CN1878876B

CN1878876B - 分子标记

Info

Publication number: CN1878876B
Application number: CN2004800330434A
Authority: CN
Inventors: M·A·克罗克德; J·R·贝利; J·V·拉蒙特; S·P·菲茨杰拉德
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 2003-11-10
Filing date: 2004-11-09
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2024-11-09
Also published as: WO2005047539A1; GB0326197D0; CN1878876A; EP1682679A1; EP1682679B1; JP2007510424A; US20070281895A1

Abstract

公开了一种可用于预测癌症、特别是乳腺癌的风险的诊断方法。本方法包括：(i)分离患者的生物样本；(ii)检测本申请中被称为SEQID No.1的序列中所含基因的存在或表达，其中，该基因的存在或表达指示癌症的存在与否或患癌风险。

Description

分子标记

技术领域

本发明涉及癌症特别是乳腺癌的存在与否或患癌风险的检测。

背景技术

全球范围内每年有超过一百万的乳腺癌病例，其中约500,000例在美国，40,000例在英国，接近2000例在爱尔兰。乳腺癌是女性患癌死亡的首要病因。尽管整体发病率在西方国家逐渐上升，但自1991年以来，更为广泛的筛检及治疗方法的改进使死亡率以每年约1％的速度逐年降低。被诊断患早期乳腺癌的患者，其5年相对存活率达90％以上，而被诊断患远端转移乳腺癌(distally metastasised breast cancer)的患者，该存活率仅为20％。然而，并没有确定的乳腺癌早期筛检方法，目前的诊断还是基于乳房造影术和细针活检(fine needle biopsy)的结果。乳房造影术有其局限性：80％以上的可疑结果是假阳性，10-15％的患乳腺癌女性其检测结果为假阴性。肿瘤通常在检测前已发育到晚期，这会降低患者的存活机会，也会提高治疗成本和医疗保健体系的管理成本。需要更为灵敏的方法检测小的(直径＜2cm)早期原位乳腺癌，以降低患者死亡率。除了早期检测外，在判断疾病是恶性还是良性、确定已知癌症的所处时期以及区分肿瘤的类型方面，也存在着严重的问题。最后，还需要随时监测治疗效果，辨别出对具体治疗方法产生抗性的患者。这种检测方法更为复杂，因为乳腺是少有的几个在成年期，特别是在妊娠期、哺乳期和更年期，其形态和功能经历显著变化的器官之一。随着时间的推移，该变化可能会引起同一乳腺中分子标签(molecular signature)的改变。

疾病诊断一般通过仔细检查少量生物标记的相对水平而实现。尽管近来有所进步，但目前的生物标记对患者治疗和临床结果的帮助依然有限。这是由于已有标记的诊断灵敏度和疾病特异性较差。然而，一些分子生物标记仍常规用于疾病诊断中，如前列腺特异抗原用于前列腺癌筛查，同时新的候选标记也正以越来越快的速度被发现(Pritzker，2002)。人们正在逐渐认识到：使用一系列效果良好的生物标记将提高检查的阳性预测值，使假阳性或假阴性降到最低(Srinivas et al.，2002)。另外，目前人们对神经网络也越来越感兴趣，该神经网络有望将各种生物标记产生的微弱而独立的信息结合起来，以产生较单独使用生物标记而言其信息量更大的预后/预测指数(Yousef et al.，2002)。

由于比较了更多的分子信息，人们正在根据与病人结果相关的遗传标签(genetic signature)对诸如乳腺癌等疾病加以细分，从而为临床医生提供有价值的信息。分子医学中的新兴技术已显示出其在以下方面的能力：区别常规病理标准无法识别的疾病亚型(Sorlie et al.，2001)，以及鉴定癌症进程中涉及的特定遗传事件(Srinivas et al.，2002)。同时，还需解决有关生物标记在不同性别和人种间的效力问题，因此有必要对不同人群进行大规模筛查。

乳腺癌的控制可通过使用新的标记得以改进。作为疾病的结果，通常该标记仅在乳腺内表达，但也在体内其它部位发现。疾病活动的预测因子，特别是能够预测原位导管癌是否会发展成为扩散性导管癌(invasive ductal carcinoma)的预测因子，在疾病控制上也具有重要的应用。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种检测患者患癌与否或患癌风险的方法，该方法包括如下步骤：

(i)从患者体内分离生物样本；

(ii)检测下述基因是否存在或表达，所述基因的特征在于被称为SEQ ID No.1的核苷酸序列，其中，该基因是否存在或表达指示癌症的存在与否或患癌风险。

根据本发明的第二方面，一种分离的多核苷酸包括本申请中被称为SEQ ID No.1的核苷酸序列，或所述序列的互补序列，或在严格杂交条件下与所述序列(或其互补序列)杂交的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。

根据本发明的第三方面，一种分离的肽包括本申请中被称为SEQID No.3的序列，或其至少10个连续氨基酸残基的片段。

根据本发明的第四方面，一种抗体对上述肽具有至少10^-6M的亲和力。

根据本发明的第五方面，一种与内源性DD20基因杂交或抑制其表达的多核苷酸用于制备治疗癌症、特别是乳腺癌的药物中。

附图说明

本发明参照所附附图进行描述，其中：

图1示出测定不同组织中所研究基因的存在与否的筛选分析结果，T表示肿瘤组织cDNA，M表示同一供体中共同切除的乳腺组织cDNA。

图2示出为测定在不同组织样本中所研究基因的表达所进行的表达分析的结果。

图3示出针对30个人组织cDNA样本进行的所研究基因半定量PCR表达分析的结果。

具体实施方式

本发明的基础是对癌症患者，特别是乳腺癌、子宫癌或睾丸癌患者体内表达的基因进行鉴定。取自患者的样本中该基因(或其表达产物)的鉴定指示患者体内癌症存在与否或患癌风险。

本发明还涉及用于检测、诊断、监测、预测、预防、成像、治疗或确定癌症诱因的试剂，如多肽序列。

实施诊断的方法可包括：由待测样本中的mRNA合成cDNA，扩增对应基因或其片段的cDNA的适当部分，检测指示该组织中疾病存在与否的产物，或检测含有指示疾病存在与否的基因序列的mRNA的翻译产物。

有用的试剂包括：可用于下述诊断方法的多肽或其片段：例如，对从活检组织、血液或其它待测样本中提取的mRNA进行RT-PCR、PCR或杂交分析；或所述mRNA的翻译产物蛋白；或针对这些蛋白的抗体。考虑到机体中可能出现翻译后修饰，包括与一些分子如辅助因子、抑制剂、激活剂以及形成亚基复合物的其它蛋白的相互作用，上述分析也包括检测基因产物(蛋白)的方法。

与癌症相关的基因的特征为如SEQ ID No.1所示的多核苷酸。推定编码序列表示为SEQ ID No.2。基因的表达产物在本申请中被称为 SEQ ID No.3。基因或其表达产物的鉴定可使用已知的多核苷酸或多肽检测或表征技术进行。例如，用与靶基因特异杂交的短寡核苷酸，可探查从患者体内分离的遗传物质。该寡核苷酸探针可带有可检测的标记物，例如萤光团标记，从而在与靶基因杂交后，所述探针能够被检测。或者，也可使用聚合酶链反应扩增基因或其部分，然后再用标记的寡核苷酸鉴别产物。

包括该基因或关联蛋白或抗体的诊断分析包括但不限于：

聚合酶链反应(PCR)

逆转录PCR

实时PCR

原位杂交

DNA点印迹

免疫组织化学

核糖核酸酶保护分析

cDNA阵列技术

ELISA

用于结合研究的承载于固体载体如玻璃或陶瓷上的蛋白、抗原或抗体阵列。

小干扰RNA功能分析。

上述所有技术为本领域所熟知。

本发明还涉及分离的多核苷酸，所述多核苷酸含有被称为SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2的序列、或其互补序列，或其含有至少15个连续核苷酸、优选30个核苷酸、更优选至少50个核苷酸的片段。与上述多核苷酸杂交的多核苷酸也在本发明的范围内。杂交通常在严格条件下进行。严格杂交条件为普通技术人员所熟知，选择严格杂交条件是为了降低非互补杂交的可能。合适条件的实例公开于Nucleic AcidHydridisation.A Practical Approach(B.D.Hames and S.J.Higgins，IRL Press编辑，1985)中。更具体地，严格杂交条件包括在含下述组分的溶液中于42℃孵育过夜：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的、经剪切的鲑精DNA，然后在约65℃下在0.1×SSC中洗涤。

基因鉴定也可开发以基因作为治疗性分子的靶标的治疗方法。例如，现有很多已知分子已经被开发用于基因治疗，用以打靶特定基因或预防其表达。一种特殊的分子是小干扰RNA(siRNA)，它通过刺激靶 mRNA的降解抑制特定靶蛋白的表达。已知能与所研究基因(或其调控元件)结合以修饰表达的其它合成寡核苷酸。还已证明与DNA联合的肽核酸(PNA)(PNA-DNA嵌合体)显示出较强的诱饵活性(decoyactivity)，从而能够改变所研究基因的表达。这些分子可用于结合基因或其上游调控元件，阻止表达。

本发明也涉及分离的所研究基因的多肽产物。本发明中分离的多肽包括本申请中被称为SEQ ID No.3的序列，或其至少10个连续氨基酸、优选至少15个连续氨基酸、更优选至少20个氨基酸的片段。多肽可用于产生抗体，或用于开发可与蛋白体内结合以抑制其活性的蛋白结合分子。

本发明也包括针对本发明的肽的抗体。该抗体通常具有对所述肽至少10^-6M、更优选10^-9M、最优选至少10^-11M的亲和力。抗体可以是任何合适的类型，包括单克隆型或多克隆型。测定待测样本中肽抗原存在与否的分析试剂盒也包括于本发明中。在一个实施方案中，该分析试剂盒包括装有与抗原特异性结合的抗体的容器，其中，所述抗原具有由DD20基因编码的至少一个抗原决定簇。这些试剂盒还可包括装有用于收集待测样本如血液、唾液、尿液和大便的工具的容器。这些工具包括用于收集和稳定血液的刺血针(lancet)以及吸水纸或吸水布、用于收集和稳定唾液的棉签(swab)、用于收集和稳定尿液及大便样本的杯子。抗体可结合到诸如玻璃或陶瓷表面的固相上。

也可检测待测样本中能够与所述抗原特异结合的抗体，该待测样本被怀疑含有上述抗体。该检测方法包括使待测样本与多肽接触，其中该多肽含有所述基因的至少一个抗原决定簇。接触在足以形成抗原/抗体复合物的条件下进行一段时间。该方法还需要检测含上述多肽的复合物。多肽复合物可重组制备、人工合成制备，或从天然来源中纯化得到。

在本发明的一个独立实施方案中，针对抗原的抗体或其片段可用于检测患者体内抗原的成像定位(image localization)，以达到检测和诊断疾病或病症的目的。这种抗体可为单克隆或多克隆抗体，或者可通过分子生物学技术制备，并可用多种可检测试剂标记，所述检测试剂包括但不限于放射性同位素。

在另一实施方案中，抗体或其片段，不管是单克隆或多克隆抗体，还是通过分子生物学技术制备的，均可用作治疗药物，用于治疗以本发明基因的表达为特征的疾病。抗体可不经衍生化而直接使用，也可用细胞毒性试剂如放射性同位素、酶、毒素、药物、前体药物等衍生化。

术语“抗体”泛指任何免疫结合试剂，如IgG、IgM、IgA、IgD和

IgE。抗体同样指任何抗体类分子，这些分子具有抗原结合区并且包括但不限于抗体片段，如单域抗体(DABS)、Fv、scFv、适体等。制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术为本领域所熟知。

如果需要，本发明的癌症筛查方法可容易地与其它方法结合，以提供更为可靠的诊断或预测指标，由此提供多标记检查。

以下实施例参照所附附图说明本发明。

实施例

使用非同位素差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)，从乳腺癌患者临床配对样本的cDNA群中分离多个差异表达的基因片段。发现其中的一个片段(本申请中称为DD20)在多个供体的乳腺癌组织样本中显著上调。该新分子标记的表达概况、全长以及相应的推测蛋白序列在本申请中详细描述。

材料与方法

将来自于同一供体的正常乳房组织与肿瘤组织配对样本(matchedpairs)进行基因差异表达分析。组织样本在得到伦理完全许可和患者同意后，从英国诺丁汉Medical Solutions plc获得。外科手术切除肿瘤后，收集一个肿瘤组织样本，以及一个一起切除的相邻正常组织样本。分别使用Dynal dT₁₈-标记的Dynabeads和Superscript II反转录方案，提取信使RNA，随后合成cDNA。采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)观察该配对样本基因表达概况的差异，分离显示上调或下调的单个基因转录本，并进行进一步研究。

Liang & Pardee(1992)首次报道：差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)使用两个或更多个生物样本的mRNA作为模板，用三个可能的锚定引物中的其中一个，通过反转录合成代表性cDNA。使用与80个13聚体随机引物偶联的各自的锚定引物，分别用PCR扩增3个亚群。据估计，此数量的引物组合有助于mRNA群中96％的已表达基因的表现(Sturtevant，2000)。该群的细分导致在每组引物的第二条cDNA链合成结束时，所估计的12,000到15,000个真核细胞中表达的mRNA减少到100-150个转录本。这有助于配对引物组在聚丙烯酰胺凝胶上的平行电泳分离和准确显示，从而可鉴定只在一个组织样本中表达的基因片段。

技术领域

在将所研究片段剪切和再扩增后，通过反向DNA点印迹除去假阳性。这需要将每个再扩增片段点样到双层尼龙膜(Hybond N⁺， Amersham Pharmacia Biotech)上，并使其与片段供体的肿瘤或正常组织cDNA群杂交。然后，对这些被确定为差异表达的片段进行直接测序，即不经克隆而测序，随后进行基于网络的数据库查询，以确定是否每个基因都是新的。与已知基因不匹配的片段被认为可能是片段来源乳腺癌的新标记。通过半定量RT-PCR或实时PCR，用多个乳腺癌供体的一组配对cDNA群，对每种转录本进行进一步筛检。在所有情况下，均使用β-肌动蛋白作为校正cDNA模板的组成性对照基因，并在PCR过程中将其作为阳性内对照。使用校正模板上的基因特异性引物组，表达每种新的推定标记基因。然后使用5’-RACE法(cDNA末端快速扩增法)，合成含开放阅读框的新的基因片段的全长转录本，该方法将基因特异性的延伸与扩增相结合，这一点可以通过测序证明。

背景技术

使用针对cDNA群的每种新标记基因特异性引物测定组织特异性，该cDNA群来自非乳腺组织，包括大脑、心脏、淋巴细胞、脾脏、肾脏、睾丸和肌肉(从Origene获得)。使用来源于更全的22种人组织的一组人组织的cDNA群，进一步检测DD20分子标记。这些组织如下：

肾上腺收集自62个供体

骨髓收集自7个供体

大脑、小脑收集自24个供体

发明内容

全脑收集自1个供体

结肠^＊收集自1个供体

胎儿大脑收集自59个供体

胎儿肝脏收集自63个供体

心脏收集自1个供体

肾脏收集自1个供体

肝脏收集自1个供体

附图说明

肺收集自1个供体

胎盘收集自7个供体

前列腺收集自47个供体

唾腺收集自24个供体

具体实施方式

骨骼肌收集自2个供体

小肠^＊收集自1个供体

脾脏收集自14个供体

睾丸收集自19个供体

胸腺收集自9个供体

甲状腺收集自65个供体

气管收集自1个供体

子宫收集自10个供体

需要注意的是：这些样本中大部分是人总RNA系列II(Clontech)中的一部分，而星号标记的两个样本是从英国诺丁汉Medical Solutionsplc的组织块中获得，并在Randox Laboratories Ltd进行了处理。

另外，分析是使用伦理允许范围内的人肿瘤样本(从MedicalSolutiosn plc.获得)进行的。采用实时PCR，针对β-肌动蛋白和DD20，对卵巢、睾丸、胃、肝脏、肺、膀胱、结肠和胰腺肿瘤的代表性cDNA进行了检查。

在进行新标记表达分析的同时，还对每对配对乳腺组织进行了分子标签分析。这需要使用针对每种组织cDNA的、在半定量RT-PCR中对多种已公开的乳腺癌分子标记具有特异性的引物。确定了每种样本每种分子标记之间的关系，并将其列表，作为对照使用，新标记可与此进行比较。这是为了细分肿瘤类型，使新标记与这些亚型相关联，同时也可以显著提高诊断标记的功用。

结果和讨论

使用差异显示法发现：与相应的正常组织cDNA相比，来源于乳腺癌供体配对组织cDNA群的称为DD20的基因片段在肿瘤cDNA群中显著上调。该由187个核苷酸组成的产物通过反向DNA点印迹被确定为差异表达。进行序列分析，然后进行数据库查询，确定DD20与EMBL和SWISSPROT数据库中的已知基因或蛋白不是同源的，因此DD20被认为可能是新的。但是，在去除多腺苷酸尾巴(poly-A tail)后，DD20与人基因组的染色体11的克隆是100％同源的。

使用基因特异性引物，通过针对原始供体配对组织样本的半定量PCR，确认了该片段的肿瘤特异性。这些数据表明DD20是乳腺癌存在的推定标记(图1)。

为简化进一步的分析，使用5′-RACE法延伸片段，以使其包含该基因的全部开放阅读框(ORF)，以及所有的5′非编码序列。使用该技术，衍生出由427个核苷酸组成的推测的全长产物(SEQ ID No.1)，随后进行数据库查询，证实了先前认为的与人染色体11的同源性，在全长序列(427/427)上是100％同源的。从该序列中形成全部6个氨基酸阅读框，并在+3框中发现一个推定的小ORF，该小ORF含67个氨基酸，包括终止密码子(SEQ ID No.3)。该小蛋白未表现出对SWALL数据库中任何已知蛋白的高度同源性，因此推测是新的。最初认为它可能是一种小的细胞因子，因为它与小鼠和人的小的诱导型细胞因子A22前体都具有适度的同源性，并与SWISSPROT数据库中的其它细胞因子大小相近。但DD20只有一个二硫键(由半胱氨酸残基表明)；而所有的细胞因子均包含两个二硫键。另外，此单个二硫键并不与细胞因子中的任何二硫键相符。

使用半定量PCR分析和实时PCR分析，对来自由其它患者供给的多个配对乳腺癌组织的cDNA群进行进一步DD20筛查。6对配对cDNA群进行常规半定量PCR分析，最初为40个循环，由于所检测DD20的水平低，又改用45个循环(图2)。用β-肌动蛋白进行模板校正，并作为PCR的阳性对照。在多个样本中观察到：肿瘤样本中的表达与其正常样本相比显著提高。这些数据确认DD20是乳腺癌存在的推定分子标记。

该分析被所有现有的配对乳腺组织样本的分子标签分析所证实，如下所示：

在肿瘤组织中表达提高 10 52.6％

在正常组织中表达提高 3 15.8％

没有显著差异 4 21.1％

没有明显表达 2 10.5％

总计 19 100％

为测定器官特异性，采用常规PCR和实时PCR，针对DD20引物，检查了22种非乳腺组织的人组织cDNA群。另外，以同样方式分析了8种肿瘤组织样本中DD20的表达。亦使用组成型管家基因β-肌动蛋白的引物作为阳性对照检查了相同样本，以校正用于半定量PCR分析的模板。β-肌动蛋白产物在所有所研究的cDNA群中被强烈扩增，确认该表达可被推测为半定量的。常规PCR的结果示于图3中。在30种组织样本中，DD20似乎有选择地表达。在大多数情况下，该推定标记的强烈表达局限在受到生殖激素影响的组织中，例如卵巢、睾丸、子宫和胎盘。在其它器官如骨髓、脾脏、胸腺和甲状腺中也发现较弱表达。在肿瘤组织中，仅在卵巢和睾丸中明显表达强烈，而在胰腺瘤中表达较弱。

该分子标记虽然不是乳腺特异性或肿瘤特异性的，但在多种乳腺癌中的表达仍显著提高，可能与特异性亚群或肿瘤所处时期有关。因此，该分子标记在乳腺癌类型的细分上可能是有用的。比较组织样本中DD20和分子标签的的表达概况，可揭示该标记和其它已发表的与疾病的分类和预后相关联的乳腺癌标记之间的联系。

作为参照，值得指出的是，DD20大大优于一些最受推崇的“标准”乳腺癌标记，如雌激素受体(ER α)和人上皮生长因子受体(c-ErbB-2)。这在所有配对乳腺癌组织样本的分子标签分析中都显而易见，其中很多情况下，同一患者的两个样本使用针对人正常组织和肿瘤组织的30个cDNA群的靶特异性引物所致的表达相似。

参考文献

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Sorlie T，Perou CM，Tibshirani R，Aas T，Geisler S，Johnsen H，Hastie T，Eisen MB，van de Rijn M，JeffreySS，Thorsen T，Quist H，Matese JC，Brown PO，Botstein D，Eystein Lonning P，Borresen-Dale AL.2001.Gene expressionpatterns of breast carcinomas distinguish tumor subdasses with clinicalimplications.Proc Nati Acad Sci U S A.Sep 11；98(19)：10869-74.

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序列表

<110>兰多克斯实验室有限公司

<120>分子标记

<130>JWJ01056WO

<150>0326197.1

<151>2003-11-10

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>427

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

ctctccaaga gcttcaaact gagtaaccag caataatagt ctaccaactg ggaccaggac 60

aaaggatggt aagagattct ctctgtggta gagaatggct gaaagcaggg gatggatcag 120

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tatcactgga ggaattggaa gtgtgtggta cacttcaggt aacaatagca aaaacaatta 240

ccaaatctag tctaactact aactagattg actcaactca gaagtagagg tacacacatt 300

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aaaaaaa 427

<210>2

<211>201

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(201)

<223>

<400>2

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1 5 10 15

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35 40 45

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65

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<213>人(Homo sapiens)

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1 5 10 15

Gly Ser Ala Ile Leu Lys Lys Thr Phe Trp Tyr Pro Arg Asn His Ser

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Lyg His Asn Val His Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Glu Val Cys Gly

35 40 45

Thr Leu Gln Val Thr Ile Ala Lys Thr Ile Thr Lys Ser Ser Leu Thr

50 55 60

Thr Asn

65

Claims

1.包括被称为SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸，或在严格杂交条件下与所述序列或其互补序列杂交的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，在制备用于诊断患者的乳腺癌的诊断试剂中的应用。

2.包括被称为SEQ ID No.2的核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸，或在严格杂交条件下与所述序列或其互补序列杂交的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，在制备用于诊断患者的乳腺癌的诊断试剂中的应用。

3.一种由SEQ ID No.1组成的分离的多核苷酸。