JPH0726963B2 - 悪性腫瘍に対する抗体、及びこの抗体を用いた悪性腫瘍の判別方法 - Google Patents

悪性腫瘍に対する抗体、及びこの抗体を用いた悪性腫瘍の判別方法

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JPH0726963B2
JPH0726963B2 JP1338686A JP33868689A JPH0726963B2 JP H0726963 B2 JPH0726963 B2 JP H0726963B2 JP 1338686 A JP1338686 A JP 1338686A JP 33868689 A JP33868689 A JP 33868689A JP H0726963 B2 JPH0726963 B2 JP H0726963B2
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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、腫瘍細胞が良性か悪性か否かを判別する悪性
腫瘍の判別に用いるSTA陽性物質に対する抗体、及びこ
の抗体を用いた悪性腫瘍の判別方法に関するものであ
る。
(発明の背景) 細胞質や細胞膜の糖鎖構造が癌化に伴なって変化するこ
とが知られている。このような糖鎖構造の変化に基づ
き、特定のオリゴ糖と強く反応するレクチンがしばしば
用いられている。しかし従来知られているレクチンは何
れも癌の種類に特異的なものであり、癌組織であるか否
かを判別するのに広く一般的に使用できるものはなかっ
た。
癌細胞であるか否かは、組織標本を形態学的に観察すれ
ば、正常組織の組織像との相違から或る程度は判定出来
る。しかしながら、良性腫瘍の中には悪性腫瘍と見分け
にくいものもあり、単なる形態学的な観察だけでは十分
な判別はできなかった。
このような状況下において、本発明者は、種々のレクチ
ンについて癌組織との反応性を調べたところ、STA(シ
ャガイモレクチン:Solanum Tuberosum Lectin)が上皮
性、間葉性を問わず多くの癌細胞と結合することを見出
し、STAを用いた腫瘍判別方法を提案した(特願平1−2
78623)。
このSTAを用いた腫瘍判別方法は、悪性腫瘍に対する特
異性が大きくまた偽陰性が殆どないという点で従来方法
に比べ優れた方法である。しかしながら、組織によって
は(例えば肝臓組織などでは)、正常細胞や良性腫瘍の
組織標品とも結合して偽陽性を示すことがあるという問
題を残していた。
STAはN−アセチル−D−グルコサミンに特異的に結合
するレクチンであり、この糖鎖が悪性腫瘍のみならず組
織によっては正常細胞にも存在するため、上記のような
偽陽性が生じるものと思われる。
そこで発明者は、「STAが結合するN−アセチル−D−
グルコサミンだけでなく、この糖鎖を伴なう蛋白質によ
る或る特殊構造が、癌化に伴なって産生される」という
仮説のもとに、この特殊構造(STAとの結合部位を含む
領域の物質という意味で、以下STA陽性物質という)を
探しだし、その抗体を得て、この抗体がSTA同様癌組織
と結合することを確認した。この抗体は、STAが認識す
るN−アセチル−D−グルコサミン糖鎖だけでなく、こ
の糖鎖を含めた癌化に伴なう特殊構造(すなわちSTA陽
性物質)を識別するものであるから、単にN−アセチル
−D−グルコサミンだけを産生するにすぎない正常組織
と結合することがないものと期待できる。
本発明はこのような知見に基づき完成されたものであ
る。
(発明の目的) すなわち本発明は、偽陽性を生じることがない悪性腫瘍
の判別方法、及びその方法に使用する抗体を提供するこ
とを目的とする。
(発明の構成) このような本発明の目的は、STA陽性物質を抗原として
認識する抗体を使用した悪性腫瘍の判別方法により達成
される。
すなわち腫瘍組織標品をSTA陽性物質に対する抗体で処
理し、この抗体の有無を形態学的に観察する悪性腫瘍の
判別方法により達成される。
STA陽性物質は悪性腫瘍細胞に存在するものであるか
ら、その遺伝子断片をクローニングしてSTAと結合する
蛋白質領域として得ることができる。具体的には、悪性
腫瘍細胞の遺伝子ライブラリーを適当なプラスミドに組
込んだりファージにパックして宿主細胞にトランスフェ
クトし、STAと結合する細胞、即ちSTA陽性物質産生細胞
を選び出し、これを大量培養してSTA陽性物質を得るこ
とができる。悪性腫瘍細胞の遺伝子ライブラリーは適当
な癌組織細胞から取得してもよく、また市販の遺伝子ラ
イブラリーを使用してもよい。
得られたSTA陽性物質を免疫源とすれば、常法によって
目的の抗体を得ることができる。好ましい態様の抗STA
陽性物質抗体(STA陽性物質を抗原として認識する抗
体)は、ヒト甲状腺癌の遺伝子断片をλファージベクタ
ーλgt11に挿入した遺伝子ライブラリーでトランスフェ
クトして得られた大腸菌菌株のうちSTAと結合する大腸
菌菌株(FERMP-11164)の菌体破砕物を免疫源として得
られた抗体であって、悪性腫瘍組織に特異的に結合する
抗体である。抗体はポリクローナルなものでもよいが、
モノクローナル抗体とすればさらに感度の良い判別方法
として使用できる。
本発明による悪性腫瘍の判別方法は、常法により作製し
た組織標品切片または細胞懸濁液を、抗STA陽性物質抗
体で処理し、鏡検により抗体結合の有無、その分布を観
察することにより、悪性腫瘍であるか否かを判定する。
この際、ローダミンやテキサスレッド等の色素やFITCな
どの蛍光色素で標識した抗体を用いれば、形態学的観察
は容易となる。あるいはペルオキシダーゼやアルカリホ
スファターゼなどの酵素やビオチンなど標識した抗体を
用い、抗体処理後にその酵素反応を利用した特殊染色を
行なってもよい。この際には観察を容易にするため核染
色を行まってもよい。またこのような標識抗体を使わな
い場合には、抗体処理後に抗IgG抗体で処理し、ペルオ
キシダーゼ・抗ペルオキシダーセ法などにより特殊染色
する免疫組織化学的観察を行なってもよい。
電子顕微鏡により抗体結合の有無を観察する場合には、
フェリチン標識した抗体を用いるのが好ましい。この場
合には通常の電子顕微鏡標品の作製手順に従って鏡検試
料を作製する。
(実施例) 癌細胞の遺伝子ライブラリーとして、ヒト甲状腺癌の遺
伝子断片(EcoRI断片)をλファージλgt11のEcoRI部位
に挿入したcDNAライブラリー(Clontech社製)を使用し
た。
宿主大腸菌Y1090r-を予めLB培地(トリプトン 10g、酵
母エキス 5g,NaCl 10g,マルトース 2g,水1、pH7.
5,アンピシリン100μg/ml)で37℃一晩培養して飽和密
度まで増殖させた。この菌液0.2mlを前述のcDNAライブ
ラリー希釈液(3×104pfu/プレート,10mM Tris-HCl,10
mM MgCl2,pH7.5)0.1mlと共にLBプレート(LB培地に寒
天15g/を加え、プレート(90mm)当り25〜30ml注いで
固めたもの)に塗布して播種した。室温下29分間放置し
てファージを菌内に吸収させた後、2.5mlのソフトアガ
ーを重層し、42℃、3.5時間インキュベート後、37℃で
1日培養した。
培養後の各プレートにニトロセルロースフィルター(予
め10mMI PTG水溶液に浸したもの)を位置決めして重
ね、37℃で3.5時間インキュベートしレプリカを調製し
た。各フィルターをTBST溶液(10mM Tris-HCl,pH8.0,15
0mM NaCl,0.05%Tween20)で洗浄した後、ビオチン標識
STA溶液(ビオチン標識ジャガイモレクチン:EY−ラボラ
トリー社製:500倍希釈)に入れ30分間インキュベートし
た。次いでこのフィルターをTBST溶液で洗浄後、アビジ
ン−ビオチン複合体溶液に30分間浸漬した。次いでTBST
溶液で洗浄後、0.01%3,3′−ジアミノベンジジン−50m
M Tris-HCl緩衝液(pH7.6)に3〜10分間浸して発色さ
せた。こうして発色したコロニーを同定し、STA陽性物
質産生菌を選択した。このSTA陽性物質産生菌株は菌株
名E.coli MF−0001として工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている(微工研菌寄第11164号:FERM P−
11164)。
STA陽性物質産生菌株E.coli MF−0001をLB培地で一晩培
養し、その菌液を超音波処理した。得られた菌体破砕物
を抗原としてマウス(Balb/C系)に免疫した。4週目に
ブーストをかけ、免疫5週目に採血して抗血清を得た。
これを抗STA陽性物質抗体として以下の実施例に用い
た。
抗STA陽性物質抗体による染色は、ヒト甲状腺の乳頭腺
癌(悪性腫瘍)と正常組織について行なった。
外科手術から得た各組織を10%緩衝ホルマリン溶液で固
定したバラフィン包埋してミクロトーム切片(厚さ4μ
m)を調製した。脱パラフィン後PBSで数回洗浄し、抗S
TA陽性物質抗体(抗血清)の40倍希釈液に浸漬し37℃で
60分間処理した。この組織切片をPBSで数回洗浄し、ペ
ルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗血清(フナコシ社
製)と60分間反応させた。次いで、PBSで数回洗浄後ア
ビジン・ビオチン・ベルオキシダーゼ複合体と60分間反
応させ、PBS洗浄して0.01%3,3′−ジアミノベンジジン
−50mM Tris-HSl緩衝液(pH7.6)に3〜10分間浸して発
色させた。発色後、ヘマトキシリンにより核染色した。
この後蒸留水で洗浄、さらに脱水して、スライドガラス
に封入し、鏡検した。
比較例として、特願平1−278623の実施例記載の方法に
従ってSTA染色を行なった。
すなわち組織切片を脱パラフィン後、PBSで洗浄、0.3%
22−メタノール溶液で20分間処理した。PBSで洗浄
し、0.1%BSA(牛血清アルブミン)溶液で5分間処理
し、HRP−HRP−STA(西洋ワサビペルオキシダーゼ標識
ジャガイモレクチン:EY−ラボラトリー社製)溶液の40
倍希釈液に浸漬し室温で30分間処理した。次いでこの組
織切片を0.1%BSA溶液で5分間処理後PBSで洗浄し、0.0
1%3,3′−ジアミノベンジジン−50mM Tris-HCl緩衝液
(pH7.6)に3〜10分間浸して発色させた。発色後、ヘ
マトキシリンにより核染色した。この後蒸留水で洗浄、
さらに脱水して、スライドガラスに封入して比較例とし
た。
抗STA陽性物質抗体による染色では、第1、2、3図に
示すように、甲状腺癌の細胞質は褐色に染色された。ま
た正常組織では抗STA陽性物質抗体による染色は認めら
れなかった。すなわち第1図の正常組織の腺細胞(図面
中央、中央右、右上部などに見られる空腔の内周に分布
している、比較的、核が大きい細胞)には染色が認めら
れないが、第1図下右隅の癌組織は染色されていた。第
2図は癌細胞が密集した甲状腺癌組織の写真図であり、
比較的、核が大きく薄く核染色されている腺癌の細胞質
が茶褐色に染色されていた。癌化した腺細胞で形成され
る空腔の中には多数のリンパ球様の細胞が浸潤してるの
が観察できた。
第3図は低倍率での甲状腺組織の鏡検像である。図面右
側で比較的、核が大きく薄く核染色されている細胞が密
集する部分が腺癌組織であり、細胞質が茶褐色に染色さ
れていた。第3図中央を上下に縦断する白っぽい部分は
コラーゲン組織であり、図面左側に広がる正常組織には
染色が認められなかった。
これらの結果は特願平1−278623の方法に従ったSTA染
色による比較例でも同様であった。
このように、抗STA陽性物質抗体による染色は、STA染色
と同様に正常細胞と癌組織とを判別できることが確認で
きた。
また本発明の抗体は、STAが認識するN−アセチル−D
−グルコサミン糖鎖だけでなく、この糖鎖を含めた癌化
に伴なう特殊構造(すなわちSTA陽性物質)を識別する
ものであるから、単にN−アセチル−D−グルコサミン
だけを産生するにすぎない正常組織と結合することがな
い。従って単なるSTA染色による場合に見られる偽陽性
が生じないものと期待できる。
(発明の効果) 以上のように本発明は、腫瘍組織標品をSTA陽性物質に
対する抗体で処理し、抗体の結合の有無を形態学的に観
察するものであり、悪性腫瘍と良性腫瘍とを容易に判別
することができる。また原理上、偽陽性が生じないこと
が期待できる。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の方法により処理したヒト甲状腺の正常
組織の高倍率組織像を示す図、第2図は同じくヒト甲状
腺癌組織の高倍率組織像を示す図、第3図はヒト甲状腺
癌組織と正常組織との境界付近の低倍率組織像を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/577 B (C12P 21/00 C12R 1:19)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ヒト甲状腺癌の遺伝子断片をλファージベ
    クターλgt11に挿入した遺伝子ライブラリーでトランス
    フェクトして得られた大腸菌菌株のうちSTAと結合する
    大腸菌菌株(FERM P-11164)の菌体破砕物を免疫源とし
    て得られた抗体であって、悪性腫瘍組織に特異的に結合
    する抗体。
  2. 【請求項2】腫瘍組織標品を抗体で処理し、この抗体の
    有無を形態学的に観察することを特徴とする悪性腫瘍の
    判別方法において、 前記抗体が、ヒト甲状腺癌の遺伝子断片をλファージベ
    クターλgt11に挿入した遺伝子ライブラリーでトランス
    フェクトして得られた大腸菌菌株のうちSTAと結合する
    大腸菌菌株(FERM P-11164)の菌体破砕物を免疫源とし
    て得られた抗体であって、悪性腫瘍組織に特異的に結合
    する抗体であることを特徴とする悪性腫瘍の判別方法。
  3. 【請求項3】前記抗体は予め酵素標識されており、この
    抗体の結合の有無を酵素組織化学的に観察することを特
    徴とする請求項(2)記載の悪性腫瘍の判別方法。
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