CN101365800A - 用于确定ck19表达的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了定量确定生物样品中的CK－19mRNA阳性细胞的方法。此方法可被用于，例如用外周血检测患者中的癌症。在一个实施方案中，此方法可被用于在辅助治疗开始之前检测癌症，从而提供有关治疗功效的信息。本发明方法的实践是敏感、可靠和容易执行的。

Description

用于确定CK19表达的组合物和方法

技术领域

本发明涉及定量确定生物样品中CK-19 mRNA阳性细胞的组合物和方法。

特别是，本发明涉及用于检测循环肿瘤细胞(CTC)的方法，所述方法基于定量的确定诸如那些来自患癌症患者的生物样品中的分子标记CK-19。使用根据本发明的方法，可以在任何辅助治疗启动之前进行检测，以提供关于治疗有效性的信息。

背景技术

在过去数年中有越来越多的证据指出，检测和表征乳腺癌患者骨髓或外周血中的肿瘤细胞，就无病间期和总生存期而言可能是临床相关的(A.C.Lambrechts等；1998)。此外，最小残余疾病(MRD)的预期评估可提供关于辅助疗法有效性的信息(K.Pantel等；2003)。因此，用于早期检测循环癌细胞的高灵敏的方法对于早期诊断和更有效的治疗MRD非常重要。

中间纤维细胞角蛋白-19(CK-19)在多数上皮性肿瘤细胞中稳定和丰富的表达，并且是用于检测乳腺癌患者外周血中潜伏肿瘤细胞的最常用的标记之一(S.Braun等；2000；Y.H.Datta等；1994；A.Schoenfield等；1997)。本发明者最近已证明，在外周血中对CK-19 mRNA阳性细胞的检测，代表在任何辅助治疗启动之前对患有可手术的乳腺癌的患者的结果的最强有力的确定之一，具有CK-19 mRNA阴性的患者有更多的机会长期生存和无病间期(A.Stathopoulou等；2002)。

此外，在早先的研究中我们发展出了定量方法，所述方法基于荧光标记CK-19 mRNA特异性杂交探针的实时监控PCR方法(A.Stathopoulou等；2003)。应用这种方法，在I/II期(可手术的)或IV期(转移的)的乳腺癌患者和在健康的献血者中，我们发现在外周血样品中阳性细胞分别为70/337(20.77％)和2/89(2.2％)。这样，当截断水平(cutoff level)定为0.6MCF-7细胞当量/5μg RNA(该方法的检测极限)时，我们观察到对于正常献血者的假阳性率(2.2％)。通过使用这一统计性的计算截断点，一些患者和健康献血者的外周血样品被视为阴性，尽管它们在很高的交叉点(Cps)显示出CK-19扩增曲线。这些扩增曲线应归于从造血细胞(J.A.López-Guerrero等；1997)、CK-19a和CK-19b假基因(P.Ruud等；1999；E.S.Savtchenko等；1988)或者的低水平异常转录的CK-19的扩增，或者污染的基因组DNA的扩增，这些基因组DNA是和总RNA一起从我们的样品中提取的。然而，对于已发现非常接近这个截断点的样品，这个“灰色地带”结果的阐释对于我们的早期乳腺癌患者的治疗非常关键(V.Bozionellou等；在印刷)。

因此，依然需要改进在生物样品中定量测定mRNA转录本的引物和方法。特别是需要改进用于在可手术的癌症患者外周血中测定CK-19 mRNA阳性细胞的引物和方法，所述方法与以前所知引物和方法相比，显示出减少的背景、高灵敏度和低频率的假阳性。

发明内容

因此，本发明一方面涉及能杂交到基因的靶标序列的引物对，所述基因包含至少一个内含子，其中所述引物的至少有一个包含至少一处跨越内含子的位点。优选引物的至少一个具有的序列与可能的假基因有低同源性。

在优选的实施方案中，所述基因是人CK-19基因。

另一方面，本发明提供了使用一对引物定量测定样品中来自基因的mRNA的改进方法，其中所述基因包含至少一个内含子序列，所述样品包含基因组基因和任选的一个或多个假基因，其中所述引物的至少一个包含至少一处跨越内含子的位点，该方法包含这样的步骤

(i)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、根据本发明的引物对和测试样品；

(ii)将该混合物置于扩增条件下，以产生与靶标序列互补的至少一个拷贝的核酸序列；和

(iii)在PCR过程中使用实时监控测定样品中的mRNA量。

优选的基因是人CK-19基因和优选的样品是血液样品、来自骨髓的样品或取自淋巴结的样品。使用CK-19引物和本发明的方法，基于在患癌症患者的生物样品中定量测定分子标记CK-19来早期检测循环肿瘤细胞(CTC)可以比使用先前已知的方法和引物具有更高的精度。令人惊讶的，观察到的背景和该方法的灵敏度有显著的改善。

在另一方面，本发明涉及在患癌症患者中确定辅助疗法前景的诊断方法，其包括这样的步骤

(i)提供来自患者的生物样品；

(ii)从生物样品中分离核酸；

(iii)当该核酸的起源是RNA时，任选的反转录分离出的核酸；

(iv)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、本发明的引物对和在步骤(ii)中分离出的核酸的等分试样；

(v)将该混合物置于扩增条件下，以产生与靶标序列互补的至少一个拷贝的核酸序列；

(vi)在PCR过程中使用实时监控来定量样品中CK-19 mRNA阳性细胞；和

(vii)基于样品中CK-19 mRNA阳性细胞的数量确定辅助疗法前景。

使用本发明的诊断方法使能够在患者的生物样品中检测更小量的CK-19 mRNA阳性细胞。另外，假阳性确定的频率是非常低的。这意味着可在疾病发展的较早时期可以做出可靠的判断，从而使对患者的预期显著改善。

在另一方面，本发明提供持家引物对。此持家引物对杂交到持家基因上，所述持家基因对于指定细胞类型/生物体是普遍存在的。因为能够避免假阴性的发生，使用持家引物对可显著改进定量实时PCR的适用性。

另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含根据本发明的引物对和根据本发明的方法所需的部分或全部的试剂。

本发明还提供了在诸如血液的生物流体中测定CK-19 mRNA存在的方法。该方法包括下列步骤的至少一个和优选所有的步骤：

a)从生物流体中分离上皮单核细胞，

b)将分离的单核细胞与抗体相接触，所述抗体优选特异性的结合上皮单核细胞表达的抗原。优选的，该抗体结合在固体支持物上并且这种接触足以形成细胞、抗体和固体支持物之间的结合复合物，

c)将结合复合物与任何未结合物质分离，

d)将核酸从与复合物结合的上皮单核细胞中分离出来，

e)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、本文公开的引物对和分离自上皮单核细胞的核酸，

f)将该混合物置于扩增条件下，以产生与CK-19靶标序列互补的核酸序列的至少一个拷贝；和

g)使用PCR而且优选使用实时PCR测定在生物流体中CK-19 mRNA的量。

附图说明

图1描述CK-19 cDNA和CK-19 α假基因序列的比对以及方案A和B中所用引物与探针的杂交位点。位点I和位点II分别代表在外显子1/2和外显子2/3之间的连接；

图2是通过使用具有同样杂交探针的引物的四个组合对基因组DNA的实时PCR，[A)CK19-do2/ck19-for2、B)CK19-do2/ck19-for、C)CK19-do/CK19-for、D)CK19-do/CK19-for2]；和

图3是显示由方案A和B获得的CK-19 mRNA阳性细胞水平的图表，表示为MCF-7细胞当量/5μg RNA。

图4是典型的PBGD实时PCR图。该图显示持家基因的实时PCR扩增曲线，所述曲线是使用本发明的持家引物对产生，使用本发明的TaqMan探针检测并且使用来自有效扩增PBGD基因的5个健康捐献者(正常样品1-5)的生物样品(外周血)。在图中可以看出，在这两个含有基因组DNA(DNA分离自健康个体)的样品中没有出现扩增。这是持家引物设计的结果，使不会扩增基因组DNA。PCR反应的相应的阴性对照(NC)不含有核酸模板。

图5是PBGD PCR产物的琼脂糖凝胶电泳(2％)。将实际的PCR产物加到琼脂糖凝胶里。将10μl反应(总体积的一半)上样并且使用标准溴化乙锭染色。样品1-5对应于图4中的正常样品1-5，而阴性对照对应于图4中的阴性对照。

图6是显示从外周血(PB)中分离循环肿瘤细胞(CTC)的某些实验步骤的示意图。

图7是显示使用单克隆抗体Ber-EP4和免疫磁珠上皮富集试剂盒进行免疫磁富集的示意图。

图8A-C是参照以下实施例部分中三组样品的实时PCR结果的图表。图8A(第1组＝PB添加已知量的MCF-7细胞，免疫磁富集)，图8B(第二组＝PBS添加已知量的MCF-7细胞)，图8C(第三组，与第一组相同，除开没有免疫磁富集)。

发明详述

本发明提供在PCR过程中使用实时监控检测基因的mRNA的引物和方法，所述基因包括至少一个内含子。

定量检测mRNA可使用任何可用的定量测定PCR产物的技术来完成。

优选的方法是实时PCR，但任何其他合适的方法，如竞争性PCR技术是在本发明的范围之内。可能由任何合适的方法来实现这种定量测定，方法的选择是在本技术领域之内的。

本发明还提供检测包含至少一个内含子的基因mRNA的存在的诊断方法和试剂盒。

因此，在第一方面提供了能杂交到基因靶标序列的引物对，所述基因包含至少一个内含子，所述引物其中至少有一个包括至少一个跨内含子位点。

此处描述的引物可能包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或核酸类似物，如不带电荷的核酸类似物包括WO 92/20702所公开的肽核酸(PNA)或US 5185444、5034506和5142047所描述的吗啉代(morpholino)类似物。可以使用多种技术常规合成这种序列。在备选的实施方案中该引物包含标签。

如此处所用的“靶标序列”是指这样的序列，其被本文提供的序列检测、扩增、同时扩增和检测，或者与本文提供的序列互补，或另外的在其天然态具有至少一个内含子，即如同基因组DNA或染色体外DNA。虽然术语靶标序列有时指的是单链的，本领域技术人员将认识到该靶标序列可以是双链的。

该靶标序列特别是CK19基因的mRNA-转录本。在优选的实施方案中提供的引物对分别具有根据SEQ ID NO：1(5＇CGGGACAAGATTCTTGGT-S＇正向)和SEQ ID NO：2(5＇CGTTGATGTCGGCCTCCA-S＇反向)的序列，所述引物可用来扩增CK19靶标序列。

应该理解，序列SEQ ID NO：1和2是本发明引物对的优选实施方案。根据本发明，该引物对的主要特点是在于它包含至少一个跨内含子位点。这提供了只与从其中剪接出内含子的序列(如mRNA、cDNA)结合的引物。应该理解的是所述“剪接”可能自然的发生，即提供在生物样品中的mRNA检测。然而，该术语也涵盖了改造的序列，其具有内含子“被剪接出”的序列，如cDNA。跨内含子位点可以只包括内含子两端位点的一个碱基，使引物在所用条件下仅结合无内含子的序列。正向和反向引物的一方或双方可包含一个或多个跨内含子位点。在优选的实施方案中，只有一个引物包含一个跨内含子位点，并且在特定优选的实施方案中正向引物包含跨内含子位点。

在本公开中正向引物是其延伸与靶标核酸编码链为同一方向的引物。相反，反向引物是其延伸与靶标核酸非编码链为同一方向的引物。因此，引物以它们的3’端彼此相对匹配。

本发明的引物的另一个特点是其引物序列不杂交或结合于靶标特定基因的假基因。这一第二特点只在假基因存在的情况下是必需的，并且构建这种序列需要可能的假基因的序列是已知的或者能够在序列数据库找到它。

在本发明这方面优选的实施方案中，设计引物对从而使所述引物的至少一个在可能的假基因3’端包含至少一个错配，并且优选有两个或者3个错配。在本发明特定的优选实施方案中，引物中至少有一个在CK-19、CK-19a假基因3’端包含至少一个错配。

本发明的第二个方面提供了使用本发明引物检测测试样品中mRNA的方法，其步骤包括：(i)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、本发明的引物对和测试样品；(ii)将该混合物置于扩增条件下，以产生与靶标序列互补的核酸序列的至少一个拷贝；和(iii)使用实时PCR监控定量样品中的mRNA。

在本说明中“测试样品”和“生物样品”可互换使用。在此背景下“测试样品”是指怀疑含有靶标序列的任何东西。测试样品可以来自任何生物源，诸如血液、骨髓、淋巴结、支气管肺泡灌洗物、唾液、咽喉擦拭物、眼晶状体液、脊髓液、汗液、痰液、尿液、乳液、腹水、黏液、滑液、腹膜液、脑脊液、羊水、组织如乳腺组织等；或者发酵肉汤、细胞培养物、化学反应混合物等。肺细胞或组织也可加以利用。最典型的测试样品是来自血液，如外周血、骨髓或淋巴结。可从来源获得该试验样品后直接使用或经预先处理改变样品特性后再使用。因此，可将试验样品在使用前预处理，例如从血液制备血浆、打碎细胞、从固体物质制备流体、稀释粘性流体、过滤流体、蒸馏流体、浓缩流体、灭活干扰组分如上皮细胞、加入试剂提纯核酸等。优选实施方案中的预处理是离心法。

“生物流体”是具有(或者制备为)流体态的生物样品。实例包括外周血、血浆、或从细胞或组织获得的提取物。

当为了扩增靶标序列所必要时，即当靶标序列的性质为RNA的情况下，本发明的方法中包括任选的反转录步骤。这个称为反转录的过程，是在依赖RNA的DNA聚合酶(被称为逆转录酶的酶)的指导下进行的。该过程还需要缓冲液和试剂，如dNTP来反转录。反转录试剂盒是商业上可获得的，并且它在此过程实施的技术领域之内。

发明中所用的核酸扩增试剂包括众所周知的试剂，并且可能包括有聚合酶活性的酶，例如Taq-聚合酶这种的热稳定聚合酶(并在必要时，如监测mRNA时，有反转录酶的活性)、酶辅因子如镁或锰、盐类和三磷酸脱氧核苷(dNTP)，但不仅限于此。

术语“扩增条件”一般被定义为这样的条件，即此条件促进引物序列与靶标序列的杂交或退火并且促进引物序列随后的延伸。本领域众所周知的是，这种退火依赖于几个参数，包括温度、离子强度、序列长度、序列的互补性和G:C含量。例如，降低互补核酸序列环境的温度会促进退火。对于任何给定的序列，可由任何已知的方法来估计解链温度或Tm。通常情况下，诊断应用会采用接近解链温度(即相差10℃之内的)的杂交温度。离子强度或“盐”浓度也会影响解链温度，因为小的阳离子趋于通过中和磷酸二酯主链上的负电荷来稳定双螺旋结构。典型的盐浓度取决于阳离子的性质和化合价，但是是本领域技术人员容易了解的。同样的，高G:C含量和增加的序列长度稳定双螺旋结构也是公知的，这是因为G:C对含有3个氢键而A:T对只有2个氢键，并且因为更长的序列有更多的氢键可以把序列拉到一起。因此，高的G:C含量和更长的序列长度通过提高解链温度影响杂交条件。一旦序列被选择用于给定的诊断应用，其G:C含量和长度将是已知的，并且能作为准确确定应该采用何种杂交条件。由于通常是为了酶活性而最优化离子强度，剩下的唯一可变的参数是温度。通常，选择的杂交温度接近或正好处于引物或探针的解链温度。因此，为特定引物、探针、或引物和探针组确认合适的杂交条件是本领域普通技术人员所熟悉的。使用任何合适的方法和更详细公开于下的探针能够在靶标序列扩增期间或随后检测如上所生产的扩增产物。

本发明还公开了任何序列特异性探针，如杂交探针、Taqman探针或分子信标型探针以检测/定量扩增产物。另外，可以使用探针来确保特异性。所述探针可能具有根据SEQ ID NO：3和4的序列以检测CK19基因的扩增。构建检测靶标序列的扩增的探针在本领域技术之内。

优选标记的探针。该标记可以是直接检测的或者间接检测的，前者例如具有荧光团、化学发光团、萤光粒子等，后者具有特异性结合配偶体和核酸。优选标记是能够直接检测的，并且特别优选的标记是荧光染料、如Sybr Green I、FAM、HEX、VIC、fluoroscein LC Red 610、LC Red640、LC Red670、LC Red 705、和其它本领域已知的荧光染料。

在一个实施方案中，探针可能最初是扩增反应混合物的一部分，在此情况下期望选择这样的条件，从而使该探针序列具有比引物序列更低的解链温度。这样，能初步选择温度使得该探针不杂交到靶标序列，即超过该探针的解链温度。在合成靶标序列的拷贝之后，可以降低温度以使探针杂交到新合成的靶标序列，假设这个靶标序列原本存在于此试验样品，并且随后这个靶标序列可能的存在将具可检测性。或者，该探针是被分开加入的。优选的，该探针不杂交到与引物序列相对应的序列。

在本发明这一第二方面的另一个变体中，方法的步骤(i)可以还包含持家引物对，该持家引物对杂交到持家基因以确保试验样品中存在可扩增材料，和为了避免假阴性结果。所述持家引物对可以是商业上可获得的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的持家引物对(购自罗氏应用科学(Roche applied Science))。

或者，本发明者所确定的持家引物对可用于本发明的方法中。

因此，在本发明第三个方面提供了持家引物对，其分别分别具有根据SEQ ID NO 5和6序列的正向和反向引物。

在本发明的上下文中，“持家引物对”和“引物对”并不相同。在本发明的上下文中，术语“持家引物对”意指这样的引物对，它能够杂交到对于给定细胞普遍存在的基因的靶标序列。换言之，“持家引物对”能在本发明的方法或试剂盒中用作内部对照，即作为阴性对照。

所述的本发明的持家引物对杂交到持家基因PBGD：人非红细胞生成胆色素原脱氨酶(PBGD；羟甲基胆色烷合酶；登记号：X04808)，血红素生物合成途径的第三个酶，其催化四个胆色素单位原的逐步缩合以产生羟甲基胆色烷，该羟甲基胆色烷又由同合成酶转化为尿卟啉原III。持家基因是细胞必不可少的基因，因此在任何条件下始终存在。本发明者所设计的PBGDmRNA扩增的持家引物对是：正向(HGF1)5＇-GGTGGGTGTGCTGCACGAT-3＇(SEQ ID NO 5)和反向(HGR)5＇-ATCTTCATGCTGGGCAGGGA-3＇(SEQ ID NO 6)。

所述持家引物对适合本发明的方法和试剂盒。然而，根据本发明第三方面的持家引物对的用途不仅限于所述方法和试剂盒，而是每当所检验样品(细胞)中普遍包含编码人非红细胞生成胆色素原脱氨酶基因的时候可以使用。

在实时PCR杂交探针中，关于权利要求1的引物对，可如前述的使用Taqman探针或分子信标型探针使PCR产物可视化。一个优选的Taqman探针是：6FAM-ATGAAGGATGGGCAACTGTACCTGACTGG-TMR。

技术人员会意识到，可以在检测生物样品中的PBGD或任何其他合适的持家基因的扩增的靶标序列中使用任何杂交探针组代替上文所述的Taqman探针。此外，利用本领域公知的PCR仪器中可用的不同荧光通道的存在(具有3-6个荧光通道的仪器是商业上可获得的)，持家基因的扩增能与CK-19基因或任何其他合适的靶标基因的扩增在同一个运行中完成，因为可在许多不同的情况下使用持家引物对作为内部对照。

优选以避免扩增基因组DNA或cDNA的方式设计持家引物，以避免样品中污染的基因组DNA的非特异性扩增。这原则上可使用如设计根据本发明的CK-19引物所使用的相同的标准用于设计持家引物来完成。

本发明的第四方面公开了在患癌症患者中确定辅助疗法前景的诊断方法，包括步骤为(i)提供来自患者的生物样品；(ii)从生物样品中分离核酸；(iii)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、权利要求1的引物对和在步骤(ii)中分离出的核酸的等分试样；(iv)将该混合物置于扩增条件下，以产生与靶标序列互补的核酸序列的至少一个拷贝；(v)用实时PCR监控定量样品中的CK-19 mRNA阳性细胞；和(vi)基于样品中CK-19 mRNA阳性细胞的量确定辅助疗法的前景。在本发明这一方面的优选的实施方案中，引物对具有根据SEQ ID NO：1和2的序列。

在另一个优选的实施方案中，生物样品来自血液、骨髓或淋巴结，并且在特别优选的实施方案中样品是血液，如外周血样品。

然而在另一个优选实施方案中，癌症是乳腺癌，优选可手术性的乳腺癌。

通常，也可使用本发明的诊断方法在上皮来源的癌症类型中基于CK-19标记来检测/定量循环肿瘤细胞(CTC)，所述上皮来源的癌症类型包括但不限于鳞状上皮细胞如鳞状细胞乳头状瘤和鳞状细胞癌、过渡性上皮细胞如移行细胞乳头状瘤和移行细胞癌、基底细胞如基底细胞癌、腺上皮如腺瘤、囊腺瘤和腺癌、肾小管上皮细胞如肾小管性腺瘤、肾细胞癌和格拉维茨肿瘤、肝细胞如肝细胞腺瘤和肝细胞癌、胆管上皮细胞如胆管腺瘤和胆管细胞型肝癌、以及黑色素细胞如黑色素细胞痣和恶性黑色素瘤。

在本发明的第四个方面，可与早先所述的“测试样品”相同，对样品进行预先处理。因此，在优选的方面示例性的血液样品是在核酸分离之前先被离心以分离外周血单核细胞(PBMC)。这可能利用本领域公知的任何分离技术来完成，如聚糖体富集、PAX基因血液收集系统、免疫磁性分离和富集，并且优选的离心技术是梯度离心。在本发明的这个方面的上下文中，“核酸扩增试剂”和“扩增条件”是与如上文所述相同的。

在本发明的第五个方面提供了试剂盒用于发明第四个方面的诊断方法。所述试剂盒包含本发明的引物、杂交于癌细胞上的其他标记物的更多任选的引物和扩增试剂。

所述扩增试剂和引物对可以被分开的提供，或者当合适的时候被混合在一起。

在这方面优选的实施方案中，更多的引物序列杂交到CK19。在另一个优选的实施方案中，更多的引物序列杂交到HER2/neu和细胞角蛋白，如CK20、CK8等、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物、GABA An、B305D-C、PIP、S100A9、S100A14、PSA、粘蛋白、癌胚抗原、人绒毛膜促性腺激素的β-亚基、乳腺球蛋白(mammaglobin)、表皮生长因子、Ep-CAM和其他几个本领域公知的mRNA标记。另外的标记的选择和组合是在本领域技术之内的。引物的组合任选的取决于癌症类型的指征。在特别优选的实施方案中引物对具有SEQ ID NO：1和2的序列。

由癌症细胞上超过一个的标记被检测这一事实决定，两个或更多的引物的组合可确保发生的假阴性结果减少。

在本发明的另一个优选的实施方案中，试剂盒包含内部对照以避免假阴性结果，其中此内部对照优选是持家引物对。所述持家引物对优选具有SEQ ID NO 5和6的序列。

在根据本发明的试剂盒的另一种实施方案中，所有成分是冻干的。而在另一个实施方案中，两种或更多(例如全部)的冻干的物质是混合的。在这种情况下，使用者如临床医生，可以简单的将该混合物溶解在合适的缓冲液中，并在扩增之前加入所测试的样品。除简化操作程序之外，冷冻干燥使试剂的储存更为稳定。

本发明的额外的CK-19引物

由前述情况显而易见的是，本发明涵盖范围广泛的能检测人CK-19基因(包括其PCR-可扩增的片段)的适当“修饰过的”引物(或修饰过的引物对)。优选这种修饰过的引物或其引物对，在公开于此的特异引物杂交条件的一个或者组合之下，完全有能力特异结合CK-19靶标(例如，图1所示序列)。通过“特异杂交”意谓在特定的杂交条件下，目标引物或引物对能与CK-19靶标形成结合复合物，此复合物能够被PCR-扩增以产生扩增产物。优选的，相对于用标准方法如定量琼脂糖凝胶电泳所确定的任何其他扩增产物，该扩增产物的丰度约为90％，优选大约95％的丰度或更高。如果使用一个引物或者引物对能实现本发明的一个或多个目标，其为“合适的”。

在开始进行有关例证性引物修饰的进一步讨论前，本发明的一个目的是提供引物，该引物具有在SEQ ID N0：1或SEQ ID NO：2中所示的至少约8个核碱基(nucleobase)(即连接的核苷)的序列。优选的，引物中的一个或两个都至少包括约10个或约12个这样的核碱基，更优选至少约15个高达约18个这样的碱基。具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2完全序列的引物对于许多发明应用更为优选。其他合适的引物包括具有额外序列多达约20个至约30个核碱基(优选从序列的5’端排列)的那些引物。其他根据本发明的合适的引物包括那些跨越约8个至约18个核碱基长度的寡核苷酸序列，其包括选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列的至少八(8)个连续的核碱基，优选至少约10个至约15个核碱基，更优选约16或17个碱基。

本发明的更多例证性引物对包括一个或多个合适的引物，其中DNA序列(或有时为RNA序列)具有在如图1所示外显子1/2交界两侧(CK-19cDNA的约449至455位核苷酸)的至少四(4)个连续的核碱基，优选五(5)、六(6)、七(7)、八(8)或九(9)个连续的核碱基。此外合适的引物在其各自的3’端包括至少约1、2、3或4个核苷酸，所述核苷酸不杂交于如图1所示的相应的CK-19假基因α序列(即不能与之形成氢键)。优选的，这样的非杂交核苷酸将跨越CK-19 cDNA的约568至571位核苷酸。即通过核苷酸取代或在某些情况下的缺失，在选择的一个杂交条件或组合的杂交条件下，引物对中的一个或两个引物的3’端将无法与CK-19假基因完全杂交。

在本发明范围内额外的合适的引物包括那些具有从SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2代表序列之一的5’-末端开始至少约10个额外的核苷酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个核苷酸)的引物。尽管其对于许多用途较少优选，本发明也涵盖合适的引物，其具有来自SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2代表序列之一的3’-末端的至少约5(五)个额外的核苷酸(例如1、2、3、4或5个核苷酸)。

本领域技术人员在阅读本申请后，会明白广泛的其他引物和引物对在本发明范围内。这样的实施方案包括(而非限制于)合适的引物，其中在SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示的一个、两个或三个核苷酸将被A、G、C、T或U取代。也可以考虑在由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2代表的序列中适当缺失一个、两个或三个序列(连续或不连续的)。

还应理解的是，核苷是碱基-糖的组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。两类最常见的这样的杂环碱基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是核苷，其还包括共价连接到核苷的糖部分的磷酸基团。对于那些包括戊呋喃基(pentofuranosyl)糖的核苷，磷酸基团可以与糖的无论是2、3或5位羟基部分连接。在形成寡核苷酸的过程中，磷酸基团将相邻核苷彼此共价连接，以形成线性多聚体化合物。然后，这线性多聚体结构各自的两端，可以进一步接合以形成环状结构，但是，一般优选打开的线性结构。此外，线性结构也可能具有内部碱基互补性，并可能因此以一种方式折叠以产生双链结构。在寡核苷酸结构内部，磷酸基团通常被认为形成寡核苷酸的核苷间(internucleoside)主链。正常的键合或^＊RNA和DNA的主链是3’至5’的磷酸二酯键合。

修饰的CK-19引物：主链

本发明范围内的引物和引物对的额外实例包括具有修饰的主链或非天然的核苷间键合的寡核苷酸。如本说明书所定义，具有修饰的主链的寡核苷酸包括那些在主链中保留磷原子和那些在主链中没有磷原子的。出于本说明书的目的，和有时如在本领域所参考的，其核苷间主链没有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以被视为寡核苷。

因此，本发明包含引物和引物对，其中一个或两个引物包括修饰的寡核苷酸主链。这类主链包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸盐包括3’-亚烃基磷酸酯、5’-亚烃基磷酸酯和手性磷酸盐、次磷酸盐，氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸和硼烷磷酸盐(borano-phosphate)，其具有这些的普通3＇-S＇键、2＇-5＇键连接的类似物，以及具有反极性(其中一个或多个核苷酸的连接是3＇至3＇、5＇至5＇或2＇至2＇键)的那些。具有反极性的额外的寡核苷酸包括在最3’端的核苷酸间键合包含单个的3＇至3＇键合，即可能是无碱基(碱基丢失或在其位置上有羟基基团)的单个相反的核苷残基。还包括各种盐、混合的盐和游离酸的形式。例如，参见下列专利3,687,808、4,469，863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697和5,625,050以及本文中公开的参考文献。

本发明另外的目标是提供适当的引物和引物对，其中引物的一个或两个均不包含磷原子。这类实施方案具有由短链烷烃或环烷基核苷酸内键合、混合杂环原子和烷基或环烷基核苷酸内键合，或一个或更多的短链杂环原子或杂环核苷酸内键合形成的主链。其中包括那些吗啉代键合(如上所讨论的，所形成部分是来自核苷的糖部分)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；核乙酰基(riboacetyl)主链；含烯烃的主链；氨基磺酸盐主链；亚甲基亚胺和亚甲基肼基主链；磺酸盐和磺胺类药物的主链；酰胺主链；以及其他具有混合的N、O、S和CH₂成分部分。参见，例如，下列专利5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269、5,677,439以及其内公开的参考文献。

在一些发明实施方案中，使一个或两个引物带有新的基团(即不与天然存在的核苷相缔合)是有用的。这样一个寡聚化合物，其已被证明具有优良杂交特性的拟寡核苷酸，被称为肽核酸(PNA，参见上述讨论)。在PNA化合物中，使用含有酰胺的主链，特别是氨乙基甘氨酸主链代替寡核苷酸的糖-主链。保留核碱基并且使其直接或间接地结合于主链酰胺部分的氮杂原子。参见，例如，下列专利：5,539,082、5,714,331和5,719,262以获得制作和使用PNA化合物的额外的信息。

根据发明更多的合适的引物和引物对，包括具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂环原子主链的寡核苷，并且特别是-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-(称为亚甲基(甲基亚胺)或MMI主链)、-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂、-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-和-O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-和-O-P-O-CH₂-。同样优选的是具吗啉代主链结构的寡核苷酸。参见前面的讨论和美国专利号5,034,506。也参见美国专利号5,489,677和5,602,240。

修饰的CK-19引物：糖基

在一些发明的实施方案中，对引物和引物中的寡核苷酸进行修饰，使具有一个或多个取代的糖部分可能是有用的。优选的，具有这种修饰的寡核苷酸在其2’位包括下列之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可以被C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基取代，或不被取代。额外的修饰包括O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH_2nOCH₃、O(CH2)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂和O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]₂，其中n和m是从1到约10。其他例证性的寡核苷酸在其2’位包含下列情形之一：C₁至C₁₀的低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多聚-烷氨基、取代硅、RNA切割基团、报告基团、或核酸插入剂。额外的修饰包括2＇-甲氧乙氧基(2＇-O-CH₂CH₂OCH₃，也称为2＇-O-(2-甲氧乙基)或2＇-MOE)(Martin等人，HeIv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即烷氧烷氧基团。更多的说明性修饰优选包括2＇-二甲氨基氧乙氧基，即如以下实例所述的O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，也称为2＇-DMAOE，和2＇-二甲氨基-乙氧乙氧基(也称为2＇-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2＇-DMAEOE)，即2＇-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₃)₂。

其他合适的引物和引物对是在本发明范围之内的。这些包括那些有修饰的引物，所述修饰包括2＇-甲氧基(2＇-O-CH₃)、2＇-氨基丙氧基(2＇-OCH₂CH₂CH₂NH₂)、2＇-烯丙基(2＇-CH₂-CH＝CH₂)、2＇-O-烯丙基(2＇-O-CH₂-CH＝CH₂)和2＇-氟基(2＇-F)。该2＇-修饰可能在阿糖基(arabino)(上方)位置或者核糖基(ribo)(下方)位置上。一个实例性的2＇-阿糖基修饰是2＇-F。类似的修饰也可在寡核苷酸的其他位置上进行，特别是在核苷酸3’末端或者以2＇-5＇键合的寡核苷酸中的3’位糖苷，和核苷酸5’末端的5’位。寡核苷酸可能也具有拟糖类，如环丁基部分代替戊呋喃基糖苷。参见，例如，下列专利：4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、5,792,747和5,700,920。

根据本发明的更多引物，包括一个或多个具有锁定的核酸(LNA)的引物。优选的LNA的特点是2＇-羟基基团键合到糖环3＇或4＇碳原子上，从而形成了双环糖基部分。该键合优选桥接2＇氧原子和碳原子的亚甲基(-CH₂-)_n基团，其中n为1或2。LNA及其制备描述在国际公布专利申请号WO 98/39352和WO 99/14226以及如下列美国专利和专利出版物中：6,794,499、6,670,461、2003/0082807(Xylo-LNA)、2003/0087230(L-ribo-LNA)和2003/0224377。

修饰的CK-19引物：核碱基

应该理解，寡核苷酸也可能包括核碱基(参考本领域通常简称为“碱基”)的修饰或取代。如本文所用，“未经修饰”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。被修饰的核碱基包括其他人工合成和天然的核碱基诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基的衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基的衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶和胞嘧啶以及其他嘧啶碱基的炔衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其它8位取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5位取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤及3-脱氮杂腺嘌呤。更多的被修饰的核碱基包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5-，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-磁夹(clamp)例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-吡啶并[5，4-b][1，4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-吡啶并[4，5-b)吲哚-2-酮))、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3＇，2＇：4，Spyrrolo[2，3-dlpyri-midin-2-酮)。

被修饰的核碱基也可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环化合物取代的那些，例如7-脱氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。更多的核碱基包括那些公开于美国专利号3,687,80、公开于高分子科学和工程的简明百科全书，第858-859页，Kroschwitz，J.I.，John Wiley和Sons编辑，1990’s，由Englisch等人，Angewandte Chemie，国际编辑，1991，30，613所公开的那些，以及由Sanghvi，Y.S.，第15章，反义研究和应用，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，CRC Press，1993所公开的那些。额外的修饰包括5位取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6位取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶和5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶的取代已显示能增加核酸双螺旋的稳定性0.6-1.2摄氏度。(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编辑，反义研究和应用，CRCPress，Boca Raton，1993，第276-278页)，并且是说明性的碱基取代，特别当与2’-O-甲氧乙基糖修饰组合时。参见，例如，美国专利号3,687,808，以及美国专利号：4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5,681,941、5,750,692。

本发明的引物或引物对如果包括至少一种前述的寡核苷酸修饰，则其是“被修饰的”。显而易见的是，被特定修饰的引物和引物对并非最适用于某些发明的实施方案，如进行实时PCR。然而，例如，可以使用被修饰的引物作为电泳标记，和/或作为“反义”成份。

对于PCR技术的应用，其中增加靶标亲和力和特异性是有用的或在增强力度时是有帮助的，由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所代表的一个或两个序列可以被修饰为包含至少1个LNA，例如，1(一)、2(二)、3(三)、4(四)或5(五)个这样的LNA。参见，例如，Vester，B和J.Wengel(2004)Biochemistry 43：13233；以及其引用的涉及LNA寡核苷酸制备和使用的另外公开的参考文献。

正如上面所讨论的，本发明也提供了在生物流体中测定CK-19mRNA存在的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤(a)-(g)：

a)从生物流体中分离任何单核细胞。该分离步骤可以用几乎任何能够从生物流体中分离细胞的方法，如过滤和/或离心进行。在已选定离心的实施方案中，往往会优选使用聚糖体或其他适合细胞分离的梯度。使用聚糖体Histopaque-1077系统(希格玛公司，St.Louis，MO(USA))对于许多应用是优选的，例如其中生物流体是外周血的那些。

b)将分离出来的单核细胞与特异结合上皮单核细胞表达抗原的多克隆或单克隆抗体(或其抗原结合片段，如Fab，F(ab＇)₂、单链抗体等)相接触。在一个实施方案中，抗原是细胞表达的糖蛋白，例如在细胞表面或胞浆中。举例说明的抗体是特异结合CDC326抗原的，例如，ber-EP4、B302(323/A3)、B29.1(VU-ID9)、VU-1D9、HEA125。这些和其他合适的抗体可从各种商业来源获取，如Abeam pic(剑桥，英国)、Dako UK LTD.(剑桥郡，英国)、和圣克鲁斯生物技术公司(圣克鲁斯，CA(USA))。抗体(或抗原结合片段)可与任何合适的固体支持物(例如玻璃纤维滤纸、硝酸纤维素、烧结微晶玻璃、塑料、合成高分子纤维素、醋酸纤维素、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯、或聚偏乙烯氟化物)预结合。在一个实施方案中，固体支持物是珠子的形式，优选其包含磁性或顺磁性物质。优选的珠子是Dynal制造的。优选的是，该方法的接触步骤足以在细胞、抗体和固体支持物之间形成结合复合物。

c)将结合复合物与任何未结合的物质分离，例如，通过过滤和/或离心的方法。

d)将核酸从与复合物结合的上皮单核细胞中分离出来(例如，RNA，诸如mRNA)。通常情况下，并如上文所述的，从由细胞分离出的RNA制备cDNA，

e)形成反应混合物，其包括核酸扩增试剂、公开于此的引物对(例如具有SEQ ID No.1和2中表现序列的引物)和分离自上皮单核细胞的核酸，

f)将该混合物置于扩增条件下，以产生与CK-19靶标序列互补的核酸序列的至少一个拷贝；和

g)使用PCR，优选使用实时PCR，检测生物样品中CK-19mRNA的量。如果期望，可以确定生物流体中CK-19mRNA的量。

术语“特异的结合”或类似的术语意指此处公开的分子，其结合另一个分子，从而形成特异的结合对。然而，如通过这些方法，例如免疫印迹ELISA、RIA、迁移滞后试验、酶联免疫试验、竞争试验、饱和度试验或其他本领域周知的蛋白质结合实验确定，该分子不识别或结合其他分子。通常参见，Harlow和Lane在抗体：实验室手册(1988)及其为检测分子间特异结合方法的举例引用的参考文献。

在前述方法的实施方案中，其中固体支持物是磁珠，该方法还包括加强结合复合物的磁场以从任何未结合物质分离该复合物的方法。接着可使用标准方法处理分离的珠子复合物以分离细胞(并从其中制备核酸)。参见例如，来自Dynal的信息(上皮富集的免疫磁珠)。

该方法是灵活的，并且与公开于此处的一个引物对的使用或引物对的组合使用是相容的。特定引物对的使用将取决于计划的用途。但是对于许多实施方案，SEQ ID No：1和SEQ ID No.2所代表的引物将是足够的。优选的生物流体是外周血。

如果期望，该方法很容易适应于包括使用一个或多个合适的对照测定，如实施例中所提到的那些。举例来说，其对于制作实施方案中CK-19表达细胞的标准曲线是有用的，在所述实施方案中使用者希望不仅检测而且对特定生物样品中的单核细胞定量。下面的实施例说明如何制作一个举例说明性的标准曲线，其中外周血被加入了MCF-7细胞。应该理解的是可以使用其他细胞制作标准曲线。同样应该理解的是，一旦制备了标准曲线，不必在每次执行该方法的时候重复。例如，在其发明用于临床背景的实施方案中，标准曲线可制作一次(或最多少数几次)，其中一种或少数几种类型的生物样品(如来自患者的外周血)被测定。

如果需要的话，前述方法还可以适应于包括公开于此的一种或多种持家基因的使用。使用公开于此的探针，可以检测并任选的定量扩增的CK-19靶序列。

从前述情况显而易见的是，本发明是灵活的，并且可用于探测和任选的定量在各种生物样品中，包括正常和异常(如癌)的组织表达的CK-19。对于正常组织，有以下实例：毛囊、分泌细胞的汗腺、Merkell细胞、乳腺管的管腔上皮细胞、子宫内膜及内子宫颈的表面粘膜和腺体、外子宫颈、卵巢表面间皮、输卵管上皮、细胞-和合体细胞滋养层细胞、羊膜、脐带表面上皮、前列腺管腔与基底细胞、睾丸膜上皮、输出小管、附睾管、肾小囊(Bowman＇s capsul)e、肾的近曲小管、远曲小管和集合管、尿道上皮、胆管和胆膀胱的上皮、舌头的鳞状上皮细胞、舌头的味蕾细胞、舌头的腺体分泌细胞和舌头的腺体导管、食道的鳞状上皮细胞和粘膜下腺、胃的表面粘膜和腺体、大肠和小肠的表面粘膜和隐窝、胰导管、唾液腺的分泌细胞和导管细胞，甲状腺上皮、气管表面粘膜和腺体、支气管粘膜和腺体、肺泡、胸膜-间皮、哈塞耳氏小体和胸腺上皮细胞。对于非正常组织，下列清单是说明性的：人乳腺肿瘤、纤维性瘤、纤维囊性疾病、叶状囊性肉瘤、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、髓样癌和转移、侵袭性癌、导管内乳头状瘤、纯原位癌、具有派杰病(Paget＇s disease)的组织、甲状腺腺瘤、结肠腺癌、胃腺癌和肺腺癌，卵巢癌和膀胱癌、畸胎瘤、胚胎癌、睾丸癌、表皮肿瘤、鳞状细胞癌和基底细胞癌、以及角膜眦疣。

前述本发明的某些方面已公开于2005年8月17日提交的希腊专利申请GR 20050100430，和于2006年4月4日提交的美国临时申请号60/795,149，其中每项都以其整体被引入作为参考。

本文引用的所有参考文献的公开内容被整体引入作为参考。已对本发明进行了详细的叙述，参考其优选的实施方案。然而，应当理解的是，本领域技术人员可以参考本公开内容进行修饰和改善而不悖离本发明的精神和范围。

实验

材料和方法

A.细胞样品

使用表达CK-19基因的人乳腺癌细胞系MCF-7(来自美国模式培养物保藏所；ATCC)作为阳性对照并如前所述进行培养(A.Stathopoulou等人；2001)。

B.临床样品

在EDTA中的外周血来自手术后I/II期(早期)的160例乳腺癌患者和62例健康的女性志愿者(年龄18-65岁)。为了减少来自皮肤上皮细胞的血液的污染，最初抽取的5ml血被丢弃并且在抽出针头之前收集管的末端是断开的。来自健康捐献者和患者的外周血样品用相同的方式收集和处理。所有的患者和捐献者都给出了他们的知情同意书并且此研究已经由参与机构的伦理和科学委员会批准。如以前所述(A.Stathopoulou等人；2001)，用聚糖体泛影钠-1077(希格玛化学公司(Sigma Chemical Company)，LTD，英格兰)梯度离心的方法在静脉穿刺后一个小时之内分离外周血单核细胞(PBMC)，细胞在提取总RNA之前保存在-80℃。

C.总RNA分离和cDNA合成

用Trizol LS试剂(英杰公司(Invitrogen，Corp.)，Carlsbad，USA)根据其厂商说明书进行总RNA分离。所有的RNA制备和操作步骤在无RNA酶的条件下于层流净化通风柜中进行。分离的RNA溶解在RNA存储缓冲液里(Ambion，USA)并且在使用之前保存于-70℃。RNA浓度用RiboGreenRNA定量试剂盒(分子探针，Eugene，OR，USA)测定，使用荧光定量PCR分析仪(罗氏诊断(Roche Diagnostics)，Manheim，德国)作为简单的荧光计。用下面的方法进行RNA定量：在荧光定量PCR分析仪的玻璃毛细管中加入5μL试剂盒供应的已知浓度的RNA溶液、或其稀释液、或未知样品，并一起加入5μL的RiboGreen荧光团。通过荧光定量PCR分析仪在实时荧光计算模式(范围为5-500ng/mL)的方式下测量RNA标准溶液的荧光值来建立标准曲线。一式三份的测量样品的荧光并且用此标准曲线来计算其RNA浓度。

用热转录RT-PCR系统(英杰公司，USA)来执行RNA的逆转录。使用从MCF-7细胞制备的总RNA作为阳性对照。从5μg总RNA合成cDNA，所述总RNA是根据厂商说明书从健康志愿者和乳腺癌患者的PBMC分离。在cDNA的制备中，通过实时PCR扩增人黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因检验RNA的完整性，根据厂商说明书使用荧光定量PCR分析仪-h-HPRT基因装置(罗氏诊断)进行所述PCR扩增。然而，因为当前的科学数据显示以单个持家基因进行的归一化是不适当的[C.Tricarico等人；2002和K.Dheda等人；2004]，我们的研究结果并没有以HPRT基因的量进行归一化，而是如先前所述，以被用于cDNA合成的总RNA量来进行(A.Stathopoulou等人；2003)。

D.最佳B方案的引物设计

使用的新引物对CK19-do2和CK19-for2的寡核苷酸序列(B方案)，最初是通过引物Premier 5软件(Premier Biosoft International，Palo Alto，CA，USA)在硅片上进行设计和评估，以避免引物二聚体的形成、假启动位点和形成发夹结构。此外，正向引物(CK19-for2)被选定在内含子-外显子交界处的位置上，从而完全避免杂交到基因组CK-19DNA。而且，引物和探针被设计以区分在BLAST序列相似性搜索工具(NCBI，NIH)的搜索找到的高度同源的CK-19a假基因(见图1)。尤其是，设计反向引物(CK19-do2)在CK-19mRNA的特定位点，以在其3’端有两个相对CK-19a假基因的错配(图1)，从而使Taq DNA聚合酶不可能延伸和避免了来自CK-19a假基因扩增的假阳性结。杂交探针(TIBmol，柏林，德国)同样如先前所述(A方案)(A.Stathopoulou等人；2003)。在微量化学实验室(FORTH，Crete，希腊)合成引物。所有引物和杂交探针序列如表1所示。

表1.在本研究中用于B方案的引物和杂交探针序列。^a用荧光素标记；^b用LC Red640(TIB MOLBIOL)标记

在评估关于基因组DNA的新引物对的特异性的过程中，我们对分离自健康捐献者外周血的基因组DNA样品进行实时PCR扩增，所述扩增使用先前用过的(CK19-do和CK19-for)和新设计的引物(CK19-do2和CK19-for2)的4种组合。

D.优化对CK-IB mRNA的实时RT-PCR(B方案)

基于PCR过程中对荧光标记的特异杂交探针CK-19的实时监控进行定量。通过荧光定量PCR分析仪软件将荧光上升到高于背景噪声的点(交叉点，Cp)作为曲线的第二最大导数进行最佳定量。CK-IB mRNA的实时RT-PCR使用荧光定量PCR分析仪-系统(罗氏诊断)进行。对于A方案，使用如先前所述(A.Stathopoulou等人；2003)的引物(CK19-do和CK19-for)和杂交探针(CK19-FL和CK19-LC)。对于B方案，使用我们新设计的引物CK19-do2和CK19-for2和与A方案中相同的杂交探针；见表1。

实时PCR在荧光定量PCR分析仪玻璃毛细管中以20μL的总体积进行。对于PCR，将2μL的cDNA放入18μL反应体积中，该反应体积包含2μL无Mg²⁺的PCR合成缓冲液(10×)、1μL的MgCl₂(50mM)、0.4μL的dNTP(10mM)、0.3μL的BSA(10μg/mL)、0.2μL的Taq platinumDNA聚合酶(5U/μL)(英杰公司，USA)、1μL的正义引物CK19-for2(3μM)、1μL的反义引物CK19-do2(3μM)、1μL杂交探针CK19-FL(3μM)、1μL的杂交探针CK19-LC(3μM)和DEPC-H₂O(加入最终体积中)。PCR反应在95℃进行10分钟变性之后开始(热启动PCR)并且以在40℃进行30秒冷却终止。循环方案由在95℃进行10秒变性、在55℃进行20秒退火以及在72℃进行20秒延伸并且重复50次组成。在每次退火步骤的最后进行0秒荧光检测。

对于定量测定，通过外部标准cDNA获得外部校准曲线。从1×10⁶MCF-7细胞(用血球计数器检验)制备总RNA。这个RNA制品在DEPC处理过的水中的一系列稀释液，其对应着1-1000 MCF-7细胞，能用来进行cDNA合成。这些cDNA以等分试样保存在-20℃并在本研究中始终作为外部标准物。通过标示对应每个外部标准cDNA的MCF-7细胞数相对其交叉点的值(Cp)来建立这个校准曲线。对于所有测试的样品，如先前所述，以每5μg总RNA的MCF-7细胞当量表示循环CK-19 mRNA阳性细胞数(A.Stathopoulou等人；2003)，所述数值是由荧光定量PCR分析仪软件3.1依据外部标准校准曲线确定的。

为了确保可扩增的原料在所有的物种都存在并且为了避免假阴性结果，在所有样品中进行对持家基因人黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的实时扩增(荧光定量PCR分析仪-h-HPRT gene set，罗氏应用科学(RocheApplied Science))。

使用下列方案扩增持家基因。实时PCR在荧光定量PCR分析仪玻璃毛细管中以20μL的总体积来进行。对于PCR，将2μL的cDNA放入18-μL反应体积中，该反应体积包含2μL无Mg²⁺的PCR合成缓冲液(10×)、1μL的MgCI₂(50mM)、0.4μL的dNTP(10mM)、0.3μL的BSA(10μg/mL)、0.2μL的Taq platinum DNA聚合酶(5U/μL)(英杰公司，USA)、各1μL的持家基因正义和反义引物(3μM)、1μL杂交探针CK19-FL(3μM)、2μL的Taq man探针(6FAM-ATGAAGGATGGGCAACTGTACCTGACTGG-TMR)(3μM)和DEPC-H₂O(加入最终体积中)。PCR反应发起于在95℃进行10分钟变性之后(热启动PCR)并且以在40℃进行30秒冷却终止。循环方案由在95℃进行10秒变性、在55℃进行20秒退火以及在72℃进行20秒延伸并且重复50次组成。在每次退火步骤的最后进行0秒荧光检测。

预防措施

为了减少污染的风险，RNA提取、cDNA合成、实时RT-PCR步骤的预备以及热循环都在分开的房间进行。PCR混合物的预备在通风柜里进行(BioTechne Hepa，TECHNE，剑桥，UK)并且我们在整个过程中的每次提取或合成步骤使用过滤嘴和包括阳性和阴性样品对照。

数据统计

使用McNemar和Fischer精确检验比较用两组引物对在同一cDNA中进行CK-19mRNA检测的实时PCR结果。使用成对非正态分布群体的Wilcoxon检验比较由两种方案评估的我们的样品中CK-19阳性细胞水平。(P<0.05被认为是统计上显著)。数据分析由Statmost统计软件包执行(Statmost，DataMost Corp，USA)。

结果

A.对CK-19和基因组DNA的B方案的实时RT-PCR

对CK-19的实时RT-PCR优化的B方案的特异性是通过在基因组DNA样品中应用4组引物[A)CK19-do2/CK19-for2、B)CK19-do2/CK19-for、C)CK19-do/CK19-for、D)CK19-do/CK19-for2]来评估的(见图2)。引物对CK19-do2/CK19-for2显示没有任何产物的扩增，而其他三组显示出扩增。

B.为CK-19优化B方案实时RT-PCR

通过为CK-19设计新的高特异性引物对，我们改善了我们先前报道过的实时试验(A.Stathopoulou等人；2003)。对关于B方案的PCR反应条件稍作修改是必要的：扩增温度降低到60至55℃并且将扩增时间从10秒增加到20秒。

我们通过在4个实验中分析cDNA外部标准(制定如上文所述)来评估B方案的CK-19实时PCR的分析灵敏度和线性度。来自这些数据的校准曲线显示，在整个定量测定范围是线性的(1-1000MCF-7细胞)和在所有情况下大于0.99的相关系数，暗示确切的对数线性关系。校准曲线的平均斜率和截距分别是-3.226±0.14(CV＝4.3％，n＝4)和32.30±0.22(CV＝0.7％，n＝4)，而PCR的效率表示成E＝[10^-1斜率]-1(I.R.Peters等人；2004)，其数值为1.04±0.06(CV＝2.9％，n＝4)。该方法的分析检测极限定义为第一个外部标准(1MCF-7细胞当量)的Cp标准差的3.3倍除以校准曲线的平均斜率(DL＝3.3标准差/斜率)，其被发现对应于0.4 MCF-7细胞当量。

为了确定B方案的试验内精确度，在对应1、10、100和1000个MCF-7细胞的四个cDNA样品中定量测定CK-19 mRNA，所述测定在同一轮试验、平行的6个测定、在荧光定量PCR分析仪中进行。

表2.CK-19mRNA的实时RT-PCRB方案的试验内(within-run)和试验间(between-run)精确度。

表2证明校准曲线所确定的MCF-7细胞测定内的CV值范围从2.9％到25％，而相应的Cp值范围从0.21％到1.25％。此外，为了确定此测定的试验间精确度，同样的cDNA样品以等分试样冻存(-20℃)并且在一个月的时间内、在4个不同的日子、用4个单独的测定进行分析。表2显示了校准曲线所确定的MCF-7细胞试验间的CV值范围从6.7％到18.9％，而相应的Cp值范围从0.76％到1.12％。

C.比较的定量测定在外周血样品中的CK-19 mRNA阳性细胞

对CK-19实时RT-PCR的优化过的B方案的特异性和敏感度进行关于A方案方面的评估。两个定量方案都应用于总共222例外周血样品，它们来自62例健康女性捐血者和160例可手术性的(I/II期)乳腺癌患者。通过HPRT持家基因的表达，所有这些样品的RNA质量和cDNA合成被检验。各个样品的总RNA由Ribo Green使用荧光计定量测定。使用同样量的RNA进行cDNA合成并且用于归一化我们的定量RT-PCR数据(A.Stathopoulou等人；2003)。

通过再次检查89例来自健康志愿者的外周血样品中的62例来评估新的引物组的特异性，所述外周血样品是我们先前用A方案已分析过的(A.Stathopoulou等人；2003)。通过应用A方案，根据本测定的分析截断点，这89例样品中的2例被认为是阳性的(Cp＝32.17±0.70，CV(％)＝2.2)，而当分析B方案的时候，62例样品中没有一例(包括两例阳性样品)显示任何扩增。通过用两种方案分析160例可手术性乳腺癌患者的外周血样品来评估优化方法的敏感度。

表3.对检测外周血样品中的CK-19阳性细胞的实时PCR的A方案和B的比较。一致性：89.2％(198/222)，(P＝0.0022，McNemar & Fischer精确检验)。

如表3中所见，这些样品中的33例(20.6％)被发现是阳性的。在灰色地带并且经A方案表征为阳性的二十例样品经B方案发现为阴性的，而4例样品使用A方案表征为阴性，因为它们给出的扩增曲线具有高于截断点的Cp，而使用B方案发现其为阴性的。通过将所有检验的外周血样品包括进来(健康捐献者n＝69和乳腺癌患者n＝160)，对于两种方案有29例样品为阳性和169例为阴性，因此两种方案之间的阳性率和阴性率有89.2％(198/222)的一致性(McNemar和Fisher精确检验，n＝222，P＝0.0022)(表3)。如图3中可见由这两种方案获得的CK-19mRNA阳性细胞水平表示成MCF-7细胞当量/5μg RNA的相关性非常好(r＝0.986，n＝29)如图3中可见，并且没有显著的不同(成对数据的Wilcoxon检验，n＝29，P＝0.164)。

上皮细胞的免疫磁富集

检验3组样品以评估从外周血分离循环肿瘤细胞(CTC)的新方案的有效性。图6显示了伴随随后操作的各个样品组。

第一组(图6中显示为组A)

第一组由添加了已知量的MCF-7细胞的外周血样品组成。将这些样品加入聚糖体Histopaque-1077系统(希格玛公司，St.Louis，MO)并且在1500rpm离心30分钟。将单核细胞层移走，用PBS洗两次，用PBS/0.1％小牛血清白蛋白稀释至1ml，并且与上皮富集的免疫磁珠(在20μL体积中有1×10⁷个珠子)孵育同时摇动1小时。将此细胞悬液在磁体上放置至少6分钟然后小心的移走上清。用1ml PBS/0.1％小牛血清白蛋白清洗结合磁珠的细胞三次并用试剂盒提供的裂解结合缓冲液进行裂解。裂解细胞的悬液(有珠子附着)在处理之前储存在-80℃。MCF-7上皮细胞通过免疫磁性捕获被富集，此过程使用单克隆抗体Ber-EP4以及根据厂商说明书(Dynal)的免疫磁珠上皮富集试剂盒。厂家显示有多达5log上皮细胞的富集和70％可获得的产量，可利用这一试剂盒获得无珠子的肿瘤细胞(Dynal)。Ber-EP4抗体识别上皮细胞表面上和细胞质中的两种糖蛋白，此上皮细胞是除了鳞状上皮细胞、肝细胞和壁细胞的表层之外的。

第二组(图6中显示为组B)

第二组由通过在PBS中添加已知量的MCF-7细胞所制备的样品组成，并且接下来是如第一组同样的操作。这组样品被用作这样情形的参考，即在使用(第一组)或不使用(第三组)免疫磁富集的聚糖体分离后，恢复MCF-7细胞。

第三组(图6中显示为组C)

第三组由添加了已知量的MCF-7细胞的外周血样品组成，将其加入聚糖体Histopaque-1077系统(希格玛公司，St.Louis，MO)并且在1500rpm离心30分钟。将单核细胞层移走，用PBS和PBMC洗两次，储存在-80℃直到处理。

mRNA分离和反转录。用Trizol LS试剂(英杰公司)根据其厂商说明书进行总RNA分离。所有的RNA制备和操作步骤在无RNA酶的条件下于层流净化通风柜中进行。分离的RNA溶解在RNA存储缓冲液(Ambion，USA)并且在使用之前保存于-70℃。用NanoDrop分光光度计ND-1000(NanoDrop)测定RNA浓度。用Superscript III Platinum两步qRT-PCR试剂盒(英杰公司)实施RNA的逆转录。

实时PCR(定量PCR)。CK-19的实时RT-PCR在荧光定量PCR分析仪玻璃毛细管中以20μL的总体积来进行。对于PCR，将2μL的cDNA放入18μL反应体积中，该反应体积包含2μL无Mg²⁺的PCR合成缓冲液(10×)、1μL的MgCl₂(50mM)、0.4μL的dNTP(10mM)、0.3μL的BSA(10μg/mL)、0.2μL的Taq platinum DNA聚合酶(5U/μL)(英杰公司，USA)、1μL的正义引物CK19-for2(3μM)、1μL的反义引物CK19-do2(3μM)、1μL的杂交探针CK19-FL(3μM)、1μL的杂交探针CK19-LC(3μM)和DEPC-H₂O(加入最终体积中)。PCR反应发起于在95℃进行10分钟变性之后(热启动PCR)并且终止于在40℃进行30秒冷却步骤。循环方案由在95℃进行10秒变性步骤、在55℃进行20秒退火以及在72℃进行20秒延伸并且重复50次。在每次退火步骤的最后进行0秒荧光检测。

现在参照图8A-C，可见当添加MCF-7细胞的外周血单核细胞(PBMC)的聚糖体分离之后通过免疫磁富集时获得高敏感度。在这些实验中，能实现的检测极限低至1MCF-7细胞/ml PB。见图8A。

发明的额外的用途

本发明公开了，例如，适合于定量检测患者生物样品中所识别的循环肿瘤细胞的方法。例如患乳腺癌的患者。优选的发明方法使用本发明的引物对利用实时PCR扩增特异的CK-19 mRNA转录本。

CK-19，作为在肿瘤中丰富表达的上皮标记，也是在有上皮来源的肿瘤的患者生物样品中识别循环肿瘤细胞的标记物(单独的或者和其它探针组合)，所述上皮来源包括子宫内膜(Ji XQ等人，Gynecol Oncol.2006 Feb；100(2)：355-60)、结肠(Yeh CS等人，Int J Oncol.2006 Feb；28(2)：411-20；Wang JY等人，World J Surg.2006 Jun；30(6)：1007-13)、胃(Wu CS等人，Int J Cancer.2006 JuI 15；119(2)：373-9)、头和颈(Tao L等人，Br J Cancer.2006 Apr 24；94(8)：1164-9)、前列腺(O＇Hara SM等人，Clin Chem.2004May；50(5)：826-35)和由各种类型的肿瘤导致的恶性胸腔积液(Xe F等人，J Zhejianq Univ Sci.2004 Oct；5(10)：1286-9)。这类生物样品可包括外周血、骨髓、淋巴结、脊髓液和眼晶状体液。

为了从来自患有上述肿瘤的患者样品中鉴定到CK-19 mRNA阳性循环肿瘤细胞的存在，可以使用公开与此的一种或几种方法的组合。例如，收集临床样品，和利用分离的外周血单核细胞(PBMC)制备总RNA。例如，可以使用上面列出的免疫磁性纯化策略。如果期望，可以定量RNA，并长时间储存在-70℃。或者，可使用RNA(5μg)来进行反转录反应合成cDNA(靶标序列)。可以使用来自健康人的样品作为对照，并且将其与临床样品用相同的方式并行处理。应该理解的是，如果检验的对照样品具有已知的CK-19表达谱则不需要做这类对照。合成的cDNA可用于通过引物对和上述杂交探针利用实时PCR反应扩增CK-19序列。如SEQ ID No.1和2提出的引物对的使用对于许多应用是优选的。

可以如此申请早先所述，通过从1×10⁶MCF-7细胞分离的RNA制备的外部标准cDNA制作外部校准曲线用于定量。

讨论

本发明者发明了特异和敏感的方法来定量乳腺癌患者外周血样品中的循环CK-19mRNA阳性细胞(A.Stathopoulou等人；2003)。尽管这个测定的假阳性很低，因为89例健康捐血者中只有2例(2.2％)被检测到CK-19mRNA阳性，但是却有含有扩增的cDNA序列的样品被认为是阴性，因为它们被检测到的非常高的交叉点在该实验的分析检测极限之下。对患者样品的评估结果显示，Cp值略低于截断点的扩增曲线已证实是非常难和关键的。这个“灰色决定地带”使得我们去设计和评估新的一套引物(CK19-do2和CK19-for2)。我们的主要目标是避免因被基因组DNA污染或者反常表达引起的假阳性，和因为在我们的样品中非常低的初始CK-19mRNA含量引起的假阴性。通过对纯基因组DNA进行新旧CK-19引物对的4个不同组合的检验，我们已经明确表明此新引物与这一杂交探针对的组合是高度特异的，并且不会被高浓度基因组DNA和CK-19假基因的存在所影响。通过对来自先前同样研究过的健康志愿者亚组(n＝62)的样品进行再次检验，我们可以看到测定的特异性明显改善，因为这些样品没有CK-19mRNA的可扩增产物。

通过在实时PCR中定量CK-19 mRNA时使用这种新的高特异性的引物对，本发明者已经相当大的改良了这种方法的特异性。这样，可以获得阳性和阴性样品之间的清楚分布，并且完全避免了对前面测定中的灰色地带结果的困难的说明。对于大多数样品而言，两对引物几乎可以得到相同结果。在所检验的总共222例样品中，两对引物都检测出29例阳性样品和169例阴性样品[一致性89.2％(198/222)]。但是，对于10例阳性样品(其浓度非常接近A方案中方法的分析检测极限，并因此位于“灰色地带”)，通过B方案检测出4个是真阳性(40％)，而6个被发现是假阳性(60％)。在其它组的其浓度比检测极限略低的19个样品中，通过A方案发现其为阴性，2例通过B方案被发现是假阴性(10.5％)。这样，如通过A方案所确定的，小百分比的患者样品(29/222)(13％)处于CK-19检测的“灰色地带”，可以被B方案更确切的表征为阳性或阴性，因为这一方案不受与总RNA共同提取出来的痕量基因组DNA的影响。

下列参考文献的回顾将增强对本发明的理解。

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Claims (39)

1.能够杂交到基因的靶标序列的引物对，其基因包含至少一个内含子，其特征为所述引物的至少一个包含至少一个跨内含子位点。

2.权利要求1的引物对，其特征为所述引物不杂交于所述基因的假基因。

3.权利要求2的引物对，其中所述引物的至少有一个在所述假基因的3’端有至少一个碱基错配。

4.权利要求1、2或3的引物对，其中该基因是人CK19基因。

5.权利要求4的引物对，其中该引物对的一个引物包含SEQ ID NO：1的序列或SEQ ID NO：2的序列。

6.权利要求5的引物对，其由具有SEQ ID NO：1序列的一个引物和具有SEQ ID NO：2序列的一个引物组成。

7.权利要求1-6的任何一项的引物对，其中引物包括核苷酸、核苷酸类似物或标记物。

8.使用引物对定量确定试验样品中存在包含至少一个内含子的基因衍生的mRNA的方法，其中所述引物的至少一个包含至少一个跨内含子位点，所述方法包括步骤

(i)形成反应混合物，包括核酸扩增试剂、权利要求1的引物对和测试样品；

(ii)将该混合物置于扩增条件下，以产生与靶标序列互补的核酸序列的至少一个拷贝；和

(iii)在PCR过程中使用实时监控测定样品中的mRNA量。

9.权利要求8的方法，其中在形成步骤(i)的反应混合物之前对该测试样品进行反转录。

10.权利要求8或9的方法，其中该测试样品选自血液样品、骨髓样品和来自淋巴结的样品。

11.权利要求10的方法，其中该样品是血液样品。

12.权利要求11的方法，其中在形成反应混合物之前离心该血液样品。

13.权利要求8-12的任一项的方法，其中步骤(i)的反应混合物还包含持家引物对。

14.权利要求13的方法，其中该持家引物对具有SEQ ID 5和6的序列。

15.在患癌症患者中确定辅助疗法前景的诊断方法，其包括步骤为

(i)提供来自患者的生物样品；

(ii)从生物样品中分离核酸；

(iii)当该核酸的起源是RNA时，任选的反转录分离的核酸；

(iv)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、权利要求4的引物对和步骤(ii)中分离出的核酸的等分试样或步骤(iii)的反转录的核酸；

(v)将该混合物置于扩增条件下，以产生与靶标序列互补的核酸序列的至少一个拷贝；

(vi)在PCR过程中使用实时监控以定量样品中CK-19mRNA阳性细胞；和

(vii)基于样品中CK-19mRNA阳性细胞的量确定辅助疗法的前景。

16.权利要求15的诊断方法，其中该癌症是乳腺癌，优选可手术的乳腺癌。

17.权利要求15或16的诊断方法，其中该生物样品是血液样品。

18.权利要求15-17的任一项的诊断方法，其中步骤(iii)的反应混合物还包含持家引物对。

19.权利要求18的方法，其中该持家引物对具有SEQ ID 5和6的序列。

20.扩增CK19靶标序列的诊断试剂盒，其包含：

(i)权利要求1的引物对；

(ii)杂交到癌细胞上额外标记物的任选的序列；

(iii)扩增试剂。

21.权利要求20的诊断试剂盒，其中该扩增试剂包含SEQ ID NO 3和4的杂交探针。

22.权利要求20或21的诊断试剂盒，其中该试剂盒还包含持家引物对，优选具有SEQ ID NO 5和6的序列。

23.权利要求20到22的任一项的诊断试剂盒，其中该扩增试剂和引物对是冻干的。

24.包括一个第一引物的引物对，所述第一引物具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2代表序列的至少8个核碱基，该第一引物的长度在约10个到约20个核碱基之间并且还能够与图1所示的CK-19 cDNA序列特异性杂交。

25.权利要求24的引物对，其还包括一个第二引物，所述第二引物具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2代表序列的至少8个核碱基，该第二引物的长度在约10个到约20个核碱基之间并且还能够与图1所示的CK-19cDNA序列特异性杂交。

26.权利要求24-25的引物对，其中第一引物和第二引物中的至少一个包含修饰的核苷间键合、修饰的糖部分或修饰的核碱基。

27.权利要求26的引物对，其中第一引物和第二引物中的至少一个包括至少一个锁定核酸(LNA)单位。

28.使用一对引物定量测定试验样品中存在包含至少一个内含子的基因衍生的mRNA的方法，其中至少一个所述引物包含至少一个跨内含子位点，所述方法包括步骤

(iv)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、权利要求24-27的引物对和试验样品；

(v)将该混合物置于扩增条件下，以产生与靶标序列互补的核酸序列的至少一个拷贝；和

(vi)在PCR过程中使用实时监控测定样品中的mRNA量。

29.权利要求28的方法，其还包括使用持家引物对。

30.包括权利要求24-27的引物或引物对的诊断试剂盒。

31.在生物样品中确定CK-19 mRNA存在的方法，此方法包括下列步骤：

a)从生物流体分离任何单核细胞，

b)使分离的单核细胞与特异结合单核细胞表达抗原的抗体(或其抗原结合片段)相接触，其中该抗体(或片段)结合固体支持物，此接触足以在细胞、抗体(或片段)和固体支持物之间形成结合复合物，

c)从任何未结合的材料分离该复合物，

d)从结合在复合物上的内皮单核细胞分离核酸，

e)形成反应混合物，其包含核酸扩增试剂、权利要求24-27的引物对和核酸，

f)将混合物置于扩增条件下，以产生与CK-19靶标序列互补的核酸序列的至少一个拷贝；和

g)使用PCR测定生物样品中的CK-19mRNA。

32.权利要求31的方法，其中通过过滤或离心分离上皮单核细胞。

33.权利要求32的方法，其中离心步骤包括聚糖体密度梯度的使用。

34.权利要求31-33的方法，其中抗体是特异结合内皮单核细胞表达的糖蛋白的单克隆抗体。

35.权利要求34的方法，其中该单克隆抗体是Ber-EP4。

36.权利要求31-35的方法，其中该固体支持物是免疫磁珠。

37.权利要求36的方法，其中该方法的步骤c)还包括加强结合复合物的磁场以从任何未结合的材料分离复合物。

38.权利要求31-36的方法，其中引物对是由SEQ ID No：1和SEQ IDNo.2代表的序列。

39.权利要求31-38的方法，其中生物流体是外周血。

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