,5 kb dentro del fragmento BanH1-Sac1 de 4 kb. También se encuentra una región rica en C-T significativamente más corta en el fragmento Sac1-BamH1 de 1,8 kb colindante. Estas regiones demostraron ser muy difíciles de secuenciar de manera inequívoca debido al alto contenido de GC (65%), a la asimetría de la purina con respecto a cada cadena y a la longitud de la repetición. La cadena codificante en esta región tiene un sesgo de pirimidina de extremo, siendo del 96% de C-T, y no pudo secuenciarse utilizando ADN polimerasa de T7 o Sequenase. Esto fue cierto independientemente del tipo de molde (plásmido, fago de cadena sencilla o ADN de cadena sencilla de cadenas separadas). En ambos casos, la cadena no codificante, que es rica en G-A, se secuenció satisfactoriamente tanto con ADN polimerasa de T7 como con Sequenase, aunque las longitudes de las series se abreviaron perceptiblemente comparado con todas las demás regiones secuenciadas. Se resolvieron las compresiones en la cadena no codificante mediante secuenciación de ciclo y convencional utilizando un molde de cadena sencilla. La asimetría de la purina de extremo de las cadenas en este segmento puede promover la conformación de triple cadena localizada en las condiciones apropiadas (pH, cationes divalentes, superenrollamiento), y puede ser una causa principal de la dificultad en la secuenciación de este segmento.

La otra repetición inusual se localizó en el fragmento Xho1 de 7,6 kb. Esta repetición es de 459 pb de longitud y consiste en 17 copias en tándem de una repetición perfecta de 27 pb.

Ejemplo 2 Secuencias de ADNc de PKD1 obtenidas a través de atrapamiento de exones y técnicas de selección de ADNc

El intervalo de 700 kpb del cromosoma 16 que incluye el gen PKD1 parece ser particularmente rico en islas CpG y, por asociación, es rico, lo más probablemente, en secuencias expresadas también. Para purificar y secuenciar las secuencias de PKD1 expresadas, se utilizó un vector de rescate de exones, pSPL3, para recuperar secuencias a partir de cósmidos que contienen tanto un elemento aceptor de corte y empalme como uno donador de corte y empalme; este método se designa "atrapamiento de exones". La aplicación de este método, junto con métodos habituales de subclonación, amplificación y secuenciación de ADN, permitió la determinación de la secuencia de ADNc de PKD1, tal como se muestra en la figura 2.

El atrapamiento de exones es un método sumamente eficaz para aislar secuencias expresadas a partir de ADN genómico. El procedimiento utiliza el plásmido pSPL3, que contiene secuencias que codifican para \delta-globina de conejo separadas por una parte del gen tat de VIH o derivados mejorados de sitios de corte y empalme crípticos (interferentes) que carecen de SPL3. Se clonaron fragmentos de ADN genómico de PKD1 clonado en el intrón del gen tat y los subclones resultantes se transfectaron en células COS-7. Las secuencias de SV40 en el vector permiten tanto la replicación episómica relajada de los vectores transfectados, así como la transcripción de los ADN genómicos clonados. Los exones dentro de los ADN genómicos subclonados que se cortaron y empalmaron en el transcrito de globina/tat se recuperaron utilizando RT-PCR, utilizando cebadores que contienen las secuencias de donador y aceptor de corte y empalme tat. Una ventaja principal del atrapamiento de exones es que la expresión del ADN clonado se dirige a través de un promotor viral; por tanto, la expresión específica del tejido o desarrollo de los productos génicos no es un problema.

Los clones genómicos que contienen PKD1, en la forma de cósmido o ADN de P1, se digirieron doblemente con BamHI y BglII o se digirieron parcialmente con Sau3A y se clonaron al azar en pSPL3 digerido con BamHI y desfosforilado (GIBCO BRL, Bethesda, MD) o sus derivados. Se sometieron a electroporación minipreparaciones de plásmido en células COS-7 y se recuperaron los exones atrapados mediante RT-PCR, seguido por subclonación, utilizando procedimientos habituales.

Los exones atrapados desde el locus de PKD1 se muestran en la figura 9 (parte inferior). Los exones atrapados se sometieron a secuenciación automática del ADN como anteriormente, permitiendo su alineación con el ADN genómico de PKD1.

Ejemplo 3 Prueba diagnóstica para determinar mutaciones de PKD1

Se centrifugaron muestras de sangre completa recogidas en tubos VacutainerMR con ACD y alta cantidad de glucosa (parte superior amarilla) y se recogió la capa leucocítica. Se lisaron los glóbulos blancos con dos lavados con una mezcla 10:1 (v/v) de NH_{4}Cl 14 mM y NaHCO_{3} 1 mM, se resuspendieron sus núcleos en tampón de lisis de núcleos (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 0,4 M, EDTA 2 mM, 0,5% de SDS, proteinasa K 500 \mug/ml) y se incubaron durante la noche a 37ºC. Entonces se extrajeron muestras con un cuarto de volumen de NaCl saturado y se precipitó el ADN en etanol. Entonces, se lavó el ADN con etanol al 70%, se secó y se disolvió en tampón TE (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM). Luego, se añadieron 0,2 - 1 \mug de ADN (en 1 - 2 \mul) a una mezcla de reacción de PCR que contenía los siguientes componentes:

\newpage

Tampón 10X Taq	8 \mul
dNTPS (2 mM cada uno)	7 \mul
Cebador directo (100 \muM)	1,5 \mul
Cebador inverso (100 \muM)	1,5 \mul
Oligo de bloqueo (2 mM)	1,5 \mul
Taq ADN polimerasa	1 \mul
agua	hasta 80 \mul

Se realizaron entonces treinta ciclos de amplificación, utilizando un ciclador térmico de ADN habitual y el siguiente protocolo para cada ciclo: 94ºC, 30 segundos; 55ºC, 30 segundos; y 72ºC, 30 segundos. Se entenderá que las enzimas y nucleótidos utilizados en las reacciones anteriores pueden obtenerse de cualquier fabricante, tal como GIBCO-BRL, Promega, New England Biolabs, y similares.

El cebador directo utilizado en la reacción descrita anteriormente comprende un oligonucleótido que se hibrida tanto con secuencias de PKD1 auténticas como homólogas a PKD1. Un ejemplo de un cebador tal es: 5'-CAGGACCTGTCCCAGGCAT-3'. El cebador inverso comprende una secuencia derivada de una región en 3' del gen PKD1 auténtico, que puede o no estar presente en los homólogos de PKD1. Ejemplos de cebadores inversos adecuados son:

5'-CTGGCGGGCGAGGAGAT-3', 5'-CTTTGACAAGCACATCT-3', \hskip0,3cm y \hskip0,3cm CAACTGGCTGGACAACA-3'.

El oligonucleótido de bloqueo comprende: 5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'. De manera importante, este oligonucleótido debe no poder soportar la polimerización. Un ejemplo es un oligonucleótido en el que el nucleótido terminal en 3' comprende un didesoxinucleótido. Se entenderá que puede utilizarse cualquier modificación que consiga este efecto en la práctica de la invención. En condiciones apropiadas, el oligonucleótido de bloqueo se hibrida eficazmente con homólogos de PKD1 pero ineficazmente con la secuencia de PKD1 auténtica. Por tanto, los productos de amplificación en esta prueba de diagnóstico se derivan solamente del gen PKD1 auténtico.

Los productos de RT-PCR obtenidos anteriormente se analizan para determinar la presencia de mutaciones de PKD1 específicas tal como sigue:

Se añaden 8 \mul del producto amplificado preparado tal como se describió anteriormente a 50 \mul de una solución desnaturalizante (NaOH 0,5 mM, NaCl 2,0 M, EDTA 25 mM) y se pusieron como un punto sobre filtros de membrana de nylon (INC Biotrans). Entonces, se fija el ADN a las membranas cociendo los filtros a 80ºC durante 15 minutos a vacío.

Se sintetizan químicamente oligonucleótidos que detectan mutaciones de PKD1 utilizando un sintetizador automático y se radiomarcó con ^{32}P con polinucleótido cinasa, utilizando métodos que son habituales en la técnica.

Se llevaron a cabo hibridaciones en bolsas de plástico que contenían los filtros preparados como en el ejemplo 1D anterior, a las que se añadió uno o más oligonucleótidos marcados en un tampón de hibridación (cloruro de tetrametilamonio (TMAC) 3,0 M; 0,6% de SDS, EDTA 1 mM, fosfato de sodio 10 mM pH 6,8, solución de Denhart 5x y ARN de levaduras 40 \mug/ml). Las concentraciones de oligonucleótido en las combinaciones oscilan desde 0,03 hasta 0,15 pmol/ml de solución de hibridación.

Se permitió que las hibridaciones continuaran durante la noche a 52ºC, con agitación. Las membranas se retiraron entonces de las bolsas y se lavaron durante 20 min. a temperatura ambiente con tampón de lavado (TMAC 3,0 M, 0,6% de SDS, EDTA 1 mM, fosfato de sodio 10 mM pH 6,8) seguido por un segundo lavado en el mimo tampón durante 20 min. a 52ºC. Entonces, se secaron las membranas y se expusieron a película Kodak X-OMAT.

Claims (17)

1. Gen PKD1 humano aislado, que comprende la secuencia de ADN expuesta en la figura 1.

2. Vector recombinante que comprende la secuencia de ADN según la reivindicación 1.

3. Vector según la reivindicación 2, que comprende además un elemento regulador transcripcional unido operativamente a dicha secuencia de ADN de PKD1, teniendo dicho elemento la capacidad para dirigir la expresión de genes de células procariotas y eucariotas y sus virus o combinaciones de los mismos.

4. Célula que comprende el vector según la reivindicación 2.

5. Método para producir la proteína PKD1, que comprende:

(a) cultivar la célula según la reivindicación 4 en un medio y en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, y

(b) aislar dicha proteína expresada.

6. Gen PKD1 humano aislado según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de ADN expuesta en la figura 1.

7. Ácido nucleico aislado que comprende:

5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'.

8. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 7, que consiste en;

5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'.

9. Método de diagnóstico para seleccionar sujetos humanos, para identificar portadores de PKD1, que comprende someter a ensayo para determinar la presencia de genes PKD1 mutantes en una muestra de material biológico obtenida de dicho sujeto.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho material biológico comprende ácido nucleico, y dicho ensayo comprende:

(a) amplificar selectivamente la secuencia del gen PKD1 de la figura 1, a partir de dicho material biológico; y

(b) detectar la presencia de genes PKD1 utilizando un método analítico seleccionado del grupo que consiste en: digestión con enzimas de restricción, secuenciación directa de ADN, hibridación con oligonucleótidos específicos de secuencia, análisis del polimorfismo conformacional de cadena sencilla, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DDGE), electroforesis en gel bidimensional y combinaciones de los mismos.

11. Método según la reivindicación 10, en el que dicho ácido nucleico comprende ARN y dicho método comprende además transcribir selectivamente dicho ARN de PKD1 antes de dicha etapa de amplificación.

12. Método según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que dicha amplificación se realiza en presencia de un oligonucleótido que comprende:

5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'

13. Anticuerpo aislado dirigido contra un péptido con la secuencia LRAKNKVHPSST.

14. Uso de un gen PKD1 humano de la figura 1 en la preparación de un agente para tratar un estado de enfermedad que tiene las características de APKD.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que dicho gen PKD1 comprende la secuencia de ADN de la figura 1.

16. Composición para tratar un estado de enfermedad que tiene las características de APKD, comprendiendo dicha composición un gen PKD1 humano aislado que tiene la secuencia de ADN de la figura 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

17. Composición según la reivindicación 16, que comprende un vector en el que se incorpora dicho gen PKD1.