JPS60253976A - 乳癌抗原 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3015—Breast
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はヒトの乳癌腫瘍に関係する抗原に関するもので
ある。また本発明はこのような乳癌に関係する抗原上に
存在する様々な決定基に対して特異的なモノク［コーナ
ル抗体およびこの抗体を産生ずる細胞系組成物に関する
ものである。さらに、本発明はこのような抗原を検定す
る方法に関するものである。
ある。また本発明はこのような乳癌に関係する抗原上に
存在する様々な決定基に対して特異的なモノク［コーナ
ル抗体およびこの抗体を産生ずる細胞系組成物に関する
ものである。さらに、本発明はこのような抗原を検定す
る方法に関するものである。
（従来の技術）
癌は初期に発見することが非常に好ましいが、これは極
めて困難なことでもある。この困難性は主として、１０
０％の感度く偽陰性のないこと）および１００％の特異
性（偽陽性のないこと）を有する一般的な癌マー７Ｊ−
が存在していないという事実に由来するものである。公
知のマーカーは感度および特異性が共に不足している。
めて困難なことでもある。この困難性は主として、１０
０％の感度く偽陰性のないこと）および１００％の特異
性（偽陽性のないこと）を有する一般的な癌マー７Ｊ−
が存在していないという事実に由来するものである。公
知のマーカーは感度および特異性が共に不足している。
さらに、このようなマーカーは全てのタイプの癌に適用
できるというものではない。例えば最も良く知られたマ
ーカーである発癌抗原（ＣＥΔ）は乳癌に関係するとは
認められない。
できるというものではない。例えば最も良く知られたマ
ーカーである発癌抗原（ＣＥΔ）は乳癌に関係するとは
認められない。
乳癌は女性において主要な癌であり、一般にも３つの主
要な癌のうちの１つである。乳癌が充分に早く発見され
れば回復のための予後は良好なものとなる。したがって
、乳癌の早期診断において医師の助けとなるような乳癌
マーカーを発見するための努力が絶えずなされている。
要な癌のうちの１つである。乳癌が充分に早く発見され
れば回復のための予後は良好なものとなる。したがって
、乳癌の早期診断において医師の助けとなるような乳癌
マーカーを発見するための努力が絶えずなされている。
このような努力の１つはバルトレリ（Ｂ ａｒｔｏｒｅ
ｌｌｌ）等による米国特許４，３８３，９８５号に開示
されており、ここでは乳癌腫瘍に関係する一連の抗原が
記載されている。このような抗原は公知の方法、通常は
溶媒抽出、イオン交換および／もしくは吸着クロマトグ
ラフィーおよびゲル濾過の組み合せによってヒトの初期
孔癌腫から分離された。充分に純粋な場合、このような
抗原は抗ＣＥへ血清と交差反応せず、糖蛋白質を用いて
ヒトの初期孔癌腫から抽出可能であると記載されている
。明らかにこのような抗原は正常な乳細胞とは関係がな
い。
ｌｌｌ）等による米国特許４，３８３，９８５号に開示
されており、ここでは乳癌腫瘍に関係する一連の抗原が
記載されている。このような抗原は公知の方法、通常は
溶媒抽出、イオン交換および／もしくは吸着クロマトグ
ラフィーおよびゲル濾過の組み合せによってヒトの初期
孔癌腫から分離された。充分に純粋な場合、このような
抗原は抗ＣＥへ血清と交差反応せず、糖蛋白質を用いて
ヒトの初期孔癌腫から抽出可能であると記載されている
。明らかにこのような抗原は正常な乳細胞とは関係がな
い。
また、ヒト癌細胞の新規なマーカーがアショール（Ａｓ
１１ａｌｌ ＞等、Ｌ ａｎｃｅｔ 、 １９８２．
ｉｉ： １〜６およびマツギー（ＭｃＧｅｅ）等、 Ｌ
ａｎｃｅｔ 、 １９８２゜１１ニア〜１０により報告
されている。要約すれば、多様な悪性ヒト細胞系の細胞
膜中に抗原が発見されたが、この抗原は二倍体ヒト細胞
株では発見されなかった。この抗原は正常な成人もしく
は胎児の組織の小モジネート中には存在しているとして
も極めて低′ａ度であった。この抗原は悪性細胞の抽出
物に由来する特定のモノクロ−デル抗体により免疫沈降
させることができたが、良性細胞の抽出物に由来するも
のによっては不可能であった。
１１ａｌｌ ＞等、Ｌ ａｎｃｅｔ 、 １９８２．
ｉｉ： １〜６およびマツギー（ＭｃＧｅｅ）等、 Ｌ
ａｎｃｅｔ 、 １９８２゜１１ニア〜１０により報告
されている。要約すれば、多様な悪性ヒト細胞系の細胞
膜中に抗原が発見されたが、この抗原は二倍体ヒト細胞
株では発見されなかった。この抗原は正常な成人もしく
は胎児の組織の小モジネート中には存在しているとして
も極めて低′ａ度であった。この抗原は悪性細胞の抽出
物に由来する特定のモノクロ−デル抗体により免疫沈降
させることができたが、良性細胞の抽出物に由来するも
のによっては不可能であった。
免疫沈降させた抗原はドデシル硫酸ナトリウムアクリル
アミド中でそれぞれ約３９０，０００ドルトンおよび約
３５０，０００ドルトンの分子量を有するバンドに分離
された。両成分は高い炭水化物含量を有する糖蛋白質の
ようであった。
アミド中でそれぞれ約３９０，０００ドルトンおよび約
３５０，０００ドルトンの分子量を有するバンドに分離
された。両成分は高い炭水化物含量を有する糖蛋白質の
ようであった。
さらに具体的な研究がセリアニ（ｃｅｒｉａｎｉ）およ
びティラー・パパディミトリュ−（７−ａｙｌｏｒ −
Ｐ ａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ）および彼らの共同研究
者等によってヒト乳房上皮細胞抗原に対して行なわれた
。
びティラー・パパディミトリュ−（７−ａｙｌｏｒ −
Ｐ ａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ）および彼らの共同研究
者等によってヒト乳房上皮細胞抗原に対して行なわれた
。
このような研究をここで詳細に述べることは本項の範囲
を越えるものであるが、選択された刊行物の概要はその
実質的な要約となるのであろう。
を越えるものであるが、選択された刊行物の概要はその
実質的な要約となるのであろう。
セリアニ等、Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ。
、 Ｓｃｉ。
７４、 ５８２ （１９７７）はヒトの乳脂肪球に担持
されたヒト乳房上皮細胞の表面分化抗原を記載している
。
されたヒト乳房上皮細胞の表面分化抗原を記載している
。
ウサギ抗ヒト乳房上皮細胞血清が脱脂ヒト乳脂肪球に対
して投与された。ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポ
リアクリルアミドゲル中にお（プる電気泳動、セフ ７
’ ロース（Ｓ ｅｐｂａｒｏｓｅＴＭ） ４Ｂに結合
した前記抗血清を用いるアフィ子ティークロマトグラフ
ィー、免疫螢光染色、および間接免疫螢光染色を行なう
ことによってヒト乳脂肪球−Ｆに存在する抗原性物質が
特色づけられ、がっ／もしくは分離された。
して投与された。ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポ
リアクリルアミドゲル中にお（プる電気泳動、セフ ７
’ ロース（Ｓ ｅｐｂａｒｏｓｅＴＭ） ４Ｂに結合
した前記抗血清を用いるアフィ子ティークロマトグラフ
ィー、免疫螢光染色、および間接免疫螢光染色を行なう
ことによってヒト乳脂肪球−Ｆに存在する抗原性物質が
特色づけられ、がっ／もしくは分離された。
脱脂されたヒト乳脂肪球は少なくとも４つの主要な蛋白
質成分がらなり、その２つは糖蛋白質のようである。ま
た、少なくとも４つの成分のうちの３つは抗原性である
。
質成分がらなり、その２つは糖蛋白質のようである。ま
た、少なくとも４つの成分のうちの３つは抗原性である
。
脱脂されたヒト乳脂肪球に対して投与された抗体は器官
特異性のものと考えられる。抗血清は腎。
特異性のものと考えられる。抗血清は腎。
肺、および結腸に由来する上皮様細胞には結合しないこ
とから、上記の抗原性成分は乳房上皮細胞以外の細胞に
は存在しないようである。
とから、上記の抗原性成分は乳房上皮細胞以外の細胞に
は存在しないようである。
抗血清によって検出された抗原は乳房上皮細胞表面上に
位置しており、ヒト乳脂肪球上に位置するものと同じも
のである。ヒト乳脂肪球は乳房細胞の頂端表面に由来す
るものであるため、抗原はこの特定表面に限定すること
ができる。
位置しており、ヒト乳脂肪球上に位置するものと同じも
のである。ヒト乳脂肪球は乳房細胞の頂端表面に由来す
るものであるため、抗原はこの特定表面に限定すること
ができる。
これらの抗原は乳腫細胞系中および乳腫転移部位中に連
続して発現する。しかしながら抗原性の発現は各乳腫細
胞系で異なっているようである。
続して発現する。しかしながら抗原性の発現は各乳腫細
胞系で異なっているようである。
上述した脱脂ヒト乳脂肪球膜の上皮細胞特異成分に対す
るモノクローナル抗体はティラー・パパディミトリュー
等、Ｉ ｎｔ、 Ｊ 、 、 Ｃａｎｃｅｒ 、 ２８
゜１７ （１９８１）に報告されている。脱脂ヒト乳脂
肪゛球に感作させたマウスの牌臓に由来する細胞が骨髄
肘系Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１に由来する細胞と融
合された。、３つのハイブリドーマが分離され、これら
は脱脂ヒト乳脂肪球の成分に反応する抗体を産生じた。
るモノクローナル抗体はティラー・パパディミトリュー
等、Ｉ ｎｔ、 Ｊ 、 、 Ｃａｎｃｅｒ 、 ２８
゜１７ （１９８１）に報告されている。脱脂ヒト乳脂
肪゛球に感作させたマウスの牌臓に由来する細胞が骨髄
肘系Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１に由来する細胞と融
合された。、３つのハイブリドーマが分離され、これら
は脱脂ヒト乳脂肪球の成分に反応する抗体を産生じた。
しかしながら、このような反応性はハイブリドーマによ
って産生された３つのモノクローナル抗体の間で有意に
異なっていた。最も反応性の低い抗体は極めてわずかに
しか結合しなかった。最も反応性の高い抗体の反応性は
最も反応性の低いもののそれの約５倍であり、第３の抗
体のそれの２倍弱であった。
って産生された３つのモノクローナル抗体の間で有意に
異なっていた。最も反応性の低い抗体は極めてわずかに
しか結合しなかった。最も反応性の高い抗体の反応性は
最も反応性の低いもののそれの約５倍であり、第３の抗
体のそれの２倍弱であった。
３つのモノクローナル抗体のうちの２つは人乳から培養
した上皮細胞および試験された８つの乳癌細胞系のうち
の７つと反応した。第３のモノクローナル抗体は人乳か
ら培養した上皮細胞に対しては反応せず、８つの乳癌細
胞系のうちのわずか２つに対してのみ反応性を有してい
た。上皮繊維芽細胞等、試験された４つの芽細胞系およ
び株のうちのいかなるものとも反応するモノクローナル
抗体は存在しなかった。モノクローナル抗体と反応ザる
抗原は試験された１１のリンパ芽球細胞においては全く
存在しないか、極めて少量しか存在しないようである。
した上皮細胞および試験された８つの乳癌細胞系のうち
の７つと反応した。第３のモノクローナル抗体は人乳か
ら培養した上皮細胞に対しては反応せず、８つの乳癌細
胞系のうちのわずか２つに対してのみ反応性を有してい
た。上皮繊維芽細胞等、試験された４つの芽細胞系およ
び株のうちのいかなるものとも反応するモノクローナル
抗体は存在しなかった。モノクローナル抗体と反応ザる
抗原は試験された１１のリンパ芽球細胞においては全く
存在しないか、極めて少量しか存在しないようである。
試験された７つの上皮細胞系のうちの５つはヒト肺癌由
来のものであり、残りの２つは５Ｖ−４０で形質転換さ
せたご（〜ケラチン細胞およびマウス乳房細胞であった
。これらの細胞系と前記３つのモノクローナル抗体との
反応は若干の例外を除いて主に陰性であった。３つの抗
体は全て強固ではないが確実に咽頭腫系と結合した。１
つの抗体は結賜腫系に結合し、他の２つの抗体はｌ−１
８Ｌａの派生物に対する結合を示したが、全ての検定に
おいてそうであったわけではない。
来のものであり、残りの２つは５Ｖ−４０で形質転換さ
せたご（〜ケラチン細胞およびマウス乳房細胞であった
。これらの細胞系と前記３つのモノクローナル抗体との
反応は若干の例外を除いて主に陰性であった。３つの抗
体は全て強固ではないが確実に咽頭腫系と結合した。１
つの抗体は結賜腫系に結合し、他の２つの抗体はｌ−１
８Ｌａの派生物に対する結合を示したが、全ての検定に
おいてそうであったわけではない。
上述の３つのモノクローナル抗体のうちの２つは組織学
的に検定され、その結果はアークリ−＜Ａｒｋｌｉｅ
）等、 Ｉ ｎｔ、 Ｊ 、 Ｃａｎｃｅｒ 、 ２８
．２３（１９８１）によって報告された。この組織学的
検定はフォルマリンで固定しかつパラフィンに埋込んだ
正常組織および腫瘍組織の切片と５％酢酸−メタノール
溶液で固定した凍結切片に対して間接、免疫ペルオキシ
ダーゼ染色法を実施しものであった。
的に検定され、その結果はアークリ−＜Ａｒｋｌｉｅ
）等、 Ｉ ｎｔ、 Ｊ 、 Ｃａｎｃｅｒ 、 ２８
．２３（１９８１）によって報告された。この組織学的
検定はフォルマリンで固定しかつパラフィンに埋込んだ
正常組織および腫瘍組織の切片と５％酢酸−メタノール
溶液で固定した凍結切片に対して間接、免疫ペルオキシ
ダーゼ染色法を実施しものであった。
休息中の乳房組織のうちの上皮細胞の多くとはいかなる
抗体も反応しなかった。休息乳房組織の非染色域には染
色性の管腔内物質が常に存在していた。抗体は双方とも
上皮細胞に対して協力な陽性反応を示し、また乳分秘中
の乳房内において分泌された。良性病変において乳頭腫
は常に強力な陽性染色を示１ノだが、線維腺腫中の上皮
要素は１０％未満しか陽性に染色されなかった。
抗体も反応しなかった。休息乳房組織の非染色域には染
色性の管腔内物質が常に存在していた。抗体は双方とも
上皮細胞に対して協力な陽性反応を示し、また乳分秘中
の乳房内において分泌された。良性病変において乳頭腫
は常に強力な陽性染色を示１ノだが、線維腺腫中の上皮
要素は１０％未満しか陽性に染色されなかった。
２つのモノクローナル抗体のうちの１つは試験された２
０個の主要な乳腫の各々に対して陽性反応を示し、これ
らのうちの６つに由来するリンパ節中の転移病変に対し
ても陽性反応を示した。また、もう１方の抗体も初期の
腫に対しては反応したが、ムコイド型のものもしくはリ
ンパ節中の転移病変とは反応しなかった。陽性反応を示
した卵乳腫瘍は肺、卵巣および子宮の腺腫のみであった
。他の腫、特に腸管、頚管、鼻咽腔、および肝臓の腫は
陰性反応を示した。
０個の主要な乳腫の各々に対して陽性反応を示し、これ
らのうちの６つに由来するリンパ節中の転移病変に対し
ても陽性反応を示した。また、もう１方の抗体も初期の
腫に対しては反応したが、ムコイド型のものもしくはリ
ンパ節中の転移病変とは反応しなかった。陽性反応を示
した卵乳腫瘍は肺、卵巣および子宮の腺腫のみであった
。他の腫、特に腸管、頚管、鼻咽腔、および肝臓の腫は
陰性反応を示した。
２つの抗体のうちの１つは肝臓、膵臓、皮脂腺。
小唾液腺、腎臓、肺、汗腺、副皐丸、および子宮に由来
する正常組織に対して陽性染色を示した。
する正常組織に対して陽性染色を示した。
双方の抗体に対して陰性染色を示した組織には胃。
小股、大腸、盲賜、胸腺、甲状腺、皐丸、７７０ビオ管
、膀胱、胆嚢、および皮膚が含まれていた。
、膀胱、胆嚢、および皮膚が含まれていた。
流動細胞螢光測定法による単細胞レベルでの正常および
悪性の乳房細胞中のヒト乳房上皮細胞抗原の発現分析が
ビータースン（Ｐ ｅｔｅｒｓｏｎ ）等。
悪性の乳房細胞中のヒト乳房上皮細胞抗原の発現分析が
ビータースン（Ｐ ｅｔｅｒｓｏｎ ）等。
Ｅｘｐｌ 、 Ｃｅ１ｌ 、 Ｂｉｏｌ 、 ４９．１
（１９８１）によって報告されている。このような分
析は間接免疫螢光によって細胞表面を抗ヒト乳房上皮１
Ｉｌｌ胞膜而清でラベリングすると同時に細胞ＤＮＡを
ヨウ化プロビジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ １ｏｄｉｄ
ｅ）でラベリングすることによるものであった。螢光強
度の分布曲線に対する非染色乳房細胞のｐＡ与を除去し
た場合には、正常な乳房に由来する乳房上皮細胞および
乳房嚢様変性線雑腫由来の上皮細胞に対する抗血清の相
対的な結合度は２つの乳癌細胞系のものに対するそれと
同等以上のものであることが認められた。ＤＮΔ単位で
表現した場合、このような相対的な結合度は２つの乳癌
細胞系のそれよりも有意に高かった。
（１９８１）によって報告されている。このような分
析は間接免疫螢光によって細胞表面を抗ヒト乳房上皮１
Ｉｌｌ胞膜而清でラベリングすると同時に細胞ＤＮＡを
ヨウ化プロビジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ １ｏｄｉｄ
ｅ）でラベリングすることによるものであった。螢光強
度の分布曲線に対する非染色乳房細胞のｐＡ与を除去し
た場合には、正常な乳房に由来する乳房上皮細胞および
乳房嚢様変性線雑腫由来の上皮細胞に対する抗血清の相
対的な結合度は２つの乳癌細胞系のものに対するそれと
同等以上のものであることが認められた。ＤＮΔ単位で
表現した場合、このような相対的な結合度は２つの乳癌
細胞系のそれよりも有意に高かった。
血清中におりるヒト乳房上皮細胞抗原の存在を測定する
ための固相ラジオイムノアッセイがセリア二等、 Ｐｒ
ｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 、 ３ｃｉ、 ７
９．５４２０（１９８２）によって報告されている。放
射性同位体で標識した抗ヒト乳房上皮細胞膜血清と、そ
の抗原となる全脱脂ヒト乳脂肪球膜とを標準曲線の作成
に用いて多発性乳癌患者の血清から高レベルのヒト乳房
上皮細胞抗原が発見された。このようなレベルは正常な
女性および男性の血清中および良性乳房疾患および初期
乳癌、肺、神経組織および結腸の多発性の癌および黒腫
を有する女性患者の血清中に見出されるバックグラウン
ドレベル（く３０ｎｐ／ ｒｎ ｌ ）よりも統計的に
有意に高いことが認められた。３段階の免疫検出法を用
い、分子量がそれぞれ１５０．０００ドルトン、 ７０
，０００ドルトンおよび４６．０００ドルトンである３
つの群の抗原をラジオイムノアッセイにおいて高レベル
のヒト乳房上皮細胞抗原が認められた患者の血清から分
離した。非乳房腫瘍を有する患者の血清および正常な血
清からは主として非特異的に結合した小量のヒト血清ア
ルブミンが得られたが、上述のような抗原は分離可能で
あった。４６，０００ドルトンのヒト乳房上皮細胞抗原
を標的とするモノクローナル抗体の代りにポリクローナ
ル抗血清を用いた場合にも同様の免疫検出結果が得られ
た。
ための固相ラジオイムノアッセイがセリア二等、 Ｐｒ
ｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 、 ３ｃｉ、 ７
９．５４２０（１９８２）によって報告されている。放
射性同位体で標識した抗ヒト乳房上皮細胞膜血清と、そ
の抗原となる全脱脂ヒト乳脂肪球膜とを標準曲線の作成
に用いて多発性乳癌患者の血清から高レベルのヒト乳房
上皮細胞抗原が発見された。このようなレベルは正常な
女性および男性の血清中および良性乳房疾患および初期
乳癌、肺、神経組織および結腸の多発性の癌および黒腫
を有する女性患者の血清中に見出されるバックグラウン
ドレベル（く３０ｎｐ／ ｒｎ ｌ ）よりも統計的に
有意に高いことが認められた。３段階の免疫検出法を用
い、分子量がそれぞれ１５０．０００ドルトン、 ７０
，０００ドルトンおよび４６．０００ドルトンである３
つの群の抗原をラジオイムノアッセイにおいて高レベル
のヒト乳房上皮細胞抗原が認められた患者の血清から分
離した。非乳房腫瘍を有する患者の血清および正常な血
清からは主として非特異的に結合した小量のヒト血清ア
ルブミンが得られたが、上述のような抗原は分離可能で
あった。４６，０００ドルトンのヒト乳房上皮細胞抗原
を標的とするモノクローナル抗体の代りにポリクローナ
ル抗血清を用いた場合にも同様の免疫検出結果が得られ
た。
上記のモノクローナル抗体と他の２つがセリア二等、Ｓ
ｏｍａｔｉｃ、 Ｃｅ１ｌ 、 Ｇｅｒ＋ｅｔｉｃｓ
、 ９． ４１５（１９８３）に記載された。要約すれ
ば、正常なじト乳房上皮細胞の３つの異なった表面抗原
に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
がマウス骨髄腫細胞と、脱脂ヒト乳脂肪球を免疫感作さ
せたマウスもしくはラット由来の牌臓細胞とを融合させ
ることによって形成された。３つのモノクローナル抗体
が製造され、それぞれ見掛は分子量４６，０００ドルト
ン、 ７０，０００ドルトン、および４ｏｏ 、 ｏｏ
ｏドルトンの分子であることが認められた。
ｏｍａｔｉｃ、 Ｃｅ１ｌ 、 Ｇｅｒ＋ｅｔｉｃｓ
、 ９． ４１５（１９８３）に記載された。要約すれ
ば、正常なじト乳房上皮細胞の３つの異なった表面抗原
に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
がマウス骨髄腫細胞と、脱脂ヒト乳脂肪球を免疫感作さ
せたマウスもしくはラット由来の牌臓細胞とを融合させ
ることによって形成された。３つのモノクローナル抗体
が製造され、それぞれ見掛は分子量４６，０００ドルト
ン、 ７０，０００ドルトン、および４ｏｏ 、 ｏｏ
ｏドルトンの分子であることが認められた。
最も高分子量の抗原は高い糖含量を有するムチン様糖蛋
白質のようである。ラジオイムノバインディングアッセ
イを用いると、３つのモノクローナル抗体は全てヒト乳
脂肪球膜および４の異なった上皮細胞起源乳癌細胞系に
結合することが認められた。しかしながら、このような
抗体は１１個の異なった非乳癌系もしくは正常な乳房上
皮細胞とは結合しなかった。４つの乳癌細胞系のうちの
３つにおいて最も高分子量の抗原が測定され、このレベ
ルは１０倍の範囲を超えて変化することが認められた。
白質のようである。ラジオイムノバインディングアッセ
イを用いると、３つのモノクローナル抗体は全てヒト乳
脂肪球膜および４の異なった上皮細胞起源乳癌細胞系に
結合することが認められた。しかしながら、このような
抗体は１１個の異なった非乳癌系もしくは正常な乳房上
皮細胞とは結合しなかった。４つの乳癌細胞系のうちの
３つにおいて最も高分子量の抗原が測定され、このレベ
ルは１０倍の範囲を超えて変化することが認められた。
ヒト乳脂肪球に対する七ツクｉ］−ナル抗体はバーシェ
ル（３ｕｒｃｈｅｌ ｌ ）等、Ｊ 、［ｍｍｕｎｏｌ
、１３１゜５０８ （１９８３）に記載されている。こ
のような２つのモノクローナル抗体は腫瘍に関連すると
思われる抗原決定基を標的とするものである。抗原は乳
分秘中の乳房上に発現するが、休息中の乳房上には発現
したとしてもわずかなものである。抗体は双方とも分子
量４００，０００を越えるヒト乳脂肪球成分中に見出さ
れる決定基を認識する。しかしながら、第１の抗体は第
２の抗体と比較してかなり低いＳ度で脱脂ヒト乳脂肪球
に結合するものであり、その差は明らかに１０倍から１
００倍の間にある。結合にお（プる同様の差はヒト乳房
上皮細胞および乳癌細胞系に関しても認められるが、ヒ
ト乳脂肪球に対する相対的結合レベルとほぼ同等な前者
細胞に対する相対的結合レベルは後者細胞においては逆
転される。第１の抗体はヒト乳脂肪球調製物中の高分子
量成分に類似するヒト乳房上皮細胞中の高分子量成分と
反応した。第２の抗体に対する高親和性部位はヒト乳房
上皮細胞および乳癌細胞系によって数種の低分子量成分
上に発現された。試験された他の乳腫系の全部と２人の
乳癌患者由来の転移細胞は様々な大きさの、すなわち分
子量８０．０００から４００，０００を超える成分−ト
に第２の抗体に対する高親和性結合部位を発現した。５
つの細胞系のうちのわずか２つと２人の患者のうちの１
人に由来する癌細胞のみが第１の抗体に対する高親和性
部位を発現し、これらの部位は高分子用の、すなわち３
００，０００〜４００，０００の糖蛋白質上に見出され
た。
ル（３ｕｒｃｈｅｌ ｌ ）等、Ｊ 、［ｍｍｕｎｏｌ
、１３１゜５０８ （１９８３）に記載されている。こ
のような２つのモノクローナル抗体は腫瘍に関連すると
思われる抗原決定基を標的とするものである。抗原は乳
分秘中の乳房上に発現するが、休息中の乳房上には発現
したとしてもわずかなものである。抗体は双方とも分子
量４００，０００を越えるヒト乳脂肪球成分中に見出さ
れる決定基を認識する。しかしながら、第１の抗体は第
２の抗体と比較してかなり低いＳ度で脱脂ヒト乳脂肪球
に結合するものであり、その差は明らかに１０倍から１
００倍の間にある。結合にお（プる同様の差はヒト乳房
上皮細胞および乳癌細胞系に関しても認められるが、ヒ
ト乳脂肪球に対する相対的結合レベルとほぼ同等な前者
細胞に対する相対的結合レベルは後者細胞においては逆
転される。第１の抗体はヒト乳脂肪球調製物中の高分子
量成分に類似するヒト乳房上皮細胞中の高分子量成分と
反応した。第２の抗体に対する高親和性部位はヒト乳房
上皮細胞および乳癌細胞系によって数種の低分子量成分
上に発現された。試験された他の乳腫系の全部と２人の
乳癌患者由来の転移細胞は様々な大きさの、すなわち分
子量８０．０００から４００，０００を超える成分−ト
に第２の抗体に対する高親和性結合部位を発現した。５
つの細胞系のうちのわずか２つと２人の患者のうちの１
人に由来する癌細胞のみが第１の抗体に対する高親和性
部位を発現し、これらの部位は高分子用の、すなわち３
００，０００〜４００，０００の糖蛋白質上に見出され
た。
脱脂されたヒト乳脂肪球の膜フラクションから調製され
た３つのヒト乳房上皮細胞抗原は咄乳類宿主内における
癌の存在を診断する方法の基本となるものである。公開
された欧州特許出願箱０，０８０．２５９号にはこれら
が記載されている。用いられた抗原にはセリアニ等に記
載された各々分子量が４８．０００．７５，０００．お
よび１５０，０００であるものが含まれている。要約覆
れば、この方法は患者の血漿サンプルを分析し、正常な
個体における存在レベルよりも高いレベルを示す１つ以
上の腫瘍関連抗原をめることからなる。乳癌が関与して
いる場合、これらの抗原はセリアニ等によって記載され
た上述の抗原によって例証される。
た３つのヒト乳房上皮細胞抗原は咄乳類宿主内における
癌の存在を診断する方法の基本となるものである。公開
された欧州特許出願箱０，０８０．２５９号にはこれら
が記載されている。用いられた抗原にはセリアニ等に記
載された各々分子量が４８．０００．７５，０００．お
よび１５０，０００であるものが含まれている。要約覆
れば、この方法は患者の血漿サンプルを分析し、正常な
個体における存在レベルよりも高いレベルを示す１つ以
上の腫瘍関連抗原をめることからなる。乳癌が関与して
いる場合、これらの抗原はセリアニ等によって記載され
た上述の抗原によって例証される。
そらに、癌の診断および治療において有用な抗原ａ３よ
び抗体が公開された英国特許出願Ｇ３２，１２１．４１
７Ａに記載されている。抗原（ま悪性細胞、特にヒト喉
頭肺由来の培養細胞に由来するものであった。この抗原
は分子量が３４０，０００〜４００，０００の範囲にあ
り、レクチン小麦胚凝集素に対する結合性、耐煮沸性、
耐破壊性を有するものであり、ある特定の溶媒を用いて
悪性細胞から抽出される。
び抗体が公開された英国特許出願Ｇ３２，１２１．４１
７Ａに記載されている。抗原（ま悪性細胞、特にヒト喉
頭肺由来の培養細胞に由来するものであった。この抗原
は分子量が３４０，０００〜４００，０００の範囲にあ
り、レクチン小麦胚凝集素に対する結合性、耐煮沸性、
耐破壊性を有するものであり、ある特定の溶媒を用いて
悪性細胞から抽出される。
抗原に対する七ツクローナル抗体の結合性試験によれば
、抗原は大多数の悪性ヒト腫瘍細胞上に存在するが良性
Ｗ瘍もしくは正常組繊細胞上には存在しないようである
。
、抗原は大多数の悪性ヒト腫瘍細胞上に存在するが良性
Ｗ瘍もしくは正常組繊細胞上には存在しないようである
。
（発明が解決しようとする問題点〉
高度の感受性および特異性を有する癌マーカーの探究は
乳癌マーカーを含めて進歩してきているが、乳癌診断の
助（プとなるようなマーカーに対する要求は依然として
存在している。本発明による新規な抗原はこのような要
求に向けられたものである。
乳癌マーカーを含めて進歩してきているが、乳癌診断の
助（プとなるようなマーカーに対する要求は依然として
存在している。本発明による新規な抗原はこのような要
求に向けられたものである。
したがって、本発明は正常および良性乳房上皮細胞股上
および乳癌細胞中に見出されるほぼ純粋な抗原を提供す
ることをその目的とするものである。
および乳癌細胞中に見出されるほぼ純粋な抗原を提供す
ることをその目的とするものである。
また、本発明はこのような抗原に対して特異性を有する
ほぼ純粋な抗体を提供することをその目的とするもので
ある。
ほぼ純粋な抗体を提供することをその目的とするもので
ある。
また、本発明はこのような抗原に対して特異性を有する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供づ
−ることをその目的とするものである。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供づ
−ることをその目的とするものである。
また、本発明はこのような抗原に対して特異性を有する
モノクローナル抗体を提供することをその目的とするも
のである。
モノクローナル抗体を提供することをその目的とするも
のである。
また、本発明はこのような抗原を検定する方法を提供す
ることをその目的とするものである。
ることをその目的とするものである。
（発明の構成）
本発明によって提供されるほぼ純粋な抗原は正常および
良性乳房上皮ＩＩＩ飽膜上膜上として管腔に隣接する頂
端表面上、および乳癌細胞中に、その細胞の見掛は−Ｆ
全域にわたって存在し、以下の特性： Ａ、最も一般的な形態において少なくとも約３００．０
００ドルトンの分子量を有すること：Ｂ、糖蛋白質であ
ること； Ｃ０塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
密度と同等の範囲にあること： Ｄ、ヒト包皮線紐芽細胞に存在しないこと：Ｅ、冠状動
脈、心臓、肝臓、稗臓Ｊ’； Ｊ：ひ皮膚の細胞に存在
しないこと； Ｆ、ヒト乳脂肪球に存在すること： Ｇ、皮脂腺、子宮頚内股、卵巣、腎臓、腸、膵臓。
良性乳房上皮ＩＩＩ飽膜上膜上として管腔に隣接する頂
端表面上、および乳癌細胞中に、その細胞の見掛は−Ｆ
全域にわたって存在し、以下の特性： Ａ、最も一般的な形態において少なくとも約３００．０
００ドルトンの分子量を有すること：Ｂ、糖蛋白質であ
ること； Ｃ０塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
密度と同等の範囲にあること： Ｄ、ヒト包皮線紐芽細胞に存在しないこと：Ｅ、冠状動
脈、心臓、肝臓、稗臓Ｊ’； Ｊ：ひ皮膚の細胞に存在
しないこと； Ｆ、ヒト乳脂肪球に存在すること： Ｇ、皮脂腺、子宮頚内股、卵巣、腎臓、腸、膵臓。
および肺の細胞上に存在すること：
Ｈ１乳癌細胞によって取り込まれること：■、ヒト血漿
サすプル中に存在すること；およびＪ１分子量がＤＮア
ーゼおよびコンドロイヂナーゼによって影響されないこ
と を有している。
サすプル中に存在すること；およびＪ１分子量がＤＮア
ーゼおよびコンドロイヂナーゼによって影響されないこ
と を有している。
好ましい実ｍ態様において、このような抗原は以下の付
加的な特性： △、正常乳房組繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する
抗原と乳癌細胞に関連する抗原との間でその濃度が有意
に変化しない第１の決定基を有すること； Ｂ、乳癌細胞に関連する抗原にお（）るその濃度が正常
乳房組繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する抗原にお
（プるその′ＩＡ度よりもイ１意に高い第２の決定基を
有すること； Ｃ２前記第１および第２の決定基の抗原性がＤＮアーゼ
およびコンドロイヂナーゼによって影響されないこと； Ｄ、前記第１および第２の決定基の抗原性がプロテアー
ゼによって低下すること； Ｅ、前記第１および第２の決定基の抗原性が穏やかなア
ルカリ処理によって低下すること；Ｆ、少なくともいく
らかの炭水化物がセリンもしくはスレオニンに対するＯ
−グリコシド結合によって蛋白質主鎖に見掛は上結合し
ていること：Ｇ、小麦胚凝集累カラムに結合することに
よってＮ−アセチルグルコサミンおよび／もしくはシア
ル酸の存在を示すこと： Ｈ１前記第１の決定基の濃度の増加によって示される乳
房起源の組織培養細胞によるその蓄積がエストロゲンに
よって増加すること：および■、そのノイラミニダーゼ
処理によって前記第１の決定基の抗原性が増加し、かつ
前記第２の決定基の抗原性が低下すること を有している。
加的な特性： △、正常乳房組繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する
抗原と乳癌細胞に関連する抗原との間でその濃度が有意
に変化しない第１の決定基を有すること； Ｂ、乳癌細胞に関連する抗原にお（）るその濃度が正常
乳房組繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する抗原にお
（プるその′ＩＡ度よりもイ１意に高い第２の決定基を
有すること； Ｃ２前記第１および第２の決定基の抗原性がＤＮアーゼ
およびコンドロイヂナーゼによって影響されないこと； Ｄ、前記第１および第２の決定基の抗原性がプロテアー
ゼによって低下すること； Ｅ、前記第１および第２の決定基の抗原性が穏やかなア
ルカリ処理によって低下すること；Ｆ、少なくともいく
らかの炭水化物がセリンもしくはスレオニンに対するＯ
−グリコシド結合によって蛋白質主鎖に見掛は上結合し
ていること：Ｇ、小麦胚凝集累カラムに結合することに
よってＮ−アセチルグルコサミンおよび／もしくはシア
ル酸の存在を示すこと： Ｈ１前記第１の決定基の濃度の増加によって示される乳
房起源の組織培養細胞によるその蓄積がエストロゲンに
よって増加すること：および■、そのノイラミニダーゼ
処理によって前記第１の決定基の抗原性が増加し、かつ
前記第２の決定基の抗原性が低下すること を有している。
また、本発明は、このような抗原を検定する方法として
以下の工程： Ａ、正常乳房組繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する
抗原と乳癌細胞に関連する抗原との間でその濃度が有意
に変化しない第１の決定基の濃度を測定し； Ｂ、乳癌細胞に関連する抗原におけるその濃度が正常乳
房組繊細胞もしくは良性ｎΦ瘍細胞に関連する抗原にお
４ｊるその濃度よりも有意に高い第２の決定基の濃度を
測定し： Ｃ１＃記第２の決定基の濃度の前記第１の決定基のｍ度
に対する比を計算することからなる方法を提供する。
以下の工程： Ａ、正常乳房組繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する
抗原と乳癌細胞に関連する抗原との間でその濃度が有意
に変化しない第１の決定基の濃度を測定し； Ｂ、乳癌細胞に関連する抗原におけるその濃度が正常乳
房組繊細胞もしくは良性ｎΦ瘍細胞に関連する抗原にお
４ｊるその濃度よりも有意に高い第２の決定基の濃度を
測定し： Ｃ１＃記第２の決定基の濃度の前記第１の決定基のｍ度
に対する比を計算することからなる方法を提供する。
また本発明は前記第１および第２の決定基に対してそれ
ぞれ特異的であるモノクローナル抗体とこのモノクロー
ナル抗体を産生するハイ１リドーマを提供する。
ぞれ特異的であるモノクローナル抗体とこのモノクロー
ナル抗体を産生するハイ１リドーマを提供する。
（実 施 例）
２つの乳腫細胞系であるＺＲ，−７５−１ＢおよびＭＣ
Ｆ−７は米国予防衛生研究所（ｔｈｅ Ｎ ａｔｉｏｎ
ａｌ １ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ）
から得たものであり１０容量％のウシ胎児血−清、１０
０ｍＭのグルタミン、１０ｎ＋ ｇ ／ｍｌのインシコ
リン、および５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有す
るダルベツコの改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅ ａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ
）に１＝１０の割合で継代して随持した。使用した他の
細胞系はウシ胎児血清、ゲンタマイシン、およびグルタ
ミンを補充した適当な基本培地中に帷持した。このよう
な細胞系には乳房細胞系のＨＢＩ−＝１００． ｌ−１
８０５７８Ｔ、 Ｔ４７Ｄ、 ＺＲ−７５−１。
Ｆ−７は米国予防衛生研究所（ｔｈｅ Ｎ ａｔｉｏｎ
ａｌ １ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ）
から得たものであり１０容量％のウシ胎児血−清、１０
０ｍＭのグルタミン、１０ｎ＋ ｇ ／ｍｌのインシコ
リン、および５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有す
るダルベツコの改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅ ａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ
）に１＝１０の割合で継代して随持した。使用した他の
細胞系はウシ胎児血清、ゲンタマイシン、およびグルタ
ミンを補充した適当な基本培地中に帷持した。このよう
な細胞系には乳房細胞系のＨＢＩ−＝１００． ｌ−１
８０５７８Ｔ、 Ｔ４７Ｄ、 ＺＲ−７５−１。
およびＺＲ−７５−３０；頚管細胞系のＭＥ−１８０゜
Ｃ３３Ｉ １．ＣＡＳＫｌ、Ｊ５Ｊ＝びＤＯＴ；咽頭腫
ＣＣＬ１３８；肺腫ＣＣＬ １８５；およびヒト包皮線
維月′細胞（１−Ｉ Ｆ Ｆ ＞が含まれていｌξ。
Ｃ３３Ｉ １．ＣＡＳＫｌ、Ｊ５Ｊ＝びＤＯＴ；咽頭腫
ＣＣＬ１３８；肺腫ＣＣＬ １８５；およびヒト包皮線
維月′細胞（１−Ｉ Ｆ Ｆ ＞が含まれていｌξ。
膜小胞の調製
ＺＲ−７５−ＩＢ由来の細胞を４ｏ、ａ９ｏｃ、Ｈのロ
ーラーボトル内で集密的となるまで増殖した。細胞はス
クレーピングによって採取し、カルシウムおよびマグネ
シウムを含有するダルベツコのリン酸緩衝溶液で３回洗
浄した。細胞は０．２４ Ｍのショ糖を含有するｐＨ７
，４の０．ＯＩＭＩ−リス緩衝液（Ｔｒｉｓ ｂｕＨｅ
＋・〉中に再び浮遊させ、Ａペストルを備えたダウンス
（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーの１０回のストロータ
によって水中において均質化した。次いで、ホモジネー
トをポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎＴＭ）ホモジナイザ
ー内で３回にわたって２０秒間バーストさせた。このよ
うにして均質化した物質は１０００×９で１０分間遠心
し、ペレット化した物質に対して均質化工程を繰り返し
た。再均質化した物質の第２の遠心分離の後、均質化工
程に由来する上澄液を混合して４８，０ＯＯＸ ９で４
５分間遠心分離し、粗膜フラクションペレットを得た。
ーラーボトル内で集密的となるまで増殖した。細胞はス
クレーピングによって採取し、カルシウムおよびマグネ
シウムを含有するダルベツコのリン酸緩衝溶液で３回洗
浄した。細胞は０．２４ Ｍのショ糖を含有するｐＨ７
，４の０．ＯＩＭＩ−リス緩衝液（Ｔｒｉｓ ｂｕＨｅ
＋・〉中に再び浮遊させ、Ａペストルを備えたダウンス
（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーの１０回のストロータ
によって水中において均質化した。次いで、ホモジネー
トをポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎＴＭ）ホモジナイザ
ー内で３回にわたって２０秒間バーストさせた。このよ
うにして均質化した物質は１０００×９で１０分間遠心
し、ペレット化した物質に対して均質化工程を繰り返し
た。再均質化した物質の第２の遠心分離の後、均質化工
程に由来する上澄液を混合して４８，０ＯＯＸ ９で４
５分間遠心分離し、粗膜フラクションペレットを得た。
粗膜フラクションペレットは均質化緩衝液中に浮遊させ
、３２％、３６％、４０％、４５％のショ糖段階勾配上
に重層した。勾配は９０分間１００，０００ｘ ｇで遠
心分離した。最初の２つの界面に存在する物質を血漿細
胞膜フラクションとして集めた。
、３２％、３６％、４０％、４５％のショ糖段階勾配上
に重層した。勾配は９０分間１００，０００ｘ ｇで遠
心分離した。最初の２つの界面に存在する物質を血漿細
胞膜フラクションとして集めた。
免疫感作
融合のために、１００μｑの膜フラクション蛋白質を同
体積の完全フロインドアジュバント（ｃｏｍｐｆｅｔｅ
Ｆ ｒｅｕｎｄ′ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ’ ）中に乳
化したものを３匹のＢａ１ｂ／Ｃマウスに腹腔内注射し
て、マウスに対して免疫感作を行なった。７日後、免疫
感作を繰り返した。第２の免疫感作の７日後、マウスに
１００μグの可溶蛋白質を腹腔内注射した。この注射の
４日後、マウスを殺してその牌臓を融合用に使用した。
体積の完全フロインドアジュバント（ｃｏｍｐｆｅｔｅ
Ｆ ｒｅｕｎｄ′ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ’ ）中に乳
化したものを３匹のＢａ１ｂ／Ｃマウスに腹腔内注射し
て、マウスに対して免疫感作を行なった。７日後、免疫
感作を繰り返した。第２の免疫感作の７日後、マウスに
１００μグの可溶蛋白質を腹腔内注射した。この注射の
４日後、マウスを殺してその牌臓を融合用に使用した。
融合工程
免疫感作させたマウスに由来する牌臓細胞を例えばコー
ラ−（ｋｏｈｌｅｒ）等、Ｎａｔｕｒｅ 、２５６．
４９５ （１９７５）に記載されるような公知の方法で
５Ｐ２１０細胞と融合した。要約すれば、これら２つの
型の細胞の混合物の懸濁液を５ｏｏｘ ｇで１０分間遠
心分離してペレット化した。ペレットは穏やかに粉砕し
、３７℃に温めた。粉砕したペレットに対して分子ｚｉ
ｏｏｏの３７％ポリエチレングリコール（Ｋｏｃｈ −
Ｌｉｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、 Ｌｔｄ、
） ０５ｍ ｌを攪拌しながら５０秒間以上にわたって
添加した。このようにして得た融合混合物は〜５．Ｏｍ
ｌの無血清ＲＰＭ ｌ−１６４０培地（ＲＰＭ Ｔ
１６４０．２ｍＭのグルタミン、 ５０ｍ ｏ ／＋１
１１のゲンタマイシン。
ラ−（ｋｏｈｌｅｒ）等、Ｎａｔｕｒｅ 、２５６．
４９５ （１９７５）に記載されるような公知の方法で
５Ｐ２１０細胞と融合した。要約すれば、これら２つの
型の細胞の混合物の懸濁液を５ｏｏｘ ｇで１０分間遠
心分離してペレット化した。ペレットは穏やかに粉砕し
、３７℃に温めた。粉砕したペレットに対して分子ｚｉ
ｏｏｏの３７％ポリエチレングリコール（Ｋｏｃｈ −
Ｌｉｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、 Ｌｔｄ、
） ０５ｍ ｌを攪拌しながら５０秒間以上にわたって
添加した。このようにして得た融合混合物は〜５．Ｏｍ
ｌの無血清ＲＰＭ ｌ−１６４０培地（ＲＰＭ Ｔ
１６４０．２ｍＭのグルタミン、 ５０ｍ ｏ ／＋１
１１のゲンタマイシン。
および５Ｘ１０’５Ｍの２−メルカプトエタトール）で
２分間以上にわたって徐々に希釈した。次いで１分間以
上にわたって５．Ｏｍ Ｉの培地を添加した。
２分間以上にわたって徐々に希釈した。次いで１分間以
上にわたって５．Ｏｍ Ｉの培地を添加した。
融合混合物は遠心分離し、細胞は５０ｔｌｌ ｌの無血
清信地で２回洗浄した。次いで細胞は１０％のウシ胎児
白酒を含有するＲ Ｐ Ｍ Ｉ −１６４０４Ｑ地中に
約５×１０６細胞／１１１１の密度で浮遊させた。
清信地で２回洗浄した。次いで細胞は１０％のウシ胎児
白酒を含有するＲ Ｐ Ｍ Ｉ −１６４０４Ｑ地中に
約５×１０６細胞／１１１１の密度で浮遊させた。
４ ｘ’１０３＠の［３ａｌｂ／Ｃマウス腹腔内滲出細
胞を１０％ウシ胎児血清を含有する５０ｍ１のＲＰＭＩ
−１６４０培地中に浮遊させたものを２４時間前に播種
しておいた９６ウエルのマイクロタイタープレー１〜（
ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）の各ウェルに５０
μ池の前記融合細胞浮遊液を分注した。プレートは湿潤
化した５％ＣＯ２インキュベーター内で一＠３７°Ｃに
インキュベートした。インキュベーション後、２イ８淵
縮ＨＡＴ （２Ｘ１０−４ Ｍのヒポキサンチン、８×
１０−７Ｍのアミノプテリン、お」；び３，２ｘ １い
Ｍのチミジン）を補充した１００μ応の血清含有」８地
を各ウェルに添加し、プレートをさらに５日間インキュ
ベートした。次いで、毎日、培地の一部を新鮮な１倍Ｈ
ＡＴ培地と交換することによって培地を供給した。
胞を１０％ウシ胎児血清を含有する５０ｍ１のＲＰＭＩ
−１６４０培地中に浮遊させたものを２４時間前に播種
しておいた９６ウエルのマイクロタイタープレー１〜（
ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）の各ウェルに５０
μ池の前記融合細胞浮遊液を分注した。プレートは湿潤
化した５％ＣＯ２インキュベーター内で一＠３７°Ｃに
インキュベートした。インキュベーション後、２イ８淵
縮ＨＡＴ （２Ｘ１０−４ Ｍのヒポキサンチン、８×
１０−７Ｍのアミノプテリン、お」；び３，２ｘ １い
Ｍのチミジン）を補充した１００μ応の血清含有」８地
を各ウェルに添加し、プレートをさらに５日間インキュ
ベートした。次いで、毎日、培地の一部を新鮮な１倍Ｈ
ＡＴ培地と交換することによって培地を供給した。
融合の２週間後、培地のいくつかには活発に増殖する細
胞が含まれており、牌臓細胞と５Ｐ２１０細胞との間の
融合の成功したことが示された。
胞が含まれており、牌臓細胞と５Ｐ２１０細胞との間の
融合の成功したことが示された。
増殖陽性の培地に由来する上澄液はＺＲ−７５−ＩＢ細
胞およびヒト包皮線雑芽細胞に対する抗体性に対してス
クリーニングした。前者に対して活性を示すが後者につ
いては活性を示さない培地はＢａ１ｂ／Ｃ胸腺細胞によ
る希釈度を制限することによってザブクローン化した。
胞およびヒト包皮線雑芽細胞に対する抗体性に対してス
クリーニングした。前者に対して活性を示すが後者につ
いては活性を示さない培地はＢａ１ｂ／Ｃ胸腺細胞によ
る希釈度を制限することによってザブクローン化した。
陽性サブクローンは抗体含有上澄液を産生するために培
地中で増殖させるか、あるいは抗体含有腹水を得るため
にプリスタン感作（Ｐｒｉｓｔａｎｅ −ｐｒｉｍｅｄ
） Ｂａ１ｂ ／（、マウスに２Ｘ１０ｅ個の、細胞を
腹腔内注射した。
地中で増殖させるか、あるいは抗体含有腹水を得るため
にプリスタン感作（Ｐｒｉｓｔａｎｅ −ｐｒｉｍｅｄ
） Ｂａ１ｂ ／（、マウスに２Ｘ１０ｅ個の、細胞を
腹腔内注射した。
ＺＲ−７５−ＩＢに対して反応性を有する抗体の存在は
プロティンＡ結合法［３ｒｏｗｎ ｅｔａｌ 、 Ｊ
。
プロティンＡ結合法［３ｒｏｗｎ ｅｔａｌ 、 Ｊ
。
Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、 ３１．２０
（１９７９） ］によって示された。要約すれば、ＺＲ
−７５−１Ｂ細胞を採取し、予めポリ（Ｄ−レジン）で
コーティングしたマイクロタイタープレートの各ウェル
に５×１０４個の細胞をブレーティングした。次いでプ
レートは一＠３７℃にインキュベートした。ウェルを空
にし、１５％のウシ胎児血清を含有する２００μ２のＲ
ＰＭ ｌ−１６４０を各ウェルに加えた。プレートは３
７°Ｃで４５分間インキュベートした。再びウェルを空
にし、各ウェルに試験Ｊ−べぎ」８地上澄液５０μルを
加えた。再びプレー１へを３７°Ｃで４５分間インキュ
ベートした。ウェルを空にし、１５％ウシ胎児血清を含
有するＲ ＰＭ ｌ−１６４０で３回洗浄し、各ウェル
にウサギ抗マウスＩ（＋の１ ： ’３００希釈液２０
０μ２を加えた。４５分間３７°Ｃでインキュベートし
た後２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＲ
ＰＭ Ｔ−１６４０でウェルを３回洗浄した。各ウェ
ルに、ヨウ素の放射性同位体で標識化したスタフィロコ
ッカスプロティン△を２００μ応のＢＳ△含有ＲＰＭ
ｌ−１６４０中に含有させたものを加え（５０、ｏｏｏ
ｃｐｍ ／ウェル）、再度プレートを３７℃で４５分間
インキュベートした。次いでウェルをＢＳＡ含有ＲＰＭ
ｌ−１６４０で３回洗浄し、増感スクリーンに重ねら
れたコダックＸ −ＯＭ Ａ Ｔ”Ａ Ｒフィルムに一
＠露出した。次いで、フィルムをコダックＸ線フィルム
現像液中で現像した。抗体結合はフィルム上の可視スポ
ットとして示された。これらの条件ではウェルあたり約
４００ＣＩ）ｍの比結合が検出可能である。
（１９７９） ］によって示された。要約すれば、ＺＲ
−７５−１Ｂ細胞を採取し、予めポリ（Ｄ−レジン）で
コーティングしたマイクロタイタープレートの各ウェル
に５×１０４個の細胞をブレーティングした。次いでプ
レートは一＠３７℃にインキュベートした。ウェルを空
にし、１５％のウシ胎児血清を含有する２００μ２のＲ
ＰＭ ｌ−１６４０を各ウェルに加えた。プレートは３
７°Ｃで４５分間インキュベートした。再びウェルを空
にし、各ウェルに試験Ｊ−べぎ」８地上澄液５０μルを
加えた。再びプレー１へを３７°Ｃで４５分間インキュ
ベートした。ウェルを空にし、１５％ウシ胎児血清を含
有するＲ ＰＭ ｌ−１６４０で３回洗浄し、各ウェル
にウサギ抗マウスＩ（＋の１ ： ’３００希釈液２０
０μ２を加えた。４５分間３７°Ｃでインキュベートし
た後２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＲ
ＰＭ Ｔ−１６４０でウェルを３回洗浄した。各ウェ
ルに、ヨウ素の放射性同位体で標識化したスタフィロコ
ッカスプロティン△を２００μ応のＢＳ△含有ＲＰＭ
ｌ−１６４０中に含有させたものを加え（５０、ｏｏｏ
ｃｐｍ ／ウェル）、再度プレートを３７℃で４５分間
インキュベートした。次いでウェルをＢＳＡ含有ＲＰＭ
ｌ−１６４０で３回洗浄し、増感スクリーンに重ねら
れたコダックＸ −ＯＭ Ａ Ｔ”Ａ Ｒフィルムに一
＠露出した。次いで、フィルムをコダックＸ線フィルム
現像液中で現像した。抗体結合はフィルム上の可視スポ
ットとして示された。これらの条件ではウェルあたり約
４００ＣＩ）ｍの比結合が検出可能である。
上述の工程を用いることによって、以下２１ＤＤ５およ
び２１ＤＤ７と称する２つのハイブリドーマはＺＲ−７
５−１８細胞に対して反応性を有する抗体を産生じた。
び２１ＤＤ７と称する２つのハイブリドーマはＺＲ−７
５−１８細胞に対して反応性を有する抗体を産生じた。
ヒト包皮線維芽細胞に対する反応は認められなかった。
これら２つのバイブリド−１マによって産生された抗体
は乳房細胞系７Ｒ〜７５−１ 、 ＺＲ−７５−３０，
Ｔ４７Ｄ、およびＭＣＦ−７に対しても反応性を有して
した。また、このような抗体は肺肝細胞系ＣＣＬ〜１８
５に対しても反応性を有していたが、頚管細胞系のＭ［
−１８０，ＣＡＳＫＩ、およびＣ３３１１もしくは乳房
細胞系１」ＢＬ−１００およびＨ８Ｏ５γ８Ｔとは反応
１）なかった。興味深いことに、このような抗体と反応
しなかった２つの乳房細胞系は真に形質転換した乳房上
皮細胞として特徴づりられるものではない。すなわち、
Ｈ３Ｏ５７８Ｔは筋肉肝として分類されるものであって
恐らくは上皮細胞ではなく、トＩＢＬ−ｉｏｏは乳サン
プルに由来するものであってその細胞は病理的とは診断
されなかった。
は乳房細胞系７Ｒ〜７５−１ 、 ＺＲ−７５−３０，
Ｔ４７Ｄ、およびＭＣＦ−７に対しても反応性を有して
した。また、このような抗体は肺肝細胞系ＣＣＬ〜１８
５に対しても反応性を有していたが、頚管細胞系のＭ［
−１８０，ＣＡＳＫＩ、およびＣ３３１１もしくは乳房
細胞系１」ＢＬ−１００およびＨ８Ｏ５γ８Ｔとは反応
１）なかった。興味深いことに、このような抗体と反応
しなかった２つの乳房細胞系は真に形質転換した乳房上
皮細胞として特徴づりられるものではない。すなわち、
Ｈ３Ｏ５７８Ｔは筋肉肝として分類されるものであって
恐らくは上皮細胞ではなく、トＩＢＬ−ｉｏｏは乳サン
プルに由来するものであってその細胞は病理的とは診断
されなかった。
２１ＤＤ５および２１ＤＩ）７によって産生されたモノ
クローナル抗体のＺＲ−７５−ＩＢ膜小胞に対する結合
は、２．５μＪの７Ｒ−７５−ｉ１３膜小胞蛋白質でコ
ートしたマイクロタイタープレートの各ウェルに２０μ
免の老廃ハイブリドーマ上澄液を添加することによって
示された。上述のインキュベーションおよび洗浄の後、
各ウェルに５０μ見の Ｉ−標識化ウサギ抗マウスＩｇ
を加えた。プレートを再びインキュベートおよび洗浄し
、各ウェルをカウントした。、ＺＲ−７５−１Ｂ膜小胞
蛋白質の代りに２．５μ９のヒｌ〜乳脂肪球を用いてこ
の工程を繰り返すと、このようなモノクローナル抗体は
ヒト乳脂肪球にも結合することが示された。
クローナル抗体のＺＲ−７５−ＩＢ膜小胞に対する結合
は、２．５μＪの７Ｒ−７５−ｉ１３膜小胞蛋白質でコ
ートしたマイクロタイタープレートの各ウェルに２０μ
免の老廃ハイブリドーマ上澄液を添加することによって
示された。上述のインキュベーションおよび洗浄の後、
各ウェルに５０μ見の Ｉ−標識化ウサギ抗マウスＩｇ
を加えた。プレートを再びインキュベートおよび洗浄し
、各ウェルをカウントした。、ＺＲ−７５−１Ｂ膜小胞
蛋白質の代りに２．５μ９のヒｌ〜乳脂肪球を用いてこ
の工程を繰り返すと、このようなモノクローナル抗体は
ヒト乳脂肪球にも結合することが示された。
冷凍乳房組織切片のイムノペルオキシダーゼ染色によれ
ば、２１ＤＤ５および２１Ｄ Ｄ ７によって産生され
たモノクローナル抗体は、孔管を裏打ちする正常もしく
は良性細胞の管腔表面上に支配的に存在する抗原であっ
て乳房上皮細胞中に存在する抗原と反応することが認め
られた。乳房小葉の正常もしくは良性細胞の全表面は小
葉もしくは菅由来の乳腫癌細胞と同様にこれらの抗原を
担持している。
ば、２１ＤＤ５および２１Ｄ Ｄ ７によって産生され
たモノクローナル抗体は、孔管を裏打ちする正常もしく
は良性細胞の管腔表面上に支配的に存在する抗原であっ
て乳房上皮細胞中に存在する抗原と反応することが認め
られた。乳房小葉の正常もしくは良性細胞の全表面は小
葉もしくは菅由来の乳腫癌細胞と同様にこれらの抗原を
担持している。
ハイブリドーマ２１ＤＤ５および２１ＤＤ７は１９８４
年３月２８日にアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｑａｌｔｕ
ｒｃＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 、 １２３０１ Ｐａｒｋ
ｗａｙ Ｄｒｉｖｅ、 Ｒｏｃｋｙｉｌｌｅ、 Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ ２０８５２ンに寄託され、それぞれＡＴＣ
Ｃ受託番号１−１１３８５３２およびＨ’Ｂ８５３３が
与えられた。
年３月２８日にアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｑａｌｔｕ
ｒｃＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 、 １２３０１ Ｐａｒｋ
ｗａｙ Ｄｒｉｖｅ、 Ｒｏｃｋｙｉｌｌｅ、 Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ ２０８５２ンに寄託され、それぞれＡＴＣ
Ｃ受託番号１−１１３８５３２およびＨ’Ｂ８５３３が
与えられた。
上述のように小胞を調製した。
抗原の可溶化
ＺＲ−７５−１３およヒＭＥ−１８０小胞ヲ４８０００
×３で遠心分離し、１％のＮＰ−４０および１ｍＡのフ
ェニルメチルスルフォニルフルロライドを含有する４℃
のダルベツコのリン酸Ｍ衝液中に１時間浮遊させること
によって、約５０％の小胞蛋白質を可溶化した。しＩＣ
かっ−Ｃ１不溶竹物質を除去ηるためには４８，０００
ｘ ｇの遠心分前を繰り返さねばならなかった。上澄液
は水にえｊして透４１↑した後、−１０℃で凍結乾燥し
、保存した。残清は小胞調製用に用いた当初のものの半
分の容量に相当するダルベツコのリン酸緩衝液中に再び
溶解し、１８０μ７／ｍ１の蛋白質を有するＺＲ−７５
−１Ｂ溶液および１４０μり／ｍｌの蛋白質を有するＭ
Ｆ−１８０溶液を 得 ｌこ 。
×３で遠心分離し、１％のＮＰ−４０および１ｍＡのフ
ェニルメチルスルフォニルフルロライドを含有する４℃
のダルベツコのリン酸Ｍ衝液中に１時間浮遊させること
によって、約５０％の小胞蛋白質を可溶化した。しＩＣ
かっ−Ｃ１不溶竹物質を除去ηるためには４８，０００
ｘ ｇの遠心分前を繰り返さねばならなかった。上澄液
は水にえｊして透４１↑した後、−１０℃で凍結乾燥し
、保存した。残清は小胞調製用に用いた当初のものの半
分の容量に相当するダルベツコのリン酸緩衝液中に再び
溶解し、１８０μ７／ｍ１の蛋白質を有するＺＲ−７５
−１Ｂ溶液および１４０μり／ｍｌの蛋白質を有するＭ
Ｆ−１８０溶液を 得 ｌこ 。
抗原存在の測定
ポリビニルマイクロタイタープレート上に固定されたＺ
Ｒ−７５−ＩＢ膜小胞に結合し得るモノクローナル抗体
量のいかなる低下をも検出でさるような阻止系を設けた
。要約すれば、２．５μＵのロウリープロチイン（ｌ
ｏｗｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）を７Ｒ−７５−１Ｂ膜に含
有させ１」２０中に添加したものをプレートの各つ■ル
内で乾固ざぜた。次いで抗体の非特異的結合を防止する
ため、１５％のウシ胎児血清（ＩＣ８）を含有するＲＰ
ＭＩＷ、地につ１ルを浸した。次いで、５０μ免の抗体
含有溶液を添加ｊノ、プレートを５％ＣＯ２雰囲気中に
おいて３７℃で４５分間インキュベー１〜した。ウェル
は１５％ＩＣ８−ＲＰＭＩで３回洗浄し ＋ｚＳ 、−
標識化ウサギ抗マウスＩｇを添加した。
Ｒ−７５−ＩＢ膜小胞に結合し得るモノクローナル抗体
量のいかなる低下をも検出でさるような阻止系を設けた
。要約すれば、２．５μＵのロウリープロチイン（ｌ
ｏｗｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）を７Ｒ−７５−１Ｂ膜に含
有させ１」２０中に添加したものをプレートの各つ■ル
内で乾固ざぜた。次いで抗体の非特異的結合を防止する
ため、１５％のウシ胎児血清（ＩＣ８）を含有するＲＰ
ＭＩＷ、地につ１ルを浸した。次いで、５０μ免の抗体
含有溶液を添加ｊノ、プレートを５％ＣＯ２雰囲気中に
おいて３７℃で４５分間インキュベー１〜した。ウェル
は１５％ＩＣ８−ＲＰＭＩで３回洗浄し ＋ｚＳ 、−
標識化ウサギ抗マウスＩｇを添加した。
まず、２１ＤＤ５および２１ＤＤ７ハイブリドーマ培養
上澄液に存在する一次抗体の滴定を行なった。
上澄液に存在する一次抗体の滴定を行なった。
滴定によって、ハイブリドーマ培養上澄液の１：１００
もしくは１： ５００″８釈液は容易に検出可能な結合
を示した。この希釈液は一次抗体と共に阻害剤を含むに
必要な体積をもたらすものであった。
もしくは１： ５００″８釈液は容易に検出可能な結合
を示した。この希釈液は一次抗体と共に阻害剤を含むに
必要な体積をもたらすものであった。
様々な体積の阻害剤源を小量の未希釈抗体上澄液に添加
し、次いで充分な１５％ＩＣ８−ＲＰＭＩを加えること
によって抗体を１ ： １００〜ｌ ： ５００の最終
濃度とし、阻害検定を行なった。次いでこの阻害剤混合
物を３７℃で４５分間インキュベートした後、ＺＲ−７
５−１Ｂでコートしたマイクロタイタープレートに５０
μ応の阻害剤混合物を添加して結合検定を行なった。２
１Ｄ Ｄ ５および２１ＤＤ７上澄液のいずれにおいて
も、ＺＲ−７５−１Ｂ小胞と共にプレインキコベーショ
ン（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏ口）した場合には７ Ｒ
−７５−１Ｆ３コ−１〜したつ１ルに夕・ｊする結合量
が減少した。
し、次いで充分な１５％ＩＣ８−ＲＰＭＩを加えること
によって抗体を１ ： １００〜ｌ ： ５００の最終
濃度とし、阻害検定を行なった。次いでこの阻害剤混合
物を３７℃で４５分間インキュベートした後、ＺＲ−７
５−１Ｂでコートしたマイクロタイタープレートに５０
μ応の阻害剤混合物を添加して結合検定を行なった。２
１Ｄ Ｄ ５および２１ＤＤ７上澄液のいずれにおいて
も、ＺＲ−７５−１Ｂ小胞と共にプレインキコベーショ
ン（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏ口）した場合には７ Ｒ
−７５−１Ｆ３コ−１〜したつ１ルに夕・ｊする結合量
が減少した。
Ｚ Ｒ−７Ｇ −１１３可溶化膜物質を含有する阻害溶
液の不在下にお（プるｃｐｍ結合は阻害溶液存在下にお
（ブるＣ ｌ）ｍ結合の３〜４． （（５であり、この
結果、希釈ハイブリドーマ上澄液中にお【プる特定のモ
ノクローナル抗体に結合した可溶性抗原の存在が示され
ｌこ 。
液の不在下にお（プるｃｐｍ結合は阻害溶液存在下にお
（ブるＣ ｌ）ｍ結合の３〜４． （（５であり、この
結果、希釈ハイブリドーマ上澄液中にお【プる特定のモ
ノクローナル抗体に結合した可溶性抗原の存在が示され
ｌこ 。
ＧＥ）レムリ（ｌ ａｅｍｍｌｉ） 、 Ｎａｔｕｒｏ
、２２７． ６８０ （１９７０）による不連続電気泳
動法を行４１っだ。
、２２７． ６８０ （１９７０）による不連続電気泳
動法を行４１っだ。
４％のスタッキングゲルに加えてそれぞれ２．７％の架
橋用ビスアクリルアミドを含イコする８％、１０％もし
くは１２％の総アクリルアミド含早のゲルを使用した。
橋用ビスアクリルアミドを含イコする８％、１０％もし
くは１２％の総アクリルアミド含早のゲルを使用した。
全試薬はバイオ−ラド（ｆ３ ｉｏ −Ｒａｄ ）電気
泳動グレードのものであり、全ての器具は１５ｍｍ厚ゲ
ル用に設置したホーファーバーチカルスラブグルアセン
ブリー（Ｈｏｅｆｅｒ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｓｌａｂｇ
ｅｌ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）によるものであった。分
ｌ１１１１ゲルは必ず使用前日に注入し、スタッキング
ゲルはナンプルを流す１〜２時間前に添加した。サンプ
ルは２％のドデシル硫酸ナトリウムと１０％のグリセロ
ールと５％の２−メルカプトエタノールとを含むＰＨ６
，８の０．０６ Ｍ トリス緩衝液中において １００
℃で２〜５分間加熱した。電気泳動緩衝液は０．１９２
Ｍのグリシンと０．１％のドデシル硫酸ナトリウムとを
含有するＰＨ８，３の０．２５Ｍトリスであった。
泳動グレードのものであり、全ての器具は１５ｍｍ厚ゲ
ル用に設置したホーファーバーチカルスラブグルアセン
ブリー（Ｈｏｅｆｅｒ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｓｌａｂｇ
ｅｌ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）によるものであった。分
ｌ１１１１ゲルは必ず使用前日に注入し、スタッキング
ゲルはナンプルを流す１〜２時間前に添加した。サンプ
ルは２％のドデシル硫酸ナトリウムと１０％のグリセロ
ールと５％の２−メルカプトエタノールとを含むＰＨ６
，８の０．０６ Ｍ トリス緩衝液中において １００
℃で２〜５分間加熱した。電気泳動緩衝液は０．１９２
Ｍのグリシンと０．１％のドデシル硫酸ナトリウムとを
含有するＰＨ８，３の０．２５Ｍトリスであった。
電気泳動はゲルあたり３０ミリアンペアの定常流で行な
い、トラッキング染料がゲルの底部から流れ出すまで継
続した。分子量測定のため、パイオーラド分子ｍ蛋白質
マーカーを定常的に含有させた。各泳動後、直ちにゲル
をクーマシーブルーもしくはアップジョンシルバーステ
ィン（Ｕ ｐｊｏｈｎ３１１ｖｅｒ ３ ｔａｉｎ）で
蛋白質同定のために染色するか、あるいは直ちにウェス
タンプロット（ｔｈｅＷｅｓｔｅｒｎ ３ ｌｏｊ ）
法によってニトロセルロース紙に移した。
い、トラッキング染料がゲルの底部から流れ出すまで継
続した。分子量測定のため、パイオーラド分子ｍ蛋白質
マーカーを定常的に含有させた。各泳動後、直ちにゲル
をクーマシーブルーもしくはアップジョンシルバーステ
ィン（Ｕ ｐｊｏｈｎ３１１ｖｅｒ ３ ｔａｉｎ）で
蛋白質同定のために染色するか、あるいは直ちにウェス
タンプロット（ｔｈｅＷｅｓｔｅｒｎ ３ ｌｏｊ ）
法によってニトロセルロース紙に移した。
ウェスタンプロット法
ゲルからニトロセルロース紙への蛋白質の転移およびそ
のプロット（ｂｌｏｔ）のラジオイムノアッセイのため
に用いた基本的な方法はバーネット（［３ｕｒｎｅｔｔ
） 、Ａｎａｌ 、 ＢＢｌｏＣｌｌｅ、１１２． １
９５（１９８１）によるものであった。転移「サンドイ
ッチ」は常に２０ｍ Ｍ トリス、１５０ｍＭグリシン
、および２０％メタノールからなる転移緩衝液に浸漬し
て組合せた。使用したホーファートランスファー（ｔｈ
ｅ ）−１ｏｅｆｅｒ Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ ） ユニ
ットはサンドインチ集積用の特殊なカセットを有してい
た。カセットの背部はカセットに含まれる特殊なスポン
ジと共に緩衝〜液中に浸漬した。次いで１枚の厚い吸取
紙をスポンジ上に配置し、さらに１枚のＳ＆Ｓ ＢＡ８
３ニトロセルロース紙を重ねた。これらの層が完全に湿
潤化し、層間から気泡が完全に除去されてから、ゲルを
ニトロセルロース紙上に配置し、湿らせた２枚目の吸取
紙をゲルの上に配置し、カセットの上部を閉鎖した。通
常カセットはゴムバンドで固定した。
のプロット（ｂｌｏｔ）のラジオイムノアッセイのため
に用いた基本的な方法はバーネット（［３ｕｒｎｅｔｔ
） 、Ａｎａｌ 、 ＢＢｌｏＣｌｌｅ、１１２． １
９５（１９８１）によるものであった。転移「サンドイ
ッチ」は常に２０ｍ Ｍ トリス、１５０ｍＭグリシン
、および２０％メタノールからなる転移緩衝液に浸漬し
て組合せた。使用したホーファートランスファー（ｔｈ
ｅ ）−１ｏｅｆｅｒ Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ ） ユニ
ットはサンドインチ集積用の特殊なカセットを有してい
た。カセットの背部はカセットに含まれる特殊なスポン
ジと共に緩衝〜液中に浸漬した。次いで１枚の厚い吸取
紙をスポンジ上に配置し、さらに１枚のＳ＆Ｓ ＢＡ８
３ニトロセルロース紙を重ねた。これらの層が完全に湿
潤化し、層間から気泡が完全に除去されてから、ゲルを
ニトロセルロース紙上に配置し、湿らせた２枚目の吸取
紙をゲルの上に配置し、カセットの上部を閉鎖した。通
常カセットはゴムバンドで固定した。
サンドイッチはトランスファーユニット内においてニト
ロセルロース紙がゲルと陽極との間に位置するように配
置した。移転は１００Ｖの定常電圧で少なくとも１６時
間行なった。これらの条件下では１０℃にセットした冷
媒循環ユニットでトランスファーユニットを冷却するこ
とが必要であった。
ロセルロース紙がゲルと陽極との間に位置するように配
置した。移転は１００Ｖの定常電圧で少なくとも１６時
間行なった。これらの条件下では１０℃にセットした冷
媒循環ユニットでトランスファーユニットを冷却するこ
とが必要であった。
転移が完了してから、サンドイッチを分解し、ゲルを通
常はクーマシーブルーで染色した。場合によってはニト
ロセルロース紙も４０％メタノールおよび１０％酢酸に
含まれる０、２％クーマシーブルー溶液で５分間染色し
た。いくらか変化させた９０％メタノールおよび２％酢
酸溶液中で穏やかに攪拌することによって紙は約１５分
で迅速に脱色した。
常はクーマシーブルーで染色した。場合によってはニト
ロセルロース紙も４０％メタノールおよび１０％酢酸に
含まれる０、２％クーマシーブルー溶液で５分間染色し
た。いくらか変化させた９０％メタノールおよび２％酢
酸溶液中で穏やかに攪拌することによって紙は約１５分
で迅速に脱色した。
紙は柔かくしわになりやすいために脱色中には注意を払
った。脱色した紙はオートラジオグラフによる視覚化に
先立って少なくとも３０分間トリス塩（０，９％塩化ナ
トリウムおよび１０ｍ Ｍ ＋”リスヒドロクロリド、
ＰＨ７，４）中で洗浄した。
った。脱色した紙はオートラジオグラフによる視覚化に
先立って少なくとも３０分間トリス塩（０，９％塩化ナ
トリウムおよび１０ｍ Ｍ ＋”リスヒドロクロリド、
ＰＨ７，４）中で洗浄した。
脱色しかつ完全に洗浄した紙、もしくはトランスファー
ユニットから直接取り出した紙は３７℃の５％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）のトリス塩溶液中に１時間浸漬し
た。紙は５％ＢＳＡ’ｌ−リス塩溶液でに６に希釈した
適当なハイブリドーマ上澄（２１１）Ｄ５もしくは２１
Ｄ Ｄ ７ ）溶液に移し、環境温度において振動しな
がら９０分間インキユベートシた。次いでニトロセルロ
ース紙は２００ｍ１のトリス塩溶液中で振動させながら
洗浄し、０．０５％ＮＰ−４０を含有する２００ｍ ｌ
のトリス塩溶液２組で２０分間洗浄し、最後に２００ｍ
ｌのトリス塩溶液のみを用いて１０分間洗浄した。洗
浄した紙はｉｏｏ、ｏ。
ユニットから直接取り出した紙は３７℃の５％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）のトリス塩溶液中に１時間浸漬し
た。紙は５％ＢＳＡ’ｌ−リス塩溶液でに６に希釈した
適当なハイブリドーマ上澄（２１１）Ｄ５もしくは２１
Ｄ Ｄ ７ ）溶液に移し、環境温度において振動しな
がら９０分間インキユベートシた。次いでニトロセルロ
ース紙は２００ｍ１のトリス塩溶液中で振動させながら
洗浄し、０．０５％ＮＰ−４０を含有する２００ｍ ｌ
のトリス塩溶液２組で２０分間洗浄し、最後に２００ｍ
ｌのトリス塩溶液のみを用いて１０分間洗浄した。洗
浄した紙はｉｏｏ、ｏ。
Ｏｃｐｍ／ ５０μ応の１９５’Ｉ−標識化ウサギ抗マ
ウスＩＱＧを含有する５％ＢＳＡ中で振動させながら３
０％間、環境温度においてインキュベートした。この最
後のインキュベーションの後、紙は上記のように洗浄し
、紙タオルでプロットし、プラスチックラップ中に包み
、−７０°Ｃにおいて増感スクリーンを設（プたコダッ
クＸＲ”’フィルムに露出した。
ウスＩＱＧを含有する５％ＢＳＡ中で振動させながら３
０％間、環境温度においてインキュベートした。この最
後のインキュベーションの後、紙は上記のように洗浄し
、紙タオルでプロットし、プラスチックラップ中に包み
、−７０°Ｃにおいて増感スクリーンを設（プたコダッ
クＸＲ”’フィルムに露出した。
５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから調製したウェスタンプロット
のオートラジオグラフによる視覚化は２１ＤＤ５および
２１Ｄ Ｄ ７によって産生じたモノクローナル抗体と
反応する抗原を決定的に同定した。
のオートラジオグラフによる視覚化は２１ＤＤ５および
２１Ｄ Ｄ ７によって産生じたモノクローナル抗体と
反応する抗原を決定的に同定した。
２１ＤＤ５−および２１ＤＤ７上澄液において観察され
たオートラジオグラフパターンは抗原が８％のゲルにお
いても極めてわずかしかゲル中に浸入せず、１２％ゲル
においては殆ど浸入しないという点で常に類似していた
。場合により、８％ゲル中には抗原が２つのバンドとし
て認められた。分子ｆｉ９２，５００のフォスフォリラ
ーゼは非常に大量にゲル中に侵入した。ゲルおよびニト
ロセルロース紙を特定の蛋白質で染色処理すると抗原よ
りも低分子量の数多い蛋白質バンドが認められた。２１
ＤＤ５および２１＋）Ｄ７抗体と反応する抗原は１つ以
上の分子形態を有する可能性もあるが、このような抗原
は単一の名称ＡＦ−１で呼ぶことにする。
たオートラジオグラフパターンは抗原が８％のゲルにお
いても極めてわずかしかゲル中に浸入せず、１２％ゲル
においては殆ど浸入しないという点で常に類似していた
。場合により、８％ゲル中には抗原が２つのバンドとし
て認められた。分子ｆｉ９２，５００のフォスフォリラ
ーゼは非常に大量にゲル中に侵入した。ゲルおよびニト
ロセルロース紙を特定の蛋白質で染色処理すると抗原よ
りも低分子量の数多い蛋白質バンドが認められた。２１
ＤＤ５および２１＋）Ｄ７抗体と反応する抗原は１つ以
上の分子形態を有する可能性もあるが、このような抗原
は単一の名称ＡＦ−１で呼ぶことにする。
全抗体く２次抗体および直接標識化モノクローナル）は
ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ ） 、 Ｐｒｏ、 Ｓｏｃ、
Ｅ皿、Ｂｉｏｌ、！蛙、 −１１３，９８９（１９７
０）によって記載された方法の変形を用いてヨウ化した
。要約ずれば、まず親和性を純化した、あるいはプロテ
ィンへ−純化した抗体とリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）との
１ｍ９／ｍＲ溶液 １００／／見にｐＨ７，’２の ０
．０５ Ｍリン酸５０μ池を添加した。次い−（゛、１
ミリキ：２リーの無１０体１２５−■を添加し、さらに
メタ重亜ｈｘ＋酸ナトリウム１０μ’ｉ ８３よび１０
％ウシ胎児血清（ＦＣ８）のＰＢＳ溶液１ｏｏｎｌを加
えた。未反応の試薬は１０％ＦＣ８−ＰＢＳ中のバイオ
ラドへＧ１−Ｘ２陽イオン交換樹脂カラムに通りことに
よってヨウ化蛋白質から分１１１１１． した。２ｍｌ
の溶離液を果め、比活性を測定した。一般に、この工程
によって２０８μＣＩ′２５Ｉ／蛋白質μｑの比活性を
有する蛋白質調製物が得られた。
ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ ） 、 Ｐｒｏ、 Ｓｏｃ、
Ｅ皿、Ｂｉｏｌ、！蛙、 −１１３，９８９（１９７
０）によって記載された方法の変形を用いてヨウ化した
。要約ずれば、まず親和性を純化した、あるいはプロテ
ィンへ−純化した抗体とリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）との
１ｍ９／ｍＲ溶液 １００／／見にｐＨ７，’２の ０
．０５ Ｍリン酸５０μ池を添加した。次い−（゛、１
ミリキ：２リーの無１０体１２５−■を添加し、さらに
メタ重亜ｈｘ＋酸ナトリウム１０μ’ｉ ８３よび１０
％ウシ胎児血清（ＦＣ８）のＰＢＳ溶液１ｏｏｎｌを加
えた。未反応の試薬は１０％ＦＣ８−ＰＢＳ中のバイオ
ラドへＧ１−Ｘ２陽イオン交換樹脂カラムに通りことに
よってヨウ化蛋白質から分１１１１１． した。２ｍｌ
の溶離液を果め、比活性を測定した。一般に、この工程
によって２０８μＣＩ′２５Ｉ／蛋白質μｑの比活性を
有する蛋白質調製物が得られた。
■古性試験
前述の耐１害系を用いて２１［）Ｄ５Ｊ５よひ２１１つ
１〕７の抗原性をＭＣＦ−７もしく４；Ｌ７Ｒ−７５−
１Ｂ培養物の老廃培地上澄液中にｄ５いて検出してよう
とした当初の試みは決定的なものではなかった。しかし
なから、培地を濃縮すると良好な阻害性が検出された。
１〕７の抗原性をＭＣＦ−７もしく４；Ｌ７Ｒ−７５−
１Ｂ培養物の老廃培地上澄液中にｄ５いて検出してよう
とした当初の試みは決定的なものではなかった。しかし
なから、培地を濃縮すると良好な阻害性が検出された。
すなわち、１０倍淵縮したＭＣｌ７もしくはＺ Ｒ−７
４］−１Ｂ１１０地は良好な抗体結合阻害性を示したが
ＭＦ−１８０培養物に由来する１０倍濶縮Ｊ８地は結合
に対していかなる有意な影響を有していなかった。ＭＣ
トー７１８地は常に最も優れた阻害性を示した。７［−
７５−ＩＢ培地によって得られた阻害性は変化しやすく
、ＭＣＦ−７によつ”ＣＡＷられたものよりは常に低か
った。２１ＤＤ５および２１Ｄ Ｄ ７抗体と反応する
抗原はＪ８地中に取り込まれた。
４］−１Ｂ１１０地は良好な抗体結合阻害性を示したが
ＭＦ−１８０培養物に由来する１０倍濶縮Ｊ８地は結合
に対していかなる有意な影響を有していなかった。ＭＣ
トー７１８地は常に最も優れた阻害性を示した。７［−
７５−ＩＢ培地によって得られた阻害性は変化しやすく
、ＭＣＦ−７によつ”ＣＡＷられたものよりは常に低か
った。２１ＤＤ５および２１Ｄ Ｄ ７抗体と反応する
抗原はＪ８地中に取り込まれた。
ＭＣＦ−７１ｆＩｌ胞に由来する培地はこの抗原の良好
な源であり、またＭ Ｃｆ＝ −７細胞はウシ胎児内情
の不在下で増Ｗ（可能であるため、ウシ胎児内情を含ま
イ５い老廃培地中にお（プる抗原の量を測定することを
試みた。ＭＣＦ−７培養物に由来覆る血清含有培地はこ
こでもこの系においてイｊ怠な開害を生み出したが、ｌ
−Ｉ Ｆ Ｆ ｉ８養物、に由来する新鮮ｊ６地もしく
は血清含有培地は阻害性を有していなかった。 Ｍ Ｃ
Ｆ −７１７５養物に由来する無血清培地は阻害性を含
んでいなかった。この結果は２つの巽なった実験で得ら
れたものである。したがって、ΔＦ−１を上澄液内に取
り込むためには培地中に血清が必要であると考えられる
。培地中にｉｌ′３ける血清の存在は抗体の産生にとっ
て必要条イ′１てはない。２１Ｄ Ｄ ５および２１Ｄ
Ｄ７Ｊ５よびＭＣＦ−７細胞の細胞同定によれば、これ
らの細胞か血清の存在下で増殖したかどうかに拘らず、
細胞表面にはＡＦ−１の存在が認められた。したがって
、取り込み（５ｈｅｄｄ ｉ ｎｇ ＞のみが培地中の
血清によって影響を受（プるものと考えられる。
な源であり、またＭ Ｃｆ＝ −７細胞はウシ胎児内情
の不在下で増Ｗ（可能であるため、ウシ胎児内情を含ま
イ５い老廃培地中にお（プる抗原の量を測定することを
試みた。ＭＣＦ−７培養物に由来覆る血清含有培地はこ
こでもこの系においてイｊ怠な開害を生み出したが、ｌ
−Ｉ Ｆ Ｆ ｉ８養物、に由来する新鮮ｊ６地もしく
は血清含有培地は阻害性を有していなかった。 Ｍ Ｃ
Ｆ −７１７５養物に由来する無血清培地は阻害性を含
んでいなかった。この結果は２つの巽なった実験で得ら
れたものである。したがって、ΔＦ−１を上澄液内に取
り込むためには培地中に血清が必要であると考えられる
。培地中にｉｌ′３ける血清の存在は抗体の産生にとっ
て必要条イ′１てはない。２１Ｄ Ｄ ５および２１Ｄ
Ｄ７Ｊ５よびＭＣＦ−７細胞の細胞同定によれば、これ
らの細胞か血清の存在下で増殖したかどうかに拘らず、
細胞表面にはＡＦ−１の存在が認められた。したがって
、取り込み（５ｈｅｄｄ ｉ ｎｇ ＞のみが培地中の
血清によって影響を受（プるものと考えられる。
５ＤＳ−ＰＡＧＥ試験において既に示されたように２１
ＤＤ５および２１ＤＤ７ば高分子量の抗原と反応した。
ＤＤ５および２１ＤＤ７ば高分子量の抗原と反応した。
２１Ｄ Ｄ ５抗体親和性カラムもしくは２１Ｄ］）７
抗体親和性カラム上に吸着されたＡＦ−１調製物は互い
に染色されるため、両抗体は恐らく同一の抗原すなわち
ＡＦ−１と反応づるものと考えられる。さらに、ＡＦ−
１は２１Ｄ Ｄ ５のための反復決定基を有しているよ
うでもある。なぜなｌう、ポリビニルマイクロタイター
プレー１−に吸着された２１Ｄ Ｄ ５抗体はＭ ＣＦ
−７ｊ７３地から得られた部分的に純化されたＡＦ−
１を補災し、一方後者は１２５１−標識化２１ＤＤ５抗
体を補１匙するからである。
抗体親和性カラム上に吸着されたＡＦ−１調製物は互い
に染色されるため、両抗体は恐らく同一の抗原すなわち
ＡＦ−１と反応づるものと考えられる。さらに、ＡＦ−
１は２１Ｄ Ｄ ５のための反復決定基を有しているよ
うでもある。なぜなｌう、ポリビニルマイクロタイター
プレー１−に吸着された２１Ｄ Ｄ ５抗体はＭ ＣＦ
−７ｊ７３地から得られた部分的に純化されたＡＦ−
１を補災し、一方後者は１２５１−標識化２１ＤＤ５抗
体を補１匙するからである。
ま／ｊ、２１Ｄ Ｄ ５抗体の使用によってＡＦ−１は
第４段階（Ｓ ｔａｃ＋ｅＴＶ ）の乳癌を有する患者
の血清中に存在することが認められた。
第４段階（Ｓ ｔａｃ＋ｅＴＶ ）の乳癌を有する患者
の血清中に存在することが認められた。
１ｉｆＩ酸アンモニウム（６５９ｇ）を１．９リツトル
の老廃ＺＲ−７５−’１Ｂ培地に添加し、４℃において
一晩攪拌した。翌日、温合物を１２，０ＯＯＸ ”ｊで
１５分間遠心分離した。得られたペレットはリン酸バッ
ファー溶液（Ｐ １３８ ）中に再浮遊させ、再び遠心
分離した。混合した上澄液を４リソ１ヘルのＰＢＳに対
して透析し、約２０ｎ＋又のアリコートとして凍結した
。ロウリー（Ｌ ｏｗｒｙ） 、正、Ｂｉｏｌ、’広ヒ
ｍ、１９３． ２５６（１９５１）の方法に従って蛋白
質濃度を測定した。
の老廃ＺＲ−７５−’１Ｂ培地に添加し、４℃において
一晩攪拌した。翌日、温合物を１２，０ＯＯＸ ”ｊで
１５分間遠心分離した。得られたペレットはリン酸バッ
ファー溶液（Ｐ １３８ ）中に再浮遊させ、再び遠心
分離した。混合した上澄液を４リソ１ヘルのＰＢＳに対
して透析し、約２０ｎ＋又のアリコートとして凍結した
。ロウリー（Ｌ ｏｗｒｙ） 、正、Ｂｉｏｌ、’広ヒ
ｍ、１９３． ２５６（１９５１）の方法に従って蛋白
質濃度を測定した。
処理アリコートをセファクリル３−３００カラム（ｐ
ｌ＋ａｒｍａｃｉａ ）に６６ｍ ｉ／時の流速で流し
た。最初の蛋白質ピーク、すなわちフラクション５〜３
０をプールしてＳｌと名付けた。
ｌ＋ａｒｍａｃｉａ ）に６６ｍ ｉ／時の流速で流し
た。最初の蛋白質ピーク、すなわちフラクション５〜３
０をプールしてＳｌと名付けた。
塩化セシウム勾配［Ｈａｓｃａｌｌ ｅｔ ａｌ、 Ｍ
ｅｔｈｏｄｓユｎ Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、 ８２
． ７６０ （’１９８２） ］を濃度段階として用い
た。セフノアクリル３−３００カラムから得たＳ１フラ
クション３０ｍ ｌに塩化セシウムを添加した。こうし
て１ｑだ溶液は５０Ｔ ｉ ローターを設（）たベック
マン（Ｂｅｃｋｍａｎ） Ｌ ８−７０超遠心機内にお
いて６４，０ＯＯＸ ｇで４９時間遠心分離した。
ｅｔｈｏｄｓユｎ Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、 ８２
． ７６０ （’１９８２） ］を濃度段階として用い
た。セフノアクリル３−３００カラムから得たＳ１フラ
クション３０ｍ ｌに塩化セシウムを添加した。こうし
て１ｑだ溶液は５０Ｔ ｉ ローターを設（）たベック
マン（Ｂｅｃｋｍａｎ） Ｌ ８−７０超遠心機内にお
いて６４，０ＯＯＸ ｇで４９時間遠心分離した。
温度は常に１０℃に維持した。最上部フラクションを除
去し、ＺＲ−Ｔと名付けた。
去し、ＺＲ−Ｔと名付けた。
小麦胚ｒ集素分画化
小麦胚凝集素アガロース（ｖｅｃｔｏｒ ｌ ａｂ）を
小さなカラム中に２ｍ９．の体積で詰めた。セファクル
３−３００カラムおよびコンコナバニン（ｃｏｎｃｏｎ
ａｖａｌｉｎ） Ａ−セファロースカラムに４０倍淵縮
ＺＲ−７５−１Ｂ培地を通ずことによって部分純化した
△Ｆ−１を調製した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）ヰに入れ
た部分純化ＡＦ−１を１ｍｕ／６ｍ１ｎの速度でゆっく
りと小麦胚凝集累カラム上に載せた。
小さなカラム中に２ｍ９．の体積で詰めた。セファクル
３−３００カラムおよびコンコナバニン（ｃｏｎｃｏｎ
ａｖａｌｉｎ） Ａ−セファロースカラムに４０倍淵縮
ＺＲ−７５−１Ｂ培地を通ずことによって部分純化した
△Ｆ−１を調製した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）ヰに入れ
た部分純化ＡＦ−１を１ｍｕ／６ｍ１ｎの速度でゆっく
りと小麦胚凝集累カラム上に載せた。
溶離液を７ラクシヨンとして集め、カラムをＰＢＳ、
１０ｍ Ｍ、 ５０ｍ Ｍ、 １００ｍＭ、および５０
０ｍＭのＮ−アセチルグルコサミンＰＢＳ溶液で連続し
て洗浄した。フラクションは蒸留水に対して透析し、各
フラクションを５０ｍ ｌ！ずつマイクロタイタープレ
ートの各ウェルに配し、ウェルを乾燥した。前述したよ
うに２１Ｄ Ｄ ５および２１Ｄ Ｄ ７を使用して結
合性検定を行なった。全てのＡＦ−１抗原が小麦胚擬集
素と結合した。２ｉＤ Ｄ ５抗体に対する結合性のみ
を有するＡＦ−１のフラクションが１Ｏｎ＋Ｍおよび５
０ｍ ＭのＮ−アセチルグルコサミン・を用いた際にカ
ラムから溶離された。２１ＤＤ５および２１ＤＤ７抗体
活性の双方を有するＡＦ−１は１００ｍＭを超える′ａ
度のＮ−アセチルグルコサミンを用いた場合にのみ溶離
された。
１０ｍ Ｍ、 ５０ｍ Ｍ、 １００ｍＭ、および５０
０ｍＭのＮ−アセチルグルコサミンＰＢＳ溶液で連続し
て洗浄した。フラクションは蒸留水に対して透析し、各
フラクションを５０ｍ ｌ！ずつマイクロタイタープレ
ートの各ウェルに配し、ウェルを乾燥した。前述したよ
うに２１Ｄ Ｄ ５および２１Ｄ Ｄ ７を使用して結
合性検定を行なった。全てのＡＦ−１抗原が小麦胚擬集
素と結合した。２ｉＤ Ｄ ５抗体に対する結合性のみ
を有するＡＦ−１のフラクションが１Ｏｎ＋Ｍおよび５
０ｍ ＭのＮ−アセチルグルコサミン・を用いた際にカ
ラムから溶離された。２１ＤＤ５および２１ＤＤ７抗体
活性の双方を有するＡＦ−１は１００ｍＭを超える′ａ
度のＮ−アセチルグルコサミンを用いた場合にのみ溶離
された。
Ｅ、ＡＦ−１の特色化
膜小胞の調製、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンプロット
転移、およびオートラジオグラフによる視覚化を全て前
述の通りに行なった。
転移、およびオートラジオグラフによる視覚化を全て前
述の通りに行なった。
ｒｃｈ 、 ４１．１４５１ （１９８１）による間接
４段階ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼアッセイ
をパラフィン固定■識切片中における△Ｆ−１の視覚化
のために用いた。切片をキシレンで脱パラフイン化し、
再び水和した後、０．３％過酸化水系メタノール溶液で
３０分間処理することによって内因性ペルオキシダーゼ
活性を明方した。切片は３％正常ウマ血清で２０分間処
理した後、未希釈の２１Ｄ Ｄ ５もしくは２１ＤＤ７
ハイブリドーマ上澄液もしくはジニトロフェノール（Ｄ
ＨＫ ＞に対するモノクローナル抗体を含有するコン
トロール上澄液と共に３０分間インキュベートした。次
いで、希釈率１：１０００のウサギ抗マウス［＋ Ｇ、
ｎ釈率’ｌ ： ２００のヒツジ抗ウサギＩｇＧ、およ
び希釈率１： １０００のウサギ抗ベルオギシダーゼ／
ペルオキシダーゼ複合体と共に３０分間のインキュベー
ションを行なった。抗体の各インキュベーションの間に
は１０分間の緩衝液洗浄を行なった。最後に切片を０．
０１％の過酸化水素と０．０５％のジアミノベンジンと
共に５分間インキュベーションするとアッセイによって
抗体が検出された場所の全てに茶色の沈澱が得られた。
４段階ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼアッセイ
をパラフィン固定■識切片中における△Ｆ−１の視覚化
のために用いた。切片をキシレンで脱パラフイン化し、
再び水和した後、０．３％過酸化水系メタノール溶液で
３０分間処理することによって内因性ペルオキシダーゼ
活性を明方した。切片は３％正常ウマ血清で２０分間処
理した後、未希釈の２１Ｄ Ｄ ５もしくは２１ＤＤ７
ハイブリドーマ上澄液もしくはジニトロフェノール（Ｄ
ＨＫ ＞に対するモノクローナル抗体を含有するコン
トロール上澄液と共に３０分間インキュベートした。次
いで、希釈率１：１０００のウサギ抗マウス［＋ Ｇ、
ｎ釈率’ｌ ： ２００のヒツジ抗ウサギＩｇＧ、およ
び希釈率１： １０００のウサギ抗ベルオギシダーゼ／
ペルオキシダーゼ複合体と共に３０分間のインキュベー
ションを行なった。抗体の各インキュベーションの間に
は１０分間の緩衝液洗浄を行なった。最後に切片を０．
０１％の過酸化水素と０．０５％のジアミノベンジンと
共に５分間インキュベーションするとアッセイによって
抗体が検出された場所の全てに茶色の沈澱が得られた。
全ての組織標本はペンシルバニア州セイアの刀スリーク
リニックのケネス・タイヤ−１専士（Ｄｒ 、 Ｋｅｎ
ｎｅｔｈ Ｍｅｙｅｒ ｏｆ Ｑｕｔｈｒｉｅ Ｃｌ１
ｎｉｃ 、 ３ ａｙｒｅ、 Ｐ ｅｎｎｓｙｌｖａｎ
ｉａ ）もしくはニコーヨーク州エルマイラのアーノッ
ト・オグデン病院のチャールズ・クオネン博士（Ｄｒ
、 ＣｈａｒｌｅｓＫｕｏｎｅｎ ｏｆＡｒｎｏｔ−Ｏ
ｇｄｅｎ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ 、 Ｅｌｍｉｒａ 、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）から提供されたものである。
リニックのケネス・タイヤ−１専士（Ｄｒ 、 Ｋｅｎ
ｎｅｔｈ Ｍｅｙｅｒ ｏｆ Ｑｕｔｈｒｉｅ Ｃｌ１
ｎｉｃ 、 ３ ａｙｒｅ、 Ｐ ｅｎｎｓｙｌｖａｎ
ｉａ ）もしくはニコーヨーク州エルマイラのアーノッ
ト・オグデン病院のチャールズ・クオネン博士（Ｄｒ
、 ＣｈａｒｌｅｓＫｕｏｎｅｎ ｏｆＡｒｎｏｔ−Ｏ
ｇｄｅｎ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ 、 Ｅｌｍｉｒａ 、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）から提供されたものである。
抗原の純化
抗原は」８地内に流し込まれるものであり、膜の可溶化
が不必要であるため、増殖ＭＣＦ−７細胞から集めた培
地を選択した。老廃培地（１，６リツ１ヘル）はｏ ’
ｃにおいて硫酸アンモニウムを用いて５０％飽和させた
。抗原含有沈澱物は遠心分離によって集め、１３０ｍ１
のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に再溶解した。ＰＢＳに
対する透析の後、体積か８０ｍ１ に達した際に沈澱物
が形成したために混合物濃縮の試みを中止した。部分的
に濃縮した溶液のうらの２０ｍ ｌをセファクリルＳ−
３００ゲル濾過カラムに通した。カラムから得た抗原性
を有するフラクションを混合し、予め２１ＤＤ５モノク
ロ−ナル抗体を共有結合させておいたアフィゲルく△ｆ
ｆ＋ｇｅｌ ） −１０カラムに通した。この親和性）
ｉラムは溶出液の２８０ｎｍにお（プる吸光度がゼロと
なるまで食塩水で洗浄した。ｐＨ２，３の硫酸グリシン
をこのカラムに通して抗原を２１Ｄ Ｄ ５抗体から分
離した。溶出物のｐＨを直ちに約７．３まで上昇させる
ため、フラクションはｐＨ８，０の２ Ｍ ＋−リス中
に集めた。このカラムから回収されＩＣ抗原性は親和純
化（ａＨｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）抗原と称し、
３−３００カラムから回収された抗原性は部分純化（ｐ
ａｒｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ）抗原と称する。
が不必要であるため、増殖ＭＣＦ−７細胞から集めた培
地を選択した。老廃培地（１，６リツ１ヘル）はｏ ’
ｃにおいて硫酸アンモニウムを用いて５０％飽和させた
。抗原含有沈澱物は遠心分離によって集め、１３０ｍ１
のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に再溶解した。ＰＢＳに
対する透析の後、体積か８０ｍ１ に達した際に沈澱物
が形成したために混合物濃縮の試みを中止した。部分的
に濃縮した溶液のうらの２０ｍ ｌをセファクリルＳ−
３００ゲル濾過カラムに通した。カラムから得た抗原性
を有するフラクションを混合し、予め２１ＤＤ５モノク
ロ−ナル抗体を共有結合させておいたアフィゲルく△ｆ
ｆ＋ｇｅｌ ） −１０カラムに通した。この親和性）
ｉラムは溶出液の２８０ｎｍにお（プる吸光度がゼロと
なるまで食塩水で洗浄した。ｐＨ２，３の硫酸グリシン
をこのカラムに通して抗原を２１Ｄ Ｄ ５抗体から分
離した。溶出物のｐＨを直ちに約７．３まで上昇させる
ため、フラクションはｐＨ８，０の２ Ｍ ＋−リス中
に集めた。このカラムから回収されＩＣ抗原性は親和純
化（ａＨｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）抗原と称し、
３−３００カラムから回収された抗原性は部分純化（ｐ
ａｒｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ）抗原と称する。
ΔＦ−１の炭水化物および蛋白質含量
親和純化抗原はロウクー法によって蛋白質を測定シ、７
工、／ −）Ｌｉ−硫酸法［Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔａｌ
、 ／Ａｎａ工１ 、 Ｃｈｅｍ 、 ２８． ３５０
（１９５６） ：］によって総糖分含量を測定した。
工、／ −）Ｌｉ−硫酸法［Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔａｌ
、 ／Ａｎａ工１ 、 Ｃｈｅｍ 、 ２８． ３５０
（１９５６） ：］によって総糖分含量を測定した。
このような測定の結果は蛋白質１３２μｇ／ｍＱおよび
糖分３００μｇ／ｍえであった。
糖分３００μｇ／ｍえであった。
これらの結果から、ＡＦ−１は糖蛋白質であると考えら
れるが、炭水化物と蛋白質との割り合は確立されていな
い。
れるが、炭水化物と蛋白質との割り合は確立されていな
い。
アルカリ処理
部分純化抗原はセリンおよび／もしくはスレオニン部と
炭水化物部との間の○−グリコシド結合を分割するβ−
除去反応の影響を受（プるか否かを測定するために一＠
４°Ｃにおいて０．ＩＮ水酸化ナトリウムで処理しｌＣ
０ このような穏やかなアルカリ処理により、より小さな分
子量の形態に関連づけられるべき抗原性が生じ、炭水化
物ユニットが少なくとも部分的にはＯ−グルコシド結合
によって蛋白質の主鎖に、恐らくはセリンもしくはスレ
オニンに結合していることが示された。
炭水化物部との間の○−グリコシド結合を分割するβ−
除去反応の影響を受（プるか否かを測定するために一＠
４°Ｃにおいて０．ＩＮ水酸化ナトリウムで処理しｌＣ
０ このような穏やかなアルカリ処理により、より小さな分
子量の形態に関連づけられるべき抗原性が生じ、炭水化
物ユニットが少なくとも部分的にはＯ−グルコシド結合
によって蛋白質の主鎖に、恐らくはセリンもしくはスレ
オニンに結合していることが示された。
注入されたＡＦ−１の分子量測定
ＺＲ−７５−１Ｂ細胞を増殖させた組織培養培地は１０
分間５００ｘ ｇで遠心分離して細胞を除去した後、４
５分間４８，０００ｘ ｇで遠心分離した。ペレット化
した物質には全てΔＦ−１活性が認められた。
分間５００ｘ ｇで遠心分離して細胞を除去した後、４
５分間４８，０００ｘ ｇで遠心分離した。ペレット化
した物質には全てΔＦ−１活性が認められた。
このようなペレット化物質は一晩４℃において１％トリ
トン−Ｘ （、Ｔｒｉｔｏｎ −Ｘ”） １００中で可
溶化した。得られた混合物は４８，０ＯＯＸ ｇで４５
分間遠心分離し、上澄液は０．０１％のトリトン−Ｘ
１００を含有するリン酸緩衝液に対して透析した。透析
した溶液をセファクリル５−ｉｏｏカラム上に流すとＡ
Ｆ−１活性の１つのピークが得られ、公知の分子量を有
する蛋白質を用いたカラムの標準化により、このピーク
は分子量約３３，０００に対応することが明らかとなっ
た。
トン−Ｘ （、Ｔｒｉｔｏｎ −Ｘ”） １００中で可
溶化した。得られた混合物は４８，０ＯＯＸ ｇで４５
分間遠心分離し、上澄液は０．０１％のトリトン−Ｘ
１００を含有するリン酸緩衝液に対して透析した。透析
した溶液をセファクリル５−ｉｏｏカラム上に流すとＡ
Ｆ−１活性の１つのピークが得られ、公知の分子量を有
する蛋白質を用いたカラムの標準化により、このピーク
は分子量約３３，０００に対応することが明らかとなっ
た。
酵素処理
抗原を酵素処理し、次いで上述のＧ項に記載されたウサ
ギ抗ＡＦ−１ラジオイムノアッセイによってこのような
処理の効果を測定することによってＡＦ−１の特性に関
する他の情報を得た。
ギ抗ＡＦ−１ラジオイムノアッセイによってこのような
処理の効果を測定することによってＡＦ−１の特性に関
する他の情報を得た。
２１Ｄ Ｄ ５および２１ＤＤ７抗体の双方に対して２
組の結果を得るために様々な酵素処理を行なった。
組の結果を得るために様々な酵素処理を行なった。
各組において、抗体が使用されなかった際の結果を陽性
とし、酵素処理のない場合の結果を陽性コントロールと
した。このような酵素処理は３７℃で２時間行ない、そ
の後、反応混合物を５分間１００℃に加熱することによ
って酵素を不活化した。必要に応じてラジオイムノアッ
セイ実施例に水酸ナトリウム水溶液の添加によって反応
混合物のｐＨを７．４に調整した。２１Ｄ Ｄ ５の組
においてブランクはコントロールの約９％であった。２
１ＤＤ７の組においてブランクはコン１〜ロールの約７
％であった。各組においてコントロールを含む各々の結
果からブランクを引いた。
とし、酵素処理のない場合の結果を陽性コントロールと
した。このような酵素処理は３７℃で２時間行ない、そ
の後、反応混合物を５分間１００℃に加熱することによ
って酵素を不活化した。必要に応じてラジオイムノアッ
セイ実施例に水酸ナトリウム水溶液の添加によって反応
混合物のｐＨを７．４に調整した。２１Ｄ Ｄ ５の組
においてブランクはコントロールの約９％であった。２
１ＤＤ７の組においてブランクはコン１〜ロールの約７
％であった。各組においてコントロールを含む各々の結
果からブランクを引いた。
このような酵素処理の結果の重要性はこのような処理の
２１Ｄ Ｄ ５および２１Ｄ Ｄ ７決定基に対する影
ｉｔなわちコントロールに対するこのような処理の影響
である。このような効果は表１に要約されており、各酵
素処理にお（プる１分あたりの結合カウントがコントロ
ールに対する百分率で表わされている。すなわち、１０
０未満の百分率は２１ＤＤ５もしくは２１Ｄ Ｄ ７の
決定基活性の減少を示し、１００を超える百分率はその
増加を示す。
２１Ｄ Ｄ ５および２１Ｄ Ｄ ７決定基に対する影
ｉｔなわちコントロールに対するこのような処理の影響
である。このような効果は表１に要約されており、各酵
素処理にお（プる１分あたりの結合カウントがコントロ
ールに対する百分率で表わされている。すなわち、１０
０未満の百分率は２１ＤＤ５もしくは２１Ｄ Ｄ ７の
決定基活性の減少を示し、１００を超える百分率はその
増加を示す。
表 １
２１Ｄ Ｄ ５ ２１Ｄ Ｄ ７
無（コントロールシン １００ １００α−ガラクト
シダーゼ ６０６２
β−Ｎ−
氏
Ａｃｅｔｙｌ ６２ ６６
ノイラミニダーゼ １９８ ５６
α−Ｑ ａｔ／
Ｎ ｅｕｒ１′１３２ ２７
β−Ｎ −Ａ ｃｅｔｙｌ
／ Ｎ ｅｕｒ’ １１０ ２０
ａ β−Ｎ−アセチルグルコサミニターゼｂ α−ガラ
クトシダーゼおよびノイラミニーゼの同時使用 Ｃβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびノイラミ
ニダーゼの同時使用 表から明らかなように、α−カラクｌ〜シダーゼおよび
Ｑ−Ｎ−アセチルグルコザミニダーゼが２１ＤＤ５およ
び２１［）Ｄ７決定基に及はす影響はほぼ同等であった
。すなわち、両酵素はいずれの場合にもほぼ同等の効果
を有し、決定基活性を３４〜４０％減少させた。しかし
ながら、ノイラミニダーゼの効果は著しく異なっていた
。この酵素は２１ＤＤ５決定基活性をほぼ２倍としたの
に反して２１ＤＤ７決定暴活性をほぼ半分に低減した。
クトシダーゼおよびノイラミニーゼの同時使用 Ｃβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびノイラミ
ニダーゼの同時使用 表から明らかなように、α−カラクｌ〜シダーゼおよび
Ｑ−Ｎ−アセチルグルコザミニダーゼが２１ＤＤ５およ
び２１［）Ｄ７決定基に及はす影響はほぼ同等であった
。すなわち、両酵素はいずれの場合にもほぼ同等の効果
を有し、決定基活性を３４〜４０％減少させた。しかし
ながら、ノイラミニダーゼの効果は著しく異なっていた
。この酵素は２１ＤＤ５決定基活性をほぼ２倍としたの
に反して２１ＤＤ７決定暴活性をほぼ半分に低減した。
α−ガラクトシダーゼとノイラミニダーゼの組合せおよ
びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニタ゛−ゼとノイラミニ
ダーゼの組合せによる２１ＤＤ７決定基活性に対する効
果はいかなる単一の酵素処理よりも大きかった。しかし
ながら、２１ＤＤ５決定基活性におりる最終的な活性は
ノイラミニダーゼ処理のみの場合よりかなり低いものの
コントロールよりは高かった。
びβ−Ｎ−アセチルグルコサミニタ゛−ゼとノイラミニ
ダーゼの組合せによる２１ＤＤ７決定基活性に対する効
果はいかなる単一の酵素処理よりも大きかった。しかし
ながら、２１ＤＤ５決定基活性におりる最終的な活性は
ノイラミニダーゼ処理のみの場合よりかなり低いものの
コントロールよりは高かった。
抗原の位置
様々な型の乳房上皮細胞膜小胞を２１Ｄ Ｄ ５および
２１ＤＤ７決定基活性に対するマイクロタイタープレー
トアッセイによって分析し、結果を表Ｈに示した。アッ
セイを行なった各ウェルは全ての場合において３μｑの
蛋白質を含有していたため、小胞調製間で相対比較をす
ることか可能である。
２１ＤＤ７決定基活性に対するマイクロタイタープレー
トアッセイによって分析し、結果を表Ｈに示した。アッ
セイを行なった各ウェルは全ての場合において３μｑの
蛋白質を含有していたため、小胞調製間で相対比較をす
ることか可能である。
例えばインビトロの細胞系である７Ｒ−７５−１８およ
びＭＣＦ−７は乳房切除サンプルよりも多くの両決定基
を含有するように見えるが、物質の供給源を考慮しなけ
ればならない９．細胞系調製物の全ては腫もしくは少な
（とも形質転換された細胞であるが、乳房切除サンプル
は胛および「正常」上皮細胞および非上皮起源細胞を含
んでいる。この複洛１性にも拘らず、恐らくはＢＭｌｏ
を除く全ての乳房上皮細胞膜はい（らかの抗原を含有し
ていることが認められる。また、このような結果はＢΦ
細胞膜のみならず、ｌ−Ｉ Ｍ Ｆ Ｇ Ｐに対する結
合によって示されるように正常細胞上にも抗原の生ずる
ことを示している。
びＭＣＦ−７は乳房切除サンプルよりも多くの両決定基
を含有するように見えるが、物質の供給源を考慮しなけ
ればならない９．細胞系調製物の全ては腫もしくは少な
（とも形質転換された細胞であるが、乳房切除サンプル
は胛および「正常」上皮細胞および非上皮起源細胞を含
んでいる。この複洛１性にも拘らず、恐らくはＢＭｌｏ
を除く全ての乳房上皮細胞膜はい（らかの抗原を含有し
ていることが認められる。また、このような結果はＢΦ
細胞膜のみならず、ｌ−Ｉ Ｍ Ｆ Ｇ Ｐに対する結
合によって示されるように正常細胞上にも抗原の生ずる
ことを示している。
表 ■
２１ Ｄ Ｄ ５ Ｊ５ ｃｌ： Ｕ ２１ Ｄ Ｄ
７４Ｒ，Ｗ ｔ Ｉ−Ｘ ｒ’Ａ ｔ ６ ／Ｊ’ Ｒ
”Ｎ製物のラジオイムノアッセイ 小胞供給源 ＣＰＭ結合 Ｚ Ｒ−７５−１８ｂ６２０ ３，４３４ ４．６７８
Ｍ ＣＦ −７ｂ３９６ ２，２２６ ４．７７０８Ｍ
８° ５５７ ２，０４２ １，４９６８ Ｍ １０’
４９８ ５８４ ４２１８Ｍ１２Ｃ７０７２，００７
１，９１２８Ｍ １４° ４１１ １，２４６ ２．５
９０１−Ｉ Ｍ Ｆ Ｇ Ｐｄ４１３ ８９２ １，７
７０ａ ＤＨＫ−ジニトロフェニール抗体を産生ずるハ
イブリドーマ １） インビトロ乳肝細胞系 Ｃガスリークリニック由来の乳房切除組織サンプル （ｌ ｌ−Ｉ Ｍ Ｆ Ｇ Ｐ−ヒト乳脂肪球蛋白質こ
れらと同一の小胞調製物に対して５ＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びウェスタンプロット法を用い、次いでラジオグラフに
よる視覚化によって同様の分析を行なった。小胞調製物
をＳＤＳ処理し、アッセイに先立って還元条件とするこ
とによって抗原検出に干渉するような抗原−抗体複合体
は全て分前づることができた。ざらに、これらの１稈に
よって各調製物におりる抗原形態の分子量に関する情報
が得られた。ラジオグラフの最も顕箸な特徴は様々な小
胞調製物における抗原の分子形状の差異であった。ＺＲ
−７５−１ＢおよびＭＣＦ−７小胞はいずれも３つの形
状の抗原を有していたが、ＭＣＦ−７はＺＲ−７５−１
Ｂよりも大きな分子量の形状を有していた。この差はＺ
Ｒ−７５−１Ｂ調製物に出現する最小の形態がＭＣＦ、
７７調製物中には極わずかしか検出され得なかったこと
から恐らく減成に起因するものと考えられた。予想通り
、ＭＥ−１８０小胞〈頚管）は抗原を有していなかった
。４つの乳房切除小胞調製物のうち３つは抗原の分子形
態を２つ有しており、これらはいずれも７Ｒ−７５−１
ＢもしくはＭＣＦ−７小胞調製物のその形態と同じ位置
にバンドを形成するものではなかった。８Ｍ１０小胞調
製物は２１Ｄ Ｄ ５活性が検出できないという点で他
と異なっているが、２１ＤＤ７活性はＺＲ−７５−ＩＢ
およびＭＣＦ−７調製物の中位バンドと同様の位置に１
本のバンドとして存在した。ＨＭＦＧ調製物はこれと同
一のバンドを２１ＤＤ７に関して有していたが、２１Ｄ
Ｄ５活性に関してはより大きな分子形態しか有していな
かった。ＭＣＦ−７培地から分離した親和純化抗原はＭ
ＣＦ−７調製物の最も高いバンドに対応した。プレート
した小胞調製物のラジオイムノアッセイで得た相対的な
値とは必ずしも相関関係のない主要な量的差異が認めら
れた。例えば、ウェスタンプロットにおいてはＨＭＦＧ
調製物は２１Ｄ Ｄ５活性よりも大きな２１ＤＤ７活性
を示したが、ラジオイムノアッセイでは正反対であった
。
７４Ｒ，Ｗ ｔ Ｉ−Ｘ ｒ’Ａ ｔ ６ ／Ｊ’ Ｒ
”Ｎ製物のラジオイムノアッセイ 小胞供給源 ＣＰＭ結合 Ｚ Ｒ−７５−１８ｂ６２０ ３，４３４ ４．６７８
Ｍ ＣＦ −７ｂ３９６ ２，２２６ ４．７７０８Ｍ
８° ５５７ ２，０４２ １，４９６８ Ｍ １０’
４９８ ５８４ ４２１８Ｍ１２Ｃ７０７２，００７
１，９１２８Ｍ １４° ４１１ １，２４６ ２．５
９０１−Ｉ Ｍ Ｆ Ｇ Ｐｄ４１３ ８９２ １，７
７０ａ ＤＨＫ−ジニトロフェニール抗体を産生ずるハ
イブリドーマ １） インビトロ乳肝細胞系 Ｃガスリークリニック由来の乳房切除組織サンプル （ｌ ｌ−Ｉ Ｍ Ｆ Ｇ Ｐ−ヒト乳脂肪球蛋白質こ
れらと同一の小胞調製物に対して５ＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びウェスタンプロット法を用い、次いでラジオグラフに
よる視覚化によって同様の分析を行なった。小胞調製物
をＳＤＳ処理し、アッセイに先立って還元条件とするこ
とによって抗原検出に干渉するような抗原−抗体複合体
は全て分前づることができた。ざらに、これらの１稈に
よって各調製物におりる抗原形態の分子量に関する情報
が得られた。ラジオグラフの最も顕箸な特徴は様々な小
胞調製物における抗原の分子形状の差異であった。ＺＲ
−７５−１ＢおよびＭＣＦ−７小胞はいずれも３つの形
状の抗原を有していたが、ＭＣＦ−７はＺＲ−７５−１
Ｂよりも大きな分子量の形状を有していた。この差はＺ
Ｒ−７５−１Ｂ調製物に出現する最小の形態がＭＣＦ、
７７調製物中には極わずかしか検出され得なかったこと
から恐らく減成に起因するものと考えられた。予想通り
、ＭＥ−１８０小胞〈頚管）は抗原を有していなかった
。４つの乳房切除小胞調製物のうち３つは抗原の分子形
態を２つ有しており、これらはいずれも７Ｒ−７５−１
ＢもしくはＭＣＦ−７小胞調製物のその形態と同じ位置
にバンドを形成するものではなかった。８Ｍ１０小胞調
製物は２１Ｄ Ｄ ５活性が検出できないという点で他
と異なっているが、２１ＤＤ７活性はＺＲ−７５−ＩＢ
およびＭＣＦ−７調製物の中位バンドと同様の位置に１
本のバンドとして存在した。ＨＭＦＧ調製物はこれと同
一のバンドを２１ＤＤ７に関して有していたが、２１Ｄ
Ｄ５活性に関してはより大きな分子形態しか有していな
かった。ＭＣＦ−７培地から分離した親和純化抗原はＭ
ＣＦ−７調製物の最も高いバンドに対応した。プレート
した小胞調製物のラジオイムノアッセイで得た相対的な
値とは必ずしも相関関係のない主要な量的差異が認めら
れた。例えば、ウェスタンプロットにおいてはＨＭＦＧ
調製物は２１Ｄ Ｄ５活性よりも大きな２１ＤＤ７活性
を示したが、ラジオイムノアッセイでは正反対であった
。
パラフィン固定組織サンプル中における抗原の位置の直
接視覚化はイムノペルオキシダーゼアッセイによって得
た。表■に示す通り、これらのアッセイは試験された全
ての乳房組織が上皮細胞上に局在した抗原を担持してい
ることを示した点で小胞調製物で得た結果を立証するも
のであった。
接視覚化はイムノペルオキシダーゼアッセイによって得
た。表■に示す通り、これらのアッセイは試験された全
ての乳房組織が上皮細胞上に局在した抗原を担持してい
ることを示した点で小胞調製物で得た結果を立証するも
のであった。
良性乳房組織もしくは正常上皮細胞は管腔に隣接した頂
端表面に局在した抗原を有しているようであった。腫細
胞はより多くの抗原を有してａ５す、抗原は頂端表面の
みならず全ｍ飽にわたって存在しているようであった。
端表面に局在した抗原を有しているようであった。腫細
胞はより多くの抗原を有してａ５す、抗原は頂端表面の
みならず全ｍ飽にわたって存在しているようであった。
多くの場合、２１ＤＤ７で得た染色は２１ＤＤ５で得た
ものよりも大きかった。
ものよりも大きかった。
抗原はこれまで試験した組織のうち皮脂腺、卵巣。
肺、腎臓および子宮頚内膜組織内に存在することが見出
された。
された。
表 ■
組織における２１Ｄ Ｄ ５ ／２１Ｄ Ｄ ７活性の
位置測定良性乳房−１災患（＋− ＋ 乳 腫 （７） ＋ 転移性乳腫（３） ＋ 正常皮膚（２） − 皮膚腫一皮脂腺 ＋ １ 常 頚 管 − 正常子宮頚管一管腔上皮 十 侵入性頚管腫 − 子 宮 腫 十 腎 腫 十 腸 腫 − 正 常 膵 臓 − 正 常 心 臓 − 正 常 肺 ＋ １ 常 肝 臓 − 正 常 牌 臓 − ａ 括弧内の数字は試験されたこの型の組織の数を示す
。
位置測定良性乳房−１災患（＋− ＋ 乳 腫 （７） ＋ 転移性乳腫（３） ＋ 正常皮膚（２） − 皮膚腫一皮脂腺 ＋ １ 常 頚 管 − 正常子宮頚管一管腔上皮 十 侵入性頚管腫 − 子 宮 腫 十 腎 腫 十 腸 腫 − 正 常 膵 臓 − 正 常 心 臓 − 正 常 肺 ＋ １ 常 肝 臓 − 正 常 牌 臓 − ａ 括弧内の数字は試験されたこの型の組織の数を示す
。
最後に発癌抗原（ＣＥＡ） 、ヘパリン、およびＩｉ！
酸コントロイヂンを用いてウェスタンプロットを行なっ
たが、いずれも２１ＤＤ５抗体に対していかなる反応性
も示さなかった。
酸コントロイヂンを用いてウェスタンプロットを行なっ
たが、いずれも２１ＤＤ５抗体に対していかなる反応性
も示さなかった。
したがって、２１１）Ｄ５および２１ＤＤ７モノクロー
ナル抗体は同一の抗原分子に特異的に結合するが、その
異なった決定基を検出するものと考えられる。抗原は明
らかに上皮１飽起源のものであり、乳房、子宮頚管、お
よび卵巣等のような正常な分泌組織に主として関係して
いるものと考えられる。
ナル抗体は同一の抗原分子に特異的に結合するが、その
異なった決定基を検出するものと考えられる。抗原は明
らかに上皮１飽起源のものであり、乳房、子宮頚管、お
よび卵巣等のような正常な分泌組織に主として関係して
いるものと考えられる。
抗原上の２１Ｄ Ｄ ７決定基のｈ（は乳腫の存在によ
って増加する。
って増加する。
Ｆ、エストロゲン刺激試験
要約すれば、デキストランコートした木炭で処理してス
テロイドを除去した１０％のウシ胎児血清（ＤＣＣ，−
Ｆｅ２）にＺ Ｒ−７５−１ＢＩＩＩＩ胞を５日間さら
すことによってステロイドを枯渇させた。
テロイドを除去した１０％のウシ胎児血清（ＤＣＣ，−
Ｆｅ２）にＺ Ｒ−７５−１ＢＩＩＩＩ胞を５日間さら
すことによってステロイドを枯渇させた。
次いで、この枯渇細胞に１０（Ｉ Ｍ （１７β）−エ
ストラジオールを含有するＤＣＣ−Ｆｅ２を２日、６日
、もしくは９日間再供給し、ざらに無血清下で３日間ホ
ルモンにさらした。コントロールとしては枯渇細胞にＤ
ＣＣ−Ｆｅ２のみを２日、６日。
ストラジオールを含有するＤＣＣ−Ｆｅ２を２日、６日
、もしくは９日間再供給し、ざらに無血清下で３日間ホ
ルモンにさらした。コントロールとしては枯渇細胞にＤ
ＣＣ−Ｆｅ２のみを２日、６日。
もしくは９日間再供給した後、無血清培地を３日間供給
した。細胞は溶解し、細胞蛋白質は５〜１６％５ＤＳ−
ＰＡＣｉＥで処理し、前述のウェスタンプロット転移法
を行なった。オートグラフによる視覚化において前述の
ように２１Ｄ Ｄ ５および２１ＤＤ７抗体を用いた。
した。細胞は溶解し、細胞蛋白質は５〜１６％５ＤＳ−
ＰＡＣｉＥで処理し、前述のウェスタンプロット転移法
を行なった。オートグラフによる視覚化において前述の
ように２１Ｄ Ｄ ５および２１ＤＤ７抗体を用いた。
細胞はホルモンにさらした後５日日、９日目、および１
２日日日サンプリングした。培地は１２日日日サンプリ
ングした。
２日日日サンプリングした。培地は１２日日日サンプリ
ングした。
これらの実験によれば１０−８Ｍ（１７β）−エストラ
ジオールが培地内に増殖した乳癌細胞中の２１ＤＤ５決
定基の蓄積を刺激し、また２１ＤＤ５決定基に富んだ抗
原は培地内に取り込まれたことが明らかとなった。ＺＲ
−７５−１Ｂ細胞内においてエストロゲン効果は主とし
て細胞と関連する。使用された実験条件下においては比
較的小量の２１ＤＤ決定基に富んだ抗原が培地内に取り
込まれたが、培地内において測定可能であれば細胞によ
って取り込まれた量もまたエストロゲンによって刺激さ
れた。ＭＣＦ−７細胞系においてはエストロゲンは培地
内に取り込まれる抗原を極めてより多く増大する。２１
ＤＤ’５決定基はニストロジエンによって最初（２日日
）は細胞内で刺激され、次いで細胞から減少し、培地内
で（５日日に）蓄積が増大するようであった。エストロ
ゲンは２１ＤＤ７決定基増大させるものとは考えられな
かった。
ジオールが培地内に増殖した乳癌細胞中の２１ＤＤ５決
定基の蓄積を刺激し、また２１ＤＤ５決定基に富んだ抗
原は培地内に取り込まれたことが明らかとなった。ＺＲ
−７５−１Ｂ細胞内においてエストロゲン効果は主とし
て細胞と関連する。使用された実験条件下においては比
較的小量の２１ＤＤ決定基に富んだ抗原が培地内に取り
込まれたが、培地内において測定可能であれば細胞によ
って取り込まれた量もまたエストロゲンによって刺激さ
れた。ＭＣＦ−７細胞系においてはエストロゲンは培地
内に取り込まれる抗原を極めてより多く増大する。２１
ＤＤ’５決定基はニストロジエンによって最初（２日日
）は細胞内で刺激され、次いで細胞から減少し、培地内
で（５日日に）蓄積が増大するようであった。エストロ
ゲンは２１ＤＤ７決定基増大させるものとは考えられな
かった。
２１ＤＤ５決定基のエストロゲン刺激はエストロゲン操
作に反応するＩＩ！Ｉ！瘍を有する乳癌患右の同定にと
って有用となるものである。２１Ｄ Ｄ ５決定基のよ
うなエストロゲンで変化する最終産物を用いた場合、エ
ストロゲンが腫瘍（癌）の成長を制御する能力を鑑みれ
ば、７５〜８０％という従来技術の方法の精度よりもよ
り決定的な診断が可能であろう。
作に反応するＩＩ！Ｉ！瘍を有する乳癌患右の同定にと
って有用となるものである。２１Ｄ Ｄ ５決定基のよ
うなエストロゲンで変化する最終産物を用いた場合、エ
ストロゲンが腫瘍（癌）の成長を制御する能力を鑑みれ
ば、７５〜８０％という従来技術の方法の精度よりもよ
り決定的な診断が可能であろう。
Ｇ、乳癌の診断および予後
２１ＤＤ５おにび２１Ｄ Ｄ ７抗体によって認識され
る２つの決定基の測定を可能とするイムノアッセイを行
なうため、多価ハ種つサギ抗血消を形成した。要約すれ
は、等体積の完全フロインドアジュバント中に此化した
１００μ応の標準ＡＦ−１調製物でウサギを免疫した。
る２つの決定基の測定を可能とするイムノアッセイを行
なうため、多価ハ種つサギ抗血消を形成した。要約すれ
は、等体積の完全フロインドアジュバント中に此化した
１００μ応の標準ＡＦ−１調製物でウサギを免疫した。
免疫化は３回繰返し、最後の注射の７日後につ４ツギの
川から放血を行なった。抗血清由来の抗体は部分純化し
たΔＦ−，１の８１フラクシヨン（Ｄ項参照）を結合し
たセフアローズＣｌ−１カラム上で親和純化した。
川から放血を行なった。抗血清由来の抗体は部分純化し
たΔＦ−，１の８１フラクシヨン（Ｄ項参照）を結合し
たセフアローズＣｌ−１カラム上で親和純化した。
これらの親和純化した抗体を以下のラジオイムノアッセ
イにおける固定相として用いた場合、２１ＤＤ５もしく
は２１ＤＤ７抗体の使用により、このようなウサギ抗体
に袖板された特定の決定基を含有する分子の早を測定す
ることが可能となった。
イにおける固定相として用いた場合、２１ＤＤ５もしく
は２１ＤＤ７抗体の使用により、このようなウサギ抗体
に袖板された特定の決定基を含有する分子の早を測定す
ることが可能となった。
以下に記載する結果は、２１ＤＤ７決定基活性の絶対量
および２１ＤＤ７決定基活性の２１ＤＤ５決定阜活性に
対する割合の双方が進行乳癌の指標を与えるものである
ことを示している。
および２１ＤＤ７決定基活性の２１ＤＤ５決定阜活性に
対する割合の双方が進行乳癌の指標を与えるものである
ことを示している。
５５人の異なった個体から得た血漿サンプルを試験した
。２７サンプルは正常な女性もしくは食性の乳疾患を有
する女性に由来するもめであり、２８サンプルは乳癌も
しくは他の癌忠者に由来するものであった。
。２７サンプルは正常な女性もしくは食性の乳疾患を有
する女性に由来するもめであり、２８サンプルは乳癌も
しくは他の癌忠者に由来するものであった。
モノクローナル抗体
２１Ｄ Ｄ ５および２１Ｄ Ｄ ７抗体の形成は前述
の通りである。全ての抗体は老廃培地上澄液の最適な希
釈液として用いた。
の通りである。全ての抗体は老廃培地上澄液の最適な希
釈液として用いた。
Ｆ−１
前述した手順にほぼ従って、７Ｒ−７５−ＩＢ細胞老廃
」上澄液から標準抗原調製物を得た。要約すれば、老廃
培地を５０％硫酸アンモニウムで沈澱させた。沈澱物を
集め、再可溶化し、セファ・クリルＳ−３００カラムで
分画した。排除したフラクションはΔＦ−１活性につい
てスクリーニングを行ない、２１ＤＤ５決定基活性を含
むフラクションをプールした。プールした物質は２１１
］）５抗体カラム上のアフイニテイクロマトクラフイー
で純化し、ＰＨ２，３の０．２Ｍ硫酸グリシンによる溶
離液をこの実験に用いる純化へＦ−１とした。
」上澄液から標準抗原調製物を得た。要約すれば、老廃
培地を５０％硫酸アンモニウムで沈澱させた。沈澱物を
集め、再可溶化し、セファ・クリルＳ−３００カラムで
分画した。排除したフラクションはΔＦ−１活性につい
てスクリーニングを行ない、２１ＤＤ５決定基活性を含
むフラクションをプールした。プールした物質は２１１
］）５抗体カラム上のアフイニテイクロマトクラフイー
で純化し、ＰＨ２，３の０．２Ｍ硫酸グリシンによる溶
離液をこの実験に用いる純化へＦ−１とした。
１九り蜆Ｎ二二１久’＞ｉ＃Ａム乙ム回光ウサつ抗ＡＦ
−１はＳ１親和性ツノラムから回収した未濃縮ストック
溶液の１：２希釈液として用いた。血漿は１％ウシ血清
アルブミンを含有するリン酸緩衝溶液で １．２． １
．４．もしくは１．８倍に希釈した。２１ＤＤ５抗体は
ハイブリドーマ培地上澄液の１：１０希釈液として用い
、２１Ｄ Ｄ ７抗体・（よ１：５希釈液として用いた
。ウサギ抗マウスＩｇは約５ Ｘ １１０６Ｃｐ ／μ
３の比活性を有するものを用いた。
−１はＳ１親和性ツノラムから回収した未濃縮ストック
溶液の１：２希釈液として用いた。血漿は１％ウシ血清
アルブミンを含有するリン酸緩衝溶液で １．２． １
．４．もしくは１．８倍に希釈した。２１ＤＤ５抗体は
ハイブリドーマ培地上澄液の１：１０希釈液として用い
、２１Ｄ Ｄ ７抗体・（よ１：５希釈液として用いた
。ウサギ抗マウスＩｇは約５ Ｘ １１０６Ｃｐ ／μ
３の比活性を有するものを用いた。
検定を行なうため、ポリビニルマイクロタイタープレー
トの各ウェルを５０μ免のウサギ抗ＡＦ−１でコートし
た。プレートは４℃で一晩インキユベートした。つ■ル
はＰＨ７，４のリン酸緩衝溶液で１回洗浄した後、非特
貨性部位を封鎖するために１％ウシ血清アルブミンを含
有するｐＨ７，４のリンＭ緩衝溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ）
に浸した。次いで各ウェルに純化した５０μ池のΔＦ−
１溶液を添加した。プレートは３７℃で４５分間インキ
ュベートした。ウェルはＢＳＡ−ＰＢＳで４回洗浄した
。各ウェルに適当なモノクローナル抗体溶液（２１ＤＤ
５もしくは２１Ｄ Ｄ ７ ）を５０μ応添加した。プ
レートは再び３７℃で４５分間インキュベートし、次い
でＢＳＡ−ＰＢＳで４回洗浄した。１００，０００ｃｐ
ｍの１２５■−標識化ウサギ抗マウスＩ（ｌを含有する
５０μ免のＢＳＡ−ＰＢＳを各ウェルに添加しＩＣ、プ
レートは３７℃で４５分間、３回目のインキュベートを
行なった。以前と同様にプレートを４回洗浄した後、各
ウェルの１分あたりの結合カウントを測定した。
トの各ウェルを５０μ免のウサギ抗ＡＦ−１でコートし
た。プレートは４℃で一晩インキユベートした。つ■ル
はＰＨ７，４のリン酸緩衝溶液で１回洗浄した後、非特
貨性部位を封鎖するために１％ウシ血清アルブミンを含
有するｐＨ７，４のリンＭ緩衝溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ）
に浸した。次いで各ウェルに純化した５０μ池のΔＦ−
１溶液を添加した。プレートは３７℃で４５分間インキ
ュベートした。ウェルはＢＳＡ−ＰＢＳで４回洗浄した
。各ウェルに適当なモノクローナル抗体溶液（２１ＤＤ
５もしくは２１Ｄ Ｄ ７ ）を５０μ応添加した。プ
レートは再び３７℃で４５分間インキュベートし、次い
でＢＳＡ−ＰＢＳで４回洗浄した。１００，０００ｃｐ
ｍの１２５■−標識化ウサギ抗マウスＩ（ｌを含有する
５０μ免のＢＳＡ−ＰＢＳを各ウェルに添加しＩＣ、プ
レートは３７℃で４５分間、３回目のインキュベートを
行なった。以前と同様にプレートを４回洗浄した後、各
ウェルの１分あたりの結合カウントを測定した。
各アッセイは３回ずつ行ない、結果は平均上標準偏差で
示した。
示した。
患者の血漿サンプルは通常ヘパリン処理した管に採取し
、直ちにアリコート化して一７０°Ｃで凍結した。若干
のサンプルは以前の実験に由来するもので、そのうちの
いくつかは数回の凍結−解凍ナイクルを経たものであっ
た。一般に凍結および解凍による明白な結果の変動は認
められなかった。
、直ちにアリコート化して一７０°Ｃで凍結した。若干
のサンプルは以前の実験に由来するもので、そのうちの
いくつかは数回の凍結−解凍ナイクルを経たものであっ
た。一般に凍結および解凍による明白な結果の変動は認
められなかった。
最初の実験においては正常な３検体、良性乳房疾患の３
検体、および第４段階の乳癌患者４検体に由来する血漿
をアッセイにおいて試験した。系は１連のＡＦ−１希釈
液（１：２０〜１ ： １６０）を１つのプレート上に
流し、これら希釈液のうちの２つ（１：２０および”ｌ
：８０）を全ての隣接したプレートに流すことによって
内部標準化した。この結果、各プレートの特性に対して
内部コントロールが得られ、結合性には２０〜２５％以
下の変動が生じたが、多くのプレートはこのような変動
よりも互いにより近くなった。血漿Ｎ０１１および１４
は同一の女性に出来する連続した放血であり、極めて類
似した結果を示した。いかなる統泪操作においてもＮｏ
、１１のみが包含される。表ＩＶにおりるデータは３回
の測定の平均値であり、同様の結合値を与えるへＦ−１
ス１へツクの希釈率の逆数として表わした。次いでこの
値を希釈率に換算した。各特性に対する値を１００倍す
るとΔＦ−１ストック中に存在する抗原の百分率が表わ
される。また、２１ＤＤ５／２１ＤＤ７比を希釈率１：
４の各血漿において計算した。正常もしくは良性乳房疾
患＠壱〇検体において得た比は１．９１〜２．５０で平
均は２．１８±０．２０５ （Ｓ Ｄ ）であった。こ
れに対し、第４段階の乳癌患者に由来する血漿において
この値は２．７５〜５６．６で平均は２２．１２±２５
．３ （・Ｓ Ｄ ＞であった。この限定的な実験にお
いてこれらの範囲は全く重複せず、コントロール群で得
られた値の分布は極めて狭かった。２１ＤＤ７値をそれ
だけで比較すると癌患者に由来する血漿は高い値の２１
ＤＤ７を有しているが、血漿Ｎｏ、１３は明らかに正常
群領域に入る値を示した。これら２つの群の間における
２１Ｄ Ｄ ７値の差は小さい。この結果から、２１Ｄ
Ｄ５決定基は正常組織抗原を反映するものであり、２１
ＤＤ７決定基の増加もしくは２１ＤＤ７決定基の２１Ｄ
Ｄ ５決定基に対する相対的な増加は新生変化を反映
するものであると解釈することが可能である。
検体、および第４段階の乳癌患者４検体に由来する血漿
をアッセイにおいて試験した。系は１連のＡＦ−１希釈
液（１：２０〜１ ： １６０）を１つのプレート上に
流し、これら希釈液のうちの２つ（１：２０および”ｌ
：８０）を全ての隣接したプレートに流すことによって
内部標準化した。この結果、各プレートの特性に対して
内部コントロールが得られ、結合性には２０〜２５％以
下の変動が生じたが、多くのプレートはこのような変動
よりも互いにより近くなった。血漿Ｎ０１１および１４
は同一の女性に出来する連続した放血であり、極めて類
似した結果を示した。いかなる統泪操作においてもＮｏ
、１１のみが包含される。表ＩＶにおりるデータは３回
の測定の平均値であり、同様の結合値を与えるへＦ−１
ス１へツクの希釈率の逆数として表わした。次いでこの
値を希釈率に換算した。各特性に対する値を１００倍す
るとΔＦ−１ストック中に存在する抗原の百分率が表わ
される。また、２１ＤＤ５／２１ＤＤ７比を希釈率１：
４の各血漿において計算した。正常もしくは良性乳房疾
患＠壱〇検体において得た比は１．９１〜２．５０で平
均は２．１８±０．２０５ （Ｓ Ｄ ）であった。こ
れに対し、第４段階の乳癌患者に由来する血漿において
この値は２．７５〜５６．６で平均は２２．１２±２５
．３ （・Ｓ Ｄ ＞であった。この限定的な実験にお
いてこれらの範囲は全く重複せず、コントロール群で得
られた値の分布は極めて狭かった。２１ＤＤ７値をそれ
だけで比較すると癌患者に由来する血漿は高い値の２１
ＤＤ７を有しているが、血漿Ｎｏ、１３は明らかに正常
群領域に入る値を示した。これら２つの群の間における
２１Ｄ Ｄ ７値の差は小さい。この結果から、２１Ｄ
Ｄ５決定基は正常組織抗原を反映するものであり、２１
ＤＤ７決定基の増加もしくは２１ＤＤ７決定基の２１Ｄ
Ｄ ５決定基に対する相対的な増加は新生変化を反映
するものであると解釈することが可能である。
表 ＩＶ
１ ０．０１３６ ０，０３１４ ２．３１ 正常（Ｎ
）２ ０．０１２９ ０，０２７４ ２，１２３ ０．
０１５５ ０，０２９Ｇ １．９１４、 ０．０１０３
０，０２５８ ２．５０ 良性乳房疾患（ＢＢ） ５ ０．００８５ ０．０１６７ １．９６６ ０．０
０５６ ０．０１２８ ２，２８１０ ０．０１７３
０，０４７６ ２，７５ 第４段階乳癌 １１ ０．０１’ｌｌ １．０＆１０ ５６．６０１２
０．０１１７ ０，２９８５ ２５．５１１３ ０．
００７１ ０．０２５８ ３．６３１４ ０．０１８３
１．２１２１ ６６．２２２つの付加的な実験におい
ては５５人の異なった患習の値を含むようにデータを広
げた。これらのデータを表Ｖ ａ３よびＶＩに示す。ひ
れらの拡大したデータはもはやコントロールおよび癌患
者の間に非重複領域を示すものではないが、多くの癌患
者においては増加した２１Ｄ Ｄ ７値もしくは増加し
た２１Ｄ Ｄ ７ ／２１Ｄ Ｄ ５比が残存している
。
）２ ０．０１２９ ０，０２７４ ２，１２３ ０．
０１５５ ０，０２９Ｇ １．９１４、 ０．０１０３
０，０２５８ ２．５０ 良性乳房疾患（ＢＢ） ５ ０．００８５ ０．０１６７ １．９６６ ０．０
０５６ ０．０１２８ ２，２８１０ ０．０１７３
０，０４７６ ２，７５ 第４段階乳癌 １１ ０．０１’ｌｌ １．０＆１０ ５６．６０１２
０．０１１７ ０，２９８５ ２５．５１１３ ０．
００７１ ０．０２５８ ３．６３１４ ０．０１８３
１．２１２１ ６６．２２２つの付加的な実験におい
ては５５人の異なった患習の値を含むようにデータを広
げた。これらのデータを表Ｖ ａ３よびＶＩに示す。ひ
れらの拡大したデータはもはやコントロールおよび癌患
者の間に非重複領域を示すものではないが、多くの癌患
者においては増加した２１Ｄ Ｄ ７値もしくは増加し
た２１Ｄ Ｄ ７ ／２１Ｄ Ｄ ５比が残存している
。
表 Ｖ
１８ ０．０１５６ ０．０３１５ ２．０２ 良性乳
房疾、そ、１９０．００Ｇ３４０，０１４２２，２４２
００．００６９５０，０１５４２，２１２１０．００９
３＆ ０，０２１３２．２７２２ ０．００８８８ ０
，０２０７ ２．３３ 正常２３０．００８９８０，０
１７２１．９１７ ０．０１２０１ ０，０２６８ ２
．２３ 良性乳房疾患、８ ０．０１６８７ ｏ、ｏ、
＋ １２ １．８５ ：Ｋ 小１ｓｔｘａｔ。
房疾、そ、１９０．００Ｇ３４０，０１４２２，２４２
００．００６９５０，０１５４２，２１２１０．００９
３＆ ０，０２１３２．２７２２ ０．００８８８ ０
，０２０７ ２．３３ 正常２３０．００８９８０，０
１７２１．９１７ ０．０１２０１ ０，０２６８ ２
．２３ 良性乳房疾患、８ ０．０１６８７ ｏ、ｏ、
＋ １２ １．８５ ：Ｋ 小１ｓｔｘａｔ。
９ ０．００７６ ０，０１８８ ２．４７１０ ０．
０１０８ ０．０２Ｇ３ ２．４３ 正常７５ ０．０
０８１ ０，０２０５ ２．５３ 良性乳房疾患・１４
０．１６０ ０，５００ ３．１２ 第４段階乳癌 ６０ ０．０３３３ ０，０４１２ １．２４６２ ０
．０１ｆ３５ ２．８５７ １７３．１ 〃１５ ０．
００８８６ ０，０２２９ ２．５８１Ｇ ０．０１１
５ ０．２９６ ２５．７１ｙ Ｏ，００６６（１，１
１１１６，８表 ■■ 血清 ２１ＤＤ７／ Ｎｏ、２１ＤＤ５ ２１ＤＤ７ ２Ｎ）Ｄ５ Ｐ％１
０．００４１ ０，０１Ｇ３ ３．９７ 正常２ ０．
００９８ ０．０２７７ ２，８２３ ０．００８２
’ ０，０１８５ ２，２５４ ０．００１１６０．０
２１８ １，８７ 正キ５ ０．００４９ ０．０１５
５ ３゜１６８ ０．００６１ ０，０２０２ ３，３
１９ ０．００６６ ０．０１５２ ２．３０１１ ０
．００５３ ０．０１７５ ３．３０１２ ０．００５
３ ＜１．０１３１ ２．４７１３ ０．００８０’
０．０１’３１ １．６４１８ ０．００４２ ０．０
２８１ １６９ 第１段階乳癌 ２０ ０．００４９ ０．６６６６ １３５．０ 第４
段階腎癌 ２１ ０．００５１ ０．０２４２ ４．７４ 第４段
階肺癌 ３Ｇ ０，００７２ ０．０２９４ ４．０８ 第３段
階乳癌 ３７ ０．００４４ ０．０１Ｇ５ ３．７５３９ ０
．００４９ ０．０１６９ ３．４５ 第１段階乳癌 ４０ ０．００３４ ０．０１３６ ４．００ 第３段
階乳癌 ４１ ０．００ｅｉ７ ０，０２５９ ３，８６ 第１
段階乳癌 ４５ ０．００８４ ０．０４５４ ５．４０ 第３段
階乳癌 Ａ Ｏ，０６３０，０１９８３，１４第１段階乳癌 Ｂ ００００５７ ０，０１８５ ３，２４ＣＯ０σ０
５３ ０．０２５３ ４，７７Ｄ ００００４２ ０，
０１２５ ２，９７Ｅ ０，００５６ ０，０１６５
２．９４Ｆ Ｏ，００３３０，０１３１３，９６Ｇ Ｏ
，００３９０，０１１２２，８７ＨＯ，００７２０，０
１８７２，５９ 表ＶおよびＶｌにおけるデータの分析を平均値の形で表
■および■に示す。データをより小さなグループに分け
ることは明らかに統計上いくらかの困難性を伴なうもの
であるが、いくつかの観察は可能であろう。どの値を考
えても正常な個体に由来するサンプルは良性乳房疾患を
有する女性から得たものとは識別不可能である。一般に
これらの値は極めて小さな標準偏差を有している。第４
段階の癌に由来する２１Ｄ Ｄ ７値および２１Ｄ Ｄ
７ ／２１ＤＤ５値は双方とも極めて大きいが、また
極めて大きな範囲の標準偏差も観察される。一般に２１
ＤＤＹ値および２．ＩＤ Ｃ７／２１Ｄ Ｄ ５比は腫
瘍の程度が進むにつれて（コントロールから第１段階、
第３段階、第４段階）増加する。
０１０８ ０．０２Ｇ３ ２．４３ 正常７５ ０．０
０８１ ０，０２０５ ２．５３ 良性乳房疾患・１４
０．１６０ ０，５００ ３．１２ 第４段階乳癌 ６０ ０．０３３３ ０，０４１２ １．２４６２ ０
．０１ｆ３５ ２．８５７ １７３．１ 〃１５ ０．
００８８６ ０，０２２９ ２．５８１Ｇ ０．０１１
５ ０．２９６ ２５．７１ｙ Ｏ，００６６（１，１
１１１６，８表 ■■ 血清 ２１ＤＤ７／ Ｎｏ、２１ＤＤ５ ２１ＤＤ７ ２Ｎ）Ｄ５ Ｐ％１
０．００４１ ０，０１Ｇ３ ３．９７ 正常２ ０．
００９８ ０．０２７７ ２，８２３ ０．００８２
’ ０，０１８５ ２，２５４ ０．００１１６０．０
２１８ １，８７ 正キ５ ０．００４９ ０．０１５
５ ３゜１６８ ０．００６１ ０，０２０２ ３，３
１９ ０．００６６ ０．０１５２ ２．３０１１ ０
．００５３ ０．０１７５ ３．３０１２ ０．００５
３ ＜１．０１３１ ２．４７１３ ０．００８０’
０．０１’３１ １．６４１８ ０．００４２ ０．０
２８１ １６９ 第１段階乳癌 ２０ ０．００４９ ０．６６６６ １３５．０ 第４
段階腎癌 ２１ ０．００５１ ０．０２４２ ４．７４ 第４段
階肺癌 ３Ｇ ０，００７２ ０．０２９４ ４．０８ 第３段
階乳癌 ３７ ０．００４４ ０．０１Ｇ５ ３．７５３９ ０
．００４９ ０．０１６９ ３．４５ 第１段階乳癌 ４０ ０．００３４ ０．０１３６ ４．００ 第３段
階乳癌 ４１ ０．００ｅｉ７ ０，０２５９ ３，８６ 第１
段階乳癌 ４５ ０．００８４ ０．０４５４ ５．４０ 第３段
階乳癌 Ａ Ｏ，０６３０，０１９８３，１４第１段階乳癌 Ｂ ００００５７ ０，０１８５ ３，２４ＣＯ０σ０
５３ ０．０２５３ ４，７７Ｄ ００００４２ ０，
０１２５ ２，９７Ｅ ０，００５６ ０，０１６５
２．９４Ｆ Ｏ，００３３０，０１３１３，９６Ｇ Ｏ
，００３９０，０１１２２，８７ＨＯ，００７２０，０
１８７２，５９ 表ＶおよびＶｌにおけるデータの分析を平均値の形で表
■および■に示す。データをより小さなグループに分け
ることは明らかに統計上いくらかの困難性を伴なうもの
であるが、いくつかの観察は可能であろう。どの値を考
えても正常な個体に由来するサンプルは良性乳房疾患を
有する女性から得たものとは識別不可能である。一般に
これらの値は極めて小さな標準偏差を有している。第４
段階の癌に由来する２１Ｄ Ｄ ７値および２１Ｄ Ｄ
７ ／２１ＤＤ５値は双方とも極めて大きいが、また
極めて大きな範囲の標準偏差も観察される。一般に２１
ＤＤＹ値および２．ＩＤ Ｃ７／２１Ｄ Ｄ ５比は腫
瘍の程度が進むにつれて（コントロールから第１段階、
第３段階、第４段階）増加する。
第４段階癌 Ｎ−１３０，４６１５±００１８８第４段
階乳癌 Ｎ＝１０ ０．５２８ ±０．８１３１第１段
階乳癌 Ｎ＝１０ ０，０１７８±（１，００４９第３
段階乳癌 Ｎ＝４ ０．０２６２±０．（１１４５正
常 Ｎ＝１６ ０．０２０７ ± ｏ、ｏｏｓｓ良性乳
房疾患 Ｎ＝１１ ０．０２１４ ＋ ０．００６６正
常十 良性乳房疾患 Ｎ＝２７ ０．０２０９±０．００６０
全 癌 Ｎ＝２８ ０，２２５ ± ０．０６１診 断
２１Ｄ Ｄ ５ 第４段ｌｌＩ癌 Ｎ＝１３ ０．０２３５±０．０４１
７第４段階乳癌 Ｎ＝１０ ０．０２９２±０．０４６
６第１段階乳癌 Ｎ＝１０ ０．００５３± ０．００
１２第３段階乳癌 Ｎ ＝ ４． （１，００５８±０
．００２３正 常 Ｎ＝１６ ０．００８７ ± ０．
００３３良性乳癌疾患 Ｎ＝１１ ０．００９７± ０
．００３７正 常十 良性乳癌疾患 Ｎ＝２７ ０．００９２±０．００３４
全 癌 Ｎ＝２８ ０．０１３８ ± ０．０２８８診
断 ２１Ｄ Ｄ ７ ／２１Ｄ′Ｄ、５第４段階癌
Ｎ ＝ １３ ３５．２±５５．７第４段階乳癌 Ｎ＝
１０ ３６．０±５３．６第１段階乳癌 Ｎ＝１０ ３
．３８±０．６５２第３段階乳癌 Ｎ＝４ ’４．３１
±０．７４１正 常 Ｎ＝１６ ２．５０ ± ０．６
１９良性乳癌疾患 Ｎ＝１１ ２．２３±０．２２０正
常十 良性乳癌疾患 Ｎ＝２７ ２．３９±０．５１３全 癌
Ｎ＝２８ １８．３±３９．７表 ■ 第４段階へ １１／ １３ （８４，６％）第４段階乳
癌 ８／１０（８０％） 第１段階乳癌 １／１０（１０％） 第３段階乳癌 ３／４（７５％） 正 常 ０／１６（０％） 良性乳房疾患 ０／１１（０％） 正字 十 良性乳房疾患 ０／２７（Ｑ％） 全 癌 １５／２８ （５３，６％） 第４段階Ａ Ｉ２／ １３ （９２，３％）第４段階乳
癌 ９／１０（９０％） 第１段階乳癌 ４／１０（４０％） 第２段階乳癌 ０／１ （０％） 第３段階乳癌 ４／４（１００％） 正 常 １−／１Ｇ（６，２５％） 良性乳房疾患 ０／１１（０％） 正 常十 良性乳房疾患 １／２７（３，７％） 全 癌 ２０／２８ （７１，４％） 表■の第１の部分は乳癌の存在を示す閾値を偽陰性の生
じないように選択した握合くすなわち １００％特異性
）に得られる結果を示すものである。
階乳癌 Ｎ＝１０ ０．５２８ ±０．８１３１第１段
階乳癌 Ｎ＝１０ ０，０１７８±（１，００４９第３
段階乳癌 Ｎ＝４ ０．０２６２±０．（１１４５正
常 Ｎ＝１６ ０．０２０７ ± ｏ、ｏｏｓｓ良性乳
房疾患 Ｎ＝１１ ０．０２１４ ＋ ０．００６６正
常十 良性乳房疾患 Ｎ＝２７ ０．０２０９±０．００６０
全 癌 Ｎ＝２８ ０，２２５ ± ０．０６１診 断
２１Ｄ Ｄ ５ 第４段ｌｌＩ癌 Ｎ＝１３ ０．０２３５±０．０４１
７第４段階乳癌 Ｎ＝１０ ０．０２９２±０．０４６
６第１段階乳癌 Ｎ＝１０ ０．００５３± ０．００
１２第３段階乳癌 Ｎ ＝ ４． （１，００５８±０
．００２３正 常 Ｎ＝１６ ０．００８７ ± ０．
００３３良性乳癌疾患 Ｎ＝１１ ０．００９７± ０
．００３７正 常十 良性乳癌疾患 Ｎ＝２７ ０．００９２±０．００３４
全 癌 Ｎ＝２８ ０．０１３８ ± ０．０２８８診
断 ２１Ｄ Ｄ ７ ／２１Ｄ′Ｄ、５第４段階癌
Ｎ ＝ １３ ３５．２±５５．７第４段階乳癌 Ｎ＝
１０ ３６．０±５３．６第１段階乳癌 Ｎ＝１０ ３
．３８±０．６５２第３段階乳癌 Ｎ＝４ ’４．３１
±０．７４１正 常 Ｎ＝１６ ２．５０ ± ０．６
１９良性乳癌疾患 Ｎ＝１１ ２．２３±０．２２０正
常十 良性乳癌疾患 Ｎ＝２７ ２．３９±０．５１３全 癌
Ｎ＝２８ １８．３±３９．７表 ■ 第４段階へ １１／ １３ （８４，６％）第４段階乳
癌 ８／１０（８０％） 第１段階乳癌 １／１０（１０％） 第３段階乳癌 ３／４（７５％） 正 常 ０／１６（０％） 良性乳房疾患 ０／１１（０％） 正字 十 良性乳房疾患 ０／２７（Ｑ％） 全 癌 １５／２８ （５３，６％） 第４段階Ａ Ｉ２／ １３ （９２，３％）第４段階乳
癌 ９／１０（９０％） 第１段階乳癌 ４／１０（４０％） 第２段階乳癌 ０／１ （０％） 第３段階乳癌 ４／４（１００％） 正 常 １−／１Ｇ（６，２５％） 良性乳房疾患 ０／１１（０％） 正 常十 良性乳房疾患 １／２７（３，７％） 全 癌 ２０／２８ （７１，４％） 表■の第１の部分は乳癌の存在を示す閾値を偽陰性の生
じないように選択した握合くすなわち １００％特異性
）に得られる結果を示すものである。
しかしながら、表■の第２の部分に示されるようにこの
ような閾値は感麿および特異性の双方を考慮した検定特
性を最適なものとするように選択することも可能である
。このようにデータを考慮すると試験された全ての癌の
うちの７２％が陽性であり、第４段階乳癌の９２％、第
３段階乳癌の１００％、および第１段階乳癌の４０％が
正常域を超える値を示す。
ような閾値は感麿および特異性の双方を考慮した検定特
性を最適なものとするように選択することも可能である
。このようにデータを考慮すると試験された全ての癌の
うちの７２％が陽性であり、第４段階乳癌の９２％、第
３段階乳癌の１００％、および第１段階乳癌の４０％が
正常域を超える値を示す。
上述のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を
用いるサンドイッチアッセイ法はいかなる抗原もしくは
ハプテンの定量化にも応用できるものである。さらに、
使用する標識は放射性同位体である必要はない。すなわ
ち、酵素、螢光体。
用いるサンドイッチアッセイ法はいかなる抗原もしくは
ハプテンの定量化にも応用できるものである。さらに、
使用する標識は放射性同位体である必要はない。すなわ
ち、酵素、螢光体。
化学発光剤等を用いることができる。
（発明の効果）
本発明による抗原、これに特異性を有する抗体、この抗
体を産生する細胞系９組成物およびこの抗原の検定法は
乳癌の診断に絶大な効果をもたらずものであって、その
利用価値は極めて大である。
体を産生する細胞系９組成物およびこの抗原の検定法は
乳癌の診断に絶大な効果をもたらずものであって、その
利用価値は極めて大である。
第１頁の続き
■Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁１
＠発 明 者 メアリー ルイーズ フニコルソン ノ
【 ０発 明 者 カレン ルイス トラ フヴイス ０発 明 者 アルバート オーガス ７ト ループラ
ー フ Ｊ整理番号 °メリカ合衆国 ニューヨーク州 １４８３０ コーニ
ング・−ト ３ ボックス １５９ エイ メリカ合衆国 ニューヨーク州 コーニング イースト
ファースト ストリート ３２１
【 ０発 明 者 カレン ルイス トラ フヴイス ０発 明 者 アルバート オーガス ７ト ループラ
ー フ Ｊ整理番号 °メリカ合衆国 ニューヨーク州 １４８３０ コーニ
ング・−ト ３ ボックス １５９ エイ メリカ合衆国 ニューヨーク州 コーニング イースト
ファースト ストリート ３２１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） 以下の特性： Ａ、最も一般的な形態において少なくとも約３００．０
００ドルトンの分子量を有すること；Ｂ、糖蛋白質であ
ること； Ｃ１塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
密度と同等のｉｉ５囲にあること：Ｄ、ヒト包皮線雑芽
細胞に存在しないこと；Ｅ、冠状動脈、心臓、肝臓、牌
臓および皮膚の細胞に存在しないこと； Ｆ、ヒト乳脂肪球に存在すること； Ｇ、皮脂腺、子宮頚内膜、卵巣、腎臓、腸、膵臓。 および肺の細胞上に存在すること； １−１ 、乳癌細胞によって取り込まれること；■、ヒ
ト血漿サすプル中に存在すること：およびＪ３分子量が
ＤＮアーゼおよびコンドロイチナーゼによって影響され
ないこと を有し、正常および良性乳房上皮細胞股上、主として管
腔に隣接する頂端表面上、および乳癌細胞中に、その細
胞の見掛は上全域にわたって存在するほぼ純粋な抗原。 （２） 前記特性に以下の特性： Ａ、正常乳房組繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する
抗原と乳癌細胞に関連する抗原との間でその濃度が有意
に変化しない第１の決定基を有すること； Ｂ９乳癌細胞に関連する抗原におけるその濃度が正常乳
房組繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する抗原におけ
るその１度よりも有意に高い第２の決定基を有すること
； Ｃ９前記第１および第２の決定基の抗原性がＤＮアーゼ
およびコンドロイチナーゼによって影響されないこと； Ｄ、前記第１および第２の決定基の抗原性がプロテアー
ゼによって低下すること； Ｅ、前記第１および第２の決定基の抗原性が穏やかなア
ルカリ処理によって低下すること：Ｆ、少なくともいく
らかの炭水化物がセリンもしくはスレオニンに対するＯ
−グリコシド結合によって蛋白質主鎖に見掛は上結合し
ていること：Ｇ、小麦胚凝集素カラムに結合することに
よってＮ−７セチルグルコサミンおよび／もしくはシア
ル酸の存在を示すこと； Ｈ０前記第１の決定基の増加によって示される乳房起源
の組織培養細胞によるその合成がエストロゲンによって
増加すること；および ■、そのノイラミニダーゼ処理によって前記第１の決定
基の抗原性が増加し、かつ前記第２の決定基の抗原性が
低下すること が含まれていることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の抗原。 （３） 以下の特性： Ａ、最も一般的な形態において少なくとも約３００．０
００ドルトンの分子量を有すること；Ｂ、糖蛋白質であ
ること： Ｃ５塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
苦瓜と同等の範囲にあること； Ｄ、ヒト包皮線雑芽細胞に存在しないこと；Ｅ、冠状動
脈、心臓、肝臓、牌臓、および皮膚の細胞に存在しない
こと： Ｆ、ヒト乳脂肪球に存在すること： Ｇ、皮脂腺、子富頚内膜、卵巣、腎臓、腸、膵臓。 および肺の細胞上に存在すること； Ｈ９乳癌細胞によって取り込まれること；■、ヒト面漿
サすプル中に存在する。こと；およびＪ０分子量がＤＮ
アーゼおよびコンドロイチナーゼによって影響されない
こと を有し、正常および良性乳房上皮細胞上、主として管腔
に隣接する頂端表面上、および乳癌細胞中に、その細胞
の見掛は上全域にわたって存在するほぼ純粋な抗原に対
して特異性を有する抗体。 （４） モノクローナルであることを特徴とする特許請
求の範囲第３項記載の抗体。 （５） 前記抗原の特性に以下の特性：Ａ、正常乳房組
繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する抗原と乳癌細胞
に関連する抗原との間でその濃度が有意に変化しない第
１の決定基を有すること； Ｂ、乳癌細胞に関連する抗原におけるその濃度が正常乳
房組繊細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する抗原におけ
るその濃度よりも有意に高い第２の決定基を有すること
； Ｃ１前記第１および第２の決定基の抗原性がＯＮアーゼ
およびコンドロイチナーゼによって影響されないこと； Ｄ、前記第１および第２の決定基の抗原性がプロテアー
ゼによって低下すること： Ｅ、前記第１および第２の決定基の抗原性が穏やかなア
ルカリ処理によって低下すること；Ｆ、少なくともいく
らかの炭水化物がセリンもしくはスレオニンに対するＯ
−グリコシド結合によって蛋白質主鎖に見掛は上結合し
ていること；Ｇ、小麦胚凝集素カラムに結合することに
よってＮ−アセチルグルコサミンおよび／もしくはシア
ル酸の存在を示すこと； Ｈ０前記第１の決定基の濃度の増加によって示される乳
房起源の組織培養細胞によるその合成エストロゲンによ
って増加すること；および１、そのノイラミニダーゼ処
理によって前記第１の決定基の抗原性が増加し、かつ前
記第２の決定基の抗原性が低下すること が含まれていることを特徴とする特許請求の範囲第３項
記載の抗体。 （６） モノクローナルであることを特徴とする特許請
求の範囲第５項記載の抗体。 （７） 前記第１の決定基に対して特異的であることを
特徴とする特許請求の範囲第６項記載の抗体。 （８） ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ ８５３２を有するハイ
ブリッド細胞系により産生されたモノクローナル抗体に
対応することを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
抗体。 （９） 前記第２の決定基に対して特異的であることを
特徴とする特許請求の範囲第６項記載の抗体。 （１０） Ａ Ｔ ＣＣ受託番号ＨＢ ８５３３を有す
るハイブリッド細胞系により産生されたモノクローナル
抗体に対応することを特徴とする特許請求の範囲第９項
記載の抗体。 （１１） 以下の特性； Δ、最も一般的な形態において少なくとも３００，００
０ドルトンの分子量を有すること； Ｂ、糖蛋白質であること： ｃ、ｊｒＡ化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白
質の密度と同等の範囲にあること； Ｄ、ヒト包皮線維芽細胞に存在しないこと；Ｅ、冠状動
脈、心臓、肝臓、牌臓、および皮膚の細胞に存在しない
こと； Ｆ、ヒト乳脂肪球に存在すること； Ｇ、皮脂腺、子営頚内膜、卵巣、牌臓、腸、膵臓。 および肺の細胞上に存在すること； Ｈ０癌細胞によって取り込まれること；■、ヒト血漿サ
すプル中に存在すること：およびＪ０分子量がＤＮアー
ゼおよびコンドロイチナーゼによって影響されないこと を有し、正常および良性乳房−上皮細胞股上、主として
管腔内に隣接する頂端表面上、Ｊ３よび乳癌細胞中に、
その細胞の見掛は上全的にわたって存在するほぼ純粋な
抗原に対する抗体を、抗原感作させたＢａ１ｂ／Ｃマウ
ス牌臓細胞とマウス５Ｐ２１０．１胞との融合細胞ハイ
ブリッドおよびその培養基からなるヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン培地内においてインビトロで産
生する連続細胞系からなる組成物。 （１２） 前記、融合細胞ハイブリッドがＡＴＣＣ受託
番号ＨＢ ８５３２を有する細胞系であることを特徴と
する特許請求の範囲第１１項記載の組、酸物。 り１３） 前記融合細胞ハイブリッドがＡＴＣＣ受託番
号８８８５３３を有する細胞系であることを特徴とする
特許請求の範囲第１１項記載の組成物。 （１４） 正常乳房細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連す
る抗原と乳癌細胞に関連する抗原との間でその濃度が有
意に変化しない第１の決定基の濃度を測定し： 乳癌細胞に関連する抗原におけるその′ａ度が正常乳房
組ｌ！細胞もしくは良性腫瘍細胞に関連する抗原にお（
プるその濃度よりも有意に高い第２の決定基の淵瓜を測
定し； 前記第２の決定基の濃度の前記第１の決定基のａ度に対
する比を計算することからなる以下の特性： Ａ、最も一般的な形態において少なくとも約３００．０
００ドルトンの分子量を有すること；Ｂ、糖蛋白質であ
ること； Ｃ１塩化セシウム勾配中における密度が通常の蛋白質の
密度と同等の範囲にあること： Ｄ、ヒト包皮線維芽細胞に存在しないこと；Ｅ、冠状動
脈、心臓、肝臓、牌臓、および皮膚の細胞に存在しない
こと； Ｆ、ヒト乳脂肪球に存在すること： Ｇ、皮脂腺、子宮頚内股、卵巣、腎臓、腸、膵臓。 および肺の細胞上に存在すること； １−１．乳癌細胞によって取り込まれること；■、ヒト
の血漿サンプル中に存在すること；および Ｊ３分子量がＤＮアーゼおよびコンドロヂナーゼによっ
て影響されないこと を有し、正常および良性乳房上皮細胞股上、主として管
腔に隣接する頂端表面上、および乳癌細胞中に、その細
胞の見掛は上全域にわたって存在するほぼ純粋な抗原の
検定方法。 （１５） 前記濃度がイムノアッセイによって測定され
ることを特徴とする特許請求のｔ！＃Ｂ第１４項記載の
方法。 （１６） 前記イムノアッセイにおいて前記第１の決定
基に対するモノクローナル抗体および前記第２の決定基
に対するモノクローナル抗体が用いられることを特徴と
する特許請求の範囲第１５項記載の方法。 （１７） 前記第１の決定基に対するモノクローナル抗
体がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ ８５３２を有するハイブリ
ッド細胞系によって産生されたものであり、前記第２の
決定基に対するモノクローナル抗体がＡＴＣＣ受託番号
ＨＢ ８５３３を有するハイブリッド細胞系によって産
生されたものであることを特徴とする特許請求のｔ５囲
第１６項記載の方法。
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