JPH07318562A - 乳癌関連抗原に特異性を有する抗体、この抗体を産生する細胞系組成物、および抗原検定法 - Google Patents
乳癌関連抗原に特異性を有する抗体、この抗体を産生する細胞系組成物、および抗原検定法Info
- Publication number
- JPH07318562A JPH07318562A JP6140265A JP14026594A JPH07318562A JP H07318562 A JPH07318562 A JP H07318562A JP 6140265 A JP6140265 A JP 6140265A JP 14026594 A JP14026594 A JP 14026594A JP H07318562 A JPH07318562 A JP H07318562A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- determinant
- cell
- breast cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 125
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 125
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 125
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 91
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 90
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 18
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 title description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 136
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 10
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 42
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 31
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 29
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 claims description 28
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 24
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 108010071421 milk fat globule Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 claims description 10
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 10
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 8
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 7
- 102000011413 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010023736 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Proteins 0.000 claims description 6
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 6
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims description 5
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 claims description 5
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 5
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 3
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 claims 3
- 101000889461 Mus musculus Trefoil factor 2 Proteins 0.000 claims 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 abstract 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 102100033458 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 4 Human genes 0.000 description 28
- 101000995014 Archaeoglobus fulgidus (strain ATCC 49558 / DSM 4304 / JCM 9628 / NBRC 100126 / VC-16) Iron-sulfur flavoprotein AF_1436 Proteins 0.000 description 28
- 101001135231 Homo sapiens 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 4 Proteins 0.000 description 28
- 101001001496 Homo sapiens Interferon gamma receptor 2 Proteins 0.000 description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 28
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 22
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 17
- 208000011803 breast fibrocystic disease Diseases 0.000 description 17
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 17
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 13
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- 108010055851 Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102100030122 Protein O-GlcNAcase Human genes 0.000 description 4
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 4
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 AF-1 carbohydrate Chemical class 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101001034314 Homo sapiens Lactadherin Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100039648 Lactadherin Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101150006061 neur gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- GZXOHHPYODFEGO-UHFFFAOYSA-N triglycine sulfate Chemical compound NCC(O)=O.NCC(O)=O.NCC(O)=O.OS(O)(=O)=O GZXOHHPYODFEGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 1
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 1
- 206010061692 Benign muscle neoplasm Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 206010015719 Exsanguination Diseases 0.000 description 1
- 208000007659 Fibroadenoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101000844719 Mus musculus Deleted in malignant brain tumors 1 protein Proteins 0.000 description 1
- 201000004458 Myoma Diseases 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067572 Oestrogenic effect Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102100034601 Peroxidasin homolog Human genes 0.000 description 1
- 241001319148 Pharmacis Species 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 101000718529 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Alpha-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 201000004283 Shwachman-Diamond syndrome Diseases 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanol Chemical compound OC.CC(O)=O ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N alpha-D-Gal-(1->3)-beta-D-Gal-(1->4)-D-GlcNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 NNISLDGFPWIBDF-MPRBLYSKSA-N 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 201000003149 breast fibroadenoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 238000007825 histological assay Methods 0.000 description 1
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GTDOPRQDTRLYAL-UHFFFAOYSA-N hydrogen peroxide;methanol Chemical compound OC.OO GTDOPRQDTRLYAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 108091005979 iodinated proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 201000004959 laryngeal benign neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 108090000959 peroxidasin Proteins 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecyl sulfate;prop-2-enamide Chemical compound [Na+].NC(=O)C=C.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O ULVBNYNCYNALAV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3015—Breast
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 乳癌抗原に対して特異性を有する抗体を提供
する。 【構成】 正常および良性乳房上皮細胞膜上および乳癌
細胞中に存在し、平均分子量約300,000 ドルトン以上の
糖蛋白質であって、塩化セシウム勾配中の密度が通常の
蛋白質の密度と同等の範囲にあり、乳癌細胞によって取
り込まれ分子量がＤＮＡ分解酵素およびコンドロイチナ
ーゼに影響されない抗原に対して特異性を有する抗体と
する。
する。 【構成】 正常および良性乳房上皮細胞膜上および乳癌
細胞中に存在し、平均分子量約300,000 ドルトン以上の
糖蛋白質であって、塩化セシウム勾配中の密度が通常の
蛋白質の密度と同等の範囲にあり、乳癌細胞によって取
り込まれ分子量がＤＮＡ分解酵素およびコンドロイチナ
ーゼに影響されない抗原に対して特異性を有する抗体と
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトの乳癌腫瘍に関係す
る抗原上に存在する様々な決定基に対して特異的なモノ
クローナル抗体およびこの抗体を産生する細胞系組成物
に関するものである。さらに、本発明はこのような抗原
を検定する方法に関するものである。
る抗原上に存在する様々な決定基に対して特異的なモノ
クローナル抗体およびこの抗体を産生する細胞系組成物
に関するものである。さらに、本発明はこのような抗原
を検定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】癌は初期に発見することが非常に好まし
いが、これは極めて困難なことでもある。この困難性は
主として、 100％の感度（偽陰性のないこと）および 1
00％の特異性（偽陽性のないこと）を有する一般的な癌
マーカーが存在していないという事実に由来するもので
ある。公知のマーカーは感度および特異性が共に不足し
ている。さらに、このようなマーカーは全てのタイプの
癌に適用できるというものではない。例えば最も良く知
られたマーカーである発癌抗原（ＣＥＡ）は乳癌に関係
するとは認められない。
いが、これは極めて困難なことでもある。この困難性は
主として、 100％の感度（偽陰性のないこと）および 1
00％の特異性（偽陽性のないこと）を有する一般的な癌
マーカーが存在していないという事実に由来するもので
ある。公知のマーカーは感度および特異性が共に不足し
ている。さらに、このようなマーカーは全てのタイプの
癌に適用できるというものではない。例えば最も良く知
られたマーカーである発癌抗原（ＣＥＡ）は乳癌に関係
するとは認められない。
【０００３】乳癌は女性において主要な癌であり、一般
にも３つの主要な癌のうちの１つである。乳癌が充分に
早く発見されれば回復のための予後は良好なものとな
る。したがって、乳癌の早期診断において医師の助けと
なるような乳癌マーカーを発見するための努力が絶えず
なされている。
にも３つの主要な癌のうちの１つである。乳癌が充分に
早く発見されれば回復のための予後は良好なものとな
る。したがって、乳癌の早期診断において医師の助けと
なるような乳癌マーカーを発見するための努力が絶えず
なされている。
【０００４】このような努力の１つはバルトレリ（Ｂar
torelli ）等による米国特許 4,38385号に開示されてお
り、ここでは乳癌腫瘍に関係する一連の抗原が記載され
ている。このような抗原は公知の方法、通常は溶媒抽
出、イオン交換および／もしくは吸着クロマトグラフィ
ーおよびゲル濾過の組み合せによってヒトの初期乳癌腫
から分離された。充分に純粋な場合、このような抗原は
抗ＣＥＡ血清と交差反応せず、糖蛋白質を用いてヒトの
初期乳癌腫から抽出可能であると記載されている。明ら
かにこのような抗原は正常な乳細胞とは関係がない。
torelli ）等による米国特許 4,38385号に開示されてお
り、ここでは乳癌腫瘍に関係する一連の抗原が記載され
ている。このような抗原は公知の方法、通常は溶媒抽
出、イオン交換および／もしくは吸着クロマトグラフィ
ーおよびゲル濾過の組み合せによってヒトの初期乳癌腫
から分離された。充分に純粋な場合、このような抗原は
抗ＣＥＡ血清と交差反応せず、糖蛋白質を用いてヒトの
初期乳癌腫から抽出可能であると記載されている。明ら
かにこのような抗原は正常な乳細胞とは関係がない。
【０００５】また、ヒト癌細胞の新規なマーカーがアシ
ョール（Ａshall ）等、Ｌancet ，1982，ii：１〜６お
よびマッギー（Ｍc Ｇee）等，Ｌancet ，1982，ii：７
〜10により報告されている。要約すれば、多様な悪性ヒ
ト細胞系の細胞膜中に抗原が発見されたが、この抗原は
二倍体ヒト細胞株では発見されなかった。この抗原は正
常な成人もしくは胎児の組織のホモジネート中には存在
しているとしても極めて低濃度であった。この抗原は悪
性細胞の抽出物に由来する特定のモノクローナル抗体に
より免疫沈降させることができたが、良性細胞の抽出物
に由来するものによっては不可能であった。免疫沈降さ
せた抗原はドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミド中で
それぞれ約 390,000ドルトンおよび約 350,000ドルトン
の分子量を有するバンドに分離された。両成分は高い炭
水化物含量を有する糖蛋白質のようであった。
ョール（Ａshall ）等、Ｌancet ，1982，ii：１〜６お
よびマッギー（Ｍc Ｇee）等，Ｌancet ，1982，ii：７
〜10により報告されている。要約すれば、多様な悪性ヒ
ト細胞系の細胞膜中に抗原が発見されたが、この抗原は
二倍体ヒト細胞株では発見されなかった。この抗原は正
常な成人もしくは胎児の組織のホモジネート中には存在
しているとしても極めて低濃度であった。この抗原は悪
性細胞の抽出物に由来する特定のモノクローナル抗体に
より免疫沈降させることができたが、良性細胞の抽出物
に由来するものによっては不可能であった。免疫沈降さ
せた抗原はドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミド中で
それぞれ約 390,000ドルトンおよび約 350,000ドルトン
の分子量を有するバンドに分離された。両成分は高い炭
水化物含量を有する糖蛋白質のようであった。
【０００６】さらに具体的な研究がセリアニ（Ｃerian
i）およびテイラー・パパディミトリュー（Ｔaylor −
Ｐapadimitriou）および彼らの共同研究者等によってヒ
ト乳房上皮細胞抗原に対して行なわれた。このような研
究をここで詳細に述べることは本項の範囲を越えるもの
であるが、選択された刊行物の概要はその実質的な要約
となるのであろう。
i）およびテイラー・パパディミトリュー（Ｔaylor −
Ｐapadimitriou）および彼らの共同研究者等によってヒ
ト乳房上皮細胞抗原に対して行なわれた。このような研
究をここで詳細に述べることは本項の範囲を越えるもの
であるが、選択された刊行物の概要はその実質的な要約
となるのであろう。
【０００７】セリアニ等、Ｐroc ，Ｎat l ，Ａcad ，Ｓ
ci，74， 582（1977）はヒトの乳脂肪球に担持されたヒ
ト乳房上皮細胞の表面分化抗原を記載している。ウサギ
抗ヒト乳房上皮細胞血清が脱脂ヒト乳脂肪球に対して投
与された。ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポリアク
リルアミドゲル中における電気泳動、セファロース（Ｓ
epharoseTM）４Ｂに結合した前記抗血清を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィー、免疫螢光染色、および間
接免疫螢光染色を行なうことによってヒト乳脂肪球上に
存在する抗原性物質が特色づけられ、かつ／もしくは分
離された。
ci，74， 582（1977）はヒトの乳脂肪球に担持されたヒ
ト乳房上皮細胞の表面分化抗原を記載している。ウサギ
抗ヒト乳房上皮細胞血清が脱脂ヒト乳脂肪球に対して投
与された。ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポリアク
リルアミドゲル中における電気泳動、セファロース（Ｓ
epharoseTM）４Ｂに結合した前記抗血清を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィー、免疫螢光染色、および間
接免疫螢光染色を行なうことによってヒト乳脂肪球上に
存在する抗原性物質が特色づけられ、かつ／もしくは分
離された。
【０００８】脱脂されたヒト乳脂肪球は少なくとも４つ
の主要な蛋白質成分からなり、その２つは糖蛋白質のよ
うである。また、少なくとも４つの成分のうちの３つは
抗原性である。
の主要な蛋白質成分からなり、その２つは糖蛋白質のよ
うである。また、少なくとも４つの成分のうちの３つは
抗原性である。
【０００９】脱脂されたヒト乳脂肪球に対して投与され
た抗体は器官特異性のものと考えられる。抗血清は腎，
肺，および結腸に由来する上皮様細胞には結合しないこ
とから、上記の抗原性成分は乳房上皮細胞以外の細胞に
は存在しないようである。
た抗体は器官特異性のものと考えられる。抗血清は腎，
肺，および結腸に由来する上皮様細胞には結合しないこ
とから、上記の抗原性成分は乳房上皮細胞以外の細胞に
は存在しないようである。
【００１０】抗血清によって検出された抗原は乳房上皮
細胞表面上に位置しており、ヒト乳脂肪球上に位置する
ものと同じものである。ヒト乳脂肪球は乳房細胞の頂端
表面に由来するものであるため、抗原はこの特定表面に
限定することができる。
細胞表面上に位置しており、ヒト乳脂肪球上に位置する
ものと同じものである。ヒト乳脂肪球は乳房細胞の頂端
表面に由来するものであるため、抗原はこの特定表面に
限定することができる。
【００１１】これらの抗原は乳腫細胞系中および乳腫転
移部位中に連続して発現する。しかしながら抗原性の発
現は各乳腫細胞系で異なっているようである。
移部位中に連続して発現する。しかしながら抗原性の発
現は各乳腫細胞系で異なっているようである。
【００１２】上述した脱脂ヒト乳脂肪球膜の上皮細胞特
異成分に対するモノクローナル抗体はテイラー・パパデ
ィミトリュー等、Ｉnt，Ｊ．，Ｃ ancer ，28，17（198
1）に報告されている。脱脂ヒト乳脂肪球に感作させた
マウスの脾臓に由来する細胞が骨髄腫系Ｐ３／ＮＳ１／
１−Ａg ４−１に由来する細胞と融合された。３つのハ
イブリドーマが分離され、これらは脱脂ヒト乳脂肪球の
成分に反応する抗体を産生した。しかしながら、このよ
うな反応性はハイブリドーマによって産生された３つの
モノクローナル抗体の間で有意に異なっていた。最も反
応性の低い抗体は極めてわずかにしか結合しなかった。
最も反応性の高い抗体の反応性は最も反応性の低いもの
のそれの約５倍であり、第３の抗体のそれの２倍弱であ
った。
異成分に対するモノクローナル抗体はテイラー・パパデ
ィミトリュー等、Ｉnt，Ｊ．，Ｃ ancer ，28，17（198
1）に報告されている。脱脂ヒト乳脂肪球に感作させた
マウスの脾臓に由来する細胞が骨髄腫系Ｐ３／ＮＳ１／
１−Ａg ４−１に由来する細胞と融合された。３つのハ
イブリドーマが分離され、これらは脱脂ヒト乳脂肪球の
成分に反応する抗体を産生した。しかしながら、このよ
うな反応性はハイブリドーマによって産生された３つの
モノクローナル抗体の間で有意に異なっていた。最も反
応性の低い抗体は極めてわずかにしか結合しなかった。
最も反応性の高い抗体の反応性は最も反応性の低いもの
のそれの約５倍であり、第３の抗体のそれの２倍弱であ
った。
【００１３】３つのモノクローナル抗体のうちの２つは
人乳から培養した上皮細胞および試験された８つの乳癌
細胞系のうちの７つと反応した。第３のモノクローナル
抗体は人乳から培養した上皮細胞に対しては反応せず、
８つの乳癌細胞系のうちのわずか２つに対してのみ反応
性を有していた。上皮繊維芽細胞等、試験された４つの
芽細胞系および株のうちのいかなるものとも反応するモ
ノクローナル抗体は存在しなかった。モノクローナル抗
体と反応する抗原は試験された11のリンパ芽球細胞にお
いては全く存在しないか、極めて少量しか存在しないよ
うである。
人乳から培養した上皮細胞および試験された８つの乳癌
細胞系のうちの７つと反応した。第３のモノクローナル
抗体は人乳から培養した上皮細胞に対しては反応せず、
８つの乳癌細胞系のうちのわずか２つに対してのみ反応
性を有していた。上皮繊維芽細胞等、試験された４つの
芽細胞系および株のうちのいかなるものとも反応するモ
ノクローナル抗体は存在しなかった。モノクローナル抗
体と反応する抗原は試験された11のリンパ芽球細胞にお
いては全く存在しないか、極めて少量しか存在しないよ
うである。
【００１４】試験された７つの上皮細胞系のうちの５つ
はヒト腫瘍由来のものであり、残りの２つはＳＶ−40で
形質転換させたヒトケラチン細胞およびマウス乳房細胞
であった。これらの細胞系と前記３つのモノクローナル
抗体との反応は若干の例外を除いて主に陰性であった。
３つの抗体は全て強固ではないが確実に咽頭腫系と結合
した。１つの抗体は結腸腫系に結合し、他の２つの抗体
はＨe Ｌa の派生物に対する結合を示したが、全ての検
定においてそうであったわけではない。
はヒト腫瘍由来のものであり、残りの２つはＳＶ−40で
形質転換させたヒトケラチン細胞およびマウス乳房細胞
であった。これらの細胞系と前記３つのモノクローナル
抗体との反応は若干の例外を除いて主に陰性であった。
３つの抗体は全て強固ではないが確実に咽頭腫系と結合
した。１つの抗体は結腸腫系に結合し、他の２つの抗体
はＨe Ｌa の派生物に対する結合を示したが、全ての検
定においてそうであったわけではない。
【００１５】上述の３つのモノクローナル抗体のうちの
２つは組織学的に検定され、その結果はアークリー（Ａ
rklie ）等，Ｉnt．Ｊ．Ｃ ancer ，28，23（1981）によ
って報告された。この組織学的検定はフォルマリンで固
定しかつパラフィンに埋込んだ正常組織および腫瘍組織
の切片と５％酢酸−メタノール溶液で固定した凍結切片
に対して間接免疫ペルオキシダーゼ染色法を実施しもの
であった。休息中の乳房組織のうちの上皮細胞の多くと
はいかなる抗体も反応しなかった。休息乳房組織の非染
色域には染色性の管腔内物質が常に存在していた。抗体
は双方とも上皮細胞に対して強力な陽性反応を示し、ま
た乳分泌中の乳房内において分泌された。良性病変にお
いて乳頭腫は常に強力な陽性染色を示したが、線維腺腫
中の上皮要素は10％未満しか陽性に染色されなかった。
２つは組織学的に検定され、その結果はアークリー（Ａ
rklie ）等，Ｉnt．Ｊ．Ｃ ancer ，28，23（1981）によ
って報告された。この組織学的検定はフォルマリンで固
定しかつパラフィンに埋込んだ正常組織および腫瘍組織
の切片と５％酢酸−メタノール溶液で固定した凍結切片
に対して間接免疫ペルオキシダーゼ染色法を実施しもの
であった。休息中の乳房組織のうちの上皮細胞の多くと
はいかなる抗体も反応しなかった。休息乳房組織の非染
色域には染色性の管腔内物質が常に存在していた。抗体
は双方とも上皮細胞に対して強力な陽性反応を示し、ま
た乳分泌中の乳房内において分泌された。良性病変にお
いて乳頭腫は常に強力な陽性染色を示したが、線維腺腫
中の上皮要素は10％未満しか陽性に染色されなかった。
【００１６】２つのモノクローナル抗体のうちの１つは
試験された20個の主要な乳腫の各々に対して陽性反応を
示し、これらのうちの６つに由来するリンパ節中の転移
病変に対しても陽性反応を示した。また、もう１方の抗
体も初期の腫に対しては反応したが、ムコイド型のもの
もしくはリンパ節中の転移病変とは反応しなかった。陽
性反応を示した非乳腫瘍は肺，卵巣および子宮の腺腫の
みであった。他の腫、特に腸管，頚管，鼻咽腔，および
肝臓の腫は陰性反応を示した。
試験された20個の主要な乳腫の各々に対して陽性反応を
示し、これらのうちの６つに由来するリンパ節中の転移
病変に対しても陽性反応を示した。また、もう１方の抗
体も初期の腫に対しては反応したが、ムコイド型のもの
もしくはリンパ節中の転移病変とは反応しなかった。陽
性反応を示した非乳腫瘍は肺，卵巣および子宮の腺腫の
みであった。他の腫、特に腸管，頚管，鼻咽腔，および
肝臓の腫は陰性反応を示した。
【００１７】２つの抗体のうちの１つは肝臓，膵臓，皮
脂腺，小唾液腺，腎臓，肺，汗腺，副睾丸，および子宮
に由来する正常組織に対して陽性染色を示した。双方の
抗体に対して陰性染色を示した組織には胃，小腸，大
腸，盲腸，胸腺，甲状腺，睾丸，ファロピオ管，膀胱，
胆嚢，および皮膚が含まれていた。
脂腺，小唾液腺，腎臓，肺，汗腺，副睾丸，および子宮
に由来する正常組織に対して陽性染色を示した。双方の
抗体に対して陰性染色を示した組織には胃，小腸，大
腸，盲腸，胸腺，甲状腺，睾丸，ファロピオ管，膀胱，
胆嚢，および皮膚が含まれていた。
【００１８】流動細胞螢光測定法による単細胞レベルで
の正常および悪性の乳房細胞中のヒト乳房上皮細胞抗原
の発現分析がピータースン（Ｐeterson ）等，Ｅ xpl ．
Ｃell ．Ｂi ol ，49，１（1981）によって報告されてい
る。このような分析は間接免疫螢光によって細胞表面を
抗ヒト乳房上皮細胞膜血清でラベリングすると同時に細
胞ＤＮＡをヨウ化プロピジウム（propidium iodide）で
ラベリングすることによるものであった。螢光強度の分
布曲線に対する非染色乳房細胞の関与を除去した場合に
は、正常な乳房に由来する乳房上皮細胞および乳房嚢様
変性線維腫由来の上皮細胞に対する抗血清の相対的な結
合度は２つの乳癌細胞系のものに対するそれと同等以上
のものであることが認められた。ＤＮＡ単位で表現した
場合、このような相対的な結合度は２つの乳癌細胞系の
それよりも有意に高かった。
の正常および悪性の乳房細胞中のヒト乳房上皮細胞抗原
の発現分析がピータースン（Ｐeterson ）等，Ｅ xpl ．
Ｃell ．Ｂi ol ，49，１（1981）によって報告されてい
る。このような分析は間接免疫螢光によって細胞表面を
抗ヒト乳房上皮細胞膜血清でラベリングすると同時に細
胞ＤＮＡをヨウ化プロピジウム（propidium iodide）で
ラベリングすることによるものであった。螢光強度の分
布曲線に対する非染色乳房細胞の関与を除去した場合に
は、正常な乳房に由来する乳房上皮細胞および乳房嚢様
変性線維腫由来の上皮細胞に対する抗血清の相対的な結
合度は２つの乳癌細胞系のものに対するそれと同等以上
のものであることが認められた。ＤＮＡ単位で表現した
場合、このような相対的な結合度は２つの乳癌細胞系の
それよりも有意に高かった。
【００１９】血清中におけるヒト乳房上皮細胞抗原の存
在を測定するための固相ラジオイムノアッセイがセリア
ニ等，Ｐroc ．Ｎatl ．Ａcad ．Ｓci，79，5420（198
2）によって報告されている。放射性同位体で標識した
抗ヒト乳房上皮細胞膜血清と、その抗原となる全脱脂ヒ
ト乳脂肪球膜とを標準曲線の作成に用いて多発性乳癌患
者の血清から高レベルのヒト乳房上皮細胞抗原が発見さ
れた。このようなレベルは正常な女性および男性の血清
中および良性乳房疾患および初期乳癌，肺，神経組織お
よび結腸の多発性の癌および黒腫を有する女性患者の血
清中に見出されるバックグラウンドレベル（＜30ng／m
l）よりも統計的に有意に高いことが認められた。３段
階の免疫検出法を用い、分子量がそれぞれ150, 000ドル
トン，70,000ドルトンおよび46,000ドルトンである３つ
の群の抗原をラジオイムノアッセイにおいて高レベルの
ヒト乳房上皮細胞抗原が認められた患者の血清から分離
した。非乳房腫瘍を有する患者の血清および正常な血清
からは主として非特異的に結合した小量のヒト血清アル
ブミンが得られたが、上述のような抗原は分離可能であ
った。46,000ドルトンのヒト乳房上皮細胞抗原を標的と
するモノクローナル抗体の代りにポリクローナル抗血清
を用いた場合にも同様の免疫検出結果が得られた。
在を測定するための固相ラジオイムノアッセイがセリア
ニ等，Ｐroc ．Ｎatl ．Ａcad ．Ｓci，79，5420（198
2）によって報告されている。放射性同位体で標識した
抗ヒト乳房上皮細胞膜血清と、その抗原となる全脱脂ヒ
ト乳脂肪球膜とを標準曲線の作成に用いて多発性乳癌患
者の血清から高レベルのヒト乳房上皮細胞抗原が発見さ
れた。このようなレベルは正常な女性および男性の血清
中および良性乳房疾患および初期乳癌，肺，神経組織お
よび結腸の多発性の癌および黒腫を有する女性患者の血
清中に見出されるバックグラウンドレベル（＜30ng／m
l）よりも統計的に有意に高いことが認められた。３段
階の免疫検出法を用い、分子量がそれぞれ150, 000ドル
トン，70,000ドルトンおよび46,000ドルトンである３つ
の群の抗原をラジオイムノアッセイにおいて高レベルの
ヒト乳房上皮細胞抗原が認められた患者の血清から分離
した。非乳房腫瘍を有する患者の血清および正常な血清
からは主として非特異的に結合した小量のヒト血清アル
ブミンが得られたが、上述のような抗原は分離可能であ
った。46,000ドルトンのヒト乳房上皮細胞抗原を標的と
するモノクローナル抗体の代りにポリクローナル抗血清
を用いた場合にも同様の免疫検出結果が得られた。
【００２０】上記のモノクローナル抗体と他の２つがセ
リアニ等、Ｓom atic，Ｃell ，Ｇenetics ，９， 415
（1983）に記載された。要約すれば、正常なヒト乳房上
皮細胞の３つの異なった表面抗原に対するモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマがマウス骨髄腫細胞
と、脱脂ヒト乳脂肪球を免疫感作させたマウスもしくは
ラット由来の脾臓細胞とを融合させることによって形成
された。３つのモノクローナル抗体が製造され、それぞ
れ見掛け分子量46,000ドルトン，70,000ドルトン，およ
び 400,000ドルトンの分子であることが認められた。最
も高分子量の抗原は高い糖含量を有するムチン様糖蛋白
質のようである。ラジオイムノバインディングアッセイ
を用いると、３つのモノクローナル抗体は全てヒト乳脂
肪球膜および４の異なった上皮細胞起源乳癌細胞系に結
合することが認められた。しかしながら、このような抗
体は11個の異なった非乳癌系もしくは正常な乳房線維芽
細胞とは結合しなかった。４つの乳癌細胞系のうちの３
つにおいて最も高分子量の抗原が測定され、このレベル
は10倍の範囲を超えて変化することが認められた。
リアニ等、Ｓom atic，Ｃell ，Ｇenetics ，９， 415
（1983）に記載された。要約すれば、正常なヒト乳房上
皮細胞の３つの異なった表面抗原に対するモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマがマウス骨髄腫細胞
と、脱脂ヒト乳脂肪球を免疫感作させたマウスもしくは
ラット由来の脾臓細胞とを融合させることによって形成
された。３つのモノクローナル抗体が製造され、それぞ
れ見掛け分子量46,000ドルトン，70,000ドルトン，およ
び 400,000ドルトンの分子であることが認められた。最
も高分子量の抗原は高い糖含量を有するムチン様糖蛋白
質のようである。ラジオイムノバインディングアッセイ
を用いると、３つのモノクローナル抗体は全てヒト乳脂
肪球膜および４の異なった上皮細胞起源乳癌細胞系に結
合することが認められた。しかしながら、このような抗
体は11個の異なった非乳癌系もしくは正常な乳房線維芽
細胞とは結合しなかった。４つの乳癌細胞系のうちの３
つにおいて最も高分子量の抗原が測定され、このレベル
は10倍の範囲を超えて変化することが認められた。
【００２１】ヒト乳脂肪球に対するモノクローナル抗体
はバーシェル（Ｂurchell ）等、Ｊ．Ｉmmunol． 131，
508（1983）に記載されている。このような２つのモノ
クローナル抗体は腫瘍に関連すると思われる抗原決定基
を標的とするものである。抗原は乳分泌中の乳房上に発
現するが、休息中の乳房上には発現したとしてもわずか
なものである。抗体は双方とも分子量 400,000を越える
ヒト乳脂肪球成分中に見出される決定基を認識する。し
かしながら、第１の抗体は第２の抗体と比較してかなり
低い濃度で脱脂ヒト乳脂肪球に結合するものであり、そ
の差は明らかに10倍から 100倍の間にある。結合におけ
る同様の差はヒト乳房上皮細胞および乳癌細胞系に関し
ても認められるが、ヒト乳脂肪球に対する相対的結合レ
ベルとほぼ同等な前者細胞に対する相対的結合レベルは
後者細胞においては逆転される。第１の抗体はヒト乳脂
肪球調製物中の高分子量成分に類似するヒト乳房上皮細
胞中の高分子量成分と反応した。第２の抗体に対する高
親和性部位はヒト乳房上皮細胞および乳癌細胞系によっ
て数種の低分子量成分上に発現された。試験された他の
乳腫系の全部と２人の乳癌患者由来の転移細胞は様々な
大きさの、すなわち分子量80,000から 400,000を超える
成分上に第２の抗体に対する高親和性結合部位を発現し
た。５つの細胞系のうちのわずか２つと２人の患者のう
ちの１人に由来する癌細胞のみが第１の抗体に対する高
親和性部位を発現し、これらの部位は高分子量の、すな
わち 300,000〜 400,000の糖蛋白質上に見出された。
はバーシェル（Ｂurchell ）等、Ｊ．Ｉmmunol． 131，
508（1983）に記載されている。このような２つのモノ
クローナル抗体は腫瘍に関連すると思われる抗原決定基
を標的とするものである。抗原は乳分泌中の乳房上に発
現するが、休息中の乳房上には発現したとしてもわずか
なものである。抗体は双方とも分子量 400,000を越える
ヒト乳脂肪球成分中に見出される決定基を認識する。し
かしながら、第１の抗体は第２の抗体と比較してかなり
低い濃度で脱脂ヒト乳脂肪球に結合するものであり、そ
の差は明らかに10倍から 100倍の間にある。結合におけ
る同様の差はヒト乳房上皮細胞および乳癌細胞系に関し
ても認められるが、ヒト乳脂肪球に対する相対的結合レ
ベルとほぼ同等な前者細胞に対する相対的結合レベルは
後者細胞においては逆転される。第１の抗体はヒト乳脂
肪球調製物中の高分子量成分に類似するヒト乳房上皮細
胞中の高分子量成分と反応した。第２の抗体に対する高
親和性部位はヒト乳房上皮細胞および乳癌細胞系によっ
て数種の低分子量成分上に発現された。試験された他の
乳腫系の全部と２人の乳癌患者由来の転移細胞は様々な
大きさの、すなわち分子量80,000から 400,000を超える
成分上に第２の抗体に対する高親和性結合部位を発現し
た。５つの細胞系のうちのわずか２つと２人の患者のう
ちの１人に由来する癌細胞のみが第１の抗体に対する高
親和性部位を発現し、これらの部位は高分子量の、すな
わち 300,000〜 400,000の糖蛋白質上に見出された。
【００２２】脱脂されたヒト乳脂肪球の膜フラクション
から調製された３つのヒト乳房上皮細胞抗原は哺乳類宿
主内における癌の存在を診断する方法の基本となるもの
である。公開された欧州特許出願第 0,080,259号にはこ
れらが記載されている。用いられた抗原にはセリアニ等
に記載された各々分子量が48,000，75,000，および 15
0,000であるものが含まれている。要約すれば、この方
法は患者の血漿サンプルを分析し、正常な個体における
存在レベルよりも高いレベルを示す１つ以上の腫瘍関連
抗原を求めることからなる。乳癌が関与している場合、
これらの抗原はセリアニ等によって記載された上述の抗
原によって例証される。
から調製された３つのヒト乳房上皮細胞抗原は哺乳類宿
主内における癌の存在を診断する方法の基本となるもの
である。公開された欧州特許出願第 0,080,259号にはこ
れらが記載されている。用いられた抗原にはセリアニ等
に記載された各々分子量が48,000，75,000，および 15
0,000であるものが含まれている。要約すれば、この方
法は患者の血漿サンプルを分析し、正常な個体における
存在レベルよりも高いレベルを示す１つ以上の腫瘍関連
抗原を求めることからなる。乳癌が関与している場合、
これらの抗原はセリアニ等によって記載された上述の抗
原によって例証される。
【００２３】そらに、癌の診断および治療において有用
な抗原および抗体が公開された英国特許出願ＧＢ 2,12
1,417Ａに記載されている。抗原は悪性細胞、特にヒト
喉頭腫由来の培養細胞に由来するものであった。この抗
原は分子量が 340,000〜 400,000の範囲にあり、レクチ
ン小麦胚凝集素に対する結合性，耐煮沸性，耐破壊性を
有するものであり、ある特定の溶媒を用いて悪性細胞か
ら抽出される。抗原に対するモノクローナル抗体の結合
性試験によれば、抗原は大多数の悪性ヒト腫瘍細胞上に
存在するが良性腫瘍もしくは正常組織細胞上には存在し
ないようである。
な抗原および抗体が公開された英国特許出願ＧＢ 2,12
1,417Ａに記載されている。抗原は悪性細胞、特にヒト
喉頭腫由来の培養細胞に由来するものであった。この抗
原は分子量が 340,000〜 400,000の範囲にあり、レクチ
ン小麦胚凝集素に対する結合性，耐煮沸性，耐破壊性を
有するものであり、ある特定の溶媒を用いて悪性細胞か
ら抽出される。抗原に対するモノクローナル抗体の結合
性試験によれば、抗原は大多数の悪性ヒト腫瘍細胞上に
存在するが良性腫瘍もしくは正常組織細胞上には存在し
ないようである。
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】高度の感受性および特
異性を有する癌マーカーの探究は乳癌マーカーを含めて
進歩してきているが、乳癌診断の助けとなるようなマー
カーに対する要求は依然として存在している。
異性を有する癌マーカーの探究は乳癌マーカーを含めて
進歩してきているが、乳癌診断の助けとなるようなマー
カーに対する要求は依然として存在している。
【００２５】本発明は正常および良性乳房上皮細胞膜上
および乳癌細胞中に見出されるほぼ純粋な抗原に対して
特異性を有するほぼ純粋な抗体を提供することをその目
的とするものである。
および乳癌細胞中に見出されるほぼ純粋な抗原に対して
特異性を有するほぼ純粋な抗体を提供することをその目
的とするものである。
【００２６】また、本発明はこのような抗原に対して特
異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを提供することをその目的とするものである。
異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを提供することをその目的とするものである。
【００２７】また、本発明はこのような抗原に対して特
異性を有するモノクローナル抗体を提供することをその
目的とするものである。
異性を有するモノクローナル抗体を提供することをその
目的とするものである。
【００２８】また、本発明はこのような抗原を検定する
方法を提供することをその目的とするものである。
方法を提供することをその目的とするものである。
【００２９】
【課題を解決するための手段】本発明によって提供され
る抗体が特異性を有するほぼ純粋な抗原は正常および良
性乳房上皮細胞膜上、主として小葉および管の管腔に隣
接する頂端表面上、および乳癌細胞中に、その細胞の見
掛け上全域にわたって存在し、以下の特性： Ａ．約 300,000ドルトンの平均分子量を有すること； Ｂ．糖蛋白質であること； Ｃ．塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
密度と同等の範囲にあること； Ｄ．ヒト包皮線維芽細胞に存在しないこと； Ｅ．冠状動脈，心臓，肝臓，脾臓および皮膚の細胞に存
在しないこと； Ｆ．ヒト乳脂肪球に存在すること； Ｇ．皮脂腺，子宮頚内膜，卵巣，腎臓，腸，膵臓，およ
び肺の細胞上に存在すること； Ｈ．乳癌細胞によって取り込まれること； Ｉ．ヒト血漿サンプル中に存在すること；およびＪ．分
子量がＤＮＡ分解酵素およびコンドロイチナーゼによっ
て影響されないことを有している。
る抗体が特異性を有するほぼ純粋な抗原は正常および良
性乳房上皮細胞膜上、主として小葉および管の管腔に隣
接する頂端表面上、および乳癌細胞中に、その細胞の見
掛け上全域にわたって存在し、以下の特性： Ａ．約 300,000ドルトンの平均分子量を有すること； Ｂ．糖蛋白質であること； Ｃ．塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
密度と同等の範囲にあること； Ｄ．ヒト包皮線維芽細胞に存在しないこと； Ｅ．冠状動脈，心臓，肝臓，脾臓および皮膚の細胞に存
在しないこと； Ｆ．ヒト乳脂肪球に存在すること； Ｇ．皮脂腺，子宮頚内膜，卵巣，腎臓，腸，膵臓，およ
び肺の細胞上に存在すること； Ｈ．乳癌細胞によって取り込まれること； Ｉ．ヒト血漿サンプル中に存在すること；およびＪ．分
子量がＤＮＡ分解酵素およびコンドロイチナーゼによっ
て影響されないことを有している。
【００３０】好ましい実施態様において、このような抗
原は以下の付加的な特性： Ａ．正常乳房組織細胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原と乳
癌細胞の抗原との間でその濃度が有意に変化しない、イ
ムノアッセイにより測定される第１の決定基を有するこ
と； Ｂ．乳癌細胞の抗原におけるその濃度が正常乳房組織細
胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原におけるその濃度よりも
有意に高い、イムノアッセイにより測定される第２の決
定基を有すること； Ｃ．前記第１および第２の決定基の抗原性がＤＮＡ分解
酵素およびコンドロイチナーゼによって影響されないこ
と； Ｄ．前記第１および第２の決定基の抗原性がプロテアー
ゼによって低下すること； Ｅ．前記第１および第２の決定基の抗原性が穏やかなア
ルカリ処理によって低下すること； Ｆ．少なくともいくらかの炭水化物がセリンもしくはス
レオニンに対するＯ−グリコシド結合によって蛋白質主
鎖に見掛け上結合していること； Ｇ．小麦胚凝集素カラムに結合することによってＮ−ア
セチルグルコサミンおよび／もしくはシアル酸の存在を
示すこと； Ｈ．前記第１の決定基の濃度の増加によって示される乳
房起源の組織培養細胞によるその蓄積がエストロゲンに
よって増加すること；および Ｉ．そのノイラミニダーゼ処理によって前記第１の決定
基の抗原性が増加し、かつ前記第２の決定基の抗原性が
低下することを有している。
原は以下の付加的な特性： Ａ．正常乳房組織細胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原と乳
癌細胞の抗原との間でその濃度が有意に変化しない、イ
ムノアッセイにより測定される第１の決定基を有するこ
と； Ｂ．乳癌細胞の抗原におけるその濃度が正常乳房組織細
胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原におけるその濃度よりも
有意に高い、イムノアッセイにより測定される第２の決
定基を有すること； Ｃ．前記第１および第２の決定基の抗原性がＤＮＡ分解
酵素およびコンドロイチナーゼによって影響されないこ
と； Ｄ．前記第１および第２の決定基の抗原性がプロテアー
ゼによって低下すること； Ｅ．前記第１および第２の決定基の抗原性が穏やかなア
ルカリ処理によって低下すること； Ｆ．少なくともいくらかの炭水化物がセリンもしくはス
レオニンに対するＯ−グリコシド結合によって蛋白質主
鎖に見掛け上結合していること； Ｇ．小麦胚凝集素カラムに結合することによってＮ−ア
セチルグルコサミンおよび／もしくはシアル酸の存在を
示すこと； Ｈ．前記第１の決定基の濃度の増加によって示される乳
房起源の組織培養細胞によるその蓄積がエストロゲンに
よって増加すること；および Ｉ．そのノイラミニダーゼ処理によって前記第１の決定
基の抗原性が増加し、かつ前記第２の決定基の抗原性が
低下することを有している。
【００３１】また、本発明は、このような抗原を検定す
る方法として以下の工程： Ａ．正常乳房組織細胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原と乳
癌細胞の抗原との間でその濃度が有意に変化しない第１
の決定基の濃度をイムノアッセイにより測定し； Ｂ．乳癌細胞の抗原におけるその濃度が正常乳房組織細
胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原におけるその濃度よりも
有意に高い第２の決定基の濃度をイムノアッセイにより
測定し； Ｃ．前記第２の決定基の濃度の前記第１の決定基の濃度
に対する比を計算することからなる方法を提供する。
る方法として以下の工程： Ａ．正常乳房組織細胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原と乳
癌細胞の抗原との間でその濃度が有意に変化しない第１
の決定基の濃度をイムノアッセイにより測定し； Ｂ．乳癌細胞の抗原におけるその濃度が正常乳房組織細
胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原におけるその濃度よりも
有意に高い第２の決定基の濃度をイムノアッセイにより
測定し； Ｃ．前記第２の決定基の濃度の前記第１の決定基の濃度
に対する比を計算することからなる方法を提供する。
【００３２】また本発明は前記第１および第２の決定基
に対してそれぞれ特異的であるモノクローナル抗体とこ
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供
する。
に対してそれぞれ特異的であるモノクローナル抗体とこ
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供
する。
【００３３】
Ａ．ハイブリド−マおよびモノクローナル抗体を産生す
る組織 培養細胞系 ２つの乳腫細胞系であるＺＲ−75−１ＢおよびＭＣＦ−
７は米国予防衛生研究所（the Ｎational Ｉnstitute o
f Ｈealth ）から得たものであり、10容量％のウシ胎児
血清、100mＭのグルタミン、10mg／mlのインシュリン、
および50mg／mlのゲンタマイシンを含有するダルベッコ
の改良イーグル培地（Ｄalbecco's modified Ｅagle m
edium ）に１：10の割合で継代して維持した。使用した
他の細胞系はウシ胎児血清，ゲンタマイシン，およびグ
ルタミンを補充した適当な基本培地中に維持した。この
ような細胞系には乳房細胞系のＨＢＬ− 100，ＨＳＯ 5
78Ｔ，Ｔ47Ｄ，ＺＲ−75−１，およびＺＲ−75−30；頚
管細胞系のＭＥ− 180，Ｃ33ＩＩ，ＣＡＳＫＩ，および
ＤＯＴ；咽頭腫ＣＣＬ 138；肺腫ＣＣＬ 185；およびヒ
ト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）が含まれていた。
る組織 培養細胞系 ２つの乳腫細胞系であるＺＲ−75−１ＢおよびＭＣＦ−
７は米国予防衛生研究所（the Ｎational Ｉnstitute o
f Ｈealth ）から得たものであり、10容量％のウシ胎児
血清、100mＭのグルタミン、10mg／mlのインシュリン、
および50mg／mlのゲンタマイシンを含有するダルベッコ
の改良イーグル培地（Ｄalbecco's modified Ｅagle m
edium ）に１：10の割合で継代して維持した。使用した
他の細胞系はウシ胎児血清，ゲンタマイシン，およびグ
ルタミンを補充した適当な基本培地中に維持した。この
ような細胞系には乳房細胞系のＨＢＬ− 100，ＨＳＯ 5
78Ｔ，Ｔ47Ｄ，ＺＲ−75−１，およびＺＲ−75−30；頚
管細胞系のＭＥ− 180，Ｃ33ＩＩ，ＣＡＳＫＩ，および
ＤＯＴ；咽頭腫ＣＣＬ 138；肺腫ＣＣＬ 185；およびヒ
ト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）が含まれていた。
【００３４】膜小胞の調製 ＺＲ−75−１Ｂ由来の細胞を40,890cm2 のローラーボト
ル内で集密的となるまで増殖した。細胞はスクレーピン
グによって採取し、カルシウムおよびマグネシウムを含
有するダルベッコのリン酸緩衝溶液で３回洗浄した。細
胞は 0.24 Ｍのショ糖を含有するpH 7.4の 0.01 Ｍトリ
ス緩衝液（Ｔris buffer）中に再び浮遊させ、Ａペスト
ルを備えたダウンス（Ｄounce ）ホモジナイザーの10回
のストロークによって氷中において均質化した。次い
で、ホモジネートをポリトロン（Ｐolytron TM）ホモジ
ナイザー内で３回にわたって20秒間バーストさせた。こ
のようにして均質化した物質は1000×ｇで10分間遠心
し、ペレット化した物質に対して均質化工程を繰り返し
た。再均質化した物質の第２の遠心分離の後、均質化工
程に由来する上澄液を混合して48,000×ｇで45分間遠心
分離し、粗膜フラクションペレットを得た。
ル内で集密的となるまで増殖した。細胞はスクレーピン
グによって採取し、カルシウムおよびマグネシウムを含
有するダルベッコのリン酸緩衝溶液で３回洗浄した。細
胞は 0.24 Ｍのショ糖を含有するpH 7.4の 0.01 Ｍトリ
ス緩衝液（Ｔris buffer）中に再び浮遊させ、Ａペスト
ルを備えたダウンス（Ｄounce ）ホモジナイザーの10回
のストロークによって氷中において均質化した。次い
で、ホモジネートをポリトロン（Ｐolytron TM）ホモジ
ナイザー内で３回にわたって20秒間バーストさせた。こ
のようにして均質化した物質は1000×ｇで10分間遠心
し、ペレット化した物質に対して均質化工程を繰り返し
た。再均質化した物質の第２の遠心分離の後、均質化工
程に由来する上澄液を混合して48,000×ｇで45分間遠心
分離し、粗膜フラクションペレットを得た。
【００３５】粗膜フラクションペレットは均質化緩衝液
中に浮遊させ、32％，36％，40％，45％のショ糖段階勾
配上に重層した。勾配は90分間 100,000×ｇで遠心分離
した。最初の２つの界面に存在する物質を血漿細胞膜フ
ラクションとして集めた。
中に浮遊させ、32％，36％，40％，45％のショ糖段階勾
配上に重層した。勾配は90分間 100,000×ｇで遠心分離
した。最初の２つの界面に存在する物質を血漿細胞膜フ
ラクションとして集めた。
【００３６】免疫感作 融合のために、 100μｇの膜フラクション蛋白質を同体
積の完全フロイントアジュバンド（complete Ｆreund'
s adjuvant）中に乳化したものを３匹のＢalb／Ｃマウ
スに腹腔内注射して、マウスに対して免疫感作を行なっ
た。７日後、免疫感作を繰り返した。第２の免疫感作の
７日後、マウスに 100μｇの可溶蛋白質を腹腔内注射し
た。この注射の４日後、マウスを殺してその脾臓を融合
用に使用した。
積の完全フロイントアジュバンド（complete Ｆreund'
s adjuvant）中に乳化したものを３匹のＢalb／Ｃマウ
スに腹腔内注射して、マウスに対して免疫感作を行なっ
た。７日後、免疫感作を繰り返した。第２の免疫感作の
７日後、マウスに 100μｇの可溶蛋白質を腹腔内注射し
た。この注射の４日後、マウスを殺してその脾臓を融合
用に使用した。
【００３７】融合工程 免疫感作させたマウスに由来する脾臓細胞を例えばコー
ラー（Ｋohler ）等、Ｎature ， 256， 495（1975）に
記載されるような公知の方法でＳＰ２／０細胞と融合し
た。要約すれば、これら２つの型の細胞の混合物の懸濁
液を 800×ｇで10分間遠心分離してペレット化した。ペ
レットは穏やかに粉砕し、37℃に温めた。粉砕したペレ
ットに対して分子量1000の37％ポリエチレングリコール
（Ｋoch−Ｌight Ｌaboratories ，Ｌtd．） 0.5mlを
撹拌しながら50秒間以上にわたって添加した。このよう
にして得た融合混合物は 5.0mlの無血清ＲＰＭＩ−1640
培地（ＲＰＭＩ1640，２m Ｍのグルタミン，50mg／mlの
ゲンタマイシン，および５×10-5Ｍの２−メルカプトエ
タトール）で２分間以上にわたって徐々に希釈した。次
いで１分間以上にわたって 5.0mlの培地を添加した。融
合混合物は遠心分離し、細胞は50mlの無血清倍地で２回
洗浄した。次いで細胞は10％のウシ胎児血清を含有する
ＲＰＭＩ−1640倍地中に約５×106 細胞／mlの密度で浮
遊させた。
ラー（Ｋohler ）等、Ｎature ， 256， 495（1975）に
記載されるような公知の方法でＳＰ２／０細胞と融合し
た。要約すれば、これら２つの型の細胞の混合物の懸濁
液を 800×ｇで10分間遠心分離してペレット化した。ペ
レットは穏やかに粉砕し、37℃に温めた。粉砕したペレ
ットに対して分子量1000の37％ポリエチレングリコール
（Ｋoch−Ｌight Ｌaboratories ，Ｌtd．） 0.5mlを
撹拌しながら50秒間以上にわたって添加した。このよう
にして得た融合混合物は 5.0mlの無血清ＲＰＭＩ−1640
培地（ＲＰＭＩ1640，２m Ｍのグルタミン，50mg／mlの
ゲンタマイシン，および５×10-5Ｍの２−メルカプトエ
タトール）で２分間以上にわたって徐々に希釈した。次
いで１分間以上にわたって 5.0mlの培地を添加した。融
合混合物は遠心分離し、細胞は50mlの無血清倍地で２回
洗浄した。次いで細胞は10％のウシ胎児血清を含有する
ＲＰＭＩ−1640倍地中に約５×106 細胞／mlの密度で浮
遊させた。
【００３８】４×103 個のＢalb ／Ｃマウス腹腔内滲出
細胞を10％ウシ胎児血清を含有する50mlのＲＰＭＩ−16
40培地中に浮遊させたものを24時間前に播種しておいた
96ウェルのマイクロタイタープレート（microtiter pla
te）の各ウェルに50μｌの前記融合細胞浮遊液を分注し
た。プレートは湿潤化した５％ＣＯ2 インキュベーター
内で一晩37℃にインキュベートした。インキュベーショ
ン後、２倍濃縮ＨＡＴ（２×10-4Ｍのヒポキサンチン，
８×10-7Ｍのアミノプテリン，および 3.2×10-5Ｍのチ
ミジン）を補充した 100μｌの血清含有培地を各ウェル
に添加し、プレートをさらに５日間インキュベートし
た。次いで、毎日、培地の一部を新鮮な１倍ＨＡＴ培地
と交換することによって培地を供給した。
細胞を10％ウシ胎児血清を含有する50mlのＲＰＭＩ−16
40培地中に浮遊させたものを24時間前に播種しておいた
96ウェルのマイクロタイタープレート（microtiter pla
te）の各ウェルに50μｌの前記融合細胞浮遊液を分注し
た。プレートは湿潤化した５％ＣＯ2 インキュベーター
内で一晩37℃にインキュベートした。インキュベーショ
ン後、２倍濃縮ＨＡＴ（２×10-4Ｍのヒポキサンチン，
８×10-7Ｍのアミノプテリン，および 3.2×10-5Ｍのチ
ミジン）を補充した 100μｌの血清含有培地を各ウェル
に添加し、プレートをさらに５日間インキュベートし
た。次いで、毎日、培地の一部を新鮮な１倍ＨＡＴ培地
と交換することによって培地を供給した。
【００３９】融合の２週間後、培地のいくつかには活発
に増殖する細胞が含まれており、脾臓細胞とＳＰ２／０
細胞との間の融合の成功したことが示された。増殖陽性
の培地に由来する上澄液はＺＲ−75−１Ｂ細胞およびヒ
ト包皮線維芽細胞に対する抗体性に対してスクリーニン
グした。前者に対して活性を示すが後者については活性
を示さない培地はＢalb ／Ｃ胸腺細胞による希釈度を制
限することによってサブクローン化した。陽性サブクロ
ーンは抗体含有上澄液を産生するために培地中で増殖さ
せるか、あるいは抗体含有腹水を得るためにプリスタン
感作（Ｐristane −primed）Ｂalb ／Ｃマウスに２×10
6 個の細胞を腹腔内注射した。
に増殖する細胞が含まれており、脾臓細胞とＳＰ２／０
細胞との間の融合の成功したことが示された。増殖陽性
の培地に由来する上澄液はＺＲ−75−１Ｂ細胞およびヒ
ト包皮線維芽細胞に対する抗体性に対してスクリーニン
グした。前者に対して活性を示すが後者については活性
を示さない培地はＢalb ／Ｃ胸腺細胞による希釈度を制
限することによってサブクローン化した。陽性サブクロ
ーンは抗体含有上澄液を産生するために培地中で増殖さ
せるか、あるいは抗体含有腹水を得るためにプリスタン
感作（Ｐristane −primed）Ｂalb ／Ｃマウスに２×10
6 個の細胞を腹腔内注射した。
【００４０】ＺＲ−75−１Ｂに対して反応性を有する抗
体の存在はプロテインＡ結合法［Ｂrown etal ，Ｊ．Ｉ
mmuno l，Ｍethods，31，20（1979）］によって示され
た。要約すれば、ＺＲ−75−１Ｂ細胞を採取し、予めポ
リ（Ｄ−レジン）でコーティングしたマイクロタイター
プレートの各ウェルに５×104 個の細胞をプレーティン
グした。次いでプレートは一晩37℃にインキュベートし
た。ウェルを空にし、15％のウシ胎児血清を含有する 2
00μｌのＲＰＭＩ−1640を各ウェルに加えた。プレート
は37℃で45分間インキュベートした。再びウェルを空に
し、各ウェルに試験すべき培地上澄液50μｌを加えた。
再びプレートを37℃で45分間インキュベートした。ウェ
ルを空にし、15％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−16
40で３回洗浄し、各ウェルにウサギ抗マウスＩg の１：
300希釈液 200μｌを加えた。45分間37℃でインキュベ
ートした後、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＲＰＭＩ−1640でウェルを３回洗浄した。各ウェ
ルに、ヨウ素の放射性同位体で標識化したスタフィロコ
ッカスプロテインＡを 200μｌのＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−
1640中に含有させたものを加え（50,000cpm ／ウェ
ル）、再度プレートを37℃で45分間インキュベートし
た。次いでウェルをＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−1640で３回洗
浄し、増感スクリーンに重ねられたコダックＸ−ＯＭＡ
ＴTMＡＲフィルムに一晩露出した。次いで、フィルムを
コダックＸ線フィルム現像液中で現像した。抗体結合は
フィルム上の可視スポットとして示された。これらの条
件ではウェルあたり約400cpmの比結合が検出可能であ
る。
体の存在はプロテインＡ結合法［Ｂrown etal ，Ｊ．Ｉ
mmuno l，Ｍethods，31，20（1979）］によって示され
た。要約すれば、ＺＲ−75−１Ｂ細胞を採取し、予めポ
リ（Ｄ−レジン）でコーティングしたマイクロタイター
プレートの各ウェルに５×104 個の細胞をプレーティン
グした。次いでプレートは一晩37℃にインキュベートし
た。ウェルを空にし、15％のウシ胎児血清を含有する 2
00μｌのＲＰＭＩ−1640を各ウェルに加えた。プレート
は37℃で45分間インキュベートした。再びウェルを空に
し、各ウェルに試験すべき培地上澄液50μｌを加えた。
再びプレートを37℃で45分間インキュベートした。ウェ
ルを空にし、15％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−16
40で３回洗浄し、各ウェルにウサギ抗マウスＩg の１：
300希釈液 200μｌを加えた。45分間37℃でインキュベ
ートした後、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＲＰＭＩ−1640でウェルを３回洗浄した。各ウェ
ルに、ヨウ素の放射性同位体で標識化したスタフィロコ
ッカスプロテインＡを 200μｌのＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−
1640中に含有させたものを加え（50,000cpm ／ウェ
ル）、再度プレートを37℃で45分間インキュベートし
た。次いでウェルをＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−1640で３回洗
浄し、増感スクリーンに重ねられたコダックＸ−ＯＭＡ
ＴTMＡＲフィルムに一晩露出した。次いで、フィルムを
コダックＸ線フィルム現像液中で現像した。抗体結合は
フィルム上の可視スポットとして示された。これらの条
件ではウェルあたり約400cpmの比結合が検出可能であ
る。
【００４１】上述の工程を用いることによって、以下21
ＤＤ５および21ＤＤ７と称する２つのハイブリドーマは
ＺＲ−75−１Ｂ細胞に対して反応性を有する抗体を産生
した。ヒト包皮線維芽細胞に対する反応は認められなか
った。これら２つのハイブリド−マによって産生された
抗体は乳房細胞系ＺＲ−75−１，ＺＲ−75−30，Ｔ47
Ｄ，およびＭＣＦ−７に対しても反応性を有してした。
また、このような抗体は肺腫細胞系ＣＣＬ− 185に対し
ても反応性を有していたが、頚管細胞系のＭＥ−180，
ＣＡＳＫ１，およびＣ33ＩＩもしくは乳房細胞系ＨＢＬ
− 100およびＨＳＯ 578Ｔとは反応しなかった。興味深
いことに、このような抗体と反応しなかった２つの乳房
細胞系は真に形質転換した乳房上皮細胞として特徴づけ
られるものではない。すなわち、ＨＳＯ 578Ｔは筋肉腫
として分類されるものであって恐らくは上皮細胞ではな
く、ＨＢＬ− 100は乳サンプルに由来するものであって
その細胞は病理的とは診断されなかった。
ＤＤ５および21ＤＤ７と称する２つのハイブリドーマは
ＺＲ−75−１Ｂ細胞に対して反応性を有する抗体を産生
した。ヒト包皮線維芽細胞に対する反応は認められなか
った。これら２つのハイブリド−マによって産生された
抗体は乳房細胞系ＺＲ−75−１，ＺＲ−75−30，Ｔ47
Ｄ，およびＭＣＦ−７に対しても反応性を有してした。
また、このような抗体は肺腫細胞系ＣＣＬ− 185に対し
ても反応性を有していたが、頚管細胞系のＭＥ−180，
ＣＡＳＫ１，およびＣ33ＩＩもしくは乳房細胞系ＨＢＬ
− 100およびＨＳＯ 578Ｔとは反応しなかった。興味深
いことに、このような抗体と反応しなかった２つの乳房
細胞系は真に形質転換した乳房上皮細胞として特徴づけ
られるものではない。すなわち、ＨＳＯ 578Ｔは筋肉腫
として分類されるものであって恐らくは上皮細胞ではな
く、ＨＢＬ− 100は乳サンプルに由来するものであって
その細胞は病理的とは診断されなかった。
【００４２】21ＤＤ５および21ＤＤ７によって産生され
たモノクローナル抗体のＺＲ−75−１Ｂ膜小胞に対する
結合は、 2.5μｇのＺＲ−75−１Ｂ膜小胞蛋白質でコー
トしたマイクロタイタープレートの各ウェルに20μｌの
老廃ハイブリドーマ上澄液を添加することによって示さ
れた。上述のインキュベーションおよび洗浄の後、各ウ
ェルに50μｌの 125Ｉ−標識化ウサギ抗マウスＩg を加
えた。プレートを再びインキュベートおよび洗浄し、各
ウェルをカウントした。ＺＲ−75−１Ｂ膜小胞蛋白質の
代りに 2.5μｇのヒト乳脂肪球を用いてこの工程を繰り
返すと、このようなモノクローナル抗体はヒト乳脂肪球
にも結合することが示された。
たモノクローナル抗体のＺＲ−75−１Ｂ膜小胞に対する
結合は、 2.5μｇのＺＲ−75−１Ｂ膜小胞蛋白質でコー
トしたマイクロタイタープレートの各ウェルに20μｌの
老廃ハイブリドーマ上澄液を添加することによって示さ
れた。上述のインキュベーションおよび洗浄の後、各ウ
ェルに50μｌの 125Ｉ−標識化ウサギ抗マウスＩg を加
えた。プレートを再びインキュベートおよび洗浄し、各
ウェルをカウントした。ＺＲ−75−１Ｂ膜小胞蛋白質の
代りに 2.5μｇのヒト乳脂肪球を用いてこの工程を繰り
返すと、このようなモノクローナル抗体はヒト乳脂肪球
にも結合することが示された。
【００４３】冷凍乳房組織切片のイムノペルオキシダー
ゼ染色によれば、21ＤＤ５および21ＤＤ７によって産生
されたモノクローナル抗体は、乳管を裏打ちする正常も
しくは良性細胞の管腔表面上に支配的に存在する抗原で
あって乳房上皮細胞中に存在する抗原と反応することが
認められた。乳房小葉の正常もしくは良性細胞の全表面
は小葉もしくは管由来の乳腫瘍細胞と同様にこれらの抗
原を担持している。
ゼ染色によれば、21ＤＤ５および21ＤＤ７によって産生
されたモノクローナル抗体は、乳管を裏打ちする正常も
しくは良性細胞の管腔表面上に支配的に存在する抗原で
あって乳房上皮細胞中に存在する抗原と反応することが
認められた。乳房小葉の正常もしくは良性細胞の全表面
は小葉もしくは管由来の乳腫瘍細胞と同様にこれらの抗
原を担持している。
【００４４】ハイブリドーマ21ＤＤ５および21ＤＤ７は
１９８４年３月２８日にアメリカンタイプカルチャーコ
レクション（the Ａmerican Ｔype Ｃalture Ｃollect
ion，12301 Ｐarkway Ｄrive，Ｒockville，Ｍaryland
20852 ）に寄託され、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＨＢ8
532およびＨＢ8533が与えられた。
１９８４年３月２８日にアメリカンタイプカルチャーコ
レクション（the Ａmerican Ｔype Ｃalture Ｃollect
ion，12301 Ｐarkway Ｄrive，Ｒockville，Ｍaryland
20852 ）に寄託され、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＨＢ8
532およびＨＢ8533が与えられた。
【００４５】Ｂ．抗原の同定および分離 膜小胞の調製 上述のように小胞を調製した。
【００４６】抗原の可溶化 ＺＲ−75−１ＢおよびＭＥ− 180小胞を48,000×ｇで遠
心分離し、１％のＮＰ−40および１m Ｍのフェニルメチ
ルスルフォニルフルロライドを含有する４℃のダルベッ
コのリン酸緩衝液中に１時間浮遊させることによって、
約50％の小胞蛋白質を可溶化した。したがって、不溶性
物質を除去するためには48,000×ｇの遠心分離を繰り返
さねばならなかった。上澄液は水に対して透析した後、
−10℃で凍結乾燥し、保存した。残渣は小胞調製用に用
いた当初のものの半分の容量に相当するダルベッコのリ
ン酸緩衝液中に再び溶解し、 180μｇ／mlの蛋白質を有
するＺＲ−75−１Ｂ溶液および 140μｇ／mlの蛋白質を
有するＭＥ− 180溶液を得た。
心分離し、１％のＮＰ−40および１m Ｍのフェニルメチ
ルスルフォニルフルロライドを含有する４℃のダルベッ
コのリン酸緩衝液中に１時間浮遊させることによって、
約50％の小胞蛋白質を可溶化した。したがって、不溶性
物質を除去するためには48,000×ｇの遠心分離を繰り返
さねばならなかった。上澄液は水に対して透析した後、
−10℃で凍結乾燥し、保存した。残渣は小胞調製用に用
いた当初のものの半分の容量に相当するダルベッコのリ
ン酸緩衝液中に再び溶解し、 180μｇ／mlの蛋白質を有
するＺＲ−75−１Ｂ溶液および 140μｇ／mlの蛋白質を
有するＭＥ− 180溶液を得た。
【００４７】抗原存在の測定 ポリビニルマイクロタイタープレート上に固定されたＺ
Ｒ−75−１Ｂ膜小胞に結合し得るモノクローナル抗体量
のいかなる低下をも検出できるような阻止系を設けた。
要約すれば、 2.5μｇのロウリープロテイン（Ｌowry p
rotein）をＺＲ−75−１Ｂ膜に含有させＨ2 Ｏ中に添加
したものをプレートの各ウェル内で乾固させた。次いで
抗体の非特異的結合を防止するため、15％のウシ胎児血
清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ媒地にウェルを浸し
た。次いで、50μｌの抗体含有溶液を添加し、プレート
を５％ＣＯ2 雰囲気中において37℃で45分間インキュベ
ートした。ウェルは15％ＦＣＳ−ＲＰＭＩで３回洗浄
し、 125Ｉ−標識化ウサギ抗マウスＩg を添加した。
Ｒ−75−１Ｂ膜小胞に結合し得るモノクローナル抗体量
のいかなる低下をも検出できるような阻止系を設けた。
要約すれば、 2.5μｇのロウリープロテイン（Ｌowry p
rotein）をＺＲ−75−１Ｂ膜に含有させＨ2 Ｏ中に添加
したものをプレートの各ウェル内で乾固させた。次いで
抗体の非特異的結合を防止するため、15％のウシ胎児血
清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ媒地にウェルを浸し
た。次いで、50μｌの抗体含有溶液を添加し、プレート
を５％ＣＯ2 雰囲気中において37℃で45分間インキュベ
ートした。ウェルは15％ＦＣＳ−ＲＰＭＩで３回洗浄
し、 125Ｉ−標識化ウサギ抗マウスＩg を添加した。
【００４８】まず、21ＤＤ５および21ＤＤ７ハイブリド
ーマ培養上澄液に存在する一次抗体の滴定を行なった。
滴定によって、ハイブリドーマ培養上澄液の１： 100も
しくは１： 500希釈液は容易に検出可能な結合を示し
た。この希釈液は一次抗体と共に阻害剤を含むに必要な
体積をもたらすものであった。様々な体積の阻害剤源を
小量の未希釈抗体上澄液に添加し、次いで充分な15％Ｆ
ＣＳ−ＲＰＭＩを加えることによって抗体を１： 100〜
１： 500の最終濃度とし、阻害検定を行なった。次いで
この阻害剤混合物を37℃で45分間インキュベートした
後、ＺＲ−75−１Ｂでコートしたマイクロタイタープレ
ートに50μｌの阻害剤混合物を添加して結合検定を行な
った。21ＤＤ５および21ＤＤ７上澄液のいずれにおいて
も、ＺＲ−75−１Ｂ小胞と共にプレインキュベーション
（preincubation ）した場合にはＺＲ−75−１Ｂコート
したウェルに対する結合量が減少した。
ーマ培養上澄液に存在する一次抗体の滴定を行なった。
滴定によって、ハイブリドーマ培養上澄液の１： 100も
しくは１： 500希釈液は容易に検出可能な結合を示し
た。この希釈液は一次抗体と共に阻害剤を含むに必要な
体積をもたらすものであった。様々な体積の阻害剤源を
小量の未希釈抗体上澄液に添加し、次いで充分な15％Ｆ
ＣＳ−ＲＰＭＩを加えることによって抗体を１： 100〜
１： 500の最終濃度とし、阻害検定を行なった。次いで
この阻害剤混合物を37℃で45分間インキュベートした
後、ＺＲ−75−１Ｂでコートしたマイクロタイタープレ
ートに50μｌの阻害剤混合物を添加して結合検定を行な
った。21ＤＤ５および21ＤＤ７上澄液のいずれにおいて
も、ＺＲ−75−１Ｂ小胞と共にプレインキュベーション
（preincubation ）した場合にはＺＲ−75−１Ｂコート
したウェルに対する結合量が減少した。
【００４９】ＺＲ−76−１Ｂ可溶化膜物質を含有する阻
害溶液の不在下におけるcpm 結合は阻害溶液存在下にお
けるcpm 結合の３〜４倍であり、この結果、希釈ハイブ
リドーマ上澄液中における特定のモノクローナル抗体に
結合した可溶性抗原の存在が示された。
害溶液の不在下におけるcpm 結合は阻害溶液存在下にお
けるcpm 結合の３〜４倍であり、この結果、希釈ハイブ
リドーマ上澄液中における特定のモノクローナル抗体に
結合した可溶性抗原の存在が示された。
【００５０】可溶化小胞調製物のドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）レムリ（Ｌaemmli），Ｎature ， 227， 680（197
0）による不連続電気泳動法を行なった。４％のスタッ
キングゲルに加えてそれぞれ 2.7％の架橋用ビスアクリ
ルアミドを含有する８％，10％もしくは12％の総アクリ
ルアミド含量のゲルを使用した。全試薬はバイオーラド
（Ｂio−Ｒad）電気泳動グレードのものであり、全ての
器具は 1.5mmゲル用に設置したホーファーバーチカルス
ラブゲルアセンブリー（Ｈoefer vertical slab gel as
semblies）によるものであった。分離ゲルは必ず使用前
日に注入し、スタッキングゲルはサンプルを流す１〜２
時間前に添加した。サンプルは２％のドデシル硫酸ナト
リウムと10％のグリセロールと５％の２ーメルカプトエ
タノールとを含むpH 6.8の 0.06 Ｍトリス緩衝液中にお
いて 100℃で２〜５分間加熱した。電気泳動緩衝液は
0.192Ｍのグリシンと 0.1％のドデシル硫酸ナトリウム
とを含有するpH 8.3の 0.25 Ｍトリスであった。
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）レムリ（Ｌaemmli），Ｎature ， 227， 680（197
0）による不連続電気泳動法を行なった。４％のスタッ
キングゲルに加えてそれぞれ 2.7％の架橋用ビスアクリ
ルアミドを含有する８％，10％もしくは12％の総アクリ
ルアミド含量のゲルを使用した。全試薬はバイオーラド
（Ｂio−Ｒad）電気泳動グレードのものであり、全ての
器具は 1.5mmゲル用に設置したホーファーバーチカルス
ラブゲルアセンブリー（Ｈoefer vertical slab gel as
semblies）によるものであった。分離ゲルは必ず使用前
日に注入し、スタッキングゲルはサンプルを流す１〜２
時間前に添加した。サンプルは２％のドデシル硫酸ナト
リウムと10％のグリセロールと５％の２ーメルカプトエ
タノールとを含むpH 6.8の 0.06 Ｍトリス緩衝液中にお
いて 100℃で２〜５分間加熱した。電気泳動緩衝液は
0.192Ｍのグリシンと 0.1％のドデシル硫酸ナトリウム
とを含有するpH 8.3の 0.25 Ｍトリスであった。
【００５１】電気泳動はゲルあたり30ミリアンペアの定
常流で行ない、トラッキング染料がゲルの底部から流れ
出すまで継続した。分子量測定のため、バイオーラド分
子量蛋白質マーカーを定常的に含有させた。各泳動後、
直ちにゲルをクーマシーブルーもしくはアップジョンシ
ルバーステイン（Ｕpjohn Ｓilver Ｓtain）で蛋白質同
定のために染色するか、あるいは直ちにウェスタンブロ
ット（the ＷesternＢlot ）法によってニトロセルロー
ス紙に移した。
常流で行ない、トラッキング染料がゲルの底部から流れ
出すまで継続した。分子量測定のため、バイオーラド分
子量蛋白質マーカーを定常的に含有させた。各泳動後、
直ちにゲルをクーマシーブルーもしくはアップジョンシ
ルバーステイン（Ｕpjohn Ｓilver Ｓtain）で蛋白質同
定のために染色するか、あるいは直ちにウェスタンブロ
ット（the ＷesternＢlot ）法によってニトロセルロー
ス紙に移した。
【００５２】ウェスタンブロット法 ゲルからニトロセルロース紙への蛋白質の転移およびそ
のブロット（blot）のラジオイムノアッセイのために用
いた基本的な方法はバーネット（Ｂurnett）、Ａnal ．
Ｂiochem， 112， 195（1981）によるものであった。転
移「サンドイッチ」は常に20m Ｍトリス、150mＭグリシ
ン、および20％メタノールからなる転移緩衝液に浸漬し
て組合せた。使用したホーファートランスファー（the
ＨoeferTransphorTM）ユニットはサンドイッチ集積用の
特殊なカセットを有していた。カセットの背部はカセッ
トに含まれる特殊なスポンジと共に緩衝液中に浸漬し
た。次いで１枚の厚い吸取紙をスポンジ上に配置し、さ
らに１枚のＳ＆Ｓ ＢＡ83ニトロセルロース紙を重ね
た。これらの層が完全に湿潤化し、層間から気泡が完全
に除去されてから、ゲルをニトロセルロース紙上に配置
し、湿らせた２枚目の吸取紙をゲルの上に配置し、カセ
ットの上部を閉鎖した。通常カセットはゴムバンドで固
定した。
のブロット（blot）のラジオイムノアッセイのために用
いた基本的な方法はバーネット（Ｂurnett）、Ａnal ．
Ｂiochem， 112， 195（1981）によるものであった。転
移「サンドイッチ」は常に20m Ｍトリス、150mＭグリシ
ン、および20％メタノールからなる転移緩衝液に浸漬し
て組合せた。使用したホーファートランスファー（the
ＨoeferTransphorTM）ユニットはサンドイッチ集積用の
特殊なカセットを有していた。カセットの背部はカセッ
トに含まれる特殊なスポンジと共に緩衝液中に浸漬し
た。次いで１枚の厚い吸取紙をスポンジ上に配置し、さ
らに１枚のＳ＆Ｓ ＢＡ83ニトロセルロース紙を重ね
た。これらの層が完全に湿潤化し、層間から気泡が完全
に除去されてから、ゲルをニトロセルロース紙上に配置
し、湿らせた２枚目の吸取紙をゲルの上に配置し、カセ
ットの上部を閉鎖した。通常カセットはゴムバンドで固
定した。
【００５３】サンドイッチはトランスファーユニット内
においてニトロセルロース紙がゲルと陽極との間に位置
するように配置した。移転は 100Ｖの定常電圧で少なく
とも16時間行なった。これらの条件下では10℃にセット
した冷媒循環ユニットでトランスファーユニットを冷却
することが必要であった。転移が完了してから、サンド
イッチを分解し、ゲルを通常はクーマシーブルーで染色
した。場合によってはニトロセルロース紙も40％メタノ
ールおよび10％酢酸に含まれる 0.2％クーマシーブルー
溶液で５分間染色した。いくらか変化させた90％メタノ
ールおよび２％酢酸溶液中で穏やかに撹拌することによ
って紙は約15分で迅速に脱色した。紙は柔かくしわにな
りやすいために脱色中には注意を払った。脱色した紙は
オートラジオグラフによる視覚化に先立って少なくとも
30分間トリス塩（ 0.9％塩化ナトリウムおよび10m Ｍト
リスヒドロクロリド，pH 7.4）中で洗浄した。
においてニトロセルロース紙がゲルと陽極との間に位置
するように配置した。移転は 100Ｖの定常電圧で少なく
とも16時間行なった。これらの条件下では10℃にセット
した冷媒循環ユニットでトランスファーユニットを冷却
することが必要であった。転移が完了してから、サンド
イッチを分解し、ゲルを通常はクーマシーブルーで染色
した。場合によってはニトロセルロース紙も40％メタノ
ールおよび10％酢酸に含まれる 0.2％クーマシーブルー
溶液で５分間染色した。いくらか変化させた90％メタノ
ールおよび２％酢酸溶液中で穏やかに撹拌することによ
って紙は約15分で迅速に脱色した。紙は柔かくしわにな
りやすいために脱色中には注意を払った。脱色した紙は
オートラジオグラフによる視覚化に先立って少なくとも
30分間トリス塩（ 0.9％塩化ナトリウムおよび10m Ｍト
リスヒドロクロリド，pH 7.4）中で洗浄した。
【００５４】脱色しかつ完全に洗浄した紙、もしくはト
ランスファーユニットから直接取り出した紙は37℃の５
％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のトリス塩溶液中に１
時間浸漬した。紙は５％ＢＳＡ−トリス塩溶液で１：６
に希釈した適当なハイブリドーマ上澄（21ＤＤ５もしく
は21ＤＤ７）溶液に移し、環境温度において振動しなが
ら90分間インキュベートした。次いでニトロセルロース
紙は200ml のトリス塩溶液中で振動させながら洗浄し、
0.05 ％ＮＰ−40を含有する200ml のトリス塩溶液２組
で20分間洗浄し、最後に200ml のトリス塩溶液のみを用
いて10分間洗浄した。洗浄した紙は100,000cpm／50μｌ
の 125Ｉ−標識化ウサギ抗マウスＩg Ｇを含有する５％
ＢＳＡ中で振動させながら30％間、環境温度においてイ
ンキュベートした。この最後のインキュベーションの
後、紙は上記のように洗浄し、紙タオルでブロットし、
プラスチックラップ中に包み、−70℃において増感スク
リーンを設けたコダックＸＲTMフィルムに露出した。
ランスファーユニットから直接取り出した紙は37℃の５
％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のトリス塩溶液中に１
時間浸漬した。紙は５％ＢＳＡ−トリス塩溶液で１：６
に希釈した適当なハイブリドーマ上澄（21ＤＤ５もしく
は21ＤＤ７）溶液に移し、環境温度において振動しなが
ら90分間インキュベートした。次いでニトロセルロース
紙は200ml のトリス塩溶液中で振動させながら洗浄し、
0.05 ％ＮＰ−40を含有する200ml のトリス塩溶液２組
で20分間洗浄し、最後に200ml のトリス塩溶液のみを用
いて10分間洗浄した。洗浄した紙は100,000cpm／50μｌ
の 125Ｉ−標識化ウサギ抗マウスＩg Ｇを含有する５％
ＢＳＡ中で振動させながら30％間、環境温度においてイ
ンキュベートした。この最後のインキュベーションの
後、紙は上記のように洗浄し、紙タオルでブロットし、
プラスチックラップ中に包み、−70℃において増感スク
リーンを設けたコダックＸＲTMフィルムに露出した。
【００５５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから調製したウェス
タンブロットのオートラジオグラフによる視覚化は21Ｄ
Ｄ５および21ＤＤ７によって産生したモノクローナル抗
体と反応する抗原を決定的に同定した。21ＤＤ５および
21ＤＤ７上澄液において観察されたオートラジオグラフ
パターンは抗原が８％のゲルにおいても極めてわずかし
かゲル中に浸入せず、12％ゲルにおいては殆ど浸入しな
いという点で常に類似していた。場合により、８％ゲル
中には抗原が２つのバンドとして認められた。分子量9
2,500のフォスフォリラーゼは非常に大量にゲル中に侵
入した。ゲルおよびニトロセルロース紙を特定の蛋白質
で染色処理すると抗原よりも低分子量の数多い蛋白質バ
ンドが認められた。21ＤＤ５および21ＤＤ７抗体と反応
する抗原は１つ以上の分子形態を有する可能性もある
が、このような抗原は単一の名称ＡＦ−１で呼ぶことに
する。
タンブロットのオートラジオグラフによる視覚化は21Ｄ
Ｄ５および21ＤＤ７によって産生したモノクローナル抗
体と反応する抗原を決定的に同定した。21ＤＤ５および
21ＤＤ７上澄液において観察されたオートラジオグラフ
パターンは抗原が８％のゲルにおいても極めてわずかし
かゲル中に浸入せず、12％ゲルにおいては殆ど浸入しな
いという点で常に類似していた。場合により、８％ゲル
中には抗原が２つのバンドとして認められた。分子量9
2,500のフォスフォリラーゼは非常に大量にゲル中に侵
入した。ゲルおよびニトロセルロース紙を特定の蛋白質
で染色処理すると抗原よりも低分子量の数多い蛋白質バ
ンドが認められた。21ＤＤ５および21ＤＤ７抗体と反応
する抗原は１つ以上の分子形態を有する可能性もある
が、このような抗原は単一の名称ＡＦ−１で呼ぶことに
する。
【００５６】Ｃ．ＡＦ―１の測定および部分的特色化 抗体のヨウ化 全抗体（２次抗体および直接標識化モノクローナル）は
ハンター（Ｈunter ），Ｐro．Ｓoc，Ｅxp．Ｂ iol ．Ｍ
ed， 113， 989（1970）によって記載された方法の変形
を用いてヨウ化した。要約すれば、まず親和性を純化し
た、あるいはプロテインＡ−純化した抗体とリン酸緩衝
溶液（ＰＢＳ）との１mg／ml溶液 100μｌにpH 7.2の
0.05 Ｍリン酸50μｌを添加した。次いで、１ミリキュ
リーの無担体125 −Ｉを添加し、さらにメタ重亜硫酸ナ
トリウム10μｇおよび10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）のＰ
ＢＳ溶液100ml を加えた。未反応の試薬は10％ＦＣＳ−
ＰＢＳ中のバイオラドＡＧ１−Ｘ２陽イオン交換樹脂カ
ラムに通すことによってヨウ化蛋白質から分離した。２
mlの溶離液を集め、比活性を測定した。一般に、この工
程によって 208μＣi 125Ｉ／蛋白質μｇの比活性を有
する蛋白質調製物が得られた。
ハンター（Ｈunter ），Ｐro．Ｓoc，Ｅxp．Ｂ iol ．Ｍ
ed， 113， 989（1970）によって記載された方法の変形
を用いてヨウ化した。要約すれば、まず親和性を純化し
た、あるいはプロテインＡ−純化した抗体とリン酸緩衝
溶液（ＰＢＳ）との１mg／ml溶液 100μｌにpH 7.2の
0.05 Ｍリン酸50μｌを添加した。次いで、１ミリキュ
リーの無担体125 −Ｉを添加し、さらにメタ重亜硫酸ナ
トリウム10μｇおよび10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）のＰ
ＢＳ溶液100ml を加えた。未反応の試薬は10％ＦＣＳ−
ＰＢＳ中のバイオラドＡＧ１−Ｘ２陽イオン交換樹脂カ
ラムに通すことによってヨウ化蛋白質から分離した。２
mlの溶離液を集め、比活性を測定した。一般に、この工
程によって 208μＣi 125Ｉ／蛋白質μｇの比活性を有
する蛋白質調製物が得られた。
【００５７】阻害性試験 前述の阻害系を用いて21ＤＤ５および21ＤＤ７の抗原性
をＭＣＦ−７もしくはＺＲ−75−１Ｂ培養物の老廃培地
上澄液中において検出してようとした当初の試みは決定
的なものではなかった。しかしながら、培地を濃縮する
と良好な阻害性が検出された。すなわち、10倍濃縮した
ＭＣＦ−７もしくはＺＲ−75−１Ｂ培地は良好な抗体結
合阻害性を示したがＭＥ− 180培養物に由来する10倍濃
縮培地は結合に対しててかなる有意な影響を有していな
かった。ＭＣＦ−７培地は常に最も優れた阻害性を示し
た。ＺＲ−75−１Ｂ培地によって得られた阻害性は変化
しやすく、ＭＣＦ−７によって得られたものよりは常に
低かった。21ＤＤ５および21ＤＤ７抗体と反応する抗原
は培地中に取り込まれた。
をＭＣＦ−７もしくはＺＲ−75−１Ｂ培養物の老廃培地
上澄液中において検出してようとした当初の試みは決定
的なものではなかった。しかしながら、培地を濃縮する
と良好な阻害性が検出された。すなわち、10倍濃縮した
ＭＣＦ−７もしくはＺＲ−75−１Ｂ培地は良好な抗体結
合阻害性を示したがＭＥ− 180培養物に由来する10倍濃
縮培地は結合に対しててかなる有意な影響を有していな
かった。ＭＣＦ−７培地は常に最も優れた阻害性を示し
た。ＺＲ−75−１Ｂ培地によって得られた阻害性は変化
しやすく、ＭＣＦ−７によって得られたものよりは常に
低かった。21ＤＤ５および21ＤＤ７抗体と反応する抗原
は培地中に取り込まれた。
【００５８】ＭＣＦ−７細胞に由来する培地はこの抗原
の良好な源であり、またＭＣＦ−７細胞はウシ胎児血清
の不在下で増殖可能であるため、ウシ胎児血清を含まな
い老廃培地中における抗原の量を測定することを試み
た。ＭＣＦ−７培養物に由来する血清含有培地はここで
もこの系において有意な阻害を生み出したが、ＨＦＦ培
養物に由来する新鮮培地もしくは血清含有培地は阻害性
を有していなかった。ＭＣＦ−７培養物に由来する無血
清培地は阻害性を含んでいなかった。この結果は２つの
異なった実験で得られたものである。したがって、ＡＦ
−１を上澄液内に取り込むためには培地中に血清が必要
であると考えられる。培地中における血清の存在は抗体
の産生にとって必要条件ではない。21ＤＤ５および21Ｄ
Ｄ７およびＭＣＦ−７細胞の細胞同定によれば、これら
の細胞が血清の存在下で増殖したかどうかに拘らず、細
胞表面にはＡＦ−１の存在が認められた。したがって、
取り込み（shedding）のみが培地中の血清によって影響
を受けるものと考えられる。
の良好な源であり、またＭＣＦ−７細胞はウシ胎児血清
の不在下で増殖可能であるため、ウシ胎児血清を含まな
い老廃培地中における抗原の量を測定することを試み
た。ＭＣＦ−７培養物に由来する血清含有培地はここで
もこの系において有意な阻害を生み出したが、ＨＦＦ培
養物に由来する新鮮培地もしくは血清含有培地は阻害性
を有していなかった。ＭＣＦ−７培養物に由来する無血
清培地は阻害性を含んでいなかった。この結果は２つの
異なった実験で得られたものである。したがって、ＡＦ
−１を上澄液内に取り込むためには培地中に血清が必要
であると考えられる。培地中における血清の存在は抗体
の産生にとって必要条件ではない。21ＤＤ５および21Ｄ
Ｄ７およびＭＣＦ−７細胞の細胞同定によれば、これら
の細胞が血清の存在下で増殖したかどうかに拘らず、細
胞表面にはＡＦ−１の存在が認められた。したがって、
取り込み（shedding）のみが培地中の血清によって影響
を受けるものと考えられる。
【００５９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験において既に示され
たように21ＤＤ５および21ＤＤ７は高分子量の抗原と反
応した。21ＤＤ５抗体親和性カラムもしくは21ＤＤ７抗
体親和性カラム上に吸着されたＡＦ−１調製物は互いに
染色されるため、両抗体は恐らく同一の抗原すなわちＡ
Ｆ−１と反応するものと考えられる。さらに、ＡＦ−１
は21ＤＤ５のための反復決定基を有しているようでもあ
る。なぜなら、ポリビニルマイクロタイタープレートに
吸着された21ＤＤ５抗体はＭＣＦ−７培地から得られた
部分的に純化されたＡＦ−１を補捉し、一方後者は 125
Ｉ−標識化21ＤＤ５抗体を補捉するからである。また、
21ＤＤ５抗体の使用によってＡＦ−１は第４段階（Ｓta
geIV）の乳癌を有する患者の血清中に存在することが認
められた。
たように21ＤＤ５および21ＤＤ７は高分子量の抗原と反
応した。21ＤＤ５抗体親和性カラムもしくは21ＤＤ７抗
体親和性カラム上に吸着されたＡＦ−１調製物は互いに
染色されるため、両抗体は恐らく同一の抗原すなわちＡ
Ｆ−１と反応するものと考えられる。さらに、ＡＦ−１
は21ＤＤ５のための反復決定基を有しているようでもあ
る。なぜなら、ポリビニルマイクロタイタープレートに
吸着された21ＤＤ５抗体はＭＣＦ−７培地から得られた
部分的に純化されたＡＦ−１を補捉し、一方後者は 125
Ｉ−標識化21ＤＤ５抗体を補捉するからである。また、
21ＤＤ５抗体の使用によってＡＦ−１は第４段階（Ｓta
geIV）の乳癌を有する患者の血清中に存在することが認
められた。
【００６０】Ｄ．ＡＦ―１の分離 培地の初期処理 硫酸アンモニウム（ 659ｇ）を 1.9リットルの老廃ＺＲ
−75−１Ｂ培地に添加し、４℃において一晩撹拌した。
翌日、混合物を12,000×ｇで15分間遠心分離した。得ら
れたペレットはリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）中に再
浮遊させ、再び遠心分離した。混合した上澄液を４リッ
トルのＰＢＳに対して透析し、約20mlのアリコートとし
て凍結した。ロウリー（Ｌowry），Ｊ．Ｂ iol ．Ｃhem
， 193，256（1951）の方法に従って蛋白質濃度を測定
した。
−75−１Ｂ培地に添加し、４℃において一晩撹拌した。
翌日、混合物を12,000×ｇで15分間遠心分離した。得ら
れたペレットはリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）中に再
浮遊させ、再び遠心分離した。混合した上澄液を４リッ
トルのＰＢＳに対して透析し、約20mlのアリコートとし
て凍結した。ロウリー（Ｌowry），Ｊ．Ｂ iol ．Ｃhem
， 193，256（1951）の方法に従って蛋白質濃度を測定
した。
【００６１】セファクリル（Ｓeph acryl TM）Ｓ― 30 0カ
ラム処理 アリコートをセファクリルＳ− 300カラム（Ｐharmaci
a）に66ml／時の流速で流した。最初の蛋白質ピーク、
すなわちフラクション５〜30をプールしてＳ１と名付け
た。
ラム処理 アリコートをセファクリルＳ− 300カラム（Ｐharmaci
a）に66ml／時の流速で流した。最初の蛋白質ピーク、
すなわちフラクション５〜30をプールしてＳ１と名付け
た。
【００６２】塩化セシウム勾配［Ｈascall et al，Ｍet
hods in Ｅnzymology ，82， 769（1982）］を濃度段階
として用いた。セファクリルＳ− 300カラムから得たＳ
１フラクション30mlに塩化セシウムを添加した。こうし
て得た溶液は50Ｔi ローターを設けたベックマン（Ｂec
kman）Ｌ８−70超遠心機内において64,000×ｇで49時間
遠心分離した。温度は常に10℃に維持した。最上部フラ
クションを除去し、ＺＲ−Ｔと名付けた。
hods in Ｅnzymology ，82， 769（1982）］を濃度段階
として用いた。セファクリルＳ− 300カラムから得たＳ
１フラクション30mlに塩化セシウムを添加した。こうし
て得た溶液は50Ｔi ローターを設けたベックマン（Ｂec
kman）Ｌ８−70超遠心機内において64,000×ｇで49時間
遠心分離した。温度は常に10℃に維持した。最上部フラ
クションを除去し、ＺＲ−Ｔと名付けた。
【００６３】小麦胚凝集素分画化 小麦胚凝集素アガロース（Ｖector Ｌab）を小さなカラ
ム中に２mlの体積で詰めた。セファクルＳ− 300カラム
およびコンコナバニン（conconavalin）Ａ−セファロ−
スカラムに40倍濃縮ＺＲ−75−１Ｂ培地を通すことによ
って部分純化したＡＦ−１を調製した。リン酸緩衝液
（ＰＢＳ）中に入れた部分純化ＡＦ−１を１ml／６min
の速度でゆっくりと小麦胚凝集素カラム上に載せた。溶
離液をフラクションとして集め、カラムをＰＢＳ、10m
Ｍ，50m Ｍ，100mＭ，および500mＭのＮ−アセチルグル
コサミンＰＢＳ溶液で連続して洗浄した。フラクション
は蒸留水に対して透析し、各フラクションを50mlずつマ
イクロタイタープレートの各ウェルに配し、ウェルを乾
燥した。前述したように21ＤＤ５および21ＤＤ７を使用
して結合性検定を行なった。全てのＡＦ−１抗原が小麦
胚凝集素と結合した。21ＤＤ５抗体に対する結合性のみ
を有するＡＦ−１のフラクションが10m Ｍおよび50m Ｍ
のＮ−アセチルグルコサミンを用いた際にカラムから溶
離された。21ＤＤ５および21ＤＤ７抗体活性の双方を有
するＡＦ−１は100mＭを超える濃度のＮ−アセチルグル
コサミンを用いた場合にのみ溶離された。
ム中に２mlの体積で詰めた。セファクルＳ− 300カラム
およびコンコナバニン（conconavalin）Ａ−セファロ−
スカラムに40倍濃縮ＺＲ−75−１Ｂ培地を通すことによ
って部分純化したＡＦ−１を調製した。リン酸緩衝液
（ＰＢＳ）中に入れた部分純化ＡＦ−１を１ml／６min
の速度でゆっくりと小麦胚凝集素カラム上に載せた。溶
離液をフラクションとして集め、カラムをＰＢＳ、10m
Ｍ，50m Ｍ，100mＭ，および500mＭのＮ−アセチルグル
コサミンＰＢＳ溶液で連続して洗浄した。フラクション
は蒸留水に対して透析し、各フラクションを50mlずつマ
イクロタイタープレートの各ウェルに配し、ウェルを乾
燥した。前述したように21ＤＤ５および21ＤＤ７を使用
して結合性検定を行なった。全てのＡＦ−１抗原が小麦
胚凝集素と結合した。21ＤＤ５抗体に対する結合性のみ
を有するＡＦ−１のフラクションが10m Ｍおよび50m Ｍ
のＮ−アセチルグルコサミンを用いた際にカラムから溶
離された。21ＤＤ５および21ＤＤ７抗体活性の双方を有
するＡＦ−１は100mＭを超える濃度のＮ−アセチルグル
コサミンを用いた場合にのみ溶離された。
【００６４】Ｅ．ＡＦ―１の特色化 膜小胞の調製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット
転移、およびオートラジオグラフによる視覚化を全て前
述の通りに行なった。
転移、およびオートラジオグラフによる視覚化を全て前
述の通りに行なった。
【００６５】イムノペルオキシダ―ゼアッセイ コルチャー（Ｃolcher）等、Ｃancer ．Ｒesearch ，4
1，1451（1981）による間接４段階ペルオキシダーゼ−
抗ペルオキシダーゼアッセイをパラフィン固定細識切片
中におけるＡＦ−１の視覚化のために用いた。切片をキ
シレンで脱パラフィン化し、再び水和した後、 0.3％過
酸化水素メタノール溶液で30分間処理することによって
内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。切片は３％正
常ウマ血清で20分間処理した後、未希釈の21ＤＤ５もし
くは21ＤＤ７ハイブリドーマ上澄液もしくはジニトロフ
ェノール（ＤＨＫ）に対するモノクローナル抗体を含有
するコントロール上澄液と共に30分間インキュベートし
た。次いで、希釈率１：1000のウサギ抗マウスＩg Ｇ、
希釈率１： 200のヒツジ抗ウサギＩg Ｇ、および希釈率
１：1000のウサギ抗ペルオキシダーゼ／ペルオキシダー
ゼ複合体と共に30分間のインキュベーションを行なっ
た。抗体の各インキュベーションの間には10分間の緩衝
液洗浄を行なった。最後に切片を 0.01 ％の過酸化水素
と 0.05 ％のジアミノベンジンと共に５分間インキュベ
ーションするとアッセイによって抗体が検出された場所
の全てに茶色の沈澱が得られた。全ての組織標本はペン
シルバニア州セイアのガスリークリニックのケネス・メ
イヤー博士（Ｄr ．Ｋenneth Ｍeyer of Ｇuthrie Ｃ
linic ，Ｓayre，Ｐennsylvania ）もしくはニューヨー
ク州エルマイラのアーノット・オグデン病院のチャール
ズ・クオネン博士（Ｄr ．Ｃharles Ｋuonen ofＡrnot
−Ｏgden Ｈospital ，Ｅlmira ，Ｎew Ｙork ）から
提供されたものである。
1，1451（1981）による間接４段階ペルオキシダーゼ−
抗ペルオキシダーゼアッセイをパラフィン固定細識切片
中におけるＡＦ−１の視覚化のために用いた。切片をキ
シレンで脱パラフィン化し、再び水和した後、 0.3％過
酸化水素メタノール溶液で30分間処理することによって
内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。切片は３％正
常ウマ血清で20分間処理した後、未希釈の21ＤＤ５もし
くは21ＤＤ７ハイブリドーマ上澄液もしくはジニトロフ
ェノール（ＤＨＫ）に対するモノクローナル抗体を含有
するコントロール上澄液と共に30分間インキュベートし
た。次いで、希釈率１：1000のウサギ抗マウスＩg Ｇ、
希釈率１： 200のヒツジ抗ウサギＩg Ｇ、および希釈率
１：1000のウサギ抗ペルオキシダーゼ／ペルオキシダー
ゼ複合体と共に30分間のインキュベーションを行なっ
た。抗体の各インキュベーションの間には10分間の緩衝
液洗浄を行なった。最後に切片を 0.01 ％の過酸化水素
と 0.05 ％のジアミノベンジンと共に５分間インキュベ
ーションするとアッセイによって抗体が検出された場所
の全てに茶色の沈澱が得られた。全ての組織標本はペン
シルバニア州セイアのガスリークリニックのケネス・メ
イヤー博士（Ｄr ．Ｋenneth Ｍeyer of Ｇuthrie Ｃ
linic ，Ｓayre，Ｐennsylvania ）もしくはニューヨー
ク州エルマイラのアーノット・オグデン病院のチャール
ズ・クオネン博士（Ｄr ．Ｃharles Ｋuonen ofＡrnot
−Ｏgden Ｈospital ，Ｅlmira ，Ｎew Ｙork ）から
提供されたものである。
【００６６】抗原の純化 抗原は培地内に流し込まれるものであり、膜の可溶化が
不必要であるため、増殖ＭＣＦ−７細胞から集めた培地
を選択した。老廃培地（ 1.6リットル）は０℃において
硫酸アンモニウムを用いて50％飽和させた。抗原含有沈
澱物は遠心分離によって集め、130ml のリン酸緩衝溶液
（ＰＢＳ）中に再溶解した。ＰＢＳに対する透析の後、
体積が80mlに達した際に沈澱物が形成したために混合物
濃縮の試みを中止した。部分的に濃縮した溶液のうちの
20mlをセファクリルＳ− 300ゲル濾過カラムに通した。
カラムから得た抗原性を有するフラクションを混合し、
予め21ＤＤ５モノクローナル抗体を共有結合させておい
たアフィゲル（ＡffigelTM）−10カラムに通した。この
親和性カラムは溶出液の280nm における吸光度がゼロと
なるまで食塩水で洗浄した。pH 2.3の硫酸グリシンをこ
のカラムに通して抗原を21ＤＤ５抗体から分離した。溶
出物のpHを直ちに約 7.3まで上昇させるため、フラクシ
ョンはpH 8.0の２Ｍトリス中に集めた。このカラムから
回収された抗原性は親和純化（affinity−purified）抗
原と称し、Ｓ− 300カラムから回収された抗原性は部分
純化（partially purified）抗原と称する。
不必要であるため、増殖ＭＣＦ−７細胞から集めた培地
を選択した。老廃培地（ 1.6リットル）は０℃において
硫酸アンモニウムを用いて50％飽和させた。抗原含有沈
澱物は遠心分離によって集め、130ml のリン酸緩衝溶液
（ＰＢＳ）中に再溶解した。ＰＢＳに対する透析の後、
体積が80mlに達した際に沈澱物が形成したために混合物
濃縮の試みを中止した。部分的に濃縮した溶液のうちの
20mlをセファクリルＳ− 300ゲル濾過カラムに通した。
カラムから得た抗原性を有するフラクションを混合し、
予め21ＤＤ５モノクローナル抗体を共有結合させておい
たアフィゲル（ＡffigelTM）−10カラムに通した。この
親和性カラムは溶出液の280nm における吸光度がゼロと
なるまで食塩水で洗浄した。pH 2.3の硫酸グリシンをこ
のカラムに通して抗原を21ＤＤ５抗体から分離した。溶
出物のpHを直ちに約 7.3まで上昇させるため、フラクシ
ョンはpH 8.0の２Ｍトリス中に集めた。このカラムから
回収された抗原性は親和純化（affinity−purified）抗
原と称し、Ｓ− 300カラムから回収された抗原性は部分
純化（partially purified）抗原と称する。
【００６７】ＡＦ―１の炭水化物および蛋白質含量 親和純化抗原はロウリー法によって蛋白質を測定し、フ
ェノールー硫酸法［Ｄubois etal，Ａnal ．Ｃhem ，2
8， 350（1956）］によって総糖分含量を測定した。こ
のような測定の結果は蛋白質 132μｇ／mlおよび糖分 3
00μｇ／mlであった。これらの結果から、ＡＦ−１は糖
蛋白質であると考えられるが、炭水化物と蛋白質との割
合は確立されていない。
ェノールー硫酸法［Ｄubois etal，Ａnal ．Ｃhem ，2
8， 350（1956）］によって総糖分含量を測定した。こ
のような測定の結果は蛋白質 132μｇ／mlおよび糖分 3
00μｇ／mlであった。これらの結果から、ＡＦ−１は糖
蛋白質であると考えられるが、炭水化物と蛋白質との割
合は確立されていない。
【００６８】アルカリ処理 部分純化抗原はセリンおよび／もしくはスレオニン部と
炭水化物部との間のＯ−グリコシド結合を分割するβ−
除去反応の影響を受けるか否かを測定するために一晩４
℃において 0.1Ｎ水酸化ナトリウムで処理した。
炭水化物部との間のＯ−グリコシド結合を分割するβ−
除去反応の影響を受けるか否かを測定するために一晩４
℃において 0.1Ｎ水酸化ナトリウムで処理した。
【００６９】このような穏やかなアルカリ処理により、
より小さな分子量の形態に関連づけられるべき抗原性が
生じ、炭水化物ユニットが少なくとも部分的にはＯ−グ
ルコシド結合によって蛋白質の主鎖に、恐らくはセリン
もしくはスレオニンに結合していることが示された。
より小さな分子量の形態に関連づけられるべき抗原性が
生じ、炭水化物ユニットが少なくとも部分的にはＯ−グ
ルコシド結合によって蛋白質の主鎖に、恐らくはセリン
もしくはスレオニンに結合していることが示された。
【００７０】注入されたＡＦ―１の分子量測定 ＺＲ−75−１Ｂ細胞を増殖させた組織培養培地は10分間
500×ｇで遠心分離して細胞を除去した後、45分間48,0
00×ｇで遠心分離した。ペレット化した物質には全てＡ
Ｆ−１活性が認められた。このようなペレット化物質は
一晩４℃において１％トリトン−Ｘ（Ｔriton −ＸTM）
100中で可溶化した。得られた混合物は48,000×ｇで45
分間遠心分離し、上澄液は 0.01 ％のトリトン−Ｘ 100
を含有するリン酸緩衝液に対して透析した。透析した溶
液をセファクリルＳ− 100カラム上に流すとＡＦ−１活
性の１つのピークが得られ、公知の分子量を有する蛋白
質を用いたカラムの標準化により、このピークは分子量
約33,000に対応することが明らかとなった。
500×ｇで遠心分離して細胞を除去した後、45分間48,0
00×ｇで遠心分離した。ペレット化した物質には全てＡ
Ｆ−１活性が認められた。このようなペレット化物質は
一晩４℃において１％トリトン−Ｘ（Ｔriton −ＸTM）
100中で可溶化した。得られた混合物は48,000×ｇで45
分間遠心分離し、上澄液は 0.01 ％のトリトン−Ｘ 100
を含有するリン酸緩衝液に対して透析した。透析した溶
液をセファクリルＳ− 100カラム上に流すとＡＦ−１活
性の１つのピークが得られ、公知の分子量を有する蛋白
質を用いたカラムの標準化により、このピークは分子量
約33,000に対応することが明らかとなった。
【００７１】酵素処理 抗原を酵素処理し、次いで上述のＧ項に記載されたウサ
ギ抗ＡＦ−１ラジオイムノアッセイによってこのような
処理の効果を測定することによってＡＦ−１の特性に関
する他の情報を得た。
ギ抗ＡＦ−１ラジオイムノアッセイによってこのような
処理の効果を測定することによってＡＦ−１の特性に関
する他の情報を得た。
【００７２】21ＤＤ５および21ＤＤ７抗体の双方に対し
て２組の結果を得るために様々な酵素処理を行なった。
各組において、抗体が使用されなかった際の結果を陽性
とし、酵素処理のない場合の結果を陽性コントロールと
した。このような酵素処理は37℃で２時間行ない、その
後、反応混合物を５分間 100℃に加熱することによって
酵素を不活化した。必要に応じてラジオイムノアッセイ
実施前に水酸ナトリウム水溶液の添加によって反応混合
物のpHを 7.4に調整した。21ＤＤ５の組においてブラン
クはコントロールの約９％であった。21ＤＤ７の組にお
いてブランクはコントロールの約７％であった。各組に
おいてコントロールを含む各々の結果からブランクを引
いた。
て２組の結果を得るために様々な酵素処理を行なった。
各組において、抗体が使用されなかった際の結果を陽性
とし、酵素処理のない場合の結果を陽性コントロールと
した。このような酵素処理は37℃で２時間行ない、その
後、反応混合物を５分間 100℃に加熱することによって
酵素を不活化した。必要に応じてラジオイムノアッセイ
実施前に水酸ナトリウム水溶液の添加によって反応混合
物のpHを 7.4に調整した。21ＤＤ５の組においてブラン
クはコントロールの約９％であった。21ＤＤ７の組にお
いてブランクはコントロールの約７％であった。各組に
おいてコントロールを含む各々の結果からブランクを引
いた。
【００７３】このような酵素処理の結果の重要性はこの
ような処理の21ＤＤ５および21ＤＤ７決定基に対する影
響すなわちコントロールに対するこのような処理の影響
である。このような効果は表１に要約されており、各酵
素処理における１分あたりの結合カウントがコントロー
ルに対する百分率で表わされている。すなわち、 100未
満の百分率は21ＤＤ５もしくは21ＤＤ７の決定基活性の
減少を示し、 100を超える百分率はその増加を示す。
ような処理の21ＤＤ５および21ＤＤ７決定基に対する影
響すなわちコントロールに対するこのような処理の影響
である。このような効果は表１に要約されており、各酵
素処理における１分あたりの結合カウントがコントロー
ルに対する百分率で表わされている。すなわち、 100未
満の百分率は21ＤＤ５もしくは21ＤＤ７の決定基活性の
減少を示し、 100を超える百分率はその増加を示す。
【００７４】
【表１】 21ＤＤ５および21 ＤＤ７抗体によって測定され た様々な酵素処理の結果 酵素処理 21ＤＤ５コントロ―ルの％ 21ＤＤ７コントロ―ルの％ 無コントロール 100 100 α−ガラクトシダーゼ 60 62 β−Ｎ−Ａcetyl a 62 66 ノイラミニダーゼ 198 56 α−Ｇal／Ｎeur b 132 27 β−Ｎ−Ａcetyl ／Ｎeur c 110 20 a β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ b α−ガラクトシダーゼおよびノイラニミダーゼの同
時使用 c β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびノイラ
ミニダーゼの同時使用 表から明らかなように、α−ガラクトシダーゼおよびβ
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが21ＤＤ５および21
ＤＤ７決定基に及ぼす影響はほぼ同等であった。すなわ
ち、両酵素はいずれの場合にもほぼ同等の効果を有し、
決定基活性を34〜40％減少させた。しかしながら、ノイ
ラミニダーゼの効果は著しく異なっていた。この酵素は
21ＤＤ５決定基活性をほぼ２倍としたのに反して21ＤＤ
７決定基活性をほぼ半分に低減した。
時使用 c β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびノイラ
ミニダーゼの同時使用 表から明らかなように、α−ガラクトシダーゼおよびβ
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが21ＤＤ５および21
ＤＤ７決定基に及ぼす影響はほぼ同等であった。すなわ
ち、両酵素はいずれの場合にもほぼ同等の効果を有し、
決定基活性を34〜40％減少させた。しかしながら、ノイ
ラミニダーゼの効果は著しく異なっていた。この酵素は
21ＤＤ５決定基活性をほぼ２倍としたのに反して21ＤＤ
７決定基活性をほぼ半分に低減した。
【００７５】α−ガラクトシダーゼとノイラミニダーゼ
の組合せおよびβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼと
ノイラミニダーゼの組合せによる21ＤＤ７決定基活性に
対する効果はいかなる単一の酵素処理よりも大きかっ
た。しかしながら、21ＤＤ５決定基活性における最終的
な活性はノイラミニダーゼ処理のみの場合よりかなり低
いもののコントロールよりは高かった。
の組合せおよびβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼと
ノイラミニダーゼの組合せによる21ＤＤ７決定基活性に
対する効果はいかなる単一の酵素処理よりも大きかっ
た。しかしながら、21ＤＤ５決定基活性における最終的
な活性はノイラミニダーゼ処理のみの場合よりかなり低
いもののコントロールよりは高かった。
【００７６】抗原の位置 様々な型の乳房上皮細胞膜小胞を21ＤＤ５および21ＤＤ
７決定基活性に対するマイクロタイタープレートアッセ
イによって分析し、結果を表２に示した。アッセイを行
なった各ウェルは全ての場合において３μｇの蛋白質を
含有していたため、小胞調製間で相対比較をすることが
可能である。例えばインビトロの細胞系であるＺＲ−75
−１ＢおよびＭＣＦ−７は乳房切除サンプルよりも多く
の両決定基を含有するように見えるが、物質の供給源を
考慮しなければならない。細胞系調製物の全ては腫もし
くは少なくとも形質転換された細胞であるが、乳房切除
サンプルは腫および「正常」上皮細胞および非上皮起源
細胞を含んでいる。この複雑性にも拘らず、恐らくはＢ
Ｍ10を除く全ての乳房上皮細胞膜はいくらかの抗原を含
有していることが認められる。また、このような結果は
腫細胞膜のみならず、ＨＭＦＧＰに対する結合によって
示されるように正常細胞上にも抗原の生ずることを示し
ている。
７決定基活性に対するマイクロタイタープレートアッセ
イによって分析し、結果を表２に示した。アッセイを行
なった各ウェルは全ての場合において３μｇの蛋白質を
含有していたため、小胞調製間で相対比較をすることが
可能である。例えばインビトロの細胞系であるＺＲ−75
−１ＢおよびＭＣＦ−７は乳房切除サンプルよりも多く
の両決定基を含有するように見えるが、物質の供給源を
考慮しなければならない。細胞系調製物の全ては腫もし
くは少なくとも形質転換された細胞であるが、乳房切除
サンプルは腫および「正常」上皮細胞および非上皮起源
細胞を含んでいる。この複雑性にも拘らず、恐らくはＢ
Ｍ10を除く全ての乳房上皮細胞膜はいくらかの抗原を含
有していることが認められる。また、このような結果は
腫細胞膜のみならず、ＨＭＦＧＰに対する結合によって
示されるように正常細胞上にも抗原の生ずることを示し
ている。
【００７７】
【表２】 21ＤＤ５および21 ＤＤ７抗原性に関する小胞調 製物のラジオイムノアッセイ 小胞供給源 ＣＰＭ結合 ＤＨＫ a 21 ＤＤ７ 21ＤＤ５ ＺＲ−75−１Ｂb 620 3,434 4,678 ＭＣＦ−７b 396 2,226 4,770 ＢＭ８c 557 2,042 1,496 ＢＭ10c 498 584 421 ＢＭ12c 707 2,007 1,912 ＢＭ14c 411 1,246 2,590 ＨＭＦＧＰd 413 892 1,770 a ＤＨＫ＝ジニトロフェニール抗体を産生するハイブ
リドーマ b インビトロ乳腫細胞系 c ガスリークリニック由来の乳房切除組織サンプル d ＨＭＦＧＰ＝ヒト乳脂肪球蛋白質 これらと同一の小胞調製物に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびウェスタンブロット法を用い、次いでラジオグラフ
による視覚化によって同様の分析を行なった。小胞調製
物をＳＤＳ処理し、アッセイに先立って還元条件とする
ことによって抗原検出に干渉するような抗原−抗体複合
体は全て分離することができた。さらに、これらの工程
によって各調製物における抗原形態の分子量に関する情
報が得られた。ラジオグラフの最も顕著な特徴は様々な
小胞調製物における抗原の分子形状の差異であった。Ｚ
Ｒ−75−１ＢおよびＭＣＦ−７小胞はいずれも３つの形
状の抗原を有していたが、ＭＣＦ−７はＺＲ−75−１Ｂ
よりも大きな分子量の形状を有していた。この差はＺＲ
−75−１Ｂ調製物に出現する最小の形態がＭＣＦ−７調
製物中には極わずかしか検出され得なかったことから恐
らく減成に起因するものと考えられた。予想通り、ＭＥ
− 180小胞（頚管）は抗原を有していなかった。４つの
乳房切除小胞調製物のうち３つは抗原の分子形態を２つ
有しており、これらはいずれもＺＲ−75−１Ｂもしくは
ＭＣＦ−７小胞調製物のその形態と同じ位置にバンドを
形成するものではなかった。ＢＭ10小胞調製物は21ＤＤ
５活性が検出できないという点で他と異なっているが、
21ＤＤ７活性はＺＲ−75−１ＢおよびＭＣＦ−７調製物
の中位バンドと同様の位置に１本のバンドとして存在し
た。ＨＭＦＧ調製物はこれと同一のバンドを21ＤＤ７に
関して有していたが、21ＤＤ５活性に関してはより大き
な分子形態しか有していなかった。ＭＣＦ−７培地から
分離した親和純化抗原はＭＣＦ−７調製物の最も高いバ
ンドに対応した。プレートした小胞調製物のラジオイム
ノアッセイで得た相対的な値とは必ずしも相関関係のな
い主要な量的差異が認められた。例えば、ウェスタンブ
ロットにおいてはＨＭＦＧ調製物は21ＤＤ５活性よりも
大きな21ＤＤ７活性を示したが、ラジオイムノアッセイ
では正反対であった。
リドーマ b インビトロ乳腫細胞系 c ガスリークリニック由来の乳房切除組織サンプル d ＨＭＦＧＰ＝ヒト乳脂肪球蛋白質 これらと同一の小胞調製物に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびウェスタンブロット法を用い、次いでラジオグラフ
による視覚化によって同様の分析を行なった。小胞調製
物をＳＤＳ処理し、アッセイに先立って還元条件とする
ことによって抗原検出に干渉するような抗原−抗体複合
体は全て分離することができた。さらに、これらの工程
によって各調製物における抗原形態の分子量に関する情
報が得られた。ラジオグラフの最も顕著な特徴は様々な
小胞調製物における抗原の分子形状の差異であった。Ｚ
Ｒ−75−１ＢおよびＭＣＦ−７小胞はいずれも３つの形
状の抗原を有していたが、ＭＣＦ−７はＺＲ−75−１Ｂ
よりも大きな分子量の形状を有していた。この差はＺＲ
−75−１Ｂ調製物に出現する最小の形態がＭＣＦ−７調
製物中には極わずかしか検出され得なかったことから恐
らく減成に起因するものと考えられた。予想通り、ＭＥ
− 180小胞（頚管）は抗原を有していなかった。４つの
乳房切除小胞調製物のうち３つは抗原の分子形態を２つ
有しており、これらはいずれもＺＲ−75−１Ｂもしくは
ＭＣＦ−７小胞調製物のその形態と同じ位置にバンドを
形成するものではなかった。ＢＭ10小胞調製物は21ＤＤ
５活性が検出できないという点で他と異なっているが、
21ＤＤ７活性はＺＲ−75−１ＢおよびＭＣＦ−７調製物
の中位バンドと同様の位置に１本のバンドとして存在し
た。ＨＭＦＧ調製物はこれと同一のバンドを21ＤＤ７に
関して有していたが、21ＤＤ５活性に関してはより大き
な分子形態しか有していなかった。ＭＣＦ−７培地から
分離した親和純化抗原はＭＣＦ−７調製物の最も高いバ
ンドに対応した。プレートした小胞調製物のラジオイム
ノアッセイで得た相対的な値とは必ずしも相関関係のな
い主要な量的差異が認められた。例えば、ウェスタンブ
ロットにおいてはＨＭＦＧ調製物は21ＤＤ５活性よりも
大きな21ＤＤ７活性を示したが、ラジオイムノアッセイ
では正反対であった。
【００７８】パラフィン固定組織サンプル中における抗
原の位置の直接視覚化はイムノペルオキシダーゼアッセ
イによって得た。表３に示す通り、これらのアッセイは
試験された全ての乳房組織が上皮細胞上に局在した抗原
を担持していることを示した点で小胞調製物で得た結果
を立証するものであった。良性乳房組織もしくは正常上
皮細胞は管腔に隣接した頂端表面に局在した抗原を有し
ているようであった。腫細胞はより多くの抗原を有して
おり、抗原は頂端表面のみならず全細胞にわたって存在
しているようであった。多くの場合、21ＤＤ７で得た染
色は21ＤＤ５で得たものよりも大きかった。抗原はこれ
まで試験した組織のうち皮脂腺，卵巣，肺，腎臓および
子宮頚内膜組織内に存在することが見出された。
原の位置の直接視覚化はイムノペルオキシダーゼアッセ
イによって得た。表３に示す通り、これらのアッセイは
試験された全ての乳房組織が上皮細胞上に局在した抗原
を担持していることを示した点で小胞調製物で得た結果
を立証するものであった。良性乳房組織もしくは正常上
皮細胞は管腔に隣接した頂端表面に局在した抗原を有し
ているようであった。腫細胞はより多くの抗原を有して
おり、抗原は頂端表面のみならず全細胞にわたって存在
しているようであった。多くの場合、21ＤＤ７で得た染
色は21ＤＤ５で得たものよりも大きかった。抗原はこれ
まで試験した組織のうち皮脂腺，卵巣，肺，腎臓および
子宮頚内膜組織内に存在することが見出された。
【００７９】
【表３】 イムノペルオキシダ−ゼ アッセイによるヒトの組織における21ＤＤ５／21ＤＤ ７活性の位置測定 被験組織 21ＤＤ５および21ＤＤ７による染色 良性乳房（４）a ＋ 乳 腫（７） ＋ 転移性乳腫（３） ＋ 正常皮膚（２） − 皮膚腫−皮脂腺 ＋ 正 常 頚 管 − 正常子宮頚管−管腔上皮 ＋ 侵入性頚管腫 − 子 宮 腫 ＋ 腎 腫 ＋ 腸 腫 − 正 常 膵 臓 − 正 常 心 臓 − 正 常 肺 ＋ 正 常 肝 臓 − 正 常 脾 臓 − a 括弧内の数字は試験されたこの型の組織の数を示
す。 最後に発癌抗原（ＣＥＡ）、ヘパリン、および硫酸コン
ドロイチンを用いてウェスタンブロットを行なったが、
いずれも21ＤＤ５抗体に対していかなる反応性も示さな
かった。
す。 最後に発癌抗原（ＣＥＡ）、ヘパリン、および硫酸コン
ドロイチンを用いてウェスタンブロットを行なったが、
いずれも21ＤＤ５抗体に対していかなる反応性も示さな
かった。
【００８０】したがって、21ＤＤ５および21ＤＤ７モノ
クローナル抗体は同一の抗原分子に特異的に結合する
が、その異なった決定基を検出するものと考えられる。
抗原は明らかに上皮細胞起源のものであり、乳房，子宮
頚管，および卵巣等のような正常な分泌組織に主として
関係しているものと考えられる。抗原上の21ＤＤ７決定
基の量は乳腫の存在によって増加する。
クローナル抗体は同一の抗原分子に特異的に結合する
が、その異なった決定基を検出するものと考えられる。
抗原は明らかに上皮細胞起源のものであり、乳房，子宮
頚管，および卵巣等のような正常な分泌組織に主として
関係しているものと考えられる。抗原上の21ＤＤ７決定
基の量は乳腫の存在によって増加する。
【００８１】Ｆ．エストロゲン刺激試験 要約すれば、デキストランコートした木炭で処理してス
テロイドを除去した10％のウシ胎児血清（ＤＣＣ−ＦＣ
Ｓ）にＺＲ−75−１Ｂ細胞を５日間さらすことによって
ステロイドを枯渇させた。次いで、この枯渇細胞に10-8
Ｍ（17β）−エストラジオールを含有するＤＣＣ−ＦＣ
Ｓを２日，６日，もしくは９日間再供給し、さらに無血
清下で３日間ホルモンにさらした。コントロールとして
は枯渇細胞にＤＣＣ−ＦＣＳのみを２日，６日，もしく
は９日間再供給した後、無血清培地を３日間供給した。
細胞は溶解し、細胞蛋白質は５〜16％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で処理し、前述のウェスタンブロット転移法を行なっ
た。オートグラフによる視覚化において前述のように21
ＤＤ５および21ＤＤ７抗体を用いた。細胞はホルモンに
さらした後５日目，９日目，および12日目にサンプリン
グした。培地は12日目にサンプリングした。
テロイドを除去した10％のウシ胎児血清（ＤＣＣ−ＦＣ
Ｓ）にＺＲ−75−１Ｂ細胞を５日間さらすことによって
ステロイドを枯渇させた。次いで、この枯渇細胞に10-8
Ｍ（17β）−エストラジオールを含有するＤＣＣ−ＦＣ
Ｓを２日，６日，もしくは９日間再供給し、さらに無血
清下で３日間ホルモンにさらした。コントロールとして
は枯渇細胞にＤＣＣ−ＦＣＳのみを２日，６日，もしく
は９日間再供給した後、無血清培地を３日間供給した。
細胞は溶解し、細胞蛋白質は５〜16％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で処理し、前述のウェスタンブロット転移法を行なっ
た。オートグラフによる視覚化において前述のように21
ＤＤ５および21ＤＤ７抗体を用いた。細胞はホルモンに
さらした後５日目，９日目，および12日目にサンプリン
グした。培地は12日目にサンプリングした。
【００８２】これらの実験によれば10-8Ｍ（17β）−エ
ストラジオールが培地内に増殖した乳癌細胞中の21ＤＤ
５決定基の蓄積を刺激し、また21ＤＤ５決定基に富んだ
抗原は培地内に取り込まれたことが明らかとなった。Ｚ
Ｒ−75−１Ｂ細胞内においてエストロゲン効果は主とし
て細胞と関連する。使用された実験条件下においては比
較的小量の21ＤＤ決定基に富んだ抗原が培地内に取り込
まれたが、培地内において測定可能であれば細胞によっ
て取り込まれた量もまたエストロゲンによって刺激され
た。ＭＣＦ−７細胞系においてはエストロゲンは培地内
に取り込まれる抗原を極めてより多く増大する。21ＤＤ
５決定基はエストロジェンによって最初（２日目）は細
胞内で刺激され、次いで細胞から減少し、培地内で（５
日目に）蓄積が増大するようであった。エストロゲンは
21ＤＤ７決定基増大させるものとは考えられなかった。
ストラジオールが培地内に増殖した乳癌細胞中の21ＤＤ
５決定基の蓄積を刺激し、また21ＤＤ５決定基に富んだ
抗原は培地内に取り込まれたことが明らかとなった。Ｚ
Ｒ−75−１Ｂ細胞内においてエストロゲン効果は主とし
て細胞と関連する。使用された実験条件下においては比
較的小量の21ＤＤ決定基に富んだ抗原が培地内に取り込
まれたが、培地内において測定可能であれば細胞によっ
て取り込まれた量もまたエストロゲンによって刺激され
た。ＭＣＦ−７細胞系においてはエストロゲンは培地内
に取り込まれる抗原を極めてより多く増大する。21ＤＤ
５決定基はエストロジェンによって最初（２日目）は細
胞内で刺激され、次いで細胞から減少し、培地内で（５
日目に）蓄積が増大するようであった。エストロゲンは
21ＤＤ７決定基増大させるものとは考えられなかった。
【００８３】21ＤＤ５決定基のエストロゲン刺激はエス
トロゲン操作に反応する腫瘍を有する乳癌患者の同定に
とって有用となるものである。21ＤＤ５決定基のような
エストロゲンで変化する最終産物を用いた場合、エスト
ロゲンが腫瘍（癌）の成長を制御する能力を鑑みれば、
75〜80％という従来技術の方法の精度よりもより決定的
な診断が可能であろう。
トロゲン操作に反応する腫瘍を有する乳癌患者の同定に
とって有用となるものである。21ＤＤ５決定基のような
エストロゲンで変化する最終産物を用いた場合、エスト
ロゲンが腫瘍（癌）の成長を制御する能力を鑑みれば、
75〜80％という従来技術の方法の精度よりもより決定的
な診断が可能であろう。
【００８４】Ｇ．乳癌の診断および予後 21ＤＤ５および21ＤＤ７抗体によって認識される２つの
決定基の測定を可能とするイムノアッセイを行なうた
め、多価異種ウサギ抗血清を形成した。要約すれば、等
体積の完全フロインドアジュバント中に浮化した 100μ
ｌの標準ＡＦ−１調製物でウサギを免疫した。免疫化は
３回繰返し、最後の注射の７日後にウサギの耳から放血
を行なった。抗血清由来の抗体は部分純化したＡＦ−１
のＳ１フラクション（Ｄ項参照）を結合したセファロー
スＣＨカラム上で親和純化した。
決定基の測定を可能とするイムノアッセイを行なうた
め、多価異種ウサギ抗血清を形成した。要約すれば、等
体積の完全フロインドアジュバント中に浮化した 100μ
ｌの標準ＡＦ−１調製物でウサギを免疫した。免疫化は
３回繰返し、最後の注射の７日後にウサギの耳から放血
を行なった。抗血清由来の抗体は部分純化したＡＦ−１
のＳ１フラクション（Ｄ項参照）を結合したセファロー
スＣＨカラム上で親和純化した。
【００８５】これらの親和純化した抗体を以下のラジオ
イムノアッセイにおける固定相として用いた場合、21Ｄ
Ｄ５もしくは21ＤＤ７抗体の使用により、このようなウ
サギ抗体に補捉された特定の決定基を含有する分子の量
を測定することが可能となった。
イムノアッセイにおける固定相として用いた場合、21Ｄ
Ｄ５もしくは21ＤＤ７抗体の使用により、このようなウ
サギ抗体に補捉された特定の決定基を含有する分子の量
を測定することが可能となった。
【００８６】以下に記載する結果は、21ＤＤ７決定基活
性の絶対量および21ＤＤ７決定基活性の21ＤＤ５決定基
活性に対する割合の双方が進行乳癌の指標を与えるもの
であることを示している。
性の絶対量および21ＤＤ７決定基活性の21ＤＤ５決定基
活性に対する割合の双方が進行乳癌の指標を与えるもの
であることを示している。
【００８７】55人の異なった個体から得た血漿サンプル
を試験した。27サンプルは正常な女性もしくは良性の乳
疾患を有する女性に由来するものであり、28サンプルは
乳癌もしくは他の癌患者に由来するものであった。
を試験した。27サンプルは正常な女性もしくは良性の乳
疾患を有する女性に由来するものであり、28サンプルは
乳癌もしくは他の癌患者に由来するものであった。
【００８８】モノクロ―ナル抗体 21ＤＤ５および21ＤＤ７抗体の形成は前述の通りであ
る。全ての抗体は老廃培地上澄液の最適な希釈液として
用いた。
る。全ての抗体は老廃培地上澄液の最適な希釈液として
用いた。
【００８９】ＡＦ―１ 前述した手順にほぼ従って、ＺＲ−75−１Ｂ細胞老廃上
澄液から標準抗原調製物を得た。要約すれば、老廃培地
を50％硫酸アンモニウムで沈澱させた。沈澱物を集め、
再可溶化し、セファクリルＳ− 300カラムで分画した。
排除したフラクションはＡＦ−１活性についてスクリー
ニングを行ない、21ＤＤ５決定基活性を含むフラクショ
ンをプールした。プールした物質は21ＤＤ５抗体カラム
上のアフィニティクロマトクラフィーで純化し、pH 2.3
の 0.2Ｍ硫酸グリシンによる溶離液をこの実験に用いる
純化ＡＦ−１とした。
澄液から標準抗原調製物を得た。要約すれば、老廃培地
を50％硫酸アンモニウムで沈澱させた。沈澱物を集め、
再可溶化し、セファクリルＳ− 300カラムで分画した。
排除したフラクションはＡＦ−１活性についてスクリー
ニングを行ない、21ＤＤ５決定基活性を含むフラクショ
ンをプールした。プールした物質は21ＤＤ５抗体カラム
上のアフィニティクロマトクラフィーで純化し、pH 2.3
の 0.2Ｍ硫酸グリシンによる溶離液をこの実験に用いる
純化ＡＦ−１とした。
【００９０】ウサギ抗ＡＦ―１ラジオイムノアッセイ ウサギ抗ＡＦ−１はＳ１親和性カラムから回収した未濃
縮ストック溶液の１：２希釈液として用いた。血漿は１
％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝溶液で 1.
2， 1.4，もしくは 1.8倍に希釈した。21ＤＤ５抗体は
ハイブリドーマ培地上澄液の１：10希釈液として用い、
21ＤＤ７抗体は１：５希釈液として用いた。ウサギ抗マ
ウスＩg は約５×106 cpm ／μｇの比活性を有するもの
を用いた。
縮ストック溶液の１：２希釈液として用いた。血漿は１
％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝溶液で 1.
2， 1.4，もしくは 1.8倍に希釈した。21ＤＤ５抗体は
ハイブリドーマ培地上澄液の１：10希釈液として用い、
21ＤＤ７抗体は１：５希釈液として用いた。ウサギ抗マ
ウスＩg は約５×106 cpm ／μｇの比活性を有するもの
を用いた。
【００９１】検定を行なうため、ポリビニルマイクロタ
イタープレートの各ウェルを50μｌのウサギ抗ＡＦ−１
でコートした。プレートは４℃で一晩インキュベートし
た。ウェルはpH 7.4のリン酸緩衝溶液で１回洗浄した
後、非特異性部位を封鎖するために１％ウシ血清アルブ
ミンを含有するpH 7.4のリン酸緩衝溶液（ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ）に浸した。次いで各ウェルに純化した50μｌのＡＦ
−１溶液を添加した。プレートは37℃で45分間インキュ
ベートした。ウェルはＢＳＡ−ＰＢＳで４回洗浄した。
各ウェルに適当なモノクローナル抗体溶液（21ＤＤ５も
しくは21ＤＤ７）を50μｌ添加した。プレートは再び37
℃で45分間インキュベートし、次いでＢＳＡ−ＰＢＳで
４回洗浄した。100,000cpmの 125Ｉ−標識化ウサギ抗マ
ウスＩg を含有する50μｌのＢＳＡ−ＰＢＳを各ウェル
に添加した。プレートは37℃で45分間、３回目のインキ
ュベートを行なった。以前と同様にプレートを４回洗浄
した後、各ウェルの１分あたりの結合カウントを測定し
た。各アッセイは３回ずつ行ない、結果は平均±標準偏
差で示した。
イタープレートの各ウェルを50μｌのウサギ抗ＡＦ−１
でコートした。プレートは４℃で一晩インキュベートし
た。ウェルはpH 7.4のリン酸緩衝溶液で１回洗浄した
後、非特異性部位を封鎖するために１％ウシ血清アルブ
ミンを含有するpH 7.4のリン酸緩衝溶液（ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ）に浸した。次いで各ウェルに純化した50μｌのＡＦ
−１溶液を添加した。プレートは37℃で45分間インキュ
ベートした。ウェルはＢＳＡ−ＰＢＳで４回洗浄した。
各ウェルに適当なモノクローナル抗体溶液（21ＤＤ５も
しくは21ＤＤ７）を50μｌ添加した。プレートは再び37
℃で45分間インキュベートし、次いでＢＳＡ−ＰＢＳで
４回洗浄した。100,000cpmの 125Ｉ−標識化ウサギ抗マ
ウスＩg を含有する50μｌのＢＳＡ−ＰＢＳを各ウェル
に添加した。プレートは37℃で45分間、３回目のインキ
ュベートを行なった。以前と同様にプレートを４回洗浄
した後、各ウェルの１分あたりの結合カウントを測定し
た。各アッセイは３回ずつ行ない、結果は平均±標準偏
差で示した。
【００９２】患者の血漿サンプルは通常ヘパリン処理し
た管に採取し、直ちにアリコート化して−70℃で凍結し
た。若干のサンプルは以前の実験に由来するもので、そ
のうちのいくつかは数回の凍結−解凍サイクルを経たも
のであった。一般に凍結および解凍による明白な結果の
変動は認められなかった。
た管に採取し、直ちにアリコート化して−70℃で凍結し
た。若干のサンプルは以前の実験に由来するもので、そ
のうちのいくつかは数回の凍結−解凍サイクルを経たも
のであった。一般に凍結および解凍による明白な結果の
変動は認められなかった。
【００９３】最初の実験においては正常な３検体、良性
乳房疾患の３検体、および第４段階の乳癌患者４検体に
由来する血漿をアッセイにおいて試験した。系は１連の
ＡＦ−１希釈液（１：20〜１： 160）を１つのプレート
上に流し、これら希釈液のうちの２つ（１：20および
１：80）を全ての隣接したプレートに流すことによって
内部標準化した。この結果、各プレートの特性に対して
内部コントロールが得られ、結合性には20〜25％以下の
変動が生じたが、多くのプレートはこのような変動より
も互いにより近くなった。血漿No.11 および14は同一の
女性に由来する連続した放血であり、極めて類似した結
果を示した。いかなる統計操作においてもNo.11 のみが
包含される。表４におけるデータは３回の測定の平均値
であり、同様の結合値を与えるＡＦ−１ストックの希釈
率の逆数として表わした。次いでこの値を希釈率に換算
した。各特性に対する値を 100倍するとＡＦ−１ストッ
ク中に存在する抗原の百分率が表わされる。また、21Ｄ
Ｄ５／21ＤＤ７比を希釈率１：４の各血漿において計算
した。正常もしくは良性乳房疾患患者６検体において得
た比は 1.91 〜 2.50 で平均は 2.18 ± 0.205（ＳＤ）
であった。これに対し、第４段階の乳癌患者に由来する
血漿においてこの値は 2.75 〜56.6で平均は22.12 ±2
5.3（ＳＤ）であった。この限定的な実験においてこれ
らの範囲は全く重複せず、コントロール群で得られた値
の分布は極めて狭かった。21ＤＤ７値をそれだけで比較
すると癌患者に由来する血漿は高い値の21ＤＤ７を有し
ているが、血漿No.13 は明らかに正常群領域に入る値を
示した。これら２つの群の間における21ＤＤ７値の差は
小さい。この結果から、21ＤＤ５決定基は正常組織抗原
を反映するものであり、21ＤＤ７決定基の増加もしくは
21ＤＤ７決定基の21ＤＤ５決定基に対する相対的な増加
は新生変化を反映するものであると解釈することが可能
である。
乳房疾患の３検体、および第４段階の乳癌患者４検体に
由来する血漿をアッセイにおいて試験した。系は１連の
ＡＦ−１希釈液（１：20〜１： 160）を１つのプレート
上に流し、これら希釈液のうちの２つ（１：20および
１：80）を全ての隣接したプレートに流すことによって
内部標準化した。この結果、各プレートの特性に対して
内部コントロールが得られ、結合性には20〜25％以下の
変動が生じたが、多くのプレートはこのような変動より
も互いにより近くなった。血漿No.11 および14は同一の
女性に由来する連続した放血であり、極めて類似した結
果を示した。いかなる統計操作においてもNo.11 のみが
包含される。表４におけるデータは３回の測定の平均値
であり、同様の結合値を与えるＡＦ−１ストックの希釈
率の逆数として表わした。次いでこの値を希釈率に換算
した。各特性に対する値を 100倍するとＡＦ−１ストッ
ク中に存在する抗原の百分率が表わされる。また、21Ｄ
Ｄ５／21ＤＤ７比を希釈率１：４の各血漿において計算
した。正常もしくは良性乳房疾患患者６検体において得
た比は 1.91 〜 2.50 で平均は 2.18 ± 0.205（ＳＤ）
であった。これに対し、第４段階の乳癌患者に由来する
血漿においてこの値は 2.75 〜56.6で平均は22.12 ±2
5.3（ＳＤ）であった。この限定的な実験においてこれ
らの範囲は全く重複せず、コントロール群で得られた値
の分布は極めて狭かった。21ＤＤ７値をそれだけで比較
すると癌患者に由来する血漿は高い値の21ＤＤ７を有し
ているが、血漿No.13 は明らかに正常群領域に入る値を
示した。これら２つの群の間における21ＤＤ７値の差は
小さい。この結果から、21ＤＤ５決定基は正常組織抗原
を反映するものであり、21ＤＤ７決定基の増加もしくは
21ＤＤ７決定基の21ＤＤ５決定基に対する相対的な増加
は新生変化を反映するものであると解釈することが可能
である。
【００９４】
【表４】血清No. 21ＤＤ５ 21ＤＤ７ 21ＤＤ７ ／21ＤＤ５ 診 断 １ 0.0136 0.0314 2.31 正常（Ｎ） ２ 0.0129 0.0274 2.12 〃 ３ 0.0155 0.0296 1.91 〃 ４ 0.0103 0.0258 2.50 良性乳房疾患（ＢＢ） ５ 0.0085 0.0167 1.96 〃 ６ 0.0056 0.0128 2.28 〃 10 0.0173 0.0476 2.75 第４段階乳癌 11 0.0191 1.0810 56.60 〃 12 0.0117 0.2985 25.51 〃 13 0.0071 0.0258 3.63 〃 14 0.0183 1.2121 66.22 〃 ２つの付加的な実験においては55人の異なった患者の値
を含むようにデータを広げた。これらのデータを表５お
よび６に示す。ひれらの拡大したデータはもはやコント
ロールおよび癌患者の間に非重複領域を示すものではな
いが、多くの癌患者においては増加した21ＤＤ７値もし
くは増加した21ＤＤ７／21ＤＤ５比が残存している。
を含むようにデータを広げた。これらのデータを表５お
よび６に示す。ひれらの拡大したデータはもはやコント
ロールおよび癌患者の間に非重複領域を示すものではな
いが、多くの癌患者においては増加した21ＤＤ７値もし
くは増加した21ＤＤ７／21ＤＤ５比が残存している。
【００９５】
【表５】 血清No. 21Ｄ Ｄ５ 21ＤＤ７ 21ＤＤ７／21ＤＤ５ 診 断 18 0.0156 0.0315 2.02 良性乳房疾患 19 0.00634 0.0142 2.24 〃 20 0.00695 0.0154 2.21 〃 21 0.00938 0.0213 2.27 〃 22 0.00888 0.0207 2.33 正 常 23 0.00898 0.0172 1.91 〃 ７ 0.01201 0.0268 2.23 良性乳房疾患 ８ 0.01687 0.0312 1.85 良性乳房疾患 ９ 0.0076 0.0188 2.47 〃 10 0.0108 0.0263 2.43 正 常 75 0.0081 0.0205 2.53 良性乳房疾患 14 0.160 0.500 3.12 第４段階乳癌 60 0.0333 0.0412 1.24 〃 62 0.0165 2.857 173.1 〃 15 0.00886 0.0229 2.58 〃 16 0.0115 0.296 25.7 〃 17 0.0066 0.111 16.8 〃
【００９６】
【表６】 血清No. 21Ｄ Ｄ５ 21ＤＤ７ 21ＤＤ７／21ＤＤ５ 診 断 １ 0.0041 0.0163 3.97 正常 ２ 0.0098 0.0277 2.82 〃 ３ 0.0082 0.0185 2.25 〃 ４ 0.00116 0.0218 1.87 正常 ５ 0.0049 0.0155 3.16 〃 ８ 0.0061 0.0202 3.31 〃 ９ 0.0066 0.0152 2.30 〃 11 0.0053 0.0175 3.30 〃 12 0.0053 0.0131 2.47 〃 13 0.0080 0.0131 1.64 〃 18 0.0042 0.0281 6.69 第４段階腸癌 20 0.0049 0.6666 135.0 第４段階腎癌 21 0.0051 0.0242 4.74 第４段階肺癌 36 0.0072 0.0294 4.08 第３段階乳癌 37 0.0044 0.0165 3.75 〃 39 0.0049 0.0169 3.45 第１段階乳癌 40 0.0034 0.0136 4.00 第３段階乳癌 41 0.0067 0.0259 3.86 第１段階乳癌 45 0.0084 0.0454 5.40 第３段階乳癌 Ａ 0.063 0.0198 3.14 第１段階乳癌 Ｂ 0.0057 0.0185 3.24 〃 Ｃ 0.0053 0.0253 4.77 〃 Ｄ 0.0042 0.0125 2.97 〃 Ｅ 0.0056 0.0165 2.94 〃 Ｆ 0.0033 0.0131 3.96 〃 Ｇ 0.0039 0.0112 2.87 〃 Ｈ 0.0072 0.0187 2.59 〃 表５および６におけるデータの分析を平均値の形で表７
および８に示す。データをより小さなグループに分ける
ことは明らかに統計上いくらかの困難性を伴なうもので
あるが、いくつかの観察は可能であろう。どの値を考え
ても正常な個体に由来するサンプルは良性乳房疾患を有
する女性から得たものとは識別不可能である。一般にこ
れらの値は極めて小さな標準偏差を有している。第４段
階の癌に由来する21ＤＤ７値および21ＤＤ７／21ＤＤ５
値は双方とも極めて大きいが、また極めて大きな範囲の
標準偏差も観察される。一般に21ＤＤ７値および21ＤＤ
７／21ＤＤ５比は腫瘍の程度が進むにつれて（コントロ
ールから第１段階，第３段階，第４段階）増加する。
および８に示す。データをより小さなグループに分ける
ことは明らかに統計上いくらかの困難性を伴なうもので
あるが、いくつかの観察は可能であろう。どの値を考え
ても正常な個体に由来するサンプルは良性乳房疾患を有
する女性から得たものとは識別不可能である。一般にこ
れらの値は極めて小さな標準偏差を有している。第４段
階の癌に由来する21ＤＤ７値および21ＤＤ７／21ＤＤ５
値は双方とも極めて大きいが、また極めて大きな範囲の
標準偏差も観察される。一般に21ＤＤ７値および21ＤＤ
７／21ＤＤ５比は腫瘍の程度が進むにつれて（コントロ
ールから第１段階，第３段階，第４段階）増加する。
【００９７】
【表７】 平均＋Ｓ．Ｄ． 診 断 21ＤＤ７ 第４段階癌 Ｎ＝13 0.4615 ± 0.788 第４段階乳癌 Ｎ＝10 0.528 ± 0.881 第１段階乳癌 Ｎ＝10 0.0178 ± 0.0049 第３段階乳癌 Ｎ＝４ 0.0262 ± 0.0145 正 常 Ｎ＝16 0.0207 ± 0.0058 良性乳房疾患 Ｎ＝11 0.0214 ＋ 0.0066 正常＋良性乳房疾患 Ｎ＝27 0.0209 ± 0.0060 全 癌 Ｎ＝28 0.225 ± 0.061 診 断 21ＤＤ５ 第４段階癌 Ｎ＝13 0.0235 ± 0.0417 第４段階乳癌 Ｎ＝10 0.0292 ± 0.0466 第１段階乳癌 Ｎ＝10 0.0053 ± 0.0012 第３段階乳癌 Ｎ＝４ 0.0058 ± 0.0023 正 常 Ｎ＝16 0.0087 ± 0.0033 良性乳癌疾患 Ｎ＝11 0.0097 ± 0.0037 正常＋良性乳癌疾患 Ｎ＝27 0.0092 ± 0.0034 全 癌 Ｎ＝28 0.0138 ± 0.0288 診 断 21ＤＤ７／21ＤＤ５ 第４段階癌 Ｎ＝13 35.2±55.7 第４段階乳癌 Ｎ＝10 36.0±53.6 第１段階乳癌 Ｎ＝10 3.38 ± 0.652 第３段階乳癌 Ｎ＝４ 4.31 ± 0.741 正 常 Ｎ＝16 2.50 ± 0.619 良性乳癌疾患 Ｎ＝11 2.23 ± 0.220 正常＋良性乳癌疾患 Ｎ＝27 2.39 ± 0.513 全 癌 Ｎ＝28 18.3±39.7
【００９８】
【表８】 検定特性 陽性／総数 診 断 21ＤＤ７＞ 0.0315 ， 21ＤＤ７／21ＤＤ５＞ 3.97 第４段階 11／13（84.6％） 第４段階乳癌 ８／10（80％） 第１段階乳癌 １／10（10％） 第３段階乳癌 ３／４（75％） 正 常 ０／16（０％） 良性乳房疾患 ０／11（０％） 正常＋良性乳房疾患 ０／27（０％） 全 癌 15／28（53.6％） 陽性／総数 診 断 21ＤＤ７＞ 0.0315 ， 21ＤＤ７／21ＤＤ５＞ 3.31 第４段階 12／13（92.3％） 第４段階乳癌 ９／10（90％） 第１段階乳癌 ４／10（40％） 第２段階乳癌 ０／１（０％） 第３段階乳癌 ４／４（100 ％） 正 常 １／16（ 6.25 ％） 良性乳房疾患 ０／11（０％） 正常＋良性乳房疾患 １／27（ 3.7％） 全 癌 20／28（71.4％） 表８の第１の部分は乳癌の存在を示す閾値を偽陰性の生
じないように選択した場合（すなわち 100％特異性）に
得られる結果を示すものである。しかしながら、表８の
第２の部分に示されるようにこのような閾値は感度およ
び特異性の双方を考慮した検定特性を最適なものとする
ように選択することも可能である。このようにデータを
考慮すると試験された全ての癌のうちの72％が陽性であ
り、第４段階乳癌の92％，第３段階乳癌の 100％、およ
び第１段階乳癌の40％が正常域を超える値を示す。
じないように選択した場合（すなわち 100％特異性）に
得られる結果を示すものである。しかしながら、表８の
第２の部分に示されるようにこのような閾値は感度およ
び特異性の双方を考慮した検定特性を最適なものとする
ように選択することも可能である。このようにデータを
考慮すると試験された全ての癌のうちの72％が陽性であ
り、第４段階乳癌の92％，第３段階乳癌の 100％、およ
び第１段階乳癌の40％が正常域を超える値を示す。
【００９９】上述のポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体を用いるサンドイッチアッセイ法はいかなる
抗原もしくはハプテンの定量化にも応用できるものであ
る。さらに、使用する標識は放射性同位体である必要は
ない。すなわち、酵素，螢光体，化学発光剤等を用いる
ことができる。
ーナル抗体を用いるサンドイッチアッセイ法はいかなる
抗原もしくはハプテンの定量化にも応用できるものであ
る。さらに、使用する標識は放射性同位体である必要は
ない。すなわち、酵素，螢光体，化学発光剤等を用いる
ことができる。
【０１００】
【発明の効果】本発明による抗原特異性を有する抗体、
この抗体を産生する細胞系，組成物およびこの抗原の検
定法は乳癌の診断に絶大な効果をもたらすものであっ
て、その利用価値は極めて大である。
この抗体を産生する細胞系，組成物およびこの抗原の検
定法は乳癌の診断に絶大な効果をもたらすものであっ
て、その利用価値は極めて大である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ Ｔ Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 メアリー ルイーズ ニコルソン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14830 コーニング ルート ３ ボックス 159エイ (72)発明者 カレン ルイス トラヴィス アメリカ合衆国 ニューヨーク州 コーニ ング イースト ファースト ストリート 321 (72)発明者 アルバート オーガスト ルーデラー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02050 マーシュフィールド スモーク ヒル リッジ ロード 21
Claims (14)
- 【請求項１】 以下の特性； Ａ．少なくとも約 300,000ドルトンの平均分子量を有す
ること； Ｂ．糖蛋白質であること； Ｃ．塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
密度と同等の範囲にあること； Ｄ．ヒト包皮線維芽細胞に存在しないこと； Ｅ．冠状動脈，心臓，肝臓，脾臓，および皮膚の細胞に
存在しないこと； Ｆ．ヒト乳脂肪球に存在すること； Ｇ．皮脂腺，子宮頚内膜，卵巣，腎臓，腸，膵臓，およ
び肺の細胞上に存在すること； Ｈ．乳癌細胞によって取り込まれること； Ｉ．ヒト血漿サンプル中に存在すること；および Ｊ．分子量がＤＮＡ分解酵素およびコンドロイチナーゼ
によって影響されないことを有し、正常および良性乳房
上皮細胞上、主として小葉および管の管腔に隣接する頂
端表面上、および乳癌細胞中に、その細胞の見掛け上全
域にわたって存在するほぼ純粋な抗原に対して特異性を
有する抗体。 - 【請求項２】 モノクローナルであることを特徴とする
請求項１記載の抗体。 - 【請求項３】 前記抗原の特性に以下の特性： Ａ．正常乳房組織細胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原と乳
癌細胞の抗原との間でその濃度が有意に変化しない、イ
ムノアッセイにより測定される第１の決定基を有するこ
と； Ｂ．乳癌細胞の抗原におけるその濃度が正常乳房組織細
胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原におけるその濃度よりも
有意に高い、イムノアッセイにより測定される第２の決
定基を有すること； Ｃ．前記第１および第２の決定基の抗原性がＤＮＡ分解
酵素およびコンドロイチナーゼによって影響されないこ
と； Ｄ．前記第１および第２の決定基の抗原性がプロテアー
ゼによって低下すること； Ｅ．前記第１および第２の決定基の抗原性が穏やかなア
ルカリ処理によって低下すること； Ｆ．少なくともいくらかの炭水化物がセリンもしくはス
レオニンに対するＯ−グリコシド結合によって蛋白質主
鎖に見掛け上結合していること； Ｇ．小麦胚凝集素カラムに結合することによってＮ−ア
セチルグルコサミンおよび／もしくはシアル酸の存在を
示すこと； Ｈ．前記第１の決定基の濃度の増加によって示される乳
房起源の組織培養細胞によるその合成エストロゲンによ
って増加すること；および Ｉ．そのノイラミニダーゼ処理によって前記第１の決定
基の抗原性が増加し、かつ前記第２の決定基の抗原性が
低下することが含まれていることを特徴とする請求項１
記載の抗体。 - 【請求項４】 モノクローナルであることを特徴とする
請求項３記載の抗体。 - 【請求項５】 前記第１の決定基に対して特異的である
ことを特徴とする請求項４記載の抗体。 - 【請求項６】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ8532を有するハイ
ブリッド細胞系により産生されたモノクローナル抗体に
対応することを特徴とする請求項５記載の抗体。 - 【請求項７】 前記第２の決定基に対して特異的である
ことを特徴とする請求項４記載の抗体。 - 【請求項８】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ8533を有するハイ
ブリッド細胞系により産生されたモノクローナル抗体に
対応することを特徴とする請求項７記載の抗体。 - 【請求項９】 以下の特性： Ａ．少なくとも 300,000ドルトンの平均分子量を有する
こと； Ｂ．糖蛋白質であること； Ｃ．塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
密度と同等の範囲にあること； Ｄ．ヒト包皮線維芽細胞に存在しないこと； Ｅ．冠状動脈，心臓，肝臓，脾臓，および皮膚の細胞に
存在しないこと； Ｆ．ヒト乳脂肪球に存在すること； Ｇ．皮脂腺，子宮頚内膜，卵巣，脾臓，腸，膵臓，およ
び肺の細胞上に存在すること； Ｈ．癌細胞によって取り込まれること； Ｉ．ヒト血漿サンプル中に存在すること；および Ｊ．分子量がＤＮＡ分解酵素およびコンドロイチナーゼ
によって影響されないことを有し、正常および良性乳房
上皮細胞膜上、主として小葉および管の管腔内に隣接す
る頂端表面上、および乳癌細胞中に、その細胞の見掛け
上全的にわたって存在するほぼ純粋な抗原に対する抗体
を、抗原感作させたＢalb ／Ｃマウス脾臓細胞とマウス
ＳＰ 2／０細胞との融合細胞ハイブリッドおよびその培
養基からなるヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン培地内においてインビトロで産生する連続細胞系から
なる組成物。 - 【請求項１０】 前記融合細胞ハイブリッドがＡＴＣＣ
受託番号ＨＢ8532を有する細胞系であることを特徴とす
る請求項９記載の組成物。 - 【請求項１１】 前記融合細胞ハイブリッドがＡＴＣＣ
受託番号ＨＢ8533を有する細胞系であることを特徴とす
る請求項９記載の組成物。 - 【請求項１２】 正常乳房細胞もしくは良性腫瘍細胞の
抗原と乳癌細胞の抗原との間でその濃度が有意に変化し
ない第１の決定基の濃度をイムノアッセイにより測定
し；乳癌細胞の抗原におけるその濃度が正常乳房組織細
胞もしくは良性腫瘍細胞の抗原におけるその濃度よりも
有意に高い第２の決定基の濃度をイムノアッセイにより
測定し；前記第２の決定基の濃度の前記第１の決定基の
濃度に対する比を計算することからなる以下の特性： Ａ．少なくとも約 300,000ドルトンの平均分子量を有す
ること； Ｂ．糖蛋白質であること； Ｃ．塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
密度と同等の範囲にあること； Ｄ．ヒト包皮線維芽細胞に存在しないこと； Ｅ．冠状動脈，心臓，肝臓，脾臓，および皮膚の細胞に
存在しないこと； Ｆ．ヒト乳脂肪球に存在すること； Ｇ．皮脂腺，子宮頚内膜，卵巣，腎臓，腸，膵臓，およ
び肺の細胞上に存在すること； Ｈ．乳癌細胞によって取り込まれること； Ｉ．ヒトの血漿サンプル中に存在すること；および Ｊ．分子量がＤＮＡ分解酵素およびコンドロチナーゼに
よって影響されないことを有し、正常および良性乳房上
皮細胞膜上、主として小葉および管の管腔に隣接する頂
端表面上、および乳癌細胞中に、その細胞の見掛け上全
域にわたって存在するほぼ純粋な抗原の検定方法。 - 【請求項１３】 前記イムノアッセイにおいて前記第１
の決定基に対するモノクローナル抗体および前記第２の
決定基に対するモノクローナル抗体が用いられることを
特徴とする請求項12記載の方法。 - 【請求項１４】 前記第１の決定基に対するモノクロー
ナル抗体がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ8532を有するハイブリ
ッド細胞系によって産生されたものであり、前記第２の
決定基に対するモノクローナル抗体がＡＴＣＣ受託番号
ＨＢ8533を有するハイブリッド細胞系によって産生され
たものであることを特徴とする請求項13記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60585384A | 1984-05-01 | 1984-05-01 | |
| US605853 | 1984-05-01 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60094560A Division JPH0721501B2 (ja) | 1984-05-01 | 1985-05-01 | 乳癌抗原 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8133774A Division JP2668523B2 (ja) | 1984-05-01 | 1996-05-28 | 乳癌関連抗原に特異性を有する抗体を産生する細胞系組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07318562A true JPH07318562A (ja) | 1995-12-08 |
| JP2580490B2 JP2580490B2 (ja) | 1997-02-12 |
Family
ID=24425469
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60094560A Expired - Lifetime JPH0721501B2 (ja) | 1984-05-01 | 1985-05-01 | 乳癌抗原 |
| JP6140265A Expired - Lifetime JP2580490B2 (ja) | 1984-05-01 | 1994-06-22 | 乳癌関連抗原に特異性を有する抗体、および抗原検定法 |
| JP8133774A Expired - Fee Related JP2668523B2 (ja) | 1984-05-01 | 1996-05-28 | 乳癌関連抗原に特異性を有する抗体を産生する細胞系組成物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60094560A Expired - Lifetime JPH0721501B2 (ja) | 1984-05-01 | 1985-05-01 | 乳癌抗原 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8133774A Expired - Fee Related JP2668523B2 (ja) | 1984-05-01 | 1996-05-28 | 乳癌関連抗原に特異性を有する抗体を産生する細胞系組成物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0160446B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0721501B2 (ja) |
| CA (1) | CA1317557C (ja) |
| DE (1) | DE3586216T2 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3416774A1 (de) * | 1984-05-07 | 1985-11-14 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Monoklonale antikoerper, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung |
| US6294172B1 (en) | 1983-08-12 | 2001-09-25 | Dade Behring Marburg Gmbh | Monoclonal antibodies with specificity for membrane-associated antigens |
| JPS61104783A (ja) * | 1985-09-10 | 1986-05-23 | Wakunaga Seiyaku Kk | 抗ヒト癌モノクロ−ナル抗体生産性ハイブリド−マ |
| JPS61103837A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-22 | Wakunaga Seiyaku Kk | 抗ヒト癌モノクロ−ナル抗体 |
| ATE74382T1 (de) * | 1984-12-05 | 1992-04-15 | Salk Inst For Biological Studi | Monoklonaler antikoerper, spezifisch fuer brustkrebszelloberflaechenantigen. |
| US4863854A (en) * | 1985-08-12 | 1989-09-05 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to mucin-like human differentiation antigens |
| US4938948A (en) * | 1985-10-07 | 1990-07-03 | Cetus Corporation | Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
| US4803169A (en) * | 1986-02-05 | 1989-02-07 | Cetus Corporation | Assay for human breast cancer |
| US5030559A (en) * | 1986-04-01 | 1991-07-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the identification of metastatic human tumors |
| NZ222509A (en) * | 1986-11-19 | 1993-03-26 | Oncogen | Hybridoma cell line producing antibodies binding to tumour-associated mucin antigen |
| US6004761A (en) * | 1986-11-19 | 1999-12-21 | Sanofi | Method for detecting cancer using monoclonal antibodies to new mucin epitopes |
| US4857452A (en) * | 1986-12-04 | 1989-08-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assay for carcinoma of breast, colon and ovary |
| DE3909799A1 (de) | 1989-03-24 | 1990-09-27 | Behringwerke Ag | Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung |
| ZA200305980B (en) | 2001-02-12 | 2007-01-31 | Res Dev Foundation | Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof |
| CN1555268B (zh) | 2001-07-17 | 2013-04-03 | 研究发展基金会 | 含促调亡蛋白质的治疗剂 |
| JP7060510B2 (ja) * | 2016-09-06 | 2022-04-26 | 富士レビオ株式会社 | 腫瘍マーカーの測定方法及び測定試薬 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO830570L (no) * | 1982-02-22 | 1983-08-23 | Carlton Med Prod | Antistoffer og antigener for diagnose og behandling av cancer |
-
1985
- 1985-04-15 EP EP19850302607 patent/EP0160446B1/en not_active Expired
- 1985-04-15 DE DE19853586216 patent/DE3586216T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-01 JP JP60094560A patent/JPH0721501B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-01 CA CA000480549A patent/CA1317557C/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-06-22 JP JP6140265A patent/JP2580490B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-28 JP JP8133774A patent/JP2668523B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2580490B2 (ja) | 1997-02-12 |
| EP0160446B1 (en) | 1992-06-17 |
| EP0160446A3 (en) | 1987-09-02 |
| EP0160446A2 (en) | 1985-11-06 |
| JPH0721501B2 (ja) | 1995-03-08 |
| JPS60253976A (ja) | 1985-12-14 |
| CA1317557C (en) | 1993-05-11 |
| JP2668523B2 (ja) | 1997-10-27 |
| DE3586216D1 (de) | 1992-07-23 |
| DE3586216T2 (de) | 1992-12-10 |
| JPH08322566A (ja) | 1996-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Atkinson et al. | Gastrointestinal cancer-associated antigen in immunoperoxidase assay | |
| JP2617289B2 (ja) | モノクローナル抗体生産性ハイブリドマ細胞系 | |
| JP2668523B2 (ja) | 乳癌関連抗原に特異性を有する抗体を産生する細胞系組成物 | |
| US4960716A (en) | Monoclonal antibodies specific for 330 KD breast tumor antigen and assay using said monoclonal antibodies | |
| Schrijvers et al. | MAb U36, a novel monoclonal antibody successful in immunotargeting of squamous cell carcinoma of the head and neck | |
| EP0252769A2 (en) | Anti-human pulmonary carcinoma monoclonal antibody | |
| AU683845B2 (en) | Small cell lung carcinoma specific antibody and antigen | |
| JPH1052269A (ja) | シアリル化されたＬｅｗｉｓ（Ｘ）エピトープに対するモノクローナル抗体の断片 | |
| Zhang et al. | Comparison of sialyl-Lewis a-carrying CD43 and MUC1 mucins secreted from a colon carcinoma cell line for E-selectin binding and inhibition of leukocyte adhesion | |
| Haggarty et al. | Epitopes of carcinoembryonic antigen defined by monoclonal antibodies prepared from mice immunized with purified carcinoembryonic antigen or HCT-8R cells | |
| MAsuKo et al. | Human bladder cancer cell-surface antigens recognized by murine monoclonal antibodies raised against T24 bladder cancer cells | |
| JP3284133B2 (ja) | ヒト乳脂肪小球膜ムチン抗原の糖タンパク質を確認する単クローン性抗体 | |
| JP3074383B2 (ja) | モノ特異性抗ｃｅａモノクローナル抗体 | |
| JPS61282096A (ja) | 新規な腫瘍関連抗原 | |
| US5077220A (en) | Monoclonal antibody specific to a novel glycoprotein antigen on human carcinoma cells | |
| EP0282581A1 (en) | Monoclonal paratopic molecule directed to human ganglioside gd2 | |
| Tsubura et al. | Expression of MAM-3 and MAM-6 antigens in endometrial and endocervical adenocarcinomas | |
| Major et al. | Monoclonal antibodies to antigens abnormally expressed in breast cancer. | |
| Ceriani et al. | Localization of human breast tumors grafted in nude mice with a monoclonal antibody directed against a defined cell surface antigen of human mammary epithelial cells | |
| Earl et al. | Immunohistochemical study of β-and κ-casein in the human breast and breast carcinomas, using monoclonal antibodies | |
| EP0242727B1 (en) | Method of assaying adenocarcinoma antigens | |
| Deutsch et al. | Detection of a novel marker in the bronchial secretions of patients with non‐small cell lung cancer using the 4B5 monoclonal antibody | |
| Skilton et al. | Characterization of monoclonal antibodies reactive with normal resting, lactating and neoplastic human breast | |
| AU625856B2 (en) | Second generation monoclonal antibodies having binding specificity to tag-72 and human carcinomas and methods for employing the same | |
| Om et al. | Use of anti-skeletal muscle antibody from myasthenic patients in the diagnosis of childhood rhabdomyosarcomas |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19960716 |