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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft das Isolieren und Klonieren von Genen, die zur
hierin erläuterten "SSX"-Familie gehören, und
deren Verwendung.
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HINTERGRUND
UND STAND DER TECHNIK
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Es
ist weithin bekannt, dass zahlreiche pathologische Leiden, wie beispielsweise
Infektionen, Krebs, Autoimmunkrankheiten usw., durch die unzulängliche
Expression bestimmter Moleküle
gekennzeichnet sind. Diese Moleküle
dienen somit als "Marker" für einen
bestimmten pathologischen oder abnormalen Zustand. Abgesehen von
ihrer Verwendung als Diagnose-"Targets", d.h. als Materialien,
die es zu identifizieren gilt, um diese abnormalen Zustände zu diagnostizieren,
dienen die Moleküle
als Reagenzien, die verwendet werden können, um diagnostische und/oder
therapeutische Mittel herzustellen. Ein keineswegs einschränkendes
Beispiel hierfür
ist die Verwendung von Krebsmarkern zur Herstellung von Antikörpern, die
für einen
bestimmten Marker spezifisch sind. Wiederum ein anderes, nicht einschränkendes
Beispiel ist die Verwendung eines Peptids, das mit einem MHC-Molekül einen
Komplex bildet, um zytolytische T-Zellen gegen abnormale Zellen
zu bilden.
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Die
Herstellüng
solcher Materialien geht natürlich
von einer bestehenden Quelle der zur Erzeugung dieser Materialien
verwendeten Reagenzien aus. Die Reinigung aus Zellen ist ein arbeitsaufwendiges
Verfahren, dessen Erfolg zur Herstellung solcher Materialien nicht
sichergestellt ist. Ein anderes bevorzugtes Verfahren ist das Isolieren
von Nucleinsäuremolekülen, die
für einen
bestimmten Marker kodieren, gefolgt von der Verwendung des isolierten
Codiermoleküls,
um das erwünschte
Molekül
zu exprimieren.
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Bis
heute wurden zwei Verfahrensweisen zur Detektion solcher Antigene
beispielsweise in menschlichen Tumoren eingesetzt. Diese werden
als der genetische Ansatz und der biochemische Ansatz bezeichnet. Der
genetische Ansatz wird beispielsweise von dePlaen et al., Proc.
Natl. Sci. USA 85, 2275 (1988), beschrieben. In diesem Ansatz werden
mehrere hundert Pools von Plasmiden einer cDNA-Bibliothek, die aus
einem Tumor erhalten wurde, in Empfängerzellen, wie COS-Zellen,
oder in Antigennegative Varianten von Tumorzelllinien transfiziert.
Transfektionsprodukte werden über
deren Fähigkeit,
Reaktionen durch zytolytische Anti-Tumor-T-Zellklone hervorzurufen,
auf die Expression von Tumorantigenen gescreent. Der biochemische
Ansatz, erläutert
von beispielsweise Mandelboim et al., Nature 369, 69 (1994), basiert
auf saurer Elution von Peptiden, die an MHC-Klasse-I-Moleküle von Tumorzellen
gebunden wurden, gefolgt von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC). Antigene Peptide werden identifiziert, nachdem sie sich
an leere MHC-Klasse-I-Moleküle
von mutierten Zelllinien gebunden haben, die bei der Verarbeitung
von Antigenen Defekte aufweisen, und induzieren spezifische Reaktionen
mit zytotoxischen T-Lymphozyten. Diese Reaktionen umfassen die Induktion
von CTL-Vermehrung, TNF-Freisetzung und Lyse von Targetzellen, messbar
in einem MTT-Test oder einem 51Cr-Freisetzungstest.
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Diese
zwei Ansätze
zur molekularen Definition von Antigenen weisen die folgenden Nachteile
auf: erstens sind sie äußerst mühsam, zeitaufwendig
und teuer; zweitens hängen
sie von der Erstellung von zytotoxischen T-Zelllinien (CTL) mit
vorbestimmter Spezifität
ab; und drittens konnte ihre Relevanz in vivo für den Verlauf der Pathologie
einer betreffenden Erkrankung noch nicht nachgewiesen werden, da
die jeweiligen CTL nicht nur vom Patienten mit der betreffenden
Erkrankung gewonnen werden können,
sondern, je nach deren T-Zell-Bestand, auch von gesunden Personen.
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Die
innewohnenden Schwierigkeiten der zwei bekannten Ansätze zur
Identifikation und molekularen Definition von Antigenen zeigt sich
am besten in der Tatsache, dass beide Verfahren bisher bei der Definition von
nur sehr wenigen neuen Antigenen in menschlichen Tumoren Erfolg
zeigten. Siehe beispielsweise van der Bruggen et al., Science 254,
1643–1647
(1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178, 489–495 (1993); Coulie et al.,
J. Exp. Med. 180, 35–42
(1994); Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3515–3519 (1994).
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Darüber hinaus
hängen
die beschriebenen Verfahren von der Verfügbarkeit erstellter permanenter Zelllinien
der in Betracht kommenden Krebsart ab. Es ist sehr schwierig, von
bestimmten Krebsarten Zelllinien zu erstellen, wie beispielsweise
von Oettgen et al., Immunol. Allerg. Clin. North. Am 10, 607–637 (1990),
gezeigt wird. Auch ist bekannt, dass manche Epithelzelltyp-Krebsarten
auf CTL in vitro nur schlecht ansprechen, was herkömmliche
Analyseverfahren ausschließt.
Durch diese Probleme wurde auf dem Gebiet der Erfindung ein Impuls
gesetzt, zusätzliche
Verfahren zur Identifikation von Krebs-assoziierten Antigenen zu
entwickeln.
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Ein
zentrales Verfahren wird von Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92, 11810–11913
(1995), beschrieben. Siehe auch die US-Patentanmeldungen mit den
Serien-Nr. 08/580.980
und 08/479.328, eingereicht am 7. Juni 1995 bzw. am 3. Jänner 1996.
Kurz zusammengefasst umfasst das Verfahren die Expression von cDNA-Bibliotheken
in einem prokaryotischen Wirt. (Die Bibliotheken stammen aus einer
Tumorprobe.) Die exprimierten Bibliotheken werden anschließend mit
absorbierenden und verdünnenden
Seren immunologisch gescreent, um jene Antigene nachzuweisen, die
hohe humorale Titerreaktionen hervorrufen. Diese Methodologie ist
bekannt als das SEREX-Verfahren ("Serologische Identifikation von Antigenen
durch Rekombinantes Expressionsklonieren"). Das Verfahren wurde eingesetzt, um
Expression von zuvor identifizierten Tumor-assoziierten Antigenen
zu bestätigen
sowie um neue Antigene nachzuweisen. Siehe auf die zuvor verwiesenen Patentanmeldungen
und Sahin et al., s.o., sowie Crew et al., EMBO J. 144, 2333–2340 (1995).
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Das
SEREX-Verfahren wurde an Speiseröhrenkrebsproben
angewandt, und ein Speiseröhrenkrebs-assoziiertes
Antigen konnte bereits identifiziert werden und das dafür kodierende
Nucleinsäuremolekül isoliert
und kloniert werden, wie in der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr.
08/725.182, eingereicht am 3. Oktober 1996, durch Verweis hierin
aufgenommen, beschrieben wird.
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Die
Beziehung zwischen manchen der Tumor-assoziierten Gene und einer
Triade von Genen, die als die SSX-Gene bekannt sind, wird derzeit
untersucht. Siehe Sahin et al., s.o., Tureci et al., Cancer Res.
56, 4766–4722
(1996). Eines dieser SSX-Gene, als SSX2 bezeichnet, wurde zuerst
als eines der zwei Gene identifiziert, die in ein chromosomales
Translokationsereignis (t(X; 18)(p11.2; q 11.2) eingebunden sind,
das in 70 % von Synovialsarkomen vorhanden ist. Siehe Clark et al.,
Nature Genetics 7, 502–508
(1994); Crew et al., EMBO J. 14, 2333–2340 (1995). Später wurde
für dieses
Gen herausgefunden, dass es in zahlreichen Tumorzellen exprimiert
wird, und daher wird es nun als ein Tumor-assoziiertes Antigen betrachtet,
das von Tureci et al., s.o., als HOM-MEL-40 bezeichnet wird. Seine
Expression wurde bis heute nur in Krebszellen und normalem Testikel
beobachtet. Somit gleicht es anderen Mitgliedern der "CT"-Familie von Tumorantigenen,
da diese nur in Krebs- und
Testikel-Zellen exprimiert werden. Crew et al. isolierten und klonierten
auch das SSX1-Gen, das 89 % Nucleotidsequenzhomologie mit SSX2 aufweist.
Siehe Crew et al., s.o. Zusätzliche
Studien, die sich auf die Identifizierung von SSX-Genen konzentrierten,
führten
zur Identifizierung von SSX3, das von DeLeeuw et al., Cytogenet.
Genet. 73, 179–183
(1996), beschrieben wird. Die Tatsache, dass die SSX-Darstellung
anderen CT-Antigenen gleicht, ließ die Erfinder darauf schließen, dass
andere SSX-Gene isoliert werden könnten.
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Eine
Anwendung einer Modifikation des SEREX-Verfahrens, das zuvor beschrieben
wurde, kam gemeinsam mit anderen Verfahren zum Einsatz, um ein zusätzliches
SSX-Gen, das nachstehend als SSX5 bezeichnet wird, sowie eine unterschiedliche
Spleißvariante
des SSX4-Gens zu klonieren. Während
das SEREX-Verfahren autologes Serum verwendet, bringen die nachstehend
beschriebenen Verfahren allogenes Serum zum Einsatz. Dies sowie
andere Eigenschaften der Erfindung werden in der nachstehenden Offenbarung
erläutert.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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BEISPIEL 1
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Eine
menschliche Hoden-cDNA-Expressionsbibliothek wurde erhalten und
mit Serum von einem Melanompatienten, bezeichnet als MZ2, gescreent.
Siehe z.B. die Stamm-Anmeldung US-Patentanmeldung der Seriennummer
08/479.328, durch Verweis aufgenommen; siehe auch US-Patentanmeldung
der Seriennummer 08/725.182, auch durch Verweis aufgenommen; Sahin
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810–11813 (1995). Dieses Serum
wurde unter Verwendung des in diesen Verweisen beschriebenen Verfahrens
behandelt. Kurz beschrieben wurde das Serum 1:10 verdünnt und
anschließend
mit transfiziertem E.-coli-Lysat vorabsorbiert. Nach diesem Schritt
der Vorabsorption wurde das absorbierte Serum 1:10 verdünnt, um
eine Endverdünnung
von 1:100 zu erlangen. Nach der letzten Verdünnung wurden die Proben über Nacht
bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Nitrocellulose-Membranen Phagen-Plaques
enthielten, die unter Verwendung des zuvor erwähnten Verfahrens gebildet wurden.
Die Nitrocellulose-Membranen wurden gewaschen, mit alkalische-Phosphatase-konjugierten
Ziege-Anti-Mensch-Fcγ-Sekundarantikörpern inkubiert,
und die Reaktion wurde mit den Substraten 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat
und Nitroblautetrazolium beobachtet. In einem zweiten Screen wurden
jegliche Phagemiden, die für
das menschliche Immunglobulin kodierten, eliminiert.
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Insgesamt
wurden 3,6 × 105 pfu gescreent, was in acht positiven Klonen
resultierte. Herkömmliche
Sequenzierungsreaktionen wurden durchgeführt, und die Sequenzen wurden
mit Sequenzbanken bekannter Sequenzen verglichen.
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Von
den acht Klonen wurde für
zwei festgestellt, dass sie für
bekannte Moleküle,
die in Verbindung mit Autoimmunerkrankungen stehen, kodieren, d.h.
für Golgin – 95 (Fritzler
et al., J. Exp. Med. 178, 49–62
(1993)) und für
den menschlichen Stromauf-Bindungsfaktor
(Chan et al., J. Exp. Med. 174, 1239–1244 (1991)). Für drei andere
Klone wurde erkannt, dass sie für
Proteine kodieren, die in menschlichem Gewebe häufig exprimiert werden, d.h.
für den
ribosomalen Rezeptor, für
die globuläre
Domäne
von Collagen Typ VI und für
Rapamycin-Bindungsprotein. Von den verbleibenden drei Sequenzen
wurde eine als nicht-homolog zu sämtlichen bekannten Sequenzen
erkannt, wurde jedoch überall
in menschlichem Gewebe exprimiert (dies wurde über RT-PCR-Analyse erkannt,
wobei hierin jedoch keine Details bereitgestellt werden). Die übrigen zwei
wurden als identisch mit dem Volllängen-HOM-MEL-40 erkannt, das
in 08/479.328 beschrieben wird, wobei der achte Klon als beinahe
identisch mit "SSX3", das von DeLeeuw
et al., Cytogenet. Cell Genet. 73, 179–183 (1996), beschrieben wurde,
erkannt wurde, der sich davon nur durch zwei Basenpaar-Unterschiede
in der Codierregion unterscheidet. Diese Unterschiede sind eventuell
ein Artefakt in der Natur; der Klon umfasste jedoch auch eine 3'-untranslatierte
43-Basenpaar-Region.
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BEISPIEL 2
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Um
Southern-Blotting-Versuche durchzuführen, die nachstehend beschrieben
werden, wurden die SSX-Gene unter Verwendung von RT-PCR amplifiziert.
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Hierzu
wurden zwei Primer unter Verwendung der veröffentlichten SSX2-Sequenz gebildet,
d.h. unter Verwendung von
MEL-40A:
5'-CACACAGGAT CCATGAACGG AGA (Seq.-ID
Nr. 3),
und von
MEL-40B:
5'-CACACAAAGC TTTGAGGGGA GTTACTCGTC ATC
(Seq.-ID Nr. 4).
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Siehe
Crew et al., EMBO J. 14, 2333–2340
(1995). Die Amplifikation wurde unter Verwendung von 0,25 U Taq-Polymerase
in einem 25-μl-Reaktionsvolumen
unter Verwendung einer Annealing-Temperatur von 60 °C durchgeführt. Insgesamt
wurden 35 Zyklen durchgeführt.
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BEISPIEL 3
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Das
zuvor beschriebene RT-PCR-Verfahren wurde an Hoden-Gesamt-RNA durchgeführt, und
das Amplifikationsprodukt wurde in Southern-Blotting-Versuchen verwendet.
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Genomische
DNA wurde aus nicht-neoplastischen Gewebeproben extrahiert, anschließend unter
Verwendung von BamHI, Eco RI oder HindIII in getrennten Versuchen
Restriktionsenzymverdau unterzogen und dann auf einem 0,7%igen Agarosegel
getrennt, woraufhin Blotten auf Nitrocellulosefilter folgte. Die
zuvor beschriebenen Amplifikationsprodukte wurden mit 32P
unter Verwendung bekannter Verfahren markiert, und die markierten
Materialien wurden dann unter hochstringenten Bedingungen (65 °C, wässriger
Puffer) als Sonden verwendet, wonach Waschschritte unter hochstringenten
Bedingungen erfolgten, die mit einem letzten Waschschritt bei 0,2xSSC,
0,2 % SDS, 65 °C
abgeschlossen wurden.
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Das
Southern-Blotting zeigte in jedem Fall (d.h. bei jedem der BamHI-,
EcoRI- und HindIII-Verdaue) mehr als 10 Banden, was stark darauf
schließen
lässt,
dass es eine Familie von SSX-Genen gibt, die mehr als die drei davor
identifizierten Gene enthielt. In Anbetracht dieser Beobachtung
wurde ein Ansatz entwickelt, der PCR-Klonieren und Restriktionskarten-Analyse
kombinierte, um andere SSX-Gene zu identifizieren.
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BEISPIEL 4
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Bei
einem Vergleich der Sequenzen von SSX1, 2 und 3 wurde herausgefunden,
dass sie hoch konservierte 5'-
und 3'-Regionen
gemeinsam hatten, was erklärte,
warum die Oligonucleotide der Seq.-ID Nr. 3 und 4 in der Lage waren,
alle drei Sequenzen unter den genannten Bedingungen zu amplifizieren,
und darauf schließen
ließ,
dass diese Homologie allen Genen der Familie von SSX-Genen unabhängig von
ihrer Größe gemeinsam
war. So würden
die Oligonucleotide der Seq.-ID Nr. 3 und 4 ausreichend sein, um
die anderen Mitglieder der SSX-Gen-Familie zu amplifizieren.
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Eine
Analyse der Sequenzen von SSX1, 2 und 3 zeigte, dass SSX1 und 2
eine BgIII-Stelle
enthielten, die SSX3 nicht aufwies. Demähnlich enthielt SSX3 eine EcoRV-Stelle, die die anderen
beiden Gene nicht mit ihm gemeinsam hatten.
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In
Anbetracht dieser Information wurde Hoden-cDNA unter Verwendung
der Seq.-ID Nr. 3 und 4 wie zuvor beschrieben amplifiziert und wurde
dann BgIII-Verdau unterzogen. Jegliche BgIII-resistente Sequenz wurde
anschließend
kloniert, sequenziert und mit den bekannten Sequenzen verglichen.
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Dies
führte
zur Identifizierung einer davor nicht identifizierten Sequenz, die
nachstehend als SSXS bezeichnet und hierin als Seq.-ID Nr. 2 dargestellt
wird. Mittels einer Durchsuchung der GenBank-Datenbank wurden zwei
Klone gefunden, die durch die Zugriffsnummern N24445 und W00507
gekennzeichnet waren, die beide aus von einer Sequenzmarkierung
abgeleiteten cDNA-Segmenten bestehen. Der durch N24445 gekennzeichnete
Klon enthielt die 3'-untranslatierte
Region von SSX4 und einen Teil seiner Codiersequenz, während der
durch W00507 gekennzeichnete Klon ein kürzeres Fragment der 3'-untranslatierten
Region von SSX4 und einen längeren
Teil der Codiersequenz enthielt. Insbesondere besteht N24445 von
Base 344 von SSX4 (Seq.-ID Nr. 1) bis zum 3-Ende plus 319 Basen
3' vom Stoppcodon.
Die W00507-Sequenz besteht aus einer 99-Basenpaar-Sequenz, die keine
Homologie zu den SSX-Genen aufweist, gefolgt von einer Region, die
mit Nucleotiden 280 bis zum Ende von Seq.-ID Nr. 1 identisch ist,
bis 67 Basen 3' vom
Stoppcodon aus Seq.-ID Nr. 1.
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Zwei
Formen von SSX4 (Seq.-ID Nr. 1) wurden identifiziert. Einer dieser
Formen fehlten die Nucleotide 331 bis 466, war abgesehen davon jedoch
mit SSX4, dargestellt durch Seq.-ID Nr. 1, identisch. Wie nachstehend
beschrieben ist die kürzere
Form eine alternativ gespleißte
Variante.
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In
der nachstehenden Tabelle 1 werden die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen
der 5 bekannten Mitglieder der SSX-Familie verglichen. Die Tabelle
ist waagrecht in Bezug auf Nucleotidhomologie und senkrecht in Bezug
auf Aminosäurehomologie
zu lesen.
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TABELLE
1 – NUCLEOTID-
UND AMINOSÄUREHOMOLOGIE
UNTER SSX-FAMILIENMITGLIEDERN
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Demnach
weisen SSX1 und SSX4 89,4 % Homologie auf Nucleotidebene und 79,3
% Homologie auf Aminosäureebene
auf.
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Wird
die trunkierte Form von SSX4 analysiert, so weist sie eine Aminosäuresequenz
auf, die sich aufgrund veränderten
Spleißens
und Verschiebens eines offenen Stromab-Leserasters von den anderen
völlig unterscheidet.
Das mutmaßliche
Protein ist 153 Aminosäuren
lang, und die 42 Carboxy-terminalen Aminosäuren weisen keine Homologie
zu den anderen SSX-Proteinen auf.
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BEISPIEL 5
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Die
genomische Organisation der SSX2-Gene wurde dann studiert. Hierzu
wurde eine genomische menschliche Plazenta-Bibliothek (in Lambda-Phagen)
unter Verwendung derselben Arbeitsvorschriften und Sonden, wie zuvor
in der Erläuterung
der Southern-Blotting-Studie beschrieben, gescreent. Alle positiven
primären
Klone wurden durch zwei zusätzliche
Klonierungszyklen gereinigt.
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Mehrere
positive primäre
Klone wurden isoliert, wovon einer teilweise sequenziert und als
der genomische Klon von SSX2 identifiziert wurde. Eine Reihe an
Experi menten zur Durchführung
von herkömmlichem Subklonieren
und Sequenzieren folgte daraufhin, um die Exon-Intron-Grenzen zu
bestimmen.
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Die
Analyse zeigte, dass das SSX2-Gen sechs Exons enthält und sich über zumindest
8 Kilobasen erstreckt. Für
alle definierten Abgrenzungen wurde erkannt, dass sie die Consensus-Sequenz
von Exon/Intron-Junctions, d.h. GT/AG, berücksichtigten.
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Für die alternative
Spleißvariante
von SSX4, die zuvor erläutert
wurde, wurde erkannt, dass ihr das fünfte Exon in der Codierregion
fehlte. Dies wurde durch einen Vergleich mit dem SSX2-Genomklon
und Korrelationen, die daraus erkannt wurden, bestätigt.
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BEISPIEL 6
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Die
Expression einzelner SSX-Gene in normalem Gewebe und Tumorgewebe
wurde anschließend untersucht.
Dies erforderte die Konstruktion spezifischer Primer, basierend
auf den bekannten Sequenzen, und diese entsprechen den Seq.-ID Nr.
5-14:
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TABELLE
2 – GENSPEZIFISCHE
PCR-PRIMERSEQUENZEN FÜR
DIE EINZELNEN SSX-GENE
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Die
Spezifität
der Klone wurde durch Amplifizieren der davor identifizierten cDNA
für SSX1
bis SSXS bestätigt.
Taq-Polymerase wurde bei 60 °C
für SSX1
und 4 und bei 65 °C
für SSX2,
3 und 5 verwendet. Jedes Set an Primer-Paaren wurde als spezifisch
erkannt, mit Ausnahme der SSX2-Primer, für die erkannt wurde, dass sie
kleinste Mengen (weniger als 1/20 von SSX2) von SSX3-Plasmid-DNA
amplifzieren.
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Nachdem
die Spezifität
bestätigt
worden war, wurden die Primer verwendet, um Hoden-mRNA unter Verwendung
der zuvor beschriebenen RT-PCR-Arbeitsvorschriften zu analysieren.
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Die
erwarteten PCR-Produkte wurden in allen 5 Fällen gefunden, und Amplifikation
mit dem SSX4-Paar führte
zu zwei Amplifikationsprodukten, was mit alternativen Spleißvarianten übereinstimmt.
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Die
Expression von SSX-Genen in kultivierten Melanocyten wurde anschließend untersucht.
RT-PCR wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen Arbeitsvorschriften
durchgeführt.
Kein PCR-Produkt wurde gefunden. Reamplifikation führte zu
einer geringen Menge an SSX4-Produkt, das beide unterschiedlichen
Formen umfasste, was darauf hinweist, dass SSX4-Expression in kultivierten
Melanocyten unbeständig
ist und, sofern sie auftritt, nur in geringen Konzentrationen erfolgt.
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Diese
Analyse wurde auf ein Panel von zwölf Melanom-Zelllinien erweitert.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt.
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TABELLE
3 – SSX-EXPRESSION
IN MELANOM-ZELLLINIEN, NACHGEWIESEN DURCH RT-PCR
1
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Die
vorangehenden Beispiele beschreiben das Isolieren und Klonieren
von Nucleinsäuremolekülen für das SSX5-Gen.
Wie bereits oben angegeben wird dieses Gen in Tumorzellen exprimiert,
was Fachleuten ermöglicht,
dieses Gen z.B. zum Testen auf das Vorhandensein von Krebs wie beispielsweise
ein Melanom zu verwenden. Da das Gen ein Protein exprimiert, das
seinerseits die Bildung von Antikörpern in vivo hervorrufen würde, ist
dieses Protein, wie auch die für
dieses Protein spezifischen isolierten Antikörper, ebenfalls Teil der Erfindung.
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Die
isolierten Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
umfassen jene degenerierten Sequenzen, die, obwohl sie mit Seq.-ID
Nr. 2 nicht identisch sind, für
dieselben Proteine kodieren wie diese Sequenzen. Auch Expressionsvektoren,
die diese Moleküle
umfassen und operabel an einen Promotor gebunden sind, sowie die Zelllinien
oder Zellstämme,
die mit diesen Vektoren transformiert oder transfiziert sind, oder
die Nucleinsäuremoleküle selbst
sind Teil der Erfindung. all diese Elemente sind z.B. zur Herstellung
des Proteins sowie zur Bildung amplifzierter Kopien der relevanten
Sequenzen nützlich.
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Auch
Teil der Erfindung sind jene Nucleinsäuremoleküle, die hierin durch Seq.-ID
Nr. 13 und 14 definiert sind, Zusammensetzungen, die diese enthalten,
und die Verwendung davon zum Testen auf Expression eines oder mehrerer
SSX-Gene. Hierbei kann jedes beliebige Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren
verwendet werden, umfassend z.B. PCR-Verfahren. Die Antikörper der
Erfindung können
auch in Tests verwendet werden, wobei jedoch in diesem Fall das
Target das Expressionsprodukt der SSX-Gene ist.
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Andere
Eigenschaften der Erfindung sind Fachleuten bekannt und müssen hierin
nicht explizit erwähnt werden.
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Die
Bezeichnungen und Ausdrücke,
die verwendet wurden, dienen der Beschreibung und nicht der Einschränkung der
Erfindung, und es wird im Rahmen der Verwendung solcher Bezeichnungen
und Ausdrücke
keineswegs die Absicht verfolgt, jegliche Äquivalente der gezeigten und
beschriebenen Eigenschaften oder von Teilen davon auszuschließen; es
gilt demnach anzumerken, dass verschiedene Modifikationen innerhalb
des Schutzumfangs der Erfindung möglich sind.
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(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
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- (i) ANMELDER: Gure, Ali O.; Tureci, Ozlem;
Sahin, Ugur; Tsang, Solam; Scanlan, Matthew J.; Knuth Alexander;
Pfreundschuh, Michael; Old, Lloyd J.; Chen, Yao-Tseng
- (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für SSX-Familienmitglieder kodieren, und deren
Verwendung
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
- (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Felfe & Lynch
(B)
STRASSE: 805 Third Avenue
(C) STADT: New York City
(D)
BUNDESSTAAT: New York
(F) POSTLEITZAHL: 10022
- (v) COMPUTERLESBARE FORM:.
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette,
3,5 Zoll, 144 kb Speicherplatz
(B) COMPUTER: IBM
(C) BETRIEBSSYSTEM:
PC-DOS
(D) SOFTWARE: Wordperfect
- (vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B)
EINREICHDATUM:
- (vii) PRIORITÄTSANMELDUNGSDATEN:
(A)
ANMELDUNGSNUMMER: 08/851.138
(B) ANMELDUNGSDATUM: 5. Mai 1997
(C)
KLASSIFIKATION: 435
- (viii) INFORMATIONEN ÜBER
ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Hanson, Norman D.
(B) REGISTRATIONSNUMMER:
30.946
(C) KENNZAHL/ZEICHEN: LUD 5480-PCT
- (ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: (212) 688-9200
(B)
TELEFAX: (212) 838-3884
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(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID
NR. 2
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- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 576
Nucleotide
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT:
einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:
Seq.-ID Nr. 2
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