JP2001158751A - 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現 - Google Patents

脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子治療および免疫化のための医薬を提供
する。 【解決手段】 治療または免疫原性処置のため身体の組
織に直接投与するための医薬であって、非統合性でかつ
非感染性であり、かつ身体内に所望の治療効果または免
疫原性効果を生じさせる遺伝子生産物を作動的にコード
する配列を有する裸のポリヌクレオチドと、カチオン脂
質物質とからなり、該ポリヌクレオチドは該カチオン脂
質物質と複合化されている、医薬。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の背景】本発明はポリペプチドの制御された発現
を達成するために、脊椎動物内に裸のDNAおよびRN
A配列を導入することに関する。これは、遺伝子治療、
ワクチン投与および生体内細胞に対しポリペプチドを投
与する必要があるいかなる治療の状況においても役立つ
ものである。
【0002】遺伝子治療における現在の研究は、DNA
が患者のゲノム内に組込まれる、「永久の」治癒に焦点
がおかれている。ウイルスのベクターは、患者の細胞を
形質転換させかつDNAをゲノム内に導入するための手
段として現在最も頻繁に使用される手段である。間接的
な方法においては、新しい遺伝子情報を保持するウイル
スベクターが、身体から取り出された標的細胞に感染さ
せるために使用され、かつこれらの細胞はその後再移植
される。出生後の動物への直接の生体内遺伝子移植につ
いては、リポソーム内にカプセル化されたDNAおよび
ウイルス外膜受容体タンパク質を含むプロテオリポソー
ムに包含されたDNAの処方物が報告されている(Nico
lau et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 80: 1068-1072
(1983); Kaneda et al., Science 243:375-378(198
9); Mannino et al., Biotechniques 6:682-690(198
8)。また肯定的な結果がリン酸カルシウム共沈DNA
と共に記述されている(Benvenisty and Reshef Proc.
Natl. Acad Sci USA 83:9551-9555(1986))。
【0003】遺伝子治療の医療への応用および組換型レ
トロウイルスベクターの利用は、安全性への配慮から遅
れている。細胞のゲノム内へ外因性DNAを導入するこ
とでDNAに障害を引起こしかつ悪性疾患の素因となり
得る、受容細胞の遺伝子の変化を引起こし得る。これら
の潜在的な問題を回避する方法は、遺伝子治療を安全で
かつ有効なものにするうえで重要な利益を有するものと
考えられる。
【0004】免疫原性タンパク質を用いてワクチン投与
を行なうことで多くの疾病の発生を根絶しまたは低減し
てきたが、免疫原として、他の病原体および症状と関連
するタンパク質を使用することには大きな困難が存在し
ている。多くのタンパク質抗原は本来免疫原性のもので
はない。むしろ、それらは免疫系が働く態様から、ワク
チンとしては効果的ではない。
【0005】脊椎動物の免疫系は幾つかの相互作用的要
素から構成される。最もよく特徴が表われかつ最も重要
な部分は体液性および細胞性(細胞溶解性の)ブランチ
である。体液性免疫は、体液内に分泌しかつ直接的に抗
原を認識するタンパク質、すなわち抗体を含む。細胞系
は、対照的に、外来の抗原を作り出している他の細胞を
認識しかつこれらを殺す特別な細胞に依存している。こ
の基本的機能の違いが免疫防御の2つの異なる戦略を反
映している。体液性免疫は主に動物にとって外因性のも
のである抗原に向けられ、一方細胞系は動物内で活発に
合成される抗原に応答する。
【0006】体液性免疫のエフェクタである抗体分子は
特殊なBリンパ細胞、すなわち抗原に応答するB細胞に
より分泌される。抗体は抗原に結合および直接的にこれ
を不活性化し(抗体を中和し)または抗原を破壊するた
めに免疫系の他の細胞を活性化することが可能である。
【0007】細胞の免疫認識は特殊なクラスのリンパ細
胞、すなわち細胞傷害性T細胞により行なわれる。これ
らの細胞は抗原全体を認識しないが、クラスI主要組織
適合複合体(MHC)分子と呼ばれるタンパク質に結合
した標的細胞の表面上に現われる、抗原の分解したペプ
チドフラグメントに応答する。本質的にすべての核のあ
る細胞はクラスI分子を有している。細胞内で生産され
るタンパク質は正常な細胞の代謝の一環として連続的に
ペプチドに分解されると考えられている。これらのフラ
グメントはMHC分子に結合しかつ細胞の表面に輸送さ
れる。こうして、細胞の免疫系は常に身体のすべての細
胞に生産されるタンパク質のスペクトルを常にモニター
しかつ外来の抗原を生産するいかなる細胞をも除去すべ
く平衡を保っている。
【0008】ワクチン投与は動物を抗原に応答させる準
備のプロセスである。ワクチン投与は、免疫認識よりも
より複雑でかつB細胞および細胞傷害性T細胞を巻き込
むのみならず、他のタイプのリンパ細胞をも巻き込む。
ワクチン投与の間、抗原を認識する細胞(B細胞または
細胞傷害性T細胞)はクローン増殖する。加えて、抗原
に特異的な補助細胞(ヘルパーT細胞)の数もまた増大
する。ワクチン投与はまた抗原を加工しかつ2つの経路
のうちの1つを刺激し得る形でそれを提示し得る特殊化
された抗原提示細胞をも巻き込む。
【0009】ワクチン投与は、ルイ・パスツール(LOUI
S PASTEUR)の時代からほとんど変化していない。外来
の抗原が動物内に導入され、これが表面免疫グロブリン
に結合することにより特異的B細胞を活性化する。これ
はまた抗原プロセシング細胞によっても吸収され、分解
されかつクラスIIMHC分子に結合するこれら細胞の
表面上にフラグメントとなって現われる。クラスII分
子に結合するペプチドはヘルパークラスT細胞を刺激す
ることが可能である。ヘルパーT細胞および活性化され
たB細胞の双方が活性な体液性免疫を生成させるのに必
要である。細胞性免疫は類似するも、あまりよく理解さ
れていないメカニズムにより刺激を受けると考えられて
いる。
【0010】こうして、2つの異なりかつ顕著な抗原処
理の経路は、クラスIIMHC分子に結合した外因性抗
原を生産し、それらはTヘルパー細胞を刺激し、同様に
分解され、クラスIMHC分子に結合し、細胞傷害性ク
ラスのT細胞により認識される内因性タンパク質を生産
する。
【0011】MHC分子の分布においてはほとんどまた
は全く違いが存在しない。本質的にすべての核を有する
細胞はクラスI分子を発現し、一方クラスIIMHCタ
ンパク質は幾つかのタイプのリンパ細胞に制限される。
【0012】通常のワクチン投与方法によれば常にヒト
の免疫反応がもたらされることになる。これらはまた細
胞傷害性免疫をももたらす。体液系は病原体からの引き
続いて起こる攻撃からワクチンを投与されたヒトを保護
しかつもし病原体がその生存期間内に細胞外の段階を経
るならば、細胞内感染が広がることを防止することがで
きるが、しかし、細胞内の病原体を除去するためには相
対的にあまり有効ではない。細胞傷害性免疫は感染した
細胞を除去することにより体液系を補う。したがって、
有効なワクチン投与により双方のタイプの免疫が活性化
されるはずである。
【0013】細胞傷害性T細胞の応答はウイルス等の細
胞内病原体および悪性の細胞を除去するために必要であ
る。十分な応答を確保するために、クラスI分子と関連
して十分な濃度で外因的に投与された抗原を提供するこ
とは困難であることがわかっている。このことが、腫瘍
に特異的な抗原(たとえば乳癌または結腸癌の細胞に対
する)、および免疫原性が弱いウイルスタンパク質(た
とえばHIV,ヘルペス,非−A型および非−B型肝
炎,CMVおよびEBV)に対するワクチンの開発を著
しく妨げてきた。
【0014】抗体が感染性の増大を示すようなウイルス
等の因子に対して免疫処置を行なうには、細胞性免疫応
答だけを与えることが望ましいと考えられる。またこの
ような応答を慢性および潜伏しているウイルス感染なら
びに悪性細胞に対して与えることも有益であると考えら
れる。
【0015】合成ペプチドワクチンの使用はこれらの問
題を解決することにはならない。というのもペプチド
は、組織適合分子と容易に結合せず、血清半減期が短
く、急速に分解され、あるいは抗原提示単球およびマク
ロファージに対して特定的に局在化しないからである。
最良の場合でもすべての外因的に投与された抗原は抗原
提示マクロファージに結びつく自己タンパク質の母集団
と競合しなければならない。
【0016】ヘルペスウイルス、非−Aおよび非−B型
肝炎、HIVその他からの免疫原性に乏しいウイルスタ
ンパク質に対し、免疫反応を引き出すために多くの努力
がなされてきた。これらの病原体を生体外で増殖させる
ことは困難でありかつまた危険なものである。上記のと
おり、ウイルスによりコードされるタンパク質に対応す
る合成ペプチドワクチンが作られてきたが、これらは決
定的な落とし穴を伴うものであった。他のウイルスから
タンパク質を発現させるためにワクシニアウイルスベク
ターを使用する試みもなされてきた。しかしながら、結
果は満足のいくものではなかった。というのも(a)組
換型ワクシニアウイルスは既に免疫のあるヒトの循環か
ら急速に排除されかつ(b)複雑なウイルス抗原の投与
は「抗原競合」として知られる現象を誘因し得るからで
ある。そこにおいて、免疫原性の弱いウイルスの部分は
免疫反応を引き出すことができず、というのもそれらは
投与された抗原のうち他より潜在能力のある領域に負け
てしまうからである。
【0017】タンパク質またはペプチドワクチンに関す
るもう1つの大きな問題は、強い免疫反応をもたらすた
めの努力として抗原の注射を繰返し行なう場合に発生し
得る過敏反応である。この現象においては抗原に応答し
て形成されたIgE抗体が激しいかつ時には死に至るア
レルギー反応を引き起こす。
【0018】したがって、この種のタンパク質またはポ
リペプチドに対して安全でかつ有効な免疫応答を引き起
こすための方法が必要とされている。そのうえ、細胞傷
害性T細胞反応を誘因し、過敏症および血清中の物質の
タンパク質分解を回避しかつ単球およびマクロファージ
への物質の局在化を容易にするために、これらの抗原を
細胞表面上のクラスI組織適合抗原に結合する方法が非
常に必要とされている。
【0019】治療用ペプチドの投与は数多くの疾病状態
に有効である。このようなペプチドには、インターロイ
キン−2、腫瘍壊死因子、およびインターフェロン等の
リンホカイン、神経成長因子、表皮増殖因子およびヒト
成長ホルモン等の成長因子、組織プラスミノーゲンアク
チベーター、因子VIII:C、顆粒球−マクロファー
ジコロニー刺激因子、エリトロポエチン、インスリン、
カルシトニン、チミジンキナーゼなどが含まれる。その
うえ、(リシン、ジフテリア毒素またはコブラの毒液因
子等の)毒性ペプチドを疾病のあるまたは新生物細胞に
選択的に配達することにより大きな治療上の利益がもた
らされ得る。現在のペプチドデリバリーシステムには、
機能的細胞表面受容体を細胞膜に有効に組込むことがで
きないこと、および標的細胞内へまたはこれに対して治
療に必要な量のペプチドを配達するために、大量のペプ
チドを全身的に投薬することの必要性(これは結果とし
て望ましくない全身の副作用をもたらす)を含む重大な
問題が存在している。
【0020】遺伝子治療、免疫化および細胞への治療用
ペプチドのデリバリーに伴う上記の問題に本発明は取組
むものである。
【0021】
【発明の要約】本発明は、インビボで脊椎動物の細胞の
内部に医薬または免疫原性のポリペプチドを配達するた
めの方法を提供し、この方法は製薬的に許容される注射
可能な担体およびポリペプチドを作動的にコードする裸
のポリヌクレオチドを含む調製物を細胞を含む組織の間
質的空間へ導入するステップを含み、これにより裸のポ
リヌクレオチドが細胞の内部に取込まれかつ脊椎動物に
対して免疫原性または薬理学的効果をもたらすものであ
る。またインビボで筋肉細胞にポリヌクレオチドを導入
するための方法も提供され、これは製薬的に許容される
担体内に裸のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する
ステップ、その組成物をインビボで脊椎動物の筋肉組織
に接触させ、これによりポリヌクレオチドが組織の筋肉
細胞に導入されるステップとを含む。このポリヌクレオ
チドはアンチセンスポリヌクレオチドでもよい。代替的
には、このポリヌクレオチドは脊椎動物に対し治療を施
す接触ステップの後に筋肉細胞により発現される治療用
のペプチドをコードしてもよい。同様に、接触ステップ
の後に筋肉細胞により発現されかつ免疫反応を発生し
て、それにより脊椎動物に免疫処置を行なう免疫原性ペ
プチドをコードしてもよい。
【0022】本発明の1つの特に魅力的な局面は、脊椎
動物に対するポリペプチドの長期にわたる投与を行なう
ための方法であって、この方法は脊椎動物の組織内に、
ポリペプチドを作動的にコードする裸のDNA配列を間
質的に導入し、これにより組織の細胞が少なくとも1カ
月または少なくとも3カ月、より好ましくは少なくとも
6カ月にわたってポリペプチドを生産するというステッ
プを含む。本発明の具体例において、ポリペプチドを生
産する細胞は筋肉細胞等の非増殖性の細胞である。
【0023】本発明に従うもう1つの方法は、脊椎動物
におけるポリペプチドの一過性の発現を得るための方法
であり、この方法はポリペプチドを作動的にコードする
裸のmRNA配列を間質的に脊椎動物の組織内に導入
し、これによりその組織の細胞が約20日未満、通常は
約10日未満、およびしばしば3日または5日未満にわ
たってポリペプチドを生産するというステップを含む。
本発明の方法の多くに関しては、固形の組織への投与が
好まれる。
【0024】本発明の1つの重要な局面は、筋ジストロ
フィーの治療のための方法であり、筋ジストロフィーを
患う動物の筋肉細胞内へ、インビボで、製薬的に許容さ
れる注射可能な担体において、ジストロフィンを作動的
にコードするポリヌクレオチドを含む組成物の治療上有
効な量を導入し、これによりポリヌクレオチドが細胞内
に取込まれかつジストロフィンが生体内で生産されると
いうステップを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは
裸のポリヌクレオチドでありかつその組成物は筋肉組織
の間質に導入される。
【0025】本発明はまたここに記載された方法すべて
において使用が考慮される医薬製品を含む。たとえば、
生物学的に活性のポリヌクレオチドを作動的にコードす
る裸のポリヌクレオチドを含む医薬製品がある。該ポリ
ヌクレオチドは容器内に、生理学的に許容される投与可
能な形で含まれ、さらに医薬製品は、薬物の生産、使用
または販売を規制する政府の省庁により規定された形で
該容器に付随する注意書を有し、その注意書はヒトまた
は動物への投与のためのポリヌクレオチドのその形態に
関してその省庁が承認したということを表わすものであ
る。このような注意書は、たとえば米国食品医薬品局に
より承認された処方薬のためのラベルまたは承認された
製品挿入物でもよい。
【0026】もう1つの具体例において、本発明は医薬
製品を提供し、この製品は、組織の細胞にポリペプチド
を発現させるため組織内へ間質的に導入するのに適した
生理学的に許容される注射可能な担体内の溶液中の生物
学的に活性なペプチドを作動的にコードする裸のポリヌ
クレオチドと、その溶液を収容する容器と、この容器に
付随する注意書とを含み、その注意書は薬物の製造、使
用または販売を規制する政府の省庁により規定された形
式のものであり、その注意書は、ヒトまたは動物に投与
するためのポリヌクレオチド溶液の製造、使用または販
売に関してその省庁が承認を与えたということを反映す
る。そのペプチドは免疫原性のものとすることができ、
その溶液の投与は、ヒトまたは動物に対するワクチン処
置の役割を果たし得る。同様に、ペプチドは治療用にも
なり得、ポリペプチドに関し治療の必要な脊椎動物に、
この溶液を投与することにより治療上の効果がもたらさ
れる。
【0027】本発明はまた医薬製品を提供し、この製品
は、組織の細胞にポリヌクレオチドの取込みを引き起こ
させかつ治療効果をもたらすため、組織内へ間質的に導
入するのに適した生理的に許容される注射可能な担体に
おける溶液での裸のアンチセンスポリヌクレオチドと、
その溶液を収める容器と、薬物の製造、使用または販売
を管轄する政府の省庁により規定される形式での容器に
添付された注意書とを含み、その注意書はヒトまたは動
物への投与のためのポリヌクレオチドの溶液の製造、使
用、または販売に関してその省庁が承認したということ
を反映するものである。
【0028】本発明の1つの特に重要な局面は、減菌し
た、製薬的に許容される担体と、ジストロフィンを作動
的にコードする製薬的に有効な量の裸のポリヌクレオチ
ドと、担体およびポリヌクレオチドを無菌状態で収める
容器とを含む、筋ジストロフィー治療のための医薬製品
に関する。
【0029】好ましくは、このポリヌクレオチドはDN
Aである。もう1つの側面から、本発明は脊椎動物に生
物学的に活性のポリペプチドを供給するうえで使用され
る医薬製品を含み、この製品はポリヌクレオチドを作動
的にコードする製薬的に有効な量の裸のポリヌクレオチ
ド、無菌状態で担体とポリヌクレオチドとを収める容
器、およびこの容器に付随して、この容器から組織の間
質的空間へポリヌクレオチドを移すことを可能にし、こ
れにより組織の細胞がポリヌクレオチドを取込みかつこ
れを発現するための手段を含むものである。このような
移すことを可能にするための手段には針等により突き刺
すことが可能な従来の隔壁を含み得る。代替的には、そ
の容器が注射器の場合には、その手段は注射器のプラン
ジャーまたは注射器に取付けられた針を含むと考えられ
得る。本発明で使用される容器は、通常1またはそれ以
上の単位用量を提供するために少なくとも1、好ましく
は少なくとも5または10、より好ましくは少なくとも
50または100マイクログラムのポリヌクレオチドを
有することになる。多くの用途に関して、この容器は少
なくとも500マイクログラムまたは1ミリグラムを有
することになり、しばしば少なくとも50または100
ミリグラムのポリヌクレオチドを含有することになるで
あろう。
【0030】本発明のもう1つの局面は、脊椎動物に免
疫処置を行なううえでの使用のための医薬製品を提供
し、この製品は、免疫原性ポリペプチドを作動的にコー
ドする製薬的に有効な量の裸のポリペプチドと、無菌状
態でこのポリヌクレオチドを収める封止された容器と、
この容器に付随して、容器から組織の間質的空間にポリ
ヌクレオチドを移すことを可能にし、これによりその組
織の細胞がポリヌクレオチドを取込みかつこれを発現さ
せるための手段とを含む。
【0031】本発明のもう1つの局面は、組織を含む細
胞にポリペプチドを生産させるために間質的に組織内に
導入するための医薬調製物において生理学的に活性のポ
リペプチドを作動的にコードする裸のポリヌクレオチド
を使用することである。その医薬とは、たとえば筋肉組
織内への導入により筋肉細胞がポリペプチドを生産する
ためのものでもよい。また、ペプチドがジストロフィン
でありかつ医薬が筋ジストロフィーの治療のためのもの
である場合のような使用も考えられる。
【0032】本発明に従うもう1つの用途は、脊椎動物
の細胞内でのポリヌクレオチドの翻訳を抑制するために
脊椎動物の組織内に間質的に導入するための医薬調製物
において裸のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する
ことである。
【0033】ポリヌクレオチドが導入される組織は持続
性非分裂細胞であり得る。ポリヌクレオチドはDNAま
たはRNA配列のいずれでもよい。ポリヌクレオチドが
DNAである場合、それ自体は非複製性であるが、プラ
スミドに挿入されているDNA配列とすることができ
る。該プラスミドは、さらにレプリケーターを含む。D
NAは宿主細胞ゲノム内へ組込まれないように作られた
配列でもよい。ポリヌクレオチドの配列は、細胞内に含
有されるかもしくはそこから分泌されるかのいずれかの
ポリペプチドをコードするものでもよく、またはペプチ
ドの分泌を誘導する配列を含み得る。
【0034】DNA配列はまたプロモータ配列を含み得
る。1つの好ましい具体例においては、DNA配列は予
め定められた細胞においてのみDNAの実質的な転写を
可能にする細胞特異的プロモータを含む。DNAはまた
DNAを転写するためのポリメラーゼをコードし、かつ
ポリメラーゼのための認識部位を含み得、注射可能な調
製物は初回量のポリメラーゼを含み得る。
【0035】多くの場合、ポリペプチドの配達が一過性
のものとなるようにポリヌクレオチドの翻訳が限定され
た期間において行なわれることが好まれる。このポリペ
プチドは、有利に治療用ポリペプチドとすることがで
き、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、特に細胞
表面の受容体、成長因子または他の調節因子等の調節タ
ンパク質、または生きた脊椎動物の細胞に配達すること
を所望されかつこれに関し対応するDNAまたはmRN
Aが得られ得る他のいかなるタンパク質またはペプチド
をも含み得る。
【0036】好ましい具体例において、ポリヌクレオチ
ドは筋肉組織内に導入され、他の具体例において、ポリ
ヌクレオチドは皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓または血液の
組織内へ組込まれる。調製物は様々なルートにより脊椎
動物に注射され、その経路は皮内、皮下、くも膜下もし
くは静脈であり得、あるいは身体の腔内でもよい。好ま
しい具体例において、ポリヌクレオチドは筋肉内に注射
される。他の具体例において、ポリヌクレオチドを含む
調製物は皮膚内に圧入される。吸入と同様、経皮的投与
についても考慮される。
【0037】1つの好ましい具体例において、ポリヌク
レオチドはDNAを転写するためのポリメラーゼとポリ
ペプチドの双方をコードするDNAであり、かつDNA
はポリメラーゼのための認識部位を含み、かつ注射可能
な調製物はさらに初回量のポリメラーゼを細胞内に提供
するための手段を含む。ポリメラーゼの初回量はDNA
と共に物理的に存在し得る。一方、それをコードするm
RNAを含むことにより与えることができ、そのmRN
Aは細胞により翻訳される。本発明の具体例において、
DNAは好ましくはプラスミドである。好ましくは、ポ
リメラーゼはファージT7ポリメラーゼであり、かつそ
の認識部位は配列のT7複製起点である。
【0038】本発明のもう1つの局面に従い、脊椎動物
における特定のポリペプチドの欠陥またはその欠如に関
連する疾病を治療するための方法が提供され、この方法
は特定のポリペプチドをコードする裸のポリヌクレオチ
ドを含む製薬的に許容される注射可能な担体を含む注射
可能な調製物を得るステップと、注射可能な調製物を脊
椎動物に導入しかつそのポリヌクレオチドが細胞内へ組
込まれることを可能にするステップを含み、そこではポ
リペプチドがポリヌクレオチドの翻訳生産物として形成
されかつそれによりポリヌクレオチドの欠陥または欠如
が補われる。好ましい具体例において、この調製物は筋
肉組織内へ導入されかつこの方法は反復して適用され
る。この方法は欠陥またはその欠如が遺伝的欠陥による
ものである場合に有利に適用される。ポリヌクレオチド
は好ましくは非複製性DNA配列である。DNA配列は
また、複製起点を含むプラスミドベクター内へ組込まれ
得る。
【0039】好ましい一具体例において、ポリヌクレオ
チドは非分泌性のポリペプチドをコードし、かつポリペ
プチドは原位置にとどまる。この具体例によれば、ポリ
ヌクレオチドがポリペプチド:ジストロフィンをコード
する場合、デュシェーヌ症候群(Duchennes's syndrom
e)のための治療法を提供し、一方、ポリヌクレオチド
がポリペプチド:フェニルアラニンヒドロキシラーゼを
コードする場合には、この方法はフェニルケトン尿症の
ための治療法を含む。もう1つの好ましい具体例におい
て、ポリヌクレオチドは、細胞により分泌されかつ脊椎
動物の循環内へ解き放たれるポリペプチドをコードし、
特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはヒト
の成長ホルモンをコードする。
【0040】この方法のもう1つの好ましい具体例にお
いて、高コレステロール血症のための治療法が提供さ
れ、コレステロールホメオスタシスに関連する受容体を
コードするポリヌクレオチドが肝細胞内に導入され、該
受容体が細胞により発現される。
【0041】本発明のもう1つの局面に従い、脊椎動物
に免疫処置を施すための方法が提供され、この方法は免
疫原性翻訳生産物をコードする発現可能なポリヌクレオ
チドを含む調製物を得るステップと、脊椎動物にその調
製物を導入するステップとを含み、そこでは、ポリヌク
レオチドの翻訳生産物が脊椎動物の細胞により形成さ
れ、これが免疫原に対する免疫反応を引き出す。この方
法のもう1つの具体例において、注射可能な調製物は、
免疫原性ペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオ
チドを含む製薬的に許容される担体を含み、脊椎動物へ
の該調製物の導入の際には、このポリヌクレオチドが脊
椎動物の細胞内に組込まれ、そこで、そのポリヌクレオ
チドの免疫原性翻訳生産物が形成され、これが免疫原に
対する免疫反応を引き起こす。
【0042】他の具体例において、調製物は、脊椎動物
から得られかつインビトロでポリヌクレオチドによりト
ランスフェクションされた1つまたは2つ以上の細胞を
含み、これによりポリヌクレオチドは細胞内に組込ま
れ、そこにおいてポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生産
物が形成され、これにより、その調製物を脊椎動物へ導
入すると、免疫原に対する免疫反応が引き起こされる。
本発明の任意の具体例において、免疫原性生産物は細胞
により分泌され得、あるいは主要組織適合抗原のコンテ
クストにおいて脊椎動物の細胞により提示され得、これ
により免疫原に対する免疫反応が引起こされる。この方
法は、脊椎動物からの非分裂性分化細胞を使用して行な
うことが可能で、その細胞は血液サンプルから得られる
リンパ球とすることができる。一方、分裂可能な部分的
に分化した繊維芽細胞を使用して行なうこともできる。
好ましい具体例において、この方法は、免疫原性翻訳生
産物をコードするポリヌクレオチドを筋肉組織内に組込
むことにより行なわれる。
【0043】免疫処置のために使用されるポリヌクレオ
チドは好ましくはmRNA配列であるが、非複製性DN
A配列も使用され得る。ポリヌクレオチドは注射可能な
担体のみを使用して身体の組織内に導入することができ
る。脊椎動物から得られた細胞の生体外トランスフェク
ションが行なわれる方法では、リポソーム調製物が好ま
しい。
【0044】担体は好ましくはスクロース溶液によりも
たらされるような等浸透圧、低浸透圧または若干高浸透
圧のものでありかつ比較的低いイオン強度を有する。調
製物はさらにポリペプチドの形態でまたはポリヌクレオ
チドとしてリポソーム内に組込まれるサイトカインの源
を有利に含み得る。
【0045】この方法は体液性免疫反応、細胞性免疫反
応、またはこれらの組合わさったものを選択的に引起こ
すために使用され得る。細胞がクラスIの主要組織適合
複合体を発現しかつ免疫原性ペプチドがクラスI複合体
のコンテキストで提示される具体例においては、免疫反
応は細胞性のものでありかつ細胞傷害性T細胞の生産を
含む。
【0046】このような具体例の1つにおいて、免疫原
性ペプチドはウイルスと結合し、クラスI抗原のコンテ
キストで提示されかつウイルスに感染した細胞を破壊す
る能力がある細胞傷害性T細胞を刺激する。細胞傷害性
T細胞反応もまた、ポリヌクレオチドが体液性エピトー
プを欠く切り詰められたウイルス抗原をコードする場合
の方法に従いもたらされ得る。
【0047】これらのうちもう1つの具体例において、
免疫原性ペプチドは腫瘍と結合し、クラスI抗原のコン
テキストで提示されかつ腫瘍細胞を破壊する能力がある
細胞傷害性T細胞を刺激する。注射可能な調製物が、動
物から採取されインビトロでトランスフェクトされたク
ラスIおよびクラスIIの主要組織適合抗原を発現する
細胞を含むさらにもう1つの具体例において、免疫反応
は体液性および細胞性の両方であり、抗体および細胞傷
害性T細胞の生産を含む。
【0048】もう1つの具体例において、脊椎動物に免
疫処置を施す方法が提供され、この方法は、免疫原性ペ
プチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む
正に荷電されたリポソームを得るステップと、脊椎動物
にそのリポソームを導入するステップとを含み、それに
よりそのリポソームが単球、マクロファージまたは他の
細胞に組込まれ、そこで、ポリヌクレオチドの免疫原性
翻訳生産物が形成されかつその生産物が主要組織適合複
合体のコンテキストにおいて細胞により処理されかつ提
示され、それにより免疫原に対する免疫反応が引起こさ
れる。ここでも、ポリヌクレオチドは好ましくはmRN
Aであるが、DNAが使用されてもよい。そして先程と
同様、この方法は注射可能な担体中のポリヌクレオチド
のみを使用して、リポソーム抜きで実施されてもよい。
【0049】本発明はまた、ポリペプチドと、DNAを
転写するためのポリメラーゼとをコードするDNAの使
用をも包含し、かつDNAはポリメラーゼのための認識
部位を含む。ポリメラーゼの初回量は調製物の中にそれ
をコードするmRNAを含むことにより提供され、その
mRNAは細胞により翻訳される。そのmRNAには、
細胞におけるその分解を遅延させる手段を設けることが
好ましい。これには、mRNAをキャッピングするこ
と、mRNAを環状化すること、またはmRNAの5′
末端を化学的にブロックすることを含み得る。本発明で
使用されるDNAは線状DNAの形態でもよいしまたは
プラスミドでもよい。エピソームのDNAも考えられ
る。1つの好ましいポリメラーゼとしてはファージT7
RNAポリメラーゼがありかつ好ましい認識部位として
はT7RNAポリメラーゼプロモーターがある。
【0050】
【発明のより詳細な説明】本発明の実施には、脊椎動物
の細胞内へ組込まれるポリペプチドを作動的にコードす
る裸のポリヌクレオチドを得ることが必要である。ポリ
ヌクレオチドは、プロモータ等の標的細胞による発現の
ために必要なすべての遺伝子情報を有している場合にポ
リペプチドを作動的にコードする。これらのポリヌクレ
オチドは、脊椎動物の細胞に注入可能な物質を配達する
任意の方法によって、たとえば筋肉または皮膚等の組織
の間質的空間内へ注射することにより、循環系または自
身のキャビティ内への導入、または吸入もしくは吹込み
等により脊椎動物に対して投与され得る。裸のポリヌク
レオチドは注射されるかまたは他の態様では製薬的に許
容される液体の担体で動物に配達される。すべての適用
に関し、この液体の担体は水または部分的に水であり、
無菌の、パイロジェンを含まない水を含む。調製物のp
Hは適当に調節されかつ緩衝される。
【0051】リポソームの使用を必要とする本発明の具
体例において、たとえば、ポリヌクレオチドがリポソー
ムと結合される場合、リポソーム、好ましくはカチオン
性のまたはプラスに荷電されたリポソームを成形するた
めの材料が必要であり、かつリポソームの調製物がこれ
らの材料から作られることが必要である。リポソームの
材料が準備できれば、ポリヌクレオチドは、免疫を施す
因子として使用するためインビトロで細胞をトランスフ
ェクトするのに有利に使用することができ、あるいは、
リポソームが食細胞により取込まれ得る体の部位へポリ
ヌクレオチドを投与するのに有利に使用することができ
る。
【0052】ポリヌクレオチドの材料 本発明の方法に従い使用される裸のポリヌクレオチドの
材料は、DNAおよびRNAの配列または治療上有益な
用途を有するポリペプチドをコードするDNAおよびR
NA配列を含む。これらのポリヌクレオチドの配列は、
細胞内への侵入を容易にするために作用するいかなる配
達用媒介物をも伴っていないという意味で「裸」であ
り、たとえばそのようなポリヌクレオチドの配列は、ウ
イルスの配列、特に遺伝情報を運び得るいかなるウイル
ス粒子をも伴っていない。それらは、トランスフェクシ
ョンを促進するいかなる物質、たとえばリポソームの製
剤、リポフェクチン等の荷電した脂質またはCaPO4
等の沈殿剤を同様に伴っておらず、これらに対して裸で
ある。
【0053】これらの方法において使用されるDNAの
配列は宿主細胞のゲノム内に統合しない配列が可能であ
る。これらは非複製性のDNA配列か、またはゲノム−
統合能力に欠けるように遺伝子操作により作られた特異
的な複製配列でもよい。
【0054】本発明のポリヌクレオチドの配列は、細胞
により取込まれた後に治療的な効果を有するDNAまた
はRNA配列である。それら自身が治療用であるポリヌ
クレオチドの例としてはアンチセンスDNAおよびRN
A,アンチセンスRNAをコードするDNA、または欠
陥のあるまたは不良の内因性の分子を置換するtRNA
もしくはrRNAをコードするDNAがある。本発明の
ポリヌクレオチドはまた治療用ポリペプチドをコードす
ることができる。ポリペプチドは大きさに関わりなくか
つグリコシル化しているかどうかに関わりなくポリヌク
レオチドの何らかの翻訳生産物であると理解される。治
療用ポリペプチドは、主要な例として、動物における欠
陥のあるまたは欠失のある種を補うことができるポリペ
プチド、または毒性の効果を通じて身体から有害な細胞
を制限または除去する役割を果たすものを含む。
【0055】本発明により提供される治療用ポリヌクレ
オチドはまた体液性または細胞性反応またはその双方を
引起こす内因性の免疫原として作用し得る免疫供与ポリ
ペプチドをコードし得る。本発明に従い使用されるポリ
ヌクレオチドはまた抗体をコードし得る。この点に関し
て、「抗体」という用語は、任意のクラスの免疫グロブ
リン全体、二重または多重の抗原特異性もしくはエピト
ープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗
体、ならびにハイブリッドフラグメントを含むF(a
b)2、Fab’、Fab等のフラグメントを包含す
る。「抗体」の意味に含まれるものとしてはこの他にこ
のようなフラグメントの接合体、および、たとえば米国
特許第4,704,692号に記載されるようないわゆる抗原結
合タンパク質(単鎖抗体)があり、この特許の内容はこ
こに引用により援用される。
【0056】したがって、抗体の可変領域をコードする
分離されたポリヌクレオチドを本発明に従い導入するこ
とができ、これは処置を受けた対象が生体の原位置で抗
体を生産することを可能にする。抗体をコードするポリ
ヌクレオチドを得ることに関する代表的な方法に関して
は、Ward et al. Nature, 341:544-546(1989);Gill
ies et al., Biotechnol. 7:799-804(1989);および
Nakatani et al., loc, cit, 805-810(1989)を参照の
こと。抗体の方は、たとえば病原体に伴う表面抗原に結
合することにより治療的効果を奏すると考えられる。一
方、コードされる抗体として、たとえば米国特許第4,69
9,880号に記載されるような抗イディオタイプ抗体(他
の抗体と結合する抗体)が可能である。このような抗イ
ディオタイプ抗体は、治療を受ける個体において内生的
抗体または外来の抗体と結合することが可能で、それに
よりたとえば自己免疫疾患が原因の免疫反応に関連する
病的状態を改善したりまたはこれを防止することができ
る。
【0057】本発明のポリヌクレオチド配列は好ましく
は治療のまたは免疫原性のポリペプチドをコードし、か
つこれらの配列はこれらポリペプチドの発現を制御する
調節タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列
と共同して使用され得る。この調節タンパク質は、その
転写を調節するようにゲノムのDNAに結合することに
より作用することができ、一方、メッセンジャーRNA
に結合してその安定性または翻訳効率を増加させたりま
たは減少させたりすることができる。
【0058】インビボの細胞に配達されるポリヌクレオ
チド材料は様々な形式をとることが可能で、かつ本発明
は何か特定のポリペプチドまたはポリペプチドの群をコ
ードする何か特定のポリヌクレオチドに限定されるわけ
ではない。遺伝子のフラグメントのみを含んでもよい
し、複数のポリペプチド配列をコードしてもよいし、付
加的に認識およびプロモータ配列を含んでもよい。多数
の生理学的に活性のペプチドおよび抗原または免疫原を
コードする遺伝子を含むプラスミドが文献で報告されて
おり、当業者により容易に入手可能である。
【0059】ポリヌクレオチドがDNAである場合、様
々な脊椎動物系においての使用に適するプロモータがよ
く知られている。たとえば、マウスの系における使用に
適当な強いプロモータには、RSV LTR、MPSV
LTR、SV40 IEP、およびメタロチオネイン
プロモータが含まれる。これに対し、ヒトにおいてはC
MV IEP等のプロモータが有利に使用され得る。す
べての形態のDNAで、それが複製性または非複製性で
あるにかかわらず、ゲノムに統合されずかつ発現可能で
あるものは本発明により考慮される方法の範囲内にあ
る。
【0060】自動化された核酸合成装置が入手可能であ
るので、DNAおよびRNA双方とも、ヌクレオチド配
列が知られているとき直接的に、あるいはPCRクロー
ニングおよび醗酵の組合せにより合成され得る。そのう
え、所望のポリペプチドの配列が知られている場合に
は、ポリヌクレオチドのための適当なコード配列が推定
され得る。
【0061】ポリヌクレオチドがmRNAである場合、
対応するDNAからインビトロで容易に準備することが
可能である。たとえば、従来技術では、ファージRNA
ポリメラーゼSP6、T3またはT7を利用して、個々
のリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下でDNA
テンプレートからmRNAを調製する。T7複製起点等
の適切なファージプロモータを、転写されるべき遺伝子
のすぐ上流のテンプレートDNAに配置する。このよう
な態様でT7を利用するシステムがよく知られており、
かつ文献にも記載され、たとえばCurrent Protocols in
Molecular Biology, §3.8(VOL.1 1988)等に記載さ
れている。
【0062】本発明において使用されるmRNAを入手
するための特に好ましい方法が例2〜5に示されてい
る。一般的に、しかしながら、当該技術の一般的な技術
者により容易に製作され得るpXGBプラスミドまたは
任意の類似のプラスミドを本発明を実施するうえでほぼ
無制限な数のcDNAと共に使用できることは明らかな
はずである。このようなプラスミドは、5′非翻訳領
域、3′非翻訳領域およびポリAトラクトのためのテン
プレートが続く必要なRNAポリメラーゼのためのプロ
モータを有利に含み得る。これら5′領域と3′領域の
間に、任意の必要なcDNAをプラスミドに挿入するこ
とを容易にする特有の制限部位が存在すべきである。そ
こで、必要な遺伝子を含有するプラスミドをクローン化
した後、ポリアデニル化領域において切断することによ
りプラスミドを線状化し、インビトロで転写してmRN
A転写物を形成する。これら転写物は好ましくは例5で
示されるような5′キャップを設けられる。代替的に
は、5′キャップを必要としないEMC等の5′非翻訳
配列が使用され得る。
【0063】上記がmRNAを準備するための好ましい
方法を表わしている一方、多くの代替的方法がさらに存
在することは当業者に明らかである。たとえば、mRN
Aは市販のヌクレオチド合成装置により準備され得る。
代替的には、環状形のmRNAが準備され得る。抗エキ
ソヌクレアーゼRNAたとえば環状mRNA,化学的に
ブロックされたmRNAおよび5′キャップを有するm
RNA等が好ましく、というのはそれらが生体内におい
てより長い半減期を有するからである。
【0064】特に、1つの好ましいmRNAには、興味
の遺伝子に先行してポリオウイルスの5′非翻訳領域が
ある自己環状化mRNAがある。この環状mRNAが極
度に長い半減期を有し(Harland & Misher, Developmen
t 102:837-852(1988))かつポリオウイルス5′非翻
訳領域が通常の5′キャップなしでmRNAの翻訳を促
進することができる(Pelletier & Sonnenberg, Nature
334:320-325(1988)ここに引用により援用する)こ
とが実証されている。
【0065】この材料は、自己スプライシング性であり
かつ環状の「ラリアット」(投げ輪)mRNAを生成さ
せるDNAテンプレートから、Been & Cech, Cell 47:
206-216(1986)(ここに引用により援用する)の方法
を利用して調製され得る。我々は、このテンプレートを
Mniatis, T. et al. MOLECULAR CLONING:A LABORATORY
MANUAL, Cold Spring Harbor, New York(1982)の方
法に従い、興味の遺伝子のすぐ上流にポリオウイルスの
5′非翻訳領域を含めることにより修飾した。
【0066】加えて、本発明はRNAse(RNアーゼ
またはリボヌクレアーゼ)によるアクセスを防止する目
的で5′および/または3′末端で化学的にブロックさ
れたmRNAの使用を含む(この酵素(RNAse)は
エキソヌクレアーゼであり、したがって鎖の真ん中でR
NAを分割することはない)。このような化学的ブロッ
クによりインビボでのRNAの半減期を実質的に延ばす
ことができる。RNAを修飾するために使用することが
できる2つの試薬がClonetech Lanoratories,Inc., Pal
o Alto, Californiaから入手可能であり、これらはC2 A
mino Modifier(カタログ番号5204−1)と、Amino
-7-dUTP(カタログ番号K1022−1)である。これ
らの材料はRNAに反応性の基を付加する。これらの試
薬のいずれかを興味のRNA分子に導入した後、適切な
反応性の置換基を製造者の指示に従いRNAに連結する
ことができる。十分な大きさを有する基を付加すること
によりRNAseによる化学的に修飾されたRNAへの
アクセスが防止され得る。
【0067】一過性の遺伝子治療 過去に提案された遺伝子治療と異なり、本発明の1つの
主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチドの合成が
一過性の性質のものである点である。(我々はこれを可
逆的遺伝子治療またはTGTと呼ぶ)。本発明に従いm
RNAを導入すると、その効果は一般的には約1日持続
することになる。また過去に提案された遺伝子治療と顕
著に異なる点は、mRNAはタンパク質の合成を誘導す
るために核に浸透する必要がなく、したがってmRNA
は遺伝を担う性質を有している必要がないことである。
【0068】しかしながら、幾つかの状況においては、
宿主の生体のゲノム内へ外因的ポリ核酸を組込むことな
しに効果がより持続することが望まれる。このような効
果を奏するために、本発明の好ましい具体例は、細胞内
へ特異的ポリペプチドをコードするDNA配列を導入す
るステップを設ける。我々が発見したところによると、
本発明の方法に従えば、非複製性DNA配列を細胞内に
導入し、所望のポリペプチドを約6ヵ月までの期間にわ
たって生成させることが可能であり、さらに我々の観察
では、当該DNA配列が細胞のゲノムに統合されている
ことを示す証拠は見出されていない。一方、さらに長期
にわたる効果が、内部にDNA配列を挿入されたベクタ
ープラスミドによって細胞にDNA配列を導入すること
により達成され得る。好ましくは、プラスミドはさらに
レプリケーターを含む。このようなプラスミドは当業者
には周知であり、たとえば、レプリケーターpMB1を
有するプラスミドpBR322またはレプリケーターC
olE1を有するプラスミドpMK16がそれである
(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley and Sons, New York(1988)§II:1.5.
2.)。
【0069】例1および13に記載されるような筋肉細
胞内へ導入されたDNAおよびmRNAの発現過程の研
究結果から、DNA発現よりも持続時間は短いが、mR
NAの発現はより急速であることが示された。迅速でか
つ長く持続する遺伝子の発現は、DNAと、たとえばフ
ァージポリメラーゼT7、T3およびSP6などのRN
Aポリメラーゼとを含むリポソームの調製物を細胞内に
投与することにより達成され得る。リポソームはまた、
実際の酵素自体を含むかまたはその酵素をコードするm
RNAを含むことにより、適当なRNAポリメラーゼの
開始源を含む。リポソームが生体内に導入される場合、
DNAおよびRNAポリメラーゼの開始源が細胞へ配達
される。RNAポリメラーゼは導入されたDNA上のプ
ロモータを認識して双方の遺伝子を転写し、結果として
より多くのRNAポリメラーゼおよび所望のポリペプチ
ドを含む翻訳生産物を生じさせる。これらの材料の生産
は、導入されたDNA(通常プラスミドの形態である)
が分解するまで継続する。この態様で、インビボでの所
望のポリペプチドの生産が2〜3時間で達成され、1ヵ
月またはそれ以上の期間にわたって継続され得る。
【0070】遺伝病の治療に限定されるわけではない
が、本発明の方法はしたがって失われたまたは欠陥のあ
る遺伝子の配達および機能的発現を要する治療法に適用
することができる。
【0071】ポリヌクレオチドは筋肉、皮膚、脳、肺、
肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟
骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、睾丸、卵巣、子宮、直
腸、神経系、目、腺および結合組織の組織を含む動物の
身体組織の間質的空間に配達され得る。組織の間質的空
間とは、生体組織の細網繊維の間、管もしくは室の壁の
弾性繊維の間、線維組織のコラーゲン繊維の間の細胞間
液状ムコ多糖マトリクス、あるいは筋肉細胞を収める結
合組織内のまたは骨小腔の同様のマトリクスを含む。こ
れは同様に、循環系のプラズマおよびリンパ管チャネル
のリンパ液により占められる空間である。筋肉組織の間
質的空間への配達は以下の理由により好まれる。ポリヌ
クレオチドは、筋肉細胞を含む組織への注射により都合
よく配達することができる。分化した持続して非分裂の
細胞にポリヌクレオチドを配達し、発現させることが好
ましいが、配達および発現を、分化していないあるいは
完全に分化していない細胞、たとえば血液の幹細胞また
は皮膚の繊維芽細胞において行ってもよい。我々の発見
によれば、インビボの筋肉細胞は特にポリヌクレオチド
を取込みかつこれを発現する能力に優れている。この能
力は、多核細胞、筋小胞体および横行管状系を含む、筋
肉の特異的組織構造に起因するものかもしれない。ポリ
ヌクレオチドは横行管状系を介し筋肉に入ることが可能
で、この系は細胞外体液を含みかつ筋肉細胞の奥深く延
びている。ポリヌクレオチドが損傷を受けた筋肉細胞に
入りそれからその細胞が回復するということも可能であ
る。
【0072】筋肉はまた、数多くの治療上の用途におい
てポリヌクレオチドの配達および発現のための場所とし
て有利に使用することができる。というのも、動物は比
較的大きな筋肉の塊を有しており、それは皮膚を介する
直接的注射により都合よくアクセスされ、この理由から
比較的多量のポリヌクレオチドを複数回の注射により筋
肉に与えることが可能で、長期間にわたって治療を延長
するために繰返し注射を行なうことが簡単にでき、特別
の熟練または装置なしに安全に行うことができるからで
ある。
【0073】一連の一般的戦略において、ポリヌクレオ
チドを注射しかつ発現させるための場所として筋肉組織
を使用することが可能であるが、これは典型的な例であ
り、これに限定されるものではない。第1に、欠陥のあ
るまたは欠損のある遺伝子生産物に関連する筋肉の障害
は、非分泌遺伝子生産物をコードするポリヌクレオチド
を疾病のある筋肉組織内に導入することにより治療され
得る。第2の戦略として、遺伝子生産物の欠如による他
の生体または組織の障害およびその結果としての循環す
る毒性代謝物の蓄積は、筋肉組織に特定の治療用ポリペ
プチドを導入することにより治療することができ、そこ
において、非分泌遺伝子生産物が発現され、循環する代
謝物を浄化する。第3の戦略として、分泌可能な治療用
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを筋肉組織
に注射することができ、そこから、ポリペプチドは循環
系に放出され、代謝の標的を探すようになる。この使用
は例18の、筋肉内へ注射された成長ホルモン遺伝子の
発現において示される。ある種のDNAセグメントは分
泌を命令する「信号」としての役割を果たすことが知ら
れており、(Wickner, W. T. and H. F. Lodish, Scien
ce 230:400-407(1985))、これらは有利に使用され
得る。さらに、免疫化の戦略として、筋肉細胞に免疫原
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを注射してもよ
く、これらのペプチドは、免疫原に対し選択された免疫
反応を誘発するよう主要組織適合複合体の抗原のコンテ
キストにおいて筋肉細胞により提示されることになる。
【0074】筋肉以外で、注射されるポリヌクレオチド
をより低い効率で取込みかつ発現させる他の組織は、そ
れでもある種の条件下で治療用ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドを生産するために注射場所として有利に使
用され得る。そのような条件の1つが、たとえばコレス
テロールホメオスタシスと関連する肝細胞の細胞表面受
容体等の特異のタイプの細胞と共同して存在しなければ
有効でないポリペプチドを与えるポリヌクレオチドの使
用である(Brown and Goldstein, Science 232:34-47
(1986))。この適用において、またたとえば酵素また
はホルモンが遺伝子生産物であるような場合の多くの他
の適用においては、価値ある治療結果をもたらすため
に、高いレベルの発現を達成する必要がない。
【0075】TGTの1つの応用は筋ジストロフィの治
療におけるものである。筋ジストロフィの遺伝子的根拠
はちょうど解かれ始めたところである。デュシェーヌ/
ベッカー(Duchenne/Becker)筋ジストロフィに関連す
る遺伝子は近年クローン化され、ジストロフィン(dyst
rophin)と呼ばれる比較的大きなタンパク質をコードす
る。レトロウイルスのベクターはそれほど有用ではない
ようであり、なぜならそれらはジストロフィンのための
比較的大きなサイズのcDNA(約13kb)を収容す
ることができないからである。ごく最近の報告された研
究は筋芽細胞を移植することに集中しているが、この方
策の利用性は依然としてはっきりしないままである。明
らかに、魅力的な方策はデュシェーヌを有する患者の筋
肉の中においてジストロフィン遺伝子を直接発現させる
ことであるだろう。ほとんどの患者が呼吸不全で死ぬの
で、呼吸に関与する筋肉が第1の目標になるであろう。
【0076】別の応用は嚢胞性線維病の治療においてで
ある。嚢胞性線維病に対する遺伝子が最近同定された
(Goodfellow, P. Nature, 341(6238):102-3(Sept.
14,1989);Rommens, J. et al. Science, 245(492
2):1059-1065(September 8, 1989);Beardsley, T.
et al. Scientific American, 261(5):28-30(198
9))。徴候の著しい改善は、適当な肺細胞内の機能不
全タンパク質の発現によって達成可能であるはずであ
る。気管支の上皮細胞は適当な目標とする肺細胞である
はずである。また、それらは遺伝子の肺への点滴注入に
続く遺伝子移植に利用しやすいであろう。嚢胞性線維病
は常染色体の劣性障害であるので、肺の徴候を顕著に改
善するには嚢胞性線維病遺伝子産物の通常のレベルのわ
ずか5%程度を達成すればよいであろう。
【0077】中間代謝の生化学的遺伝子欠陥もまたTG
Tによって治療され得る。これらの病気はフェニルケト
ン尿症、ガラクトース血症、カエデシロップ病、ホモシ
スチン尿症、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、
およびアデノシンデアミナーゼ欠乏症を含む。これらの
障害のほとんどにおける病気の原因は、循環毒性代謝物
のフェニルケトン尿症(PKU)のモデルに適合する。
すなわち、酵素遮断のために、体に対して毒性のある生
化学物質が体液に蓄積される。これらの障害はいくつか
の理由から遺伝子療法に理想的である。第一に、患者が
顕著に改善するよう循環する毒性代謝物質を顕著に十分
取除くためには、酵素活性の通常のレベルのわずか5%
程度を達成すればよいと考えられるからである。第二
に、移植される遺伝子は、様々な組織において最もよく
発現され得るであろうし、さらに毒性の生化学物質を取
除くことができるであろうからである。
【0078】可逆的遺伝子療法はまた、細胞室内または
核内のタンパク質発現を必要とする治療法において使用
され得る。幾つかのタンパク質は核DNAにおける特定
のプロモータ領域に結合することによって転写を制御す
ることができるということが知られている。他のタンパ
ク質はRNAに結合し、その分解、核からの輸送、また
は翻訳効率を制御する。このクラスのタンパク質は活性
のために細胞内に配達されねばならない。組換転写また
は翻訳制御のタンパク質の細胞外の配達は、生物学的活
性をもたらさないと考えられるが、TGTによるDNA
またはRNAの機能的配達は活性であるであろう。TG
Tから恩恵を被るであろうこの型の代表的なタンパク質
はNEF、TAT、ステロイド受容体およびレチノイド
受容体を含む。
【0079】遺伝子療法は、AIDS患者のHIV感染
に対する抵抗を増加するための対策において使用され得
る。AIDS抵抗性遺伝子、たとえば、NEF遺伝子ま
たは溶解性CD4遺伝子のような出芽を防ぐものをAI
DS患者のT細胞に導入することにより、その患者のT
細胞はそれほど活性なAIDSウイルスを生産すること
ができなくなるであろうし、こうして免疫系の細胞をう
まく調節し、T細胞依存性の免疫応答を装備する能力を
改善する。かくして、本発明に従い、AIDS患者自身
のT細胞群が患者の血液から分離される。これら細胞
は、次にインビトロでトランスフェクトされ、それから
患者の血液に再導入される。ウイルス抵抗性細胞は通常
の細胞に対して選択的な利点を有し、結局、患者のリン
パ系を再増殖させる。マクロファージまたは他の標的細
胞に対するDNAの全身性のデリバリーは、体外の治療
法に加えて使用され得る。この方法によりマクロファー
ジ貯蔵器におけるウイルスを全滅させることは予想され
ないであろうが、それはT細胞のレベルを増加し、かつ
患者の免疫応答を改善する。
【0080】ここに示された全身性の方法のすべてにお
いて、効果的なDNAまたはmRNAの用量は、通常、
約0.05μg/kgから約50mg/kgの範囲で、
通常約0.005〜5mg/kgであるだろう。しかし
ながら、理解されるであろうように、この用量はDNA
またはmRNAによってコードされるペプチドおよび使
用される特定のペプチドの活性に従って当業者には明白
な態様で変化するであろう。アデノシンデアミナーゼの
マウスまたはヒトへの配達について、たとえば、適当な
レベルの翻訳物は、約0.5ないし5mg/kgのDN
AまたはmRNAの用量で達成される。例10を参照さ
れたい。この情報から、活性の知られた他のペプチドに
対する用量が容易に決定され得る。
【0081】重要なタンパク質の欠乏に起因する病気
は、これらのタンパク質をコードするDNAまたはmR
NAを分化した細胞に導入することによって適当に治療
されてもよい。神経成長因子および繊維芽細胞成長因子
のような様々な成長因子がアルツハイマー病の動物モデ
ルにおいて生存するニューロンの細胞に影響を及ぼすこ
とが示されている。年をとったラットのモデルでは、N
GF注入がコリン作動系ニューロンの損失を後退させ
た。房脳弓外傷のラットにおいては、遺伝子的に修飾さ
れた線維芽細胞からのNGF注入または分泌もまたコリ
ン作動系機能の損失を防いだ。コリン作動系活性はアル
ツハイマー病を有する患者において減少する。成長因子
を発現する導入された遺伝子の脳内での発現は、特定の
ニューロン群の機能の損失を後退させることができる。
【0082】アルツハイマー病の治療における本発明に
従い、ニューロン成長因子のための遺伝子の、頭蓋腔を
覆う細胞へのトランスフェクションによるDNAまたは
mRNAの導入が使用され得る。特に、本発明は三次元
挿入装置の使用を介する実質組織中への約10μgない
し約100μgのDNAまたはmRNAの頭蓋内注射に
よってこの病気を治療する。具体的に、注射は内側隔壁
におけるコリン作動系ニューロンを目標とする。DNA
またはmRNA注射は、5′キャップされた3′ポリア
デニル化mRNAについて1日ないし3日置きに、環状
mRNAについて1週間ないし21日置きに、DNAに
ついて30日ないし60日置きに繰返される。本発明に
従ってDNAの注射もまた意図される。DNAは対応す
る量で注射されるが、しかし、注射の頻度は非常に減少
されるであろう。エピソームのDNAは、たとえば、数
ヵ月にわたり活性であり得るだろうし、再注射は患者の
顕著な症候の緩解に応じて必要となるにすぎないであろ
う。
【0083】さらに、神経伝達物質合成に寄与する酵素
を、導入遺伝子から発現させることができる。たとえ
ば、アセチルコリントランスフェラーゼに対する遺伝子
を、特定領域の脳細胞(ニューロンまたはグリア)内
で、アセチルコリンレベルを増やしかつ脳機能を改善す
るために発現させることができるであろう。
【0084】ドーパミン、ノルエピエフリン、およびG
ABAのような他の神経伝達物質の合成に関わる重要な
酵素はクローン化されておりかつ入手可能である。これ
らの重要な酵素は、脳の局在化領域の中へ遺伝子移植に
よって局所的に増加され得るであろう。これらおよびそ
の他の神経伝達物質の生産が増加すれば、局在化された
神経伝達物質機能の操作、そして、神経伝達物質機能の
障害が重大な役割を果たす広い範囲の脳の病気に、広く
有効であろう。具体的には、これらの病気は、精神分裂
症および躁鬱病およびパーキンソン病を含むことができ
るであろう。パーキンソン病を有する患者は、脳幹神経
節内におけるドーパミン合成物の欠如ゆえの次第に無能
化する運動性制御に苦しむということはよく認められて
いることである。ドーパミン合成のための律速段階は、
酵素、チロシンヒドロキシラーゼによるチロシンからL
−DOPAへの変換である。L−DOPAは、それから
汎存酵素、DOPAデカルボキシラーゼによってドーパ
ミンに変換される。それゆえL−DOPAでのよく確立
された療法は効果的である(少なくとも最初の数年の治
療のためには)。遺伝子療法は、チロシンヒドロキシラ
ーゼおよび可能であればDOPAデカルボキシラーゼに
対する遺伝子を発現させることによって同様の薬理学的
効果をもたらすことができるであろう。チロシンはCN
S内で容易に利用可能である。
【0085】アルファ−1−抗トリプシン欠乏症の遺伝
子型は、肝臓および肺の両方の疾患をもたらし得る。肝
臓疾患は、それほどよく起こらないが、異常タンパク質
の蓄積によって引起こされ、遺伝子療法にそれほど馴染
みやすくはないだろう。しかしながら、肺合併病には、
肺内のアルファ−1−抗トリプシンの発現を増加させる
ことを適用しやすいであろう。これは、無能化しかつ最
終的には致命的な気腫ができるのを妨げるはずである。
【0086】アルファ−1−抗トリプシン欠乏症はまた
タバコ喫煙者においても起こり、なぜならタバコ喫煙が
アルファ−1−抗トリプシン活性を減少させ、そして気
腫をもたらすようセリンプロテアーゼ活性を減少させる
からである。さらに、ある最近のデータはタバコ喫煙の
抗トリプシン効果を大動脈の動脈瘤に結びつけている。
動脈瘤もまた、アルファ−1−抗トリプシンの血液レベ
ルを上昇させることによって防ぐことができ、なぜなら
これが動脈瘤を導くプロテアーゼ活性を減少させるであ
ろうからである。
【0087】肺の変性疾患を有する患者もまた、疾患の
肺組織において蓄積する傾向がある他の毒性代謝物を取
除くことができる酵素の発現から利益を得ることができ
る。スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼは
これらの問題を改善するためにTGTによって配達する
ことができるであろう。
【0088】TGTは細胞表面受容体の配達を必要とす
る治療法において使用され得る。遺伝子の機能的な生体
内配達のための原理体系を解読する必要がないというこ
とが議論され得るであろう。結局、タンパク質の合成お
よび大規模生産のための確立された技術があり、タンパ
ク質は遺伝子発現の最終産物である。この論理は多くの
タンパク質分子に適用され、それらは細胞外で作用する
か、あるいは細胞表面受容体と相互作用するものであ
り、たとえば、組織プラスミノーゲンアクチベーター
(TPA)、成長ホルモン、インスリン、インターフェ
ロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMC
SF)、エリトロポエチン(EPO)などである。しか
しながら、機能的受容体に対し適当な配向でその標的細
胞のプラズマ膜に挿入されるべき組換細胞表面受容体を
適切に配達することに伴う薬剤配達の問題は、今まで手
に負えないもののようであった。
【0089】細胞表面受容体をコードするDNAまたは
RNAが本発明に従って細胞内に配達されるとき、生成
するタンパク質は効果的にかつ機能的に標的細胞表面上
に発現され得る。組換細胞表面受容体の機能的な配達の
問題が依然として解決されないままであるならば、この
療法の問題を解決する唯一の方法は遺伝子配達を介する
ものであろう。遺伝子発現の核または細胞質制御のため
の同様の論理が、RNA転写を制御する(増加または減
少)ためにDNAに結合される核制御因子に適用され、
さらに翻訳効率または分解を増加または減少させるため
にRNAに結合する細胞質制御因子に適用される。この
態様でTGTは嚢胞性線維病、筋ジストロフィおよび高
コレステロール血症の治療のための療法を提供すること
ができるであろう。
【0090】血液におけるコレステロールの上昇したレ
ベルは、本発明に従いLDL表面受容体をコードするm
RNAを肝細胞に供給することによって減少させること
ができる。LDLが上昇した患者の肝臓においてこの受
容体の生産をわずかに上昇させることは著しい療法上の
利益を有する。組換タンパク質の全身投与に基づく療法
は本発明と比べものにならない。なぜなら、ただ単に組
換タンパク質を投与することでは、標的細胞のプラズマ
膜の中に受容体を入れることができないであろうからで
ある。受容体はその生物学的効果を及ぼすために膜の中
に適切に挿入されなければならない。受容体発現のレベ
ルを調節することは通常必ずしも必要ではないが、より
多くの発現があるとより良い。これは、本発明において
使用するためのmRNAの調製に必要な分子生物学を単
純化する。たとえば、LDL受容体遺伝子を含む脂質/
DNAまたはRNA複合体を調製し、反復的なI.V.
注射によって患者に供給することができる。脂質複合体
は肝臓により主として摂取されるであろう。複合体の幾
つかは肝細胞によって摂取されるであろう。肝臓におけ
るLDL受容体のレベルは注射の回数が増えるにつれ次
第に増加するであろう。より高い肝臓LDL受容体レベ
ルはLDLおよびコレステロールの低下をもたらすであ
ろう。効果的なmRNAの用量は、通常、約0.1ない
し約5mg/kgになるであろう。
【0091】TGTの他の有益な応用例には、HIVウ
イルスに感染した患者のマクロファージにチミジンキナ
ーゼ遺伝子を導入することがある。チミジンキナーゼ遺
伝子のマクロファージ貯蔵器への導入は、それらの細胞
がAZTをリン酸化することをより可能にするであろ
う。これは、それらのAZT療法に対する抵抗を克服
し、AZTがマクロファージにおけるHIV保有体を全
滅することができるようにする。チミジンキナーゼ遺伝
子を含む脂質/DNA複合体を調製し、静脈注射を繰り
返すことにより患者に投与することができる。脂質複合
体はマクロファージ貯蔵器によって主に摂取され、マク
ロファージにおけるチミジンキナーゼレベルの上昇をも
たらすであろう。これは、AZT抵抗性細胞をAZTで
治療しやすくする。チミジンキナーゼ療法はまた、HT
LV IIIプロモータの制御下にチミジンキナーゼ遺
伝子をおくことによって集中させることができる。この
戦略によれば、チミジンキナーゼは、HIVウイルスに
よる細胞の感染およびプロモータを活性化するtatタ
ンパク質の製造時にのみ合成されるはずである。類似の
療法により、同じHTLV IIIプロモータの制御下
でジフテリアトキシンに対する遺伝子を細胞に供給する
ことができ、致命的な結果をHIV感染の後にのみ細胞
内に起こすことができる。
【0092】これらのAIDS患者は、TGT法に従っ
てマクロファージにインターフェロン遺伝子を供給する
ことによっても治療され得るであろう。マクロファージ
で局部的に集中してインターフェロン生産のレベルが増
加すれば、マクロファージはHIV感染に対してより抵
抗性になり得る。インターフェロンのレベルが局所的に
高い間は、全身的なレベルは低いままであり、それによ
り組換インターフェロン投与後に観察されるような全身
性の毒性効果を避けることができる。インターフェロン
遺伝子を含む脂質/DNAまたはRNA複合体を、調製
し、静脈注射を繰り返すことにより患者に投与すること
ができる。脂質複合体はマクロファージ貯蔵器によって
主に取込まれ、マクロファージにおいてインターフェロ
ンの局部的に集中したレベルの上昇をもたらすであろ
う。これは、HIV感染に対するマクロファージの感受
性を低くする。
【0093】DNAテンプレート上のジフテリアトキシ
ン遺伝子に癌細胞において当該遺伝子の発現を集中させ
るための組織特異的エンハンサを供給することにより、
TGTを使用して様々な癌が治療され得る。ジフテリア
トキシンの細胞内発現は細胞を殺す。これらのプロモー
タは、組織特異的なものとすることができ、たとえば膵
臓癌に対し膵臓特異的プロモータを使用することができ
る。膵臓細胞に配達された機能的ジフテリアトキシン遺
伝子は膵臓全体を全滅させ得るだろう。この戦略は膵臓
癌患者のための治療として使用し得るであろう。患者は
膵臓なしで生存するのに克服できないような困難を伴う
ことはないだろう。組織特異的エンハンサは、ジフテリ
アトキシンの発現が膵臓細胞のみにおいて起こることを
確実にするであろう。組織特異的エンハンサの制御下で
ジフテリアトキシン遺伝子を含むDNA/脂質複合体
を、膵臓に血液を送るカニューレ挿入された動脈の中に
直接導入することができる。注入は膵臓組織を全滅させ
るのに必要な時間、所定の投与計画に基づき行なわれる
であろう。リシンまたはコブラの毒液因子またはエンテ
ロトキシンに対する遺伝子のようなジフテリアトキシン
以外の他の致命的な遺伝子が同様の効果で用いられるで
あろう。
【0094】また、癌細胞のような周期の早い(早く分
裂する)細胞だけを殺すであろう細胞周期特異的なプロ
モータを使用することによって癌を治療することもでき
るであろう。細胞周期特異的な抹殺はまた、サイクルを
繰り返す細胞においてのみ安定しているキラータンパク
質(たとえば、S期の間だけ安定なヒストンmRNA)
をコードするmRNAを設計することによって達成され
るであろう。また、胎児の肝臓細胞において、かつより
胎児の状態へ脱分化した胚芽腫細胞においてのみ発現さ
れるアルファ−フェトプロテインの使用のような発生上
特異的なプロモータを使用することもできるであろう。
【0095】ある種の癌の癌特性を抑制する網膜芽腫遺
伝子(およびその仲間の他のもの)のような遺伝子の移
植によって特殊化された癌もまた治療することができる
であろう。
【0096】TGT戦略はペプチドの制御され持続され
る配達を提供するために使用され得る。従来の薬剤およ
び組換タンパク質薬剤は徐放デバイスから利益を得るこ
とができる。徐放デバイスの目的はより長い期間にわた
り薬剤を配達することであり、そのため必要とされる服
用の回数が減少される。これは、患者の便利さおよびコ
ンプライアンスにおいて改善をもたらす。徐放を達成す
ることを意図された様々な種類の技術が現われている。
【0097】TGTは治療ペプチドの制御された配達を
得るために使用され得る。制御された発現は細胞特異的
プロモータを含む適当なプロモータを使用することによ
って得ることができる。本発明によって配達される適当
なペプチドは、たとえば、成長ホルモン、インスリン、
インターロイキン、インターフェロン、GMCSF、E
POなどを含む。特定の用途に依存して、選択されたD
NAまたはRNA構造物が、注射された細胞から、全身
性循環に遺伝子生産物を分泌させるように設計すること
ができる。
【0098】TGTはまた、治療ポリペプチドまたはペ
プチドの制御された配達を含み、それは、細胞において
発現されるべきポリヌクレオチドと共に、転写および翻
訳のプロセスを制御する調節タンパク質をコードする付
加的なポリヌクレオチドを含ませることによって達成さ
れる。これらのポリヌクレオチドは、ポリペプチド発現
について促進制御または抑制制御のどちらかをするよう
に作用し、核内においてかまたは細胞質内におけるタン
パク質翻訳事象を制御することによってのどちらかでそ
れらの効果を及ぼすものを含む。
【0099】T7ポリメラーゼ遺伝子は、TGTのより
長い持続期間の効果を得るために関心のある遺伝子と共
に使用することができる。エプスタインバールウイルス
に対する複製起点領域から得られるようなエピソームの
DNAを使用することができ、同様に、哺乳類細胞にお
いて機能的に活性であり、好ましくはヒトの細胞におい
て活性である、他の複製起点からのものも使用すること
ができる。これは、レトロウイルスベクターに共通する
好ましくない統合事象の危険を冒すことなく、多くの細
胞分裂の後、細胞から発現を得る方法である。それ自身
のプロモータ制御下にあるカルシトニン遺伝子を肝臓ま
たは皮膚のような所定の部位に機能的に導入することが
できれば、カルシトニンの放出を制御することができる
であろう。高カルシウム血症を有する癌患者はこの療法
が適用され得るグループであるだろう。
【0100】TGTを使用する他の遺伝子療法は、ポリ
ペプチドに翻訳されることなく、治療効果を有するポリ
ヌクレオチドの使用を含むことができる。たとえば、T
GTは特定の遺伝子の発現を止めるためのアンチセンス
ポリヌクレオチドの配達において使用され得る。従来の
アンチセンス方法論は有効性が乏しいという欠点を有
し、それは部分的には、配達されるオリゴヌクレオチド
配列が短すぎるからである。しかしながら、TGTでは
十分な長さのアンチセンス配列が短いオリゴマーと同様
に容易に配達され得る。アンチセンスポリヌクレオチド
は、内因性のヌクレオチド配列へそれら自身がハイブリ
ダイズする(それによってその転写または翻訳を妨げ
る)DNAまたはRNA分子であり得る。その代わり
に、アンチセンスDNAは内因性の配列にハイブリダイ
ズするRNAをコードして、翻訳を妨げてもよい。この
特質におけるTGTの他の使用は、その存在が病理状態
を引起こす欠陥性のまたは不完全な内因性tRNAまた
はrRNAを置き替えるためにtRNAまたはrRNA
をコードするポリヌクレオチドを配達することを含む。
【0101】細胞特異的プロモータはまた、標的細胞に
のみ遺伝子の発現を許容するために使用され得る。たと
えば、ある遺伝子は腫瘍の特定の型においてのみ成人に
おいて高度にプロモートされる。同様に、特殊化された
組織、たとえば、目の水晶体組織のようなもののための
組織特異的プロモータも同定されており、異種の発現系
において使用されている。
【0102】上述した療法以外に、本発明の方法は牛乳
の生産を増加するため家畜動物に、または食肉のために
育成されている動物の筋肉塊に、ポリヌクレオチドを配
達するために使用され得る。
【0103】DNAおよびmRNAワクチン本発明の方
法に従って、発現可能なDNAおよびmRNAはそこで
ポリヌクレオチド翻訳産物を形成するために細胞に配達
され得る。もし核酸が適切な制御配列を含むのであれ
ば、それらはコードされたタンパク質の比較的多量の合
成を誘導する。細胞に配達されるDNAおよびmRNA
が免疫ペプチドをコードするとき、本発明の方法は、細
胞内ウイルスを含む感染因子あるいは腫瘍細胞に対し、
改善されたより効果的な免疫を達成するために適用する
ことができる。
【0104】すべての脊椎動物の免疫系は同様に作用す
るので、上述した用途は哺乳類および鳥類および魚類を
含むすべての脊椎動物系において実現され得る。
【0105】本発明の方法は、インビボで動物の細胞に
ポリヌクレオチドを直接注射することにより、あるい
は、ある動物の細胞にインビトロでトランスフェクショ
ンした後当該細胞をその動物の体内に再導入することに
より、適用され得る。ポリヌクレオチドは筋肉、皮膚、
脳、肺、肝臓、脾臓、または血球を含む動物の体の様々
な細胞に配達され得る。ポリヌクレオチドのインビボで
の直接的配達は、筋肉または皮膚の細胞に対するものが
好ましい。ポリヌクレオチドは注射器を使用して筋肉ま
たは皮膚に注射されてもよい。それらはまたワクチンガ
ンを使用して筋肉または皮膚に配達されてもよい。
【0106】ある応用において、特にインビトロでのト
ランスフェクションでカチオン性脂質が細胞のトランス
フェクションを容易にするために使用できることが最近
示されてきた。カチオン性脂質に基づくトランスフェク
ション技術は、他の方法より好ましく、リン酸カルシウ
ム、DEAEデキストランまたはエレクトロポレーショ
ン(電気穿孔)法より効率的でかつ便利であり、また、
前述のように、レトロウイルス仲介のトランスフェクシ
ョンは、癌遺伝子の活性化または他の好ましくない結果
を生じさせる宿主細胞ゲノムへの統合事象をもたらし得
る。カチオン性脂質の技術がメッセンジャーRNAで効
果的であるということは、本方法に対するさらなる利点
であり、なぜならRNAは細胞内ヌクレアーゼにより迅
速に代謝され、ホストゲノムに統合されないからであ
る。高レベルの可逆性発現をもたらすトランスフェクシ
ョン系は、安定して形質転換されたクローンの選択およ
び増殖を必要とする他の方法より好ましい。なぜなら望
ましい最初の標的細胞の多くは培養において迅速に分裂
しないからである。
【0107】カチオン性リポソームを用いて高い効率で
細胞をトランスフェクトする能力は免疫化のための他の
方法を提供する。抗原のための遺伝子は動物から取出さ
れた細胞に導入される。ここで抗原を発現するトランス
フェクトされた細胞は、動物に再注入され、免疫系は、
(ここで)内因性の抗原に応答し得る。このプロセス
は、リンパ細胞をさらに刺激するためのアジュバントま
たはリンフォカインのどちらかを一緒に注射することに
より促進することができるであろう。
【0108】抗原のための遺伝子を含む核酸を用いたワ
クチン処置もまた、細胞の免疫応答を特に目標とする方
法となり得る。分泌されるタンパク質を発現する細胞
は、通常の抗原処理経路に入り、体液性と細胞毒性の応
答の両方を生ずるであろう。分泌されないタンパク質に
対する応答はより選択的である。クラスI MHC分子
だけを発現する細胞において合成された分泌されないタ
ンパク質は、細胞毒性のワクチンのみを生産することが
予期される。クラスIおよびクラスII分子の両方を有
する細胞において同じ抗原が発現されると、細胞障害性
およびヘルパーT細胞の両方を刺激することにより、よ
り強力な応答が生じ得る。免疫応答の強化はまた、抗原
のための遺伝子を抗原のペプチドフラグメントと共に注
入することによって可能となり得る。抗原は、細胞の免
疫系にクラスI MHC分子を介して提示され、一方ペ
プチドはヘルパーT細胞を刺激するためにクラスII
MHC分子を介して提示される。いずれの場合でも、こ
の方法は以前可能でなかった方法で免疫応答を刺激し調
節する方法を提供する。
【0109】サブユニットワクチンの主たる不利な点
は、糖タンパク抗原は抗原を作るために使用される組換
発現系において正確に修飾されることがほとんどないと
いうことである。糖タンパク質抗原のための遺伝子を導
入すれば、病原体タンパク質と同様に、タンパク質生産
物が同じ種および細胞において合成され、修飾されかつ
処理されることが保証されるであろう。こうして、ヒト
ウイルス糖タンパク質のための遺伝子の発現は、糖残基
の正しい補足を含むであろう。これは重要であり、なぜ
なら幾つかのウイルス系における中和抗体の本質的な成
分が炭水化物エピトープに向けられるということが示さ
れているからである。
【0110】免疫応答のための候補である任意の適当な
抗原は、体液性のものであろうと細胞性のものであろう
と、核酸形において使用され得る。細胞源は、個体から
取られた繊維芽細胞とすることができ、これは、クラス
I MHC分子のみを発現する便利な細胞源を提供す
る。その代わりに、末梢血細胞を迅速に全血から分離し
て、クラスIおよびクラスII MHCタンパク質の両
方を含む細胞源を提供することができる。それらはさら
に、もし必要であれば、B細胞、ヘルパーT細胞、細胞
障害性T細胞またはマクロファージ/単球細胞に分別す
ることができる。骨髄細胞はそれほど分化されていない
リンパ細胞の源を提供し得る。すべての場合において、
細胞は、抗原のための遺伝子を含むDNAでか、または
その遺伝子から転写された適当にキャップされポリアデ
ニル化されたmRNA、環状RNA、化学的に修飾され
たRNA、または5′キャッピングを必要としないRN
Aのいずれかでトランスフェクトされるであろう。トラ
ンスフェクトするヌクレオチドの選択は、必要な発現の
持続期間に依存し得る。ワクチン接種の目的のために
は、mRNAトランスフェクションにおいて起こるよう
に、免疫原性ペプチドの可逆的発現が好ましい。トラン
スフェクトされた細胞は動物に注射され、発現されたタ
ンパク質は処理され、通常の細胞の経路により免疫系に
与えられる。
【0111】このような方策はマウスのモデル系におい
て細胞毒性免疫を生ずるために使用されてきた。細胞
株、悪性の持続的に成長する細胞はDNAで安定して形
質転換され得る。細胞が動物に注射されたとき、それら
は発現された抗原に対する細胞性免疫を誘導する。カチ
オン性脂質配達系は、患者から取られた通常の悪性でな
い細胞にまでこの方策を拡張することを可能にするであ
ろう。
【0112】細胞性免疫を目標とするこの方策に対する
幾つかの応用がある。第1のものは、必要とされる抗体
が知られているウイルスに対するワクチン接種、または
促進されるウイルス感染に対するワクチン接種である。
ここで適用し得る2つの対策がある。免疫化の間、細胞
性経路を特に目標とすることができ、こうして促進抗体
を排除する。一方、感染性を促進する体液性エピトーム
を排除する切り詰められた抗原の遺伝子でワクチン接種
することができる。
【0113】DNAまたはmRNAのワクチン療法を使
用すれば、抗原性の弱い腫瘍に対する効果的な細胞障害
性T細胞応答を誘発する手段を同様に提供することがで
きるであろう。我々は、たとえば、もし細胞の内側で既
に処理された型でmRNAによって腫瘍特異的抗原が発
現され、細胞表面上のクラスI分子に直接組込まれるな
らば、細胞障害性T細胞応答が引出されるであろうこと
を提案する。
【0114】第2の応用は、この方策が潜伏ウイルス感
染を治療するための方法を提供するということである。
幾つかのウイルス(たとえば、B型肝炎、HIVおよび
ヘルペスBウイルス群)は、ウイルスが細胞内で非活性
または部分的に活性な型で維持される潜伏感染を確立し
得る。このような感染を治療する方法はほとんどない。
しかしながら、潜伏ウイルスタンパク質に対抗する細胞
溶解の免疫を誘導することによって、潜伏感染した細胞
は標的とされ、排除されるであろう。
【0115】この方策の関連のある応用は、慢性の病原
体感染の治療に対してである。ゆっくり複製され、かつ
細胞から細胞へ直接広がる病原体の多数の例がある。こ
れらの感染は慢性であり、幾つかの場合は数年または数
十年続く。これらの例は緩慢なウイルス(たとえばビス
ナ)、スクレーピー因子およびHIVである。病原体の
タンパク質に対する細胞性応答を誘導することによって
感染した細胞を排除することができる。
【0116】また、この方策は悪性疾患の治療に対して
も適用可能であり得る。悪性状態に対して特異的である
タンパク質に対する細胞性免疫応答を開始するワクチン
接種は、もし活性化された癌遺伝子、胎児性抗原、また
は活性化マーカーであれば、これらの細胞の排除を結果
としてもたらすであろう。
【0117】DNA/mRNAワクチンの使用は、かく
して、通常乏しい免疫応答しか引出さないあるウイルス
タンパク質および癌特異的抗原の免疫原性を大いに強化
する。mRNAワクチン法は、ヘルペスウイルス、非A
型、非B型肝炎、およびHIVからの不十分な免疫原性
のウイルスタンパク質に対抗する細胞障害性T細胞免疫
の誘起に適用可能であるはずで、また、それはこれらの
ウイルスのインビトロ増殖に伴う危険および困難をとり
除くであろう。ウイルス被覆タンパク質のような細胞表
面抗原(たとえば、HIVgp120)に関し、抗原は
主要組織適合複合体(MHC)のコンテクストにおいて
標的細胞の表面に発現され、それはより適当な強力でか
つ現実的な免疫応答をもたらすことが予期されるであろ
う。弱毒化ウイルスワクチンでしばしば観察されるより
有効な免疫応答をもたらすのはこの因子である。TGT
による単一抗原遺伝子の配達は、不適当な弱毒化ゆえに
低頻度の疾患をもたらし得る弱毒化ウイルスより遥かに
安全である。
【0118】ワクチン開発段階の間に活用され得るTG
Tのさらに他の利点がある。ワクチン開発に伴う困難の
1つは、最適な免疫応答のため、抗原の異なった構造的
変形物をスクリーニングする必要があるということであ
る。もし変形物が組換源から誘導されれば、抗原性につ
いて試験され得る前に、通常タンパク質を発現させ、純
化しなければならない。これは骨の折れ、かつ時間のか
かるプロセスである。インビトロ突然変異誘発では、所
定の抗原の多数のクローンを得、かつ配列決定すること
が可能である。もしこれらの抗原がTGTによるDNA
またはRNAレベルで抗原性に対してスクリーニングさ
れ得るならば、ワクチン開発プログラムはより早く進行
され得るであろう。
【0119】また、DNA/mRNAワクチンの場合、
タンパク質抗原は、決して直接血清抗体に晒されない
が、mRNAの翻訳に続き、トランスフェクトされた細
胞自身によって常に生産される。これゆえ、アナフィラ
キシーは問題とならないはずである。こうして、本発明
は患者がアレルギー反応の恐れなく、繰返し免疫化され
ることを可能にする。本発明のDNA/mRNAワクチ
ンの使用はこのような免疫化を可能にする。
【0120】抗原の免疫原性をさらに強化するようにこ
の技術を修飾し得る態様は、容易に想像し得る。T細胞
免疫化は、マクロファージまたは他の細胞表面上のクラ
スIおよびクラスII組織適合抗原の密度を増加するこ
とによって、および/または、リンパ球増殖をプロモー
トするサイトカインを放出するトランスフェクトされた
細胞を誘発することによって増大され得る。この目的の
ために、抗原のためのmRNAを含む同じリポソームに
インターフェロンまたはインターロイキン−1をコード
する他のmRNA種を組込んでもよい。これらのサイト
カインはマクロファージ活性化を強化することが知られ
ている。それらの全身的な使用は副作用ゆえに阻止され
てきた。しかしながら、mRNAに、抗原に対するmR
NAと共に包含されるときには、それらは抗原を協同で
発現する細胞によってのみ発現されるはずである。この
状況下で、T細胞免疫性の誘導は大いに強化され得る。
【0121】治療処方物 ポリヌクレオチド塩:ここに記述された製薬的に許容さ
れるポリヌクレオチドの塩の投与は、本発明の範囲内に
含まれる。このような塩は有機塩基および無機塩基を含
む製薬的に許容される非毒性塩基から調製されてもよ
い。塩はナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウ
ム、カルシウム、マグネシウムなどを含む無機塩基から
誘導される。塩は、1級、2級および3級アミンの塩、
塩基性アミノ酸等を含む製薬的に許容される非毒性の有
機塩基から誘導される。医薬としての塩についての役に
立つ議論として、その開示がここに引用され援用され
る、S.M.バージ(Berge)他のJournal of Pharmace
utical Sciences 66:1-19,1977年を参照されたい。
【0122】好ましい配達の方法である注射のためのポ
リヌクレオチドは、単位用量形態のアンプルで、あるい
は複用量の容器で準備することができる。ポリヌクレオ
チドは、油性のまたは好ましくは水性の賦形剤におい
て、懸濁液、溶液、または乳剤のような形で存在しても
よい。その代わりとして、ポリヌクレオチド塩は、投与
のときに無菌の、パイロジェンを含まない水のような適
当な賦形剤で再形成するために凍結乾燥された形であっ
てもよい。液体および再形成されるべき凍結乾燥された
形の両方とも、注射される溶液のpHを適当に調整する
のに必要な量の、作用物質、好ましくは緩衝剤を含むで
あろう。任意の非経口の用途のため、特にもし処方物が
静脈に投与されるべきであれば、溶質の総濃度は製剤が
等張、低張、または弱く高張であるように制御されるべ
きである。糖のような非イオン材料は、張度を調整する
ために好ましく、かつスクロースは特に好ましい。これ
らの形のいずれも、でんぷんまたは糖、グリセロールま
たは塩化ナトリウム水溶液のような適当な処方の作用物
質をさらに含んでもよい。1単位用量の組成物は、液体
であろうと固体であろうと、0.1%から99%のポリ
ヌクレオチド材料を含んでもよい。
【0123】使用の前にポリヌクレオチドが包装される
単位用量アンプルまたは複用量容器には、医薬として有
効な用量または有効な用量の倍数について適当な量のポ
リヌクレオチドまたは溶液を封入した密封容器がある。
ポリヌクレオチドは無菌の処方物として包装され、密封
容器は使用まで処方物の無菌性を保つよう設計される。
【0124】ポリヌクレオチドが包装されている容器に
はラベルが貼られ、そのラベルは政府機関、たとえば食
品医薬品局(the Food and Drug Administration)によ
って規定された形式において注意書を有し、その注意書
は、ヒトへの投与のためのその中のポリヌクレオチド材
料の製造、使用、または販売の連邦法(Federal law)
の下でのその機関による承認を反映するものである。
【0125】連邦法は、ヒトの治療における薬事的な作
用物質の使用は連邦政府の機関によって承認されること
を要求する。施行に対する責任は食品医薬品局の責任で
あり、それは21U.S.C.301−392において
詳細に示されているこのような承認を確実にするための
適当な規制を公布する。動物の組織から作られる製品を
含む生物学的材料に対する規制は42U.S.C.26
2の下で規定される。同様の承認が大抵の外国によって
も要求される。規制は国によって違うが、個々の手続は
当業者によく知られている。
【0126】用量および投与の方法 投与されるべき用量は、治療されている被験者の状態お
よび大きさならびに治療の頻度および投与の方法に大き
く依存する。用量および頻度を含む療法を継続するため
の養生法は、最初の応答および臨床判断によって導かれ
てもよい。組織の間質空間の中への注射する非経口法が
好ましいが、しかしエアロゾル処方物の吸入のような他
の非経口法が、たとえば、鼻、喉、気管支組織または肺
の粘膜へのような特定の投与において必要とされるかも
しれない。
【0127】好ましいプロトコルでは、水性担体中に裸
のポリヌクレオチドを含む処方物は、部位毎に10μl
から約1mlの量で組織に注射される。処方物における
ポリヌクレオチドの濃度は約0.1μg/mlから約2
0mg/mlである。
【0128】TGTの調節 DNAに基づく遺伝子移植プロトコルが、転写のための
適当なシグナル(プロモータ、エンハンサ)およびmR
NA転写を処理するための適当なシグナル(スプライシ
ングシグナル、ポリアデニル化シグナル)を必要とする
ように、mRNAに基づくTGTも、トランスフェクさ
れたmRNAの安定性を強化するであろう要素と共に、
効率的でかつ正確な翻訳のために適当な構造および配列
要素を必要とする。
【0129】一般的に、翻訳効率は、RNAの5′非コ
ード領域または非翻訳領域(5′UTR)における特定
の配列要素によって制御されることが発見されている。
正の配列モチーフは翻訳開始共通配列(GCC)ACC
ATGG(Kozak, Nucleic Acids Res.15 : 8125(198
7))および5G7メチルGpppGキャップ構造(Drum
mond et al. Nucleic Acids Res.13 : 7375(1985))
を含む。負の要素は分子5′UTRステムループ(stem
-loop)構造(Muesing et al. Cell 48 : 691(198
7))およびAUG配列または5′UTRにおける適当
なAUGによって先行される短いオープンリーディング
クレーム(Kozak,上記,Rao et al. Mol and Cell. Bio
l. 8 : 284(1988))を含む。さらに、ベータグロブリ
ン5′UTRのような所定の配列モチーフは、(異種
5′UTRに隣接して置かれるとき)知られていない機
構によって翻訳を強化するように作用し得る。環境シグ
ナルに応答して真核生物の翻訳効率を制御する特定の
5′UTR配列の例もまたある。これらは、ヒトフェリ
チン5′UTR(Hentze et al.、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 84 : 6730(1987))およびショウジョウバエ
hsp705′UTR(Klemenzet al., EMBO Journal 4
: 2053(1985))を含む。さらに、通常のキャップ依
存性翻訳および翻訳制御を迂回し、ウイルスまたはキメ
ラのmRNAの能率的な翻訳を仲介することができるウ
イルス5′UTR配列がある(Dolph et al., J.of Vir
ol.62 : 2059(1988))、Pelletier and Sonnenberg,
Nature 334, 320(1988))。したがって、mRNAに
基づくTGTプロトコルは、関心のあるタンパク質に対
するコード配列に隣接する適当な5′UTR翻訳要素を
含む。
【0130】翻訳関係に加えて、mRNA安定性が、m
RNAに基づくTGTプロトコルの開発の間、考慮され
ねばならない。一般的な意見として、キャッピングおよ
び3′ポリアデニル化は真核性mRNA安定性の主たる
正の決定因子であり(Drummond, 上記,Ross, Mol. Bio
l. Med. 5,1(1988))、mRNAの5′および3′末
端を分解から保護するよう機能する。一方、真核生物の
mRNAの安定性に影響を及ぼす調節要素もまた明らか
にされてきており、したがってmRNA TGTプロト
コルの開発において考慮されねばならない。これらのう
ち最も注目に値しかつ明らかにされているものは、多く
の短い半減期のmRNAにおいて発見されたウリジンの
多い3′非翻訳領域(3′UTR)デスタビライザー
(destabilizer)配列である(Shaw and Kamen Cell 46
: 659(1986))。しかしながら、それらがmRNA脱
安定化をもたらす唯一の配列モチーフでないという証拠
がある(Kabnick and Housman, Mol. and Cell. Biol.
8 : 3244(1988))。さらに、環境刺激に応答して細胞
性mRNAの半減期を調節する特異的調節配列もまた明
らかにされている。これらは、ビテロゲニンmRNA安
定性のエストロゲンにより仲介される調節(Brock And
Shapiro. Cell 34 : 207(1983))、特異的3′UTR
モチーフに起因するトランスフェリン受容体mRNAの
安定性の鉄依存性調節(Mullner and Kuhn, Cell 53 :
815(1988))、カゼインmRNAの安定性のプロラク
チンにより仲介される制御(Guyette et al., Cell 17
: 1013(1989))、多数の刺激に対応するフィブロネ
クチンmRNAの安定性の調節(Dean et al., J. Cel
l. Biol. 106 : 2159(1988))、およびヒストンmR
NA安定性の制御(Graves et al., Cell 48 : 615(19
87))を含む。さらに、正常な真核生物のmRNA翻訳
制御を迂回するウイルスRNA配列が案出されたよう
に、同様に、あるウイルスRNA配列は3′ポリアデニ
ル化なしに安定性を与えることができるようである(Mc
Grae and Woodland, Eur. J. of Biochem. 116 : 467
(1981))。例21に従いEMCのような幾つかの5′
はキャップなしで機能することが知られている。安定性
調節要素のこの例外もまたmRNAに基づくTGTプロ
トコルを開発する際に注意深く考慮されねばならず、m
RNA治療の効果を調節するのに使用され得る。
【0131】リポソーム形成材料 リポソームを形成する科学は今ではよく開発されてい
る。リポソームは単一層または多重層の小胞であり、親
油性の材料で形成された膜部分および内部の水性部分を
有する。水性部分は本発明において標的細胞に配達され
るべきポリヌクレオチド材料を含むのに使用される。
【0132】ここで使用されるリポソーム形成材料は四
級アンモニウム基のようなカチオン性基、および約6な
いし約30の炭素原子を有する飽和または不飽和のアル
キル基のような1つまたはそれ以上の親油性基を有する
ことが好ましい。適当な材料の1つの群はヨーロッパ特
許公開番号第0187702号において記述される。これらの
材料は次の式を有する。
【0133】
【化3】
【0134】式中、R1およびR2は同じかまたは異な
り、6〜22の炭素原子のアルキルまたはアルケニルで
あり、R3、R4およびR5は、同じかまたは異なり、水
素、1〜8炭素のアルキル、アリール、7〜11炭素の
アラルキルであり、あるいはR 3、R4およびR5の2つ
または3つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリ
ジノ、またはモルホリノを形成し、nは1〜8であり、
かつXは製薬的に許容されるハロゲンのような陰イオン
である。これらの化合物は上で示された特許出願におい
て詳しく書かれているように準備されてもよいし、その
代わりにとして少なくともそれらの化合物のうちの1
つ、N−(2,3−ジ−(9−(Z)−オクタデセニル
オキシ))−prop−1−イル−N,N,N−トリメ
チルアンモニウムクロリド(DOTMA)が、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda Research Labo
ratories)(BRL),ゲティスバーグ(Gaithersbur
g),メリーランド州(Maryland)20877,アメリカ合衆
国(USA)より市販されている。
【0135】これらの4級アンモニウムジエーテル化合
物は、しかしながら、幾つかの欠点を有する。エーテル
結合ゆえに、それらは生体内で容易に代謝されない。長
期間の治療が意図されているとき、これらの材料が組織
に蓄積し、究極的には脂質蓄積疾患および毒性副作用の
結果をもたらす可能性がある。したがって、本発明にお
ける使用のための組成物の好ましいクラスは次の式を有
するものである。
【0136】
【化4】
【0137】式中、R1およびR2は同じかまたは異な
り、5〜21の炭素原子のアルキルまたはアルケニルで
あり、R3、R4、およびR5は同じかまたは異なり、水
素、1〜8炭素のアルキル、アリール、7〜11炭素の
アラルキルであり、あるいはR 3、R4、およびR5の2
つまたは3つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロ
リジノ、またはモルホリノを形成し、nは1〜8であ
り、かつXはハロゲンのような製薬的に許容される陰イ
オンである。これらの化合物はカルボン酸およびアルキ
ルハロゲン化物を含む求核置換のような従来の技術を使
用して、エステル交換、または酸もしくは酸ハロゲン化
物を用いるアルコールの縮合により調製されてもよい。
【0138】さらに、多くの適当なリポソーム形成カチ
オン性脂質化合物が文献に記述されている。たとえば、
L. Stamatatos, et al., Biochemistry 27 : 3917-3925
(1988); H. Eibl. et al., Biophysical Chemistry 1
0 : 261-271(1979)を参照されたい。
【0139】リポソームの調製 本発明において使用するための適当なリポソームは商業
的に入手可能である。たとえば、DOTMAリポソーム
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ゲティスバー
グ、メリーランド州からリポフェクチン(Lipofectin)
の商標で入手可能である。
【0140】その代わりとして、容易に入手可能な、ま
たは前述の形のあらたに合成された開始材料からリポソ
ームを調製することができる。DOTAPリポソームの
調製は例6に詳細に記述されている。DOTMAリポソ
ームの調製は文献において説明され、たとえば、P. Fel
gner, et al., Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 84 : 741
3-7417を参照されたい。同様の方法が他のカチオン性脂
質材料からリポソームを調製するのに使用され得る。さ
らに、従来のリポソーム形成材料が負の電荷または中性
の電荷を有するリポソームを調製するのに使用され得
る。このような材料はホスファチジルコリン、コレステ
ロール、ホスファチジルエタノールアミン等を含む。こ
れらの材料もまた有利に、0%〜約75%の割合でDO
TAPまたはDOTMA開始材料と混合され得る。
【0141】従来の方法が他の非カチオン性リポソーム
を調製するのに使用され得る。これらのリポソームはカ
チオン性リポソームと同様に容易に細胞壁と融合するも
のではない。しかしながら、それは生体内でマクロファ
ージによって摂取され、したがってポリヌクレオチドの
これらの細胞への配達のため特に効果的である。たとえ
ば、市販のジオレオイルホスファチジルコリン(DOP
C)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DO
GP)、およびジオレオイルホスファチジルエタノール
アミン(DOPE)がコレステロールの添加と共にまた
は添加なしで、従来のリポソームを作るのに様々な組合
せで使用され得る。こうして、たとえば、DOPG/D
OPC小胞が音波処理バイアルの中への窒素ガスの流れ
の下でDOPGおよびDOPCの各々50mgを乾燥す
ることによって準備され得る。サンプルは真空ポンプ下
に一晩置かれ、かつ脱イオン水で次の日、水和される。
サンプルはそれからキャップされたバイアルで、水浴
(bath)が15℃で循環される間最大に設定される倒置
されたカップ(バス型)プローブを備えたヒートシステ
ムモデル350ソニケータを使用し、2時間音波処理さ
れる。一方、負に荷電した小胞が、多重層小胞を生産す
るために音波処理なしで、または別々のサイズの単一層
小胞を生産するためにヌクレオポア(nucleopore)膜を
介する射出によって、調製され得る。他の方法が当業者
に知られ、かつ利用可能である。
【0142】本発明は以下に与えられた23の例を使用
して詳細に説明されるが、しかしながら、記述される方
法は、ここで記述されるように広く適用可能であり、か
つそれらの例によって制限されるように意図されていな
い。
【0143】例1:リポソームを形成するDOTAPの
調製 カチオン性リポソーム形成材料1,2−ビス(オレオイ
ルオキシ)−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン
(DOTAP)がL. Stamatatos, et al.(上記)また
はH. Eibl, et al.(上記)によって報告されているよ
うに調製される。
【0144】端的には、Stamatatos, et al.は1mmo
lの3−ブロモ−1,2−プロパンジオール(アルドリ
ッチ(Aldrich))が、5mmolの乾燥ピリジンを含
む乾燥した、アルコールを含まないジエチルエーテル
(20ml)において3mmolのオレイルクロリド
(オレイン酸およびオキサロイルクロリドから新たに調
製された)で20℃で48時間アシル化されたというこ
とを報告している。ピリジニウムヒドロクロリドの沈殿
物がフィルタ除去され、かつ濾液は窒素下で濃縮され、
かつ10mlヘキサンにおいて再溶解される。ヘキサン
溶液は、pH3.0の等しい量の1:1メタノール/
0.1N水性NCOONaで3回、1:1メタノール/
0.1N水性NaOHで3回、および1%の水性NaC
lで1回洗われた。粗3−ブロモ−1,2−ビス−(オ
レオイルオキシ)プロパンは、それから25℃で乾燥し
たジメチルスルホキシド(30ml)における15%の
トリメチルアミンの溶液で封じられた管において72時
間攪拌された。この反応の生成物はクロロホルム(20
0ml)で溶解され、それは1:1メタノール/100
mM水性HCOONa、pH3.0で繰返し洗われ、そ
れから真空で淡黄色のオイルを生ずるように蒸発させら
れた。この材料は、シリシック酸(Bio-Sil A, Bio-Rad
Laboratories)のカラム上で精製され、クロロホルム
中0〜15%グラジエントのメタノールで溶出され、9
〜10%メタノールにおいて純粋な型で所望の産物をも
たらす。精製された産物は無色で、50:15:5:
5:2のCHCl3/アセトン/CH3OH/CH3CO
OH/H2Oで展開された薄層クロマトグラフィープレ
ート(シリカゲルG)上の0.4のRfで移動する粘性
油であった。
【0145】例2:関心のある任意の遺伝子のためのD
NAテンプレートを作るためのプラスミドの調製 所望のポリペプチドをコードするmRNAの生産のため
の適当なテンプレートDNAは標準の組換DNA方法論
に従って調製することができる。以前に報告されている
ように(P. Kreig, et al., Nucleic Acids Res. 12 :
7057-7070(1984))、5′キャップはmRNAの翻訳
を容易にする。さらに、3′フランキング領域およびポ
リA尾部はインビボでのmRNAの半減期を増加すると
考えられている。
【0146】ベクターpSP64Tをクローン化する容
易に入手可能なSP6は、β−グロビンからの5′およ
び3′フランキング領域、効率的に翻訳されるmRNA
を与える。このプラスミドの構成はKreig, et al.(上
記)によって詳細にされ、かつここに引用により援用さ
れる。開始コドンを含む任意のcDNAがこのプラスミ
ドに導入され得、そして、得られるテンプレートDNA
からmRNAが調製され得る。この特定のプラスミド
は、関心のあるポリペプチドをコードする任意の必要な
cDNAを挿入するためにBglIIで切断され得る。
【0147】線状化し、それからインビボでSP6RN
Aポリメラーゼを用いて転写するとき、良い結果をpS
P64Tで得ることができるが、我々はファージT7R
NAポリメラーゼと共にpSP64Tのアフリカツメガ
エルβ−グロビンフランキング配列を使用することを好
む。これらのフランキング配列は小さな(約150b
p)Hind III-Eco RI フラグメントとしてpSP64T
から精製される。これらの配列は、それから、T4DN
AリガーゼによりpIBI31(インターナショナル・
バイオテクロノジーズ・インコーポレイティッド(Inte
rnational Biotechnologies, Inc.)ニューヘブン(New
haven)コネチカット州(Connecticut)06535)から入
手可能)からの精製された線状のHind III-Eco RI フラ
グメント(約2.9Kbp)の中へ挿入される。得られ
たプラスミド、pXBGと命名は、配向についてスクリ
ーニングされ、かつE. coliにトランスフォームされ
る。これらのプラスミドは、2つのアフリカツメガエル
β−グロビン配列の間に位置するユニークなBgl II 制
限部位において関心のある任意の遺伝子を受けいれるよ
うに適合する。
【0148】例3:クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼをコードするプラスミドの調製 外因性ポリヌクレオチドのインビボ発現を明らかにする
便利なマーカー遺伝子は、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ、CATである。アフリカツメガ
エルβ−グロビン5′および3′配列によって隣接され
るCAT遺伝子を含むプラスミドpSP−CATは、C
AT遺伝子をpSP64TのBgIII部位に加えるこ
とによって調製された。我々はpSV2−CAT(Acce
ssion No.37155 the American Type Culture Collectio
n, Rockville, Maryland,から入手可能)からの小さい
BamHI/HindIIIフラグメントの形態でCA
T遺伝子を使用した。しかしながら、CAT遺伝子は一
般的に分子生物学において使用されるものであり、数多
くのソースから入手可能である。CAT BamHI/
HindIIIフラグメントおよびBgIII−開裂p
SP64Tの双方は、平滑末端を形成するためにクレノ
ウ(Klenow)フラグメントとともにインキュベートさ
れ、それからT4DNAリガーゼで結合されpSP−C
ATを形成した。
【0149】小さいPstI/HindIIIフラグメ
ントがそれから生成され精製された。このフラグメント
はpSP64Tの5′および3′β−グロビンフランキ
ング配列の間にCAT遺伝子を含む。pIBI31(In
ternational Biotechnologies, Inc.)はPstIとH
indIIIとで開裂され、長い線状の配列が精製され
た。このフラグメントはそれからCAT−遺伝子含有配
列と合わされ、フラグメントはT4DNAリガーゼで結
合され、pT7CAT Anで表わされるプラスミドを
形成した。クローンはXgalとアンシピリン耐性を用
いるβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいて選択される。
【0150】例4:精製されたDNAテンプレートの調
製 例3からのプラスミドDNAは、RNAseがない場合
を除いて、細菌性RNAを取り除くために2CsClス
ピンを使用してマニアティス(Maniatis)(上述)によ
り増殖させて調製する。特定的には、例3からのpT7
CAT Anを含むE.coliをアンピリシン含有LB培地
で増殖させた。細胞はそれからSorvall RC−
5遠心分離機(E.I. DuPont, Burbank, California 915
10)において10分間5000rpmで遠心することに
よってペレット化され、冷TE,pH8.0に再懸濁さ
れ、再び、5000rpm.で10分間遠心分離され、
50mMグルコース、25mMトリス(Tris)−Cl
pH8.0、10mM EDTAおよび40mg/ml
リゾチームの溶液に再懸濁された。ときどき倒置しなが
ら5〜10分間インキュベーションした後、1%SDS
を含む0.2 NNaOHが加えられ、0℃で10分経
過後3M酢酸カリウムおよび2M酢酸が続いた。さらに
10分後、材料は再び6000rpmで遠心分離され、
その上澄みはピペットで取除かれた。ペレットはそれか
ら0.6容量のイソプロパノール(−20℃)に混合さ
れ、混ぜられ、かつ15分間−20℃で保存された。そ
れから材料はHB4揺動バケットロータ装置(DuPont、
上述)において、20分間10,000rpmで再び遠
心分離され、その後上澄みは取除かれ、ペレットは70
%EtOHで洗われるとともに室温で乾燥された。次
に、ペレットは3.5ml TEに再懸濁され、それに
続いて3.4g CsClおよび350μlの5mg/
ml EtBrが加えられた。得られた材料をクイック
シールチューブに入れ、チューブを鉱油で上部まで満た
した。チューブはVTiSO遠心分離機(Beckmam Inst
ruments, Pasadena, California, 91051)において8
0,000rpmで3.5時間遠心された。バンドは取
除かれ、材料は再び遠心分離されて、0.95g Cs
Cl/mlおよびTE中0.1mlまたは5mg/ml
EtBr/mlで容量を補った。バンドに3容量のT
Eを加えて、上層がきれいになるまで上層を捨てた後、
EtBrは、等しい容量のTE飽和N−ブタノールで抽
出された。次に、2.5容量のEtOHが加えられ、材
料は−20℃で2時間沈殿された。得られたDNA沈殿
物は、インビトロでのmRNAの調製のためのDNAテ
ンプレートとして使用される。
【0151】例5:トランスフェクションのためのmR
NAの調製 例4からのDNAは、ポリA尾部の下流で5倍過剰のP
stIで線状にされた。線状にされたDNAはそれから
2回のフェノール/クロロホルム抽出で精製され、それ
に続いて2回のクロロホルム抽出が行なわれた。DNA
はそれからNaOAc(0.3M)および2容量のEt
OHを用いて沈殿された。ペレットはDEP−処理され
た脱イオン水中、約1mg/mlに再懸濁された。
【0152】次に、転写緩衝液が調製され、これは40
0mMトリスHCl(pH8.0)、80mM MgC
2、50mM DTTおよび40mMスペルミジンを
含む。それから、以下の材料が室温で順に1容量のDE
P−処理された水に加えられた。上で調製された1容量
のT7転写緩衝液、1mM濃度までのrATP、rCT
P、およびrUTP、rGTP0.5mM濃度、7me
G(5′)ppp(5′)G キャップ類縁体(New En
gland Biolabs, Beverly, Massachusetts, 01951)0.
5mM濃度、上で調製された線状化DNAテンプレート
0.5mg/ml濃度、RNAsin(Promega, Madis
on, Wisconsin)2000U/ml濃度、およびT7R
NAポリメラーゼ(N.E.Biolabs)4000U/ml濃
度。
【0153】この混合物は37℃で1時間インキュベー
トされた。混合物のくもりが増えることによって転写反
応が成功したことがわかった。
【0154】mRNAの生成に続いて、使用されるDN
Aテンプレートのマイクログラムあたり2UのRQ1
DNAse(Promega)が加えられ、15分間テンプレ
ートを消化させた。それからRNAはクロロホルム/フ
ェノールで2回抽出されるとともに、クロロホルムで2
回抽出された。上澄みは2容量のEtOH中0.3Mの
NaOAcで沈殿され、ペレットは500μlの転写生
産物あたり100μlのDEP−処理された脱イオン水
に再懸濁された。この溶液をRNAse−フリーセファ
デックス(Sephadex)G50カラム(Boehringer Mannh
eim #100411)に通した。得られたmRNAはインビボ
での脊椎動物のトランスフェクションに使用するのに十
分純粋であった。
【0155】例6:リポソームの調製 数多くのリポソーム調製方法は本発明の実施において有
利に使用され得る。1つの特に好ましいリポソームは以
下のようにDOTAPから作られる。
【0156】1mlクロロホルム中10mgジオレオイ
ルホスファチジルエタノールアミン(PE)および10
mgDOTAP(例1より)の溶液を、窒素の流れの下
で蒸発乾固させ、残留溶媒を一夜真空下で除去する。リ
ポソームは脂質を脱イオン水(2ml)に再懸濁し、閉
じたバイアルにおいて透明になるまで超音波処理するこ
とにより調製される。これらの調製物は少なくとも6か
月間安定している。
【0157】ポリヌクレオチド複合体は、0.4mg/
mlの0.5mlポリヌクレオチド溶液(たとえば例5
から)を一定に静かに攪拌しながら、注射器によって、
20mg/mlの超音波処理されたDOTMA/PEま
たはDOTAP/PEリポソーム0.5ml溶液に、ゆ
っくり加え、室温で混ぜることによって調製された。こ
の方法により、ポリヌクレオチドをインビボで細胞に自
発的に配達する正に荷電した複合体が得られる。正に荷
電したリポソームのヌクレオチドに対する割合を様々に
変えたものを、任意の特定の状態において特定の必要性
に合うよう使用することができる。一方、フェルグナ
(Felgner)他(上述)によって報告されるように、材
料を混合してリポソーム/ポリヌクレオチド複合体を自
発的に形成する前に、ヘペス(Hepes)緩衝生理食塩水
(150 mM NaCl;20mM Hepes,p
H7.4)でポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)
を希釈することは有利であるかもしれない。多くの例
で、しかしながら、生理食塩水の代わりに低いイオン強
度を有する溶液(スクロースのような)を使用すること
は好ましいと考えられる。特に、かかる溶液はポリヌク
レオチド/脂質複合体の沈殿を最小限にすることによっ
てポリヌクレオチドの細胞への配達を容易にすると考え
られる。
【0158】例7:ネズミにリポソーム的および非リポ
ソーム的に導入されたmRNAの生体内発現 クロラムファニコールアセチルトランスフェラーゼ(C
AT)をコードするmRNAがインビボで細胞をトラン
スフェクトする能力および続いて起こるCATタンパク
質の発現は、示されるように調製された以下の処方物各
々0.200mlを、ブレブを形成するネズミの腹筋に
直接注射することによって明らかにされた。各処方物の
6つの反復試験区がテストされた。12〜14時間後、
注射されたおよそ0.1〜0.2グラムの重さの腹筋の
セグメントが切除され、切り刻まれ、以下の成分、20
0mMトリス、pH7.6;2mM MgCl2;およ
び0.1%トリトン(Triron)X−100界面活性剤を
有する200μlの水性処方物とともに1.5ml使い
捨て乳鉢(Kontes, Morton Grove, Illinois)の中に置
かれた。乳鉢の中身はそれから使い捨て乳棒で1分間磨
り潰された。乳鉢はそれから(パラフィルム(Parafil
m)で)覆われ、1リットルパール(Parr)細胞粉砕器
ボンベ(Parr Instrument Company, Moline, Illinoi
s)に置かれるとともに、4℃の窒素で6気圧に押圧さ
れた。30分後、圧力は組織を粉砕して粗溶解産物を生
成させるために速やかに解放された。溶解産物はそれか
ら10分間13,000rpm、4℃でマイクロ遠心分
離機で遠心分離された。上澄みはそれから別の容器に移
され分析されるまで−20℃で保存された。
【0159】次に溶解産物は薄層クロマトグラフィによ
ってCATタンパク質の存在について検定された。ま
ず、各サンプルの75μl(上で調製された上澄み)が
5μlC14クロラムフェニコール(Amersham)、20μ
lの4mMアセチルCoAおよび50μlの1Mトリ
ス、pH7.8とともに37℃で2時間インキュベート
された。その後、20μlの4mMアセチルCoAが加
えられ、その混合物は再び37℃で2時間インキュベー
トされた。得られた溶液は1mlのEtOAcで抽出さ
れ、その有機相は取除かれ、真空遠心分離機(SpeedVa
c, Savant Co.)で凍結乾燥された。ペレットは20μ
lEtOAcに再懸濁され、シリカゲル薄層クロマトグ
ラフィプレート上にスポットされた。プレートは95%
クロロホルム/5%メタノールで45分間展開され、乾
燥されかつ放射性ルミネセンスインジケータ(Enhance
Spray Surface Radiography, New England Nuclear Cor
p.)を噴霧された。次いでプレートはコダック(Koda
k)XAR5フィルムでサンドイッチされ、−70℃で
一夜感光させた。そのフィルムは、製造業者の指示に従
って現像された。以下の結果が得られた。
【0160】
【表1】
【0161】Optimem:血清フリー培地(Gibco
Laboratories, Life Technologies, Inc, Grand Islan
d, N.Y. 14072) DOTMA:(Lipofectinブランド;Bathesda Researc
h Labs, Gaithersburg,MD) CAT RNA:例5からのもの すべての処方物はDEPC処理されたRNAseフリー
水(International Biotechnologies, Inc., New Have
n, CT 06535)において調製した。
【0162】例8:HIVウイルスのgp120タンパ
ク質を生産するためのマウスへのmRNAワクチン投与 HIVウイルスのgp120タンパク質をコードするm
RNAを含むリポソーム処方物は、例1〜5に従って調
製される。ただし、gp120(The Aids Research an
d Reagent Program, National Institute of Allergy A
nd InfectionsDisease, Rockville, MD 20852からのp
IIIenv3−1)のための遺伝子は、例4の方法で
プラスミドpXBGに挿入される。例6に従って調製さ
れた、10%スクロース中200μg/mlのgp12
0mRNAおよび500μg/μlの1;1DOTAP
/PEを含む処方物の200μlが、1日に3回マウス
の尾の静脈に注射される。最後の注射の後約12〜14
時間で、筋肉のセグメントが注射部位から取り出され、
例7に従って細胞溶解産物として調製される。HIV特
異的タンパク質gp120は例7の方法に従って溶解産
物中に同定される。
【0163】mRNAをワクチン投与されたマウスの血
清に存在するgp120抗体がHIV感染を防御する能
力は、HT4−6Cプラーク還元検定によって以下のよ
うに測定される。
【0164】HT4−6C細胞(CD4+ヒーラ(Hel
a)細胞)はDr.ブルースチェイスブロ(Burce Chese
bro)(Rocky Mountain National Lab, Montana)から
入手され、RPMI培地(BRL,Gaithersburg,MD)の培
養で増殖される。細胞の集団はそれからバッチに分割さ
れる。バッチの中のいくつかはHIVのおよそ105
106感染単位をおよそ107のHT4−6C細胞に加え
ることによってHIVに感染させる。他のバッチはHI
Vとgp120mRNAをワクチン投与されたマウスか
らのおよそ50μlの血清の双方を加えることによっ
て、HIV感染に対するgp120免疫血清の防御効果
をテストされる。3日間のインキュベーションの後、す
べてのバッチの細胞は洗われ、固定され、クリスタルバ
イオレットで染色され、プラークの数が数えられる。g
p120免疫血清の防御効果は、HIVだけで処理され
たバッチ中の数と比較して、gp120mRNAワクチ
ン投与されたマウス血清およびHIVの双方で処理され
た細胞のバッチにおけるプラーク数の減少として、測定
される。
【0165】例9:HIV投与が続くNEFmRNAを
用いたヒト幹細胞保有SCIDマウスへのmRNAワク
チン投与 重症複合免疫不全マウス(SCIDマウス(Molecular
Biology Institute,(MBI), La Jolla, CA 92037))
が、モジエル(Mosier)(Mosier他,Nature335:256(1
988))の方法に従って、成人ヒト末梢血リンパ球を腹
腔へ注射することによって再構築された。次にHIV−
1の400〜4000感染単位の腹腔内注射が行われ
た。マウスは密封されたグローブボックスの中でP3レ
ベル動物封じ込め設備の中で維持された。
【0166】HIVの場合、プラスミド(the NIAID, R
ockville, MD 20852からのpGM92)の形態のnef遺伝
子を獲得し、プラスミドからnef遺伝子を取出し、p
XBGプラスミドにnef遺伝子を転写のために挿入
し、例2〜例5に述べられたように転写生産物nefm
RNAを精製することによって、nefタンパク質をコ
ードするmRNAを調製した。次いでnefmRNAは
例6に従う処方物に組込まれた。200μg/mlのN
EF RNAおよび500μg/mlの1:1DOTA
P:DOPE(RNA/リポソーム複合体形態におけ
る)を含む10%スクロース溶液200マイクロリット
ルの尾の静脈注射が実験動物に毎日行なわれる一方で、
対照動物は200μg/μlの酵母tRNAおよび50
0μg/mlの1:1DOTAP/DOPEリポソーム
を含むRNA/リポソーム複合体を同じように注射され
た。注射後2、4および8週間で、生検標本が注射され
たリンパ器官から採取され、免疫組織化学のために調製
された。同じ時点で、血液サンプルが採取され、ELI
SAキット(Abbott Labs, Chicago, LL)によるp24
レベルおよび例8のプラーク検定によるウイルス力価を
検定された。HIV−1に対する免疫染色が、HIVに
感染した患者からのポリクローナル血清を使って説明さ
れるように(Namikawa他,Science 242:1684(1988))
行なわれた。陽性の細胞が数えられ、高倍率フィールド
(400x)あたりの感染細胞の数が測定された。これ
らの検定を使って、陽性の染色細胞数の少なくとも2倍
減少が8週間で観察され、力価およびp24発現は少な
くとも50%低減された。同時にこれらの結果は(生体
内)治療の穏やかな抗ウイルス性効果を示す。
【0167】10%スクロース中200μg/mlのn
efmRNAおよび500μg/mlの1:1DOTA
P:DOPEを含む処方物200μlが、ヒト幹細胞含
有SCIDマウスの尾の静脈に1日に3回注射される。
免疫化に続いて、マウスはHIVウイルスの有効量での
感染によってテストされる。血液のサンプルが定期的に
尾の静脈から取出され、ELISAキット検定(Abbott
Labs, Chicago, IL)により特徴的なHIVタンパク質
p24の生成がモニターされる。
【0168】例10:生体内mRNAトランスフェクシ
ョンによってマウスヘアデノシンデアミナーゼを与える
方法 ヒトアデノシンデアミナーゼ(ADA)遺伝子のcDN
Aに対する全長配列は、クローンADA211(Adria
n, G. 他 Mol.Cell Biol.4:1712(1984))の1,30
0bp EcoRI−AccIフラグメントから得られ
る。それは平滑末端にされ、BgIIIリンカーに結合
され、それからBgIIIで消化される。修飾されたフ
ラグメントはpXBGのBgIII部位に挿入される。
ADAのmRNAは例2〜例5に従って転写されるとと
もに精製され、精製されたADAmRNAは例6に従っ
て処方物の中に組込まれる。バルブ(Balb)3T3マウ
スは、10%スクロース中200μg/mlのADAm
RNAおよび500μg/mlのDOTAPを含むこの
処方物200μlを尾の静脈に直接注射される。
【0169】マウスの肝臓、皮膚および筋肉の組織中の
ヒトADAの存在は、等電点電気泳動(IEF)法によ
って確認される。組織抽出物は非変性ゲル上でpH4お
よび5の間で等電点電気泳動された。ゲルはそれからヴ
ァレリオ(Valerio),D他,Gene 31:137-143(1984)に
よって報告されるように原位置でのADA活性について
染色された。
【0170】ヒトおよび非ヒトADAの予備分離は、高
速タンパク質液体クロマトグラフィ(FPLC)によっ
て実行される。タンパク質は0.05Mから0.5M
KClに至る直線勾配での20mMトリス(pH7.
5)でファーマシア(Pharmacia)(Piscataway, NJ)
モノク(MonoQ)カラム(HR5/5)上で分画され
る。フラクション内でのADAの活性は、イノシンに変
換される14C−アデノシン(Amersham, Chicago, IL)
を用いてフラクションを反応させることによって測定さ
れる。薄層クロマトグラフィー(0.1M NaPi
pH6.8飽和硫酸アンモニウム:n−プロピルアルコ
ール/100:60:2)は、基質アデノシンから放射
性イノシンを分離するために使用される。
【0171】例11:マウスの筋肉に直接注射された純
粋RNAおよびDNAの生体内発現 マウスの四頭筋に、100μgのpRSVCAT DN
Aプラスミドか100μgのβgCATβgAn RN
Aのどちらかを注射し、注射部位の筋肉組織を後にCA
T活性についてテストした。
【0172】生後5〜6週間の雌および雄バルブ(Ba
lb)/Cマウスは0.3mlの2.5%アベルチン
(Avertin)で腹腔内注射によって麻酔された。1.5
cm切開が前大腿部で行なわれ、四頭筋は直接視覚化さ
れた。DNAおよびRNAは筋肉の末梢挿入部位から膝
の中におよそ0.5cmでかつ約0.2cmの深さで1
分間にわたって27ゲージ針を通して1cc注射器中
0.1mlの溶液で注射された。縫合部が将来の位置確
認のために注射部位上に置かれ、皮膚はそれからステン
レススチールのクリップで閉じられた。
【0173】3T3マウス繊維芽細胞はまた、これらの
細胞について述べられた最適の条件(Malone, R. 他,R
roc. Nat'1. Acad. Sci. USA 86:6077-6081(1989))
下で、3mlのオプティメム(Opti-Mem)(商標)(Gi
bco)中リポフェクチン(Lopofectin)(商標)(BRL)
60μgと複合された20μgのDNAまたはRNAと
ともにインビトロでトランスフェクトされた。同じ繊維
芽細胞はまた、アウスベル(Ausubel)他(Eds)Curren
t Protocols in Molecular Biology, John Wiley and S
ons, New Yok(1989)に述べられる方法に従って燐酸カ
ルシウムを使用してトランスフェクトされた。
【0174】pRSVCAT DNAプラスミドおよびβgCAT
βgAn RNAは、先行する例に述べられるように調
製された。RNAは5′および3′β−グロビン非翻訳
配列および3′ポリ−A領域によって隣接されるクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)
コード配列からなった。
【0175】全四頭筋を切除し、その筋肉を200μl
の溶解溶液(20mMトリス、pH7.4、2mM M
gCl2および0.1%トリトン(Triton)X)を含む
1.5mlミクロチューブの中に切り刻み、1分間プラ
スチック乳棒(Kontes)ですり潰すことによって、筋肉
抽出物が調製された。筋肉細胞の完全な粉砕を確実にす
るために、筋肉組織はそれから15分間4℃でボンベ
(Parr)の中で600psiのN2下に置かれた後、圧
力は開放された。
【0176】繊維芽細胞はプレートからトリプシン分解
された後同様に処理され、血清とともに培地の中に取入
れられ、PBSで2回洗われ、最終細胞ペレットは20
0μlの溶解溶液の中に懸濁された。75μlの筋肉お
よび繊維芽細胞抽出物は、C 14−クロラムフェニコール
とともに2時間反応混合物をインキュベートすることに
よってCAT活性について検定され、それに続いて例7
にすべて示されるように抽出および薄層クロマトグラフ
ィーが行なわれた。
【0177】図1は注射された四頭筋の抽出物内のCA
T活性を示す2つの別個の実験からのオートラジオグラ
ムを含む。レーン数はオートラジオグラムの一番上に示
され、%クロラムフェニコール変換率は底に示される。
サンプルの位置づけは以下のとおりである。 レーン1および13:対照繊維芽細胞 レーン2および14:5%スクロースのみを注射された
筋肉 レーン3および15:0.005単位の非注射、精製C
AT標準 レーン4および16:0.05単位の精製CAT(Sigm
a) レーン5〜8:5%スクロース中100μgのβgCA
TβgAn RNAを注射された筋肉 レーン11、12および17〜20:5%スクロース中
100μgのpRSVCAT DNAを注射された筋肉 レーン9および10:60μgのDOTMAとともに7
0%集密60mmプレートの3T3細胞(106)に脂
質導入(リポフェクション)された20μgのβgCA
TβgAn RNA レーン21、22:60μgのDOTMAとともに50
%集密60mmプレートの3T3細胞にリポフェクショ
ンされた20μgのpRSVCAT レーン23、24:50%集密60mmプレートの3T
3細胞中にリポフェクションされた20μgのpRSV
CAT燐酸カルシウム。
【0178】CAT活性は注射後18時間で4ヵ所のR
NA注射部位すべてにおいて容易に検出され、かつ注射
後48時間で6ヵ所のDNA注射部位すべてで検出され
た。4ヵ所のRNA注射部位の2ヵ所(図1、レーン6
および8)からの抽出物ならびに6ヵ所のDNA注射部
位の2ヵ所(図1、レーン11および20)からの抽出
物は、最適の条件下においてインビトロで一時的にトラ
ンスフェクトされた繊維芽細部から得られたCAT活性
のレベル(図1、レーン9、10、21−24)に匹敵
するCAT活性のレベルを含んだ。筋肉で発現されたC
AT活性の平均総量は、RNA注射に対して960p
g、DNA注射に対して116pgであった。異なる筋
肉部位から回収されたCAT活性の変動はおそらく、注
射および抽出技術に由来する変動である。なぜなら純粋
CAT蛋白質またはpRSVCATでトランスフェクト
された繊維芽細胞を筋肉部位に注射し、ただちにCAT
活性の測定のために切除したとき、顕著な変動が観察さ
れたからである。CAT活性はまた、RNAまたはDN
A CATベクターを注射された腹筋からも回収され、
他の筋肉類がポリヌクレオチドを取込みかつ発現するこ
とが可能であることを示した。
【0179】例12:マウスの筋肉に直接注射された純
粋DNAの生体内発現の部位 注射された筋肉の遺伝子発現の部位は、注射に関してE.
coli β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するpRS
VLac−Z DNAベクター(P. NortonおよびJ. Co
ffin Molec. Cell Biol. 5:281-290(1985))を利用
し、E. coliのβ−ガラクトシダーゼ活性について筋肉
細胞の原位置での細胞化学染色を観察することによって
測定された。マウスの四頭筋は前の例で説明されたよう
に露出された。四頭筋に20%スクロース中pRSVL
AC−Z DNA100μgを一回注射した。7日後個
々の四頭筋がそのまま全部取り出され、5つおきの15
μm切片がβ−ガラクトシダーゼ活性について組織化学
的に染色された。
【0180】筋肉生検は液体N2−冷却イソペンタンの
中で凍結された。15μm連続切片はクライオスタット
を使用してスライスされ、すぐにゼラチン化スライド上
に置かれた。スライドは10分間PBS中1.5%グル
タルアルデヒドで固定され、β−ガラクトシダーゼ活性
のために4時間染色された(J. Price他 Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA 84:156-160(1987))。筋肉はエオシ
ンにより対比染色された。
【0181】撮影された切片(図2)は以下のとおりで
ある。 (A):20%スクロースのみを含む溶液を注射された
対照筋肉の切片。倍率60×。 (B)(C)および(D):pRSVLacZを注射さ
れた筋肉の切片。それぞれ倍率25×、160×および
400×。 (E):pRSVLacZを注射された他の筋肉の縦方
向の切片。倍率160×。 (F)(G)および(H):0.6mm離れた同じ筋肉
の一連の切片。
【0182】全四頭筋を含むおよそ4000細胞のうち
の60の筋肉細胞(1.5%)および注射領域内の細胞
のおよそ10〜30%が、青色に染色された(図2B、
CおよびD)。20%スクロース溶液のみを注射された
対照筋肉は、バックグラウンド染色を示さなかった(図
2A)。いくつかの個々の筋肉細胞内での陽性のβ−ガ
ラクトシダーゼ染色は、一連の切片について少なくとも
1.2mmの深さであり(図2F、GおよびH)、それ
は、複数核へのトランスフェクションの結果であるか、
あるいは1つの核から発現される細胞質蛋白質が筋肉細
胞内に広く分配される能力のどちらかであり得る。縦方
向切片はまた、少なくとも400μmにわたる筋肉細胞
内のβ−ガラクトシダーゼ染色を示した(図2E)。青
色の濃い細胞に隣接する細胞の中に、弱い青色染色がし
ばしばその境界領域に現われた。これは、反応したX−
gal生成物が沈殿する前に拡散した組織化学的β−ガ
ラクトシダーゼ染色の産物である可能性が高い。
【0183】同様の結果が線状DNAを使って得られ
る。 例13:マウスの筋肉に注射されたRNAおよびDNA
の用量作用効果 ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子(LUC)を使
った実験により、注射された筋肉から抽出された総ルシ
フェラーゼに対する用量レベルおよび時間のパラメータ
の効果を調査した。
【0184】RNAおよびDNAベクターが調製され、
マウスの四頭筋に前に説明されたように注射された。全
四頭筋の筋肉抽出物は、溶解緩衝液が100mM KP
ipH7.8、1mM DTTおよび0.1%トリトン
Xであることを除いては、例11に説明されたように調
製された。200μl抽出物のうちの87.5μlがL
KB1251蛍光計を使用してルシフェラーゼ活性につ
いて分析された(J.de Wet 他 Molec. Cell Biol. 7:72
5-737(1987))。精製されたホタルルシフェラーゼ(A
nalytical Luminescence Laboratory)によって対照筋
肉抽出物で生成された光単位を測定することによって確
立された標準曲線を使用し、光単位をルシフェラーゼの
ピコグラム(pg)に変換した。注射の前のRNAおよ
びDNAの調製物は何の汚染ルシフェラーゼ活性も含ま
なかった。20%スクロースを注射された対照筋肉は何
ら検出可能なルシフェラーゼ活性を有しなかった。上述
の実験はすべて2〜3回行なわれ、特にDNAについて
40日より長いものが3回行なわれた。
【0185】図3A〜3Cは以下の結果を示している。 3(A)20%スクロース中、種々の量のβgLUCβ
gAn RNAを注射した後18時間で測定されたルシ
フェラーゼ活性、および20%スクロース中、種々の量
のpRSVLを注射した後4日で測定されたルシフェラ
ーゼ活性。
【0186】3(B)βgLUCBgAn RNA20
μgを100万の3T3繊維芽細胞(Malone, R. 他 P
roc. Nat'l. Acad Sci. USA 86:6077-6081(1989))中
にリポフェクトした後、および20%スクロース中10
0μgのβγΛΥ βg An RNAを四頭筋に注射
した後、様々な時間で検定されたルシフェラーゼ活性。
【0187】3(C)pRSVL DNAを筋肉に注射
した後、様々な時間で検定されたルシフェラーゼ活性。
【0188】A.遺伝子発現のレベル 用量作用効果は、四頭筋に様々な量のβgLucβgA
n RNAまたはDNA pRSVL構造物を注射した
際に観察された(図3A)。10倍多いDNAを注射す
ると、DNA10μg注射の後の33pgルシフェラー
ゼからDNA100μg注射後の320pgルシフェラ
ーゼへとおよそ10倍のルシフェラーゼ活性増加という
結果が得られた。10倍多いRNAの注射はまた、およ
そ10倍多いルシフェラーゼを生み出した。60mm皿
における100万の3T3マウス繊維芽細胞は、オプテ
ィメム(Opti-MEM)(Gibco)3ml中リポフェクチン
(Lipofectin)(Bethesda Research Labs)60μgと
複合されたDNAまたはRNA20μgを用いてリポフ
ェクトされた。2日後、細胞はルシフェラーゼ活性につ
いて検定され、4つの別個のプレートからの結果は平均
された。繊維芽細胞にトランスフェクトされたpRSV
L DNA20μgは、合計でルシフェラーゼ120p
g(6pgルシフェラーゼ/μgDNA)を生み出す一
方で、筋肉に注射された25μgは平均116pgのル
シフェラーゼ(4.6pgルシフェラーゼ/μgDN
A:図3A)を生み出した。RNAベクターからの発現
は、注射された筋肉におけるよりトランスフェクトされ
た繊維芽細胞においておよそ7倍効果的であった。繊維
芽細胞にトランスフェクトされた20μgのβgLuc
βgAn RNAは、合計で450pgのルシフェラー
ゼを生み出し、一方で筋肉に注射された25μgは74
pgのルシフェラーゼを生み出した(図3Aおよび3
B)。配達されたDNAの量に基づいて、DNAベクタ
ーからの発現の効率は、トランスフェクトされた繊維芽
細胞および注射された筋肉の双方で同様であった。
【0189】B.発現の時間経過 時間経過もまた調査された(図3Bおよび3C)。ルシ
フェラーゼ活性は、25μgのβgLucβgAn R
NAまたは100μgのpRSVL DNAが注射され
た後、様々な時間で検定された。RNA注射の後、平均
ルシフェラーゼ活性は18時間で最大量の74pgに達
し、それから60時間で急速に減少して2pgになっ
た。トランスフェクトされた繊維芽細胞において、ルシ
フェラーゼ活性は8時間で最大であった。筋肉へのDN
A注射に続いて、相当量のルシフェラーゼが少なくとも
60日間存在した。
【0190】図3Bのデータは、ルシフェラーゼ蛋白質
および生体外RNA転写が筋肉内で24時間より少ない
半減期を有することを示す。したがって、60日間のル
シフェラーゼ活性の持続性は、ルシフェラーゼ蛋白質の
安定性または生体内RNA転写の安定性のためではない
ようである。
【0191】例14:サザンブロット分析によって測定
された注射の後の筋肉中のDNAの持続性 筋肉DNAの調製物は、対照である非注射の四頭筋、ま
たは20%スクロース中pRSVL100μgを注射し
た30日後の四頭筋から、得られた。同じ動物からの2
つの全四頭筋がプールされ、液体N2中で切り刻まれ、
乳鉢と乳棒を使ってすり潰された。全細胞性DNAとH
IRT上澄が調製された(F. M. Ausubel 他(Eds)Cur
rent Protocols in Moleculor Biology, John Wiley, N
ew York(1987))。15μgの全細胞性DNAまたは
100μlのHIRT上澄からの10μlが消化され、
1.0%アガロースゲル上で精製され、「バキュブロッ
ト(vacublot)」装置(LKB)を使ってニトラン(Ny
tran)(商標)(SchleicherおよびSchuell, New Yor
k)に移され、マルチプライマー32P−ルシフェラーゼ
プローブ(pRSVLのHindIII−BamHl
フラグメント)とハイブリッド形成された。一夜のハイ
ブリダイゼーションに続いて、膜の最終洗浄が68℃で
0.5%SDSを含む0.2×SSCを用いて行なわれ
た。コダックXAR5フィルムに−75℃で45時間感
光させた。
【0192】図4は以下のようなサンプルパターンを有
するサザンブロットのオートラジオグラムである。 レーン1:0.05ngの非消化pRSVLプラスミド レーン2:0.05ngのBamHl消化pRSVL レーン3:ブランク レーン4:対照筋肉からのHIRT上澄のBamHl消
化物 レーン5:対照である非注射の筋肉からの細胞性DNA
のBamHl消化物 レーン6、7:pRSVLが注射された筋肉の2つの異
なるプールからのHIRT上澄のBamHl消化物 レーン8、9:pRSVLが注射された筋肉の2つの異
なるプールからの細胞性DNAのBamHl消化物 レーン10:BamHlおよびDpnlで消化された細
胞性DNA(レーン9と同一) レーン11:BamHlおよびMbolで消化された細
胞性DNA(レーン9におけるのと同一) レーン12:BgIIIで消化された細胞性DNA レーン13:BgIIIで消化されたHIRT上澄 (サイズマーカー(λ/HindIII)は左に示され
る)。
【0193】筋肉DNAのサザンブロット分析は、外来
のpRSVL DNAが少なくとも30日間(図4、レ
ーン6〜9)筋肉組織内に存在し、かつ注射後2日およ
び15日に筋肉に存在するDNAのレベルに類似するこ
とを示している。BamHl(これは一回pRSVLを
切断する。図4、レーン6〜9)で消化された筋肉DN
Aにおいて、線状にされたpRSVLに対応する5.6
kbバンドの存在(図4、レーン2)は、DNAが環状
の染色体外の形態か、染色体に組込まれたプラスミドの
大きな縦列反復のどちらかで存在することを示唆する。
BgIII(これはpRSVLを切断しない)で消化さ
れた筋肉DNAにおいて、10kbより小さく(図4、
レーン12および13)かつプラスミドpRSVLの開
いた環の形態と同じ大きさでのバンドの存在(図4、レ
ーン1)は、DNAが開いた環の形態で染色体外に存在
することを示唆する。HIRT上澄におけるpRSVL
DNAの出現(図4、レーン6、7および13)および
HIRT上澄での形質転換の後アンピシリン耐性にされ
た細菌におけるpRSVL DNAの出現はまた、DN
Aが統合されずに存在することを示唆する。外因性DN
Aの大半は染色体外に存在するようであるが、低レベル
の染色体への統合を決定的には除外することはできな
い。小滴(ブロッブ)の過度の露光は、ランダムな部位
で統合されるプラスミドDNAを表わすであろう10k
bより大きいハイブリッド形成したDNAのスポットを
明らかにしなかった。pRSVL DNAの感受性は筋
肉についてDpnI消化(図4、レーン10)に対して
であり、Mbol消化に対しては抵抗性であること(図
4、レーン11)は、DNAが筋肉細胞内で複製されな
かったことを示唆する。
【0194】例15:マウスの筋肉に直接移植された純
粋DNAの生体内発現 pRSVL DNAはエタノール中で沈殿され乾燥され
た。そのペレットは鋭い鉗子で拾い上げられ、先行する
例で述べられたように様々な筋肉群の中に入れられた。
5日後筋肉は例13で述べられたようにルシフェラーゼ
活性について分析された。DNAは以下のような様々な
筋肉群で効率的に発現された。
【0195】
【表2】
【0196】例16:肺への直接的遺伝子配達:DN
A、DNA/CL複合体または純粋蛋白質の気管内注射 リポフェクチン(Lipofectin)(商標)と複合されたD
NAルシフェラーゼベクター(pRSVL)が、20%
スクロース(2匹のラット)または5%スクロース(6
匹のラット)のどちらかでラット気管内に注射された。
注射の2日後、ラットの肺は7つの部分、LUL、LL
L、RUL、RML、RLL、AL(以下のように規定
される)および気管に分割された。ネズミの肺は左主気
管支から分かれた1つの大きな左肺を有するという点で
ヒトの肺と異なっている。この研究のために左の肺は、
左上部部分(LUL)と左下部部分(LLL)とに半分
に切断された。右肺は4つの葉、右頭蓋葉(RUL)、
右中葉(RML)、右低葉(RLL)および附属葉(A
L)を含む。これらの肺を200μlの溶解溶液(20
mMトリス、pH7.4mM MgCl2および0.1
%トリトンX)を含む別個の1.5mlミクロチューブ
に切り刻み、1分間プラスチックの乳棒(Kontes)で肺
をすり潰すことによって抽出物が調製された。肺細胞の
完全な粉砕を確実にするために、肺組織は次いで15分
間4℃でパール(Parr)ボンベの中で600psiのN
2下に置かれた後、圧力開放された。ルシフェラーゼ検
定は約350μlの全容量の中から87.5μlの肺抽
出物について行なわれた。
【0197】
【表3】
【0198】モック:この値は食道に0.3mlの20
%スクロース中25μgのDNAを摂取した動物に対す
る値である(水のみを含むサンプルは22.5l.u.
を生じる)。
【0199】25μgDNA単独:20%スクロース
0.3ml中25μgのpPGKLucを気管内注射に
より摂取した別の動物を表わす。
【0200】25μgDNA/CL:5%スクロース
0.3ml中リポフェクチン(Lipofectin)と複合され
た25μgのpPGKLucを気管内注射により摂取し
た別の動物を表わす。
【0201】注射の2日後、上述の動物は殺され、肺抽
出物が調製された。 Luc蛋白質104l.u.:精製されたホタルルシフ
ェラーゼ(Sigma)の30,000光単位(l.u.)
の等量を摂取し、それからすぐに殺された動物を表わ
す。
【0202】25μgDNA単独および25μgDNA
/CL群の動物でのルシフェラーゼ活性は、モック動物
での活性よりも大きくなかった。しかしながら、250
μgDNA単独の動物では、対照肺またはブランクに対
し、小さいがしかし確実に上昇したl.u.活性が示さ
れた(アンダーラインされたもの)。同一の抽出物に対
する二重検定によりその結果は確かなものとなった。L
KB1251蛍光計を使っての実験は、これらの値がバ
ックグラウンドを超えただけではあるが、真のルシフェ
ラーゼ活性を示すことを明らかにしている。
【0203】例17:DNA処方物を直接注射されたマ
ウス肝臓中のルシフェラーゼ活性 DNAルシフェラーゼ発現ベクターpPGKLucが、
マウスの左肝臓葉の下部に肝臓内(IH)注射された。
pPGKLucDNAは、それ自体を(20%スクロー
ス1.0ml中450μgのDNA)注射されるか、ま
たはリポフェクチン(Lipofectin)(5%スクロース
1.0ml中50μgのDNA+150μgのリポフェ
クチン)と複合されて注射された。注射の3日後、左肝
臓葉は2つの部分(葉が注射された下部部分と注射部位
から離れた葉の上部部分)に分割されるとともに、先行
する例に述べられたようにルシフェラーゼ活性について
検定された。
【0204】
【表4】
【0205】純粋なpPGKLuc注射を摂取した3匹
の動物のうちの2匹、およびpPGKLuc+リポフェ
クチン注射を摂取した3匹の動物のうちの2匹は、バッ
クグラウンドを著しく超えるルシフェラーゼ活性を有し
た(アンダーラインのもの)。直接注射された肝臓葉の
下部部分は、注射部位から離れた上部部分より大量のル
シフェラーゼ活性を有した。同様の結果がpRSVCA
T DNA発現ベクターおよびCAT検定を用いて得ら
れた。ルシフェラーゼ活性は、pPGKLuc(+およ
び−リポフェクチン)の類似の調製物をラットの門脈循
環に注射した3日後において検出されなかった。
【0206】例18:肝臓および筋肉に注射された成長
ホルモン遺伝子の発現 マウスの肝臓と筋肉の両方にpXGH5(メタロチオネ
インプロモータ成長ホルモン融合遺伝子)(Selden Ric
hard他,Molec. Cell Biol. 6:3173 - 3179(1986))
を注射した。マウスは76mMの硫酸亜鉛水上に置かれ
た。その後動物は採血され、血清はニコルス(Nichol
s)GHキット(Kit)を使用して成長ホルモンについて
分析された。
【0207】A.2匹のマウスに5%スクロース中リポ
フェクチン60μg/mlと複合された20μgのpX
GH5遺伝子を注射した。この溶液1mlが肝臓に注射
され、腹側および背側の腹筋には7つの部位に2回0.
1mlが注射された。2日後、動物は採血された。1匹
の動物の血清はバックグラウンドレベルのままであった
が、他方の血清は0.75ng/mlの成長ホルモンを
含んだ。
【0208】B.3匹のマウスに5%スクロース中1m
g/mlのpXGH5を0.1ml注射し、四頭筋に2
回、ハムストリング筋に1回、胸筋に1回、小多角骨筋
1回、2日に分けて注射した。結果は以下のとおりであ
った。
【0209】
【表5】
【0210】例19:免疫ペプチドのための遺伝子を直
接注射されたマウス内での抗体生成 マウスは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ
によって駆動されるgp−120遺伝子からなる20μ
gのプラスミド構造物を注射された。DNAは例11に
述べられた方法に従ってマウスの四頭筋に注射された。
マウス5(図5A)は、四頭筋に等張スクロース液中2
0μgのプラスミドDNAを注射された。マウス2(図
5B)は、スクロース溶液単独を注射された。血液サン
プルが、注射の前(0日目)に図5に示された時間に採
られ、注射後40日を過ぎるまで採られた。各サンプル
からの血清は、連続的に希釈され、抗原として酵母の中
に作られる組換型gp−120蛋白質を使って、抗体検
出のための標準ELISA法検定で検定された。IgG
およびIgM抗体の双方は、図5に示されるように検出
された。この研究は遺伝子はそのシグナル配列を保持
し、蛋白質は細胞から効率的に放出されることを示す。
【0211】例20:免疫ペプチドのための遺伝子をト
ランスフェクトされた細胞を注射されたマウスにおける
抗体生成 細胞株BALB/C C1.7(TIB80)を、ザ・
アメリカン・タイプ・ティシュ・カルチャ・コレクショ
ン(the American Type Tissue Culture Collection)
から得た。これらの細胞は例19に述べられたgp−1
20遺伝子構造物でトランスフェクトされた。0.75
mlオプティメム(OptiMEM)(Gibco.Inc.)に対して
6.1μgのDNAが加えられた。また、30μgの量
の陽イオンリポソーム(70:30のモル比でDOTM
Aとコレステロールを含む)が、他の0.75mlオプ
ティメム(OptiMEM)に加えられた。混合物は合わさ
れ、20%(v/v)胎仔ウシ血清を含む1.5mlの
オプティメムが加えられた。この溶液は80%の集密細
胞(プレート当りおよそ100万の総細胞)を含む60
mmプラスチックペトリ皿に注がれた。リポフェクショ
ン後3.2時間で、細胞はトリプシンおよびEDTA処
理でプレートから剥され、オプティメム(OptiMEM)で
洗われるとともに10%胎仔ウシ血清を含む0.1ml
オプティメム(OptiMEM)に再懸濁された。これらの細
胞はマウスに注射された(IP)。マウスI2(図6
A)はトランスフェクト細胞を注射された。マウスI1
(図6A)には同一数の非トランスフェクト細胞を接種
した。血液のサンプルは注射の前(0日目)に取られ、
さらに図6に示される時間に取られた。血清サンプルは
先行する例のように処理された。IgGおよびIgM抗
体の双方が図6に示されるように検出された。
【0212】例21:インビトロで細胞にトランスフェ
クトされたDNAの直接翻訳に対する無キャップ5′配
列の使用 2つの異なったDNAテンプレートが構成され、その両
者はE. coli β−ガラクトシダーゼによりレポートされ
る遺伝子を発現するRNAの合成をコードする。コザッ
ク(Kozak)コンセンサス配列を含むLac−Z遺伝子
がpβGLucβGAnテンプレートのルシフェラーゼ
コード配列の代わりに挿入され、pβGLacZβGA
nテンプレートを形成した。pEMCLacZβGAn
ンプレートはpβGLacZβGAnの5′β−グロビ
ン非翻訳配列を脳心筋炎ウイルス(EMCV)からの5
88bp EcoRl/Ncolフラグメント(Parks,
G.他,J.Virology 60:376-384(1986)中のpE5
LVPO)で置換えることによって作られた。これらの
EMC5′非翻訳配列は、網状赤血球溶解産物中インビ
トロで効率的な翻訳を開始できることが以前に示されて
いた。我々はこれらの配列もまた培養において繊維芽細
胞中にトランスフェクトされたとき効率的な翻訳を誘導
できることを明らかにした。青色細胞のパーセンテージ
は、キャップされたpEMCLacZβGAnRNAで
トランスフェクトされた細胞より、キャップされていな
いpEMCLacZβGAnRNAでトランスフェクト
された細胞の方がわずかに大きかった。非キャップまた
はキャップのいずれのpEMCLacZβGAnRNA
を用いたトランスフェクションも、キャップされたβG
LacZβGAnRNAを用いたトランスフェクション
より多い数の陽性のβ−ガラクトシダーゼ細胞を産出し
た。このEMC5′非翻訳配列は、ワクシニア−T7ポ
リメラーゼベクターの成分として、非キャップmRNA
の翻訳を4〜7倍増加できることが最近示されている
(Elroy-Stain,O. 他,Proc. Natl. Acad.Sci. USA 8
6:6126-6130(1989))。これらのEMC配列は従っ
て、非キャップメッセンジャーからの効率的な翻訳を誘
導できる能力を有する。
【0213】例22:トランスフェクトされた細胞培養
物におけるT7ポリメラーゼ転写 SV40プロモータ(Dunn, J.他,Gene 65:259(198
8))からT7ポリメラーゼを発現するSV40−T7
ポリメラーゼプラスミドを、培養において3T3繊維芽
細胞中に、pEMCLacZβGAnテンプレートDN
Aとともにリポフェクションし、T7ポリメラーゼ転写
がプラスミドを介して起こり得ることを明らかにした。
次ぎの2つの異なるSV40−T7ポリメラーゼ発現ベ
クターが使用された。
【0214】(a)pSV−Gl−A:細胞質に向けら
れるT7ポリメラーゼ蛋白質の発現を駆動するpAR3
126−SV40プロモータ。
【0215】(b)pSVNU−Gl−A:細胞質に向
けられるT7ポリメラーゼ蛋白質の発現を駆動するpA
R3132−SV40プロモータ。
【0216】これらの2つのプラスミドの各々は、1:
3および3:1の割合で、pEMCLacZβGAn
ともに、3T3細胞の60mmプレート中にリポフェク
ションされた。青色のβ−ガラクトシダーゼ細胞の数が
数えられ、以下に示されるように記録された。
【0217】
【表6】
【0218】例23:メッセンジャーRNAの制御され
た注入後の脳におけるルシフェラーゼの発現 2匹の成熟したマウスと1匹の生まれたてのマウスに、
例17に従って調製された5′キャップを含むβgLu
cβgAn mRNAを注射した。成熟したマウスにお
いて、注射は20%スクロース中3.6μg/μlのm
RNAの保存溶液から行い、注射量は5μlであり、左
右の頭頂皮質の各々に2回の注射が行なわれ、したがっ
て、マウス1匹につき4回の注射が行なわれた。組織
は、注射後18時間で検定され、例13に従って200
μlの脳ホモジェネートを使用し、パール(Parr)ボン
ベで粉砕し、87.5μlを検定に使用した。結果は以
下のとおりである。
【0219】
【表7】
【0220】生まれたてのマウスは両側前脳に1μlの
βgLucβGAn(3.6μg/μl:20%スクロ
ース)を注射され、組織は同様に処理され分析された。
【0221】
【表8】
【0222】例24:インビボでのジストロフィーマウ
ス筋肉におけるジストロフィンの機能的発現 ラウス肉腫(Rous Sarcoma)ウイルスのプロモータの制
御下でジストロフィン遺伝子を含むプラスミドが、完全
なジストロフィンコード領域およびSV40ポリを含む
Xp21プラスミドから調製された。セグメントはクン
ケル(Kunkel)とその同僚によってクローン化されたも
のである(Brumeister M., Monaco AP,Gillard EF, van
Ommen GJ, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Kunkel L
M, Lehrach H.,デュシェーヌ(Duchenne)筋ジストロフ
ィー遺伝子を含む、ヒトXp21の10メガベースフィ
ジカルマップ,Genomics 1988年4月2日(3):189-20
2:Hoffman, EPおよびKunkel, Duchenne's/Becher 筋
ジストロフィーのLMジストロフィンの異常。Neuron第
2巻,1019-1029(1989):Koenig M., Monaco AP, Kun
kel LM.,ジストロフィンの完全な列は棒状のサイトスケ
ルタル(cito-skeletal)蛋白質を予測する。Cell 1988
年4月22日,53,(2):219-26)。100μlの燐酸塩
緩衝塩類溶液中200μgのプラスミドがジストロフィ
ン遺伝子生産物が欠ける突然変異マウス系(MDXマウ
ス:Jackson Labs)の四頭筋に注射された。機能的ジス
トロフィンの発現は、クンケル(Kunkel)から入手した
同じ抗ジストロフィン抗体(蛍光2次抗体を有する抗−
60kd抗体)を使用するWatkinis他によって説明され
た手順に従って、免疫組織化学により注射後7日間モニ
ターされた。ジストロフィーマウスのジストロフィン遺
伝子生産物の機能的発現は、注射された動物からの四頭
筋の切片において観察される蛍光パターンを、正常な動
物で観察される蛍光パターンと比較することによって検
出された。(Watkins S.C., Hoffman E.P., Slayter H.
S., Kinkel L.M.)、筋原繊維におけるジストロフィン
の免疫電子顕微鏡的位置測定(Nature 1988年6月30
日:333(6176:863-6)。正常なジストロフィンの発現
は、筋肉繊維のプラズマ膜下に局在化されるので、四頭
筋の切片は細胞を取囲む蛍光パターンを与える。加え
て、ジストロフィンの発現はアフィニティ精製された抗
−60kd抗体を使用するウェスタンブロット分析によ
って定量化された。
【0223】例25:デュシェーヌ筋ジストロフィーの
患者の筋肉への修正ジストロフィン遺伝子の直接投与 筋ジストロフィーの患者は、100μlの燐酸緩衝生理
食塩水中に機能的ジストロフィン遺伝子(前の例を参
照)を含むプラスミド200μgを複数回注射される。
軽い麻酔下にある間に、患者は手術をすることなく直接
皮膚を介して骨格筋塊全体に5cm間隔で注射される。
患者の回復は痙攣緊張および最大随意収縮をモニターす
ることによって評価された。加えて、注射された領域か
らの300〜500の筋肉細胞の生検が、組織学試験、
筋肉構造の観察およびデュシェーヌ筋ジストロフィーの
患者にないジストロフィンの存在の生化学分析のために
採取される。肋骨ケージおよび横隔膜を動かす肋間筋を
含む呼吸筋は、筋ジストロフィー患者において特に重要
な障害筋肉類である。肋間筋は、他の骨格筋類が可能で
あるように、皮膚を介する注射によって到達可能であ
る。横隔膜は、プラスミドDNAの直接注射のため筋肉
を露出させる外科的手法によってアクセス可能である。
【0224】開示された発明の様々な修正、改良および
応用があり、それは当業者に明らかであろうし、本発明
の応用はかかる具体例をカバーすることを意図するもの
とする。本発明を好ましい具体例に関連して説明してき
たが、本発明の全範囲は特許請求の範囲に基づいて定め
られるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 マウスの筋肉におけるCAT遺伝子の発現を
示すクロマトグラフィー研究のオートラジオグラムから
なる。
【図2】 pRSVLac−Z DNAベクターを注射
した後のベータ−ガラクトシダーゼ活性に対して染色さ
れた筋肉組織の顕微鏡写真からなる。
【図3】 βgLucBgAnの筋肉への注射の後の筋
肉におけるルシフェラーゼの活性に関するデータを提示
する。
【図4】 pRSVLを注射した筋肉からの抽出液を分
析した後のサザンブロットのオートラジオグラムを提示
する。
【図5】 免疫原性ペプチドのための遺伝子の注射の後
のマウスにおける抗体の生産を示すグラフを含む。
【図6】 免疫原性ペプチドのための遺伝子をトランス
フェクションされたマウス細胞の注射の後の、マウスに
おける抗体の生産を示すグラフからなる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 38/21 A61K 47/48 39/395 A61P 31/18 47/18 31/20 47/24 31/22 47/48 35/00 A61P 31/18 A61K 37/02 31/20 37/24 31/22 37/48 35/00 37/66 C C12N 15/09 C12N 15/00 A (71)出願人 500484146 ウィスコンシン・アラムナイ・リサーチ・ ファウンデイション WISCONSIN ALUMNI RE SEARCH FOUNDATION アメリカ合衆国、53705 ウィスコンシン 州、マディソン、ウォルナット・ストリー ト、614 (72)発明者 フェルグナー,フィリップ・エル アメリカ合衆国、92067 カリフォルニア 州、ランチョ・サンタ・フェ、ラス・パロ マス、5412 (72)発明者 ウルフ,ジョン・アシャー アメリカ合衆国、53705 ウィスコンシン 州、マディソン、ユニバーシティ・ベイ・ ドライブ、1122 (72)発明者 ロウドズ,ガリー・エイチ アメリカ合衆国、92024 カリフォルニア 州、リュケイディア、バーガンディ・ロー ド、1618 (72)発明者 マロウン,ロバート・ウォリス アメリカ合衆国、60611 イリノイ州、シ カゴ、シカゴ・アベニュ、303・イー (72)発明者 カーソン,デニス・エイ アメリカ合衆国、92014 カリフォルニア 州、デル・マー、ビスタ・デル・オウシア ノウ、14824

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 治療または免疫原性処置のため身体の組
    織に直接投与するための医薬であって、 非統合性でかつ非感染性であり、かつ身体内に所望の治
    療効果または免疫原性効果を生じさせる遺伝子生産物を
    作動的にコードする配列を有する、ポリヌクレオチド、
    およびカチオン脂質物質からなり、 前記ポリヌクレオチドは前記カチオン脂質物質と複合化
    されており、かつ病気の治療または身体における免疫応
    答の誘導のため使用される、医薬。
  2. 【請求項2】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種
    と組合された正に荷電した脂質種からなる、請求項1に
    記載の医薬。
  3. 【請求項3】 前記遺伝子生産物が疾病治療物質であ
    る、請求項1に記載の医薬。
  4. 【請求項4】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種
    と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項
    3に記載の医薬。
  5. 【請求項5】 前記遺伝子生産物がガン治療物質であ
    る、請求項1に記載の医薬。
  6. 【請求項6】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種
    と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項
    5に記載の医薬。
  7. 【請求項7】 前記遺伝子生産物がインターフェロンで
    ある、請求項1に記載の医薬。
  8. 【請求項8】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質種
    と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求項
    7に記載の医薬。
  9. 【請求項9】 前記遺伝子生産物がインターロイキン−
    2である、請求項1に記載の医薬。
  10. 【請求項10】 前記カチオン脂質物質は、中性の脂質
    種と組み合わされた正に荷電した脂質種からなる、請求
    項9に記載の医薬。
  11. 【請求項11】 治療または免疫原性処置のため哺乳動
    物の身体の組織に直接投与するための医薬であって、 哺乳動物の細胞において治療ポリペプチドの合成を誘導
    するポリヌクレオチドおよびトランスフェクションを促
    進するカチオン脂質物質を有効成分として含み、 前記ポリヌクレオチドは前記カチオン脂質物質と複合化
    されており、 前記ポリヌクレオチドは、前記治療ポリペプチドが必要
    な前記哺乳動物の組織にインビボで直接導入されると
    き、前記哺乳動物の細胞に組込まれ、かつ、前記治療ポ
    リペプチドは必要な治療効果をもたらすのに十分な量で
    発現される、医薬。
  12. 【請求項12】 前記ポリヌクレオチドは、プロモータ
    ーと結合して前記治療ポリペプチドを作動的にコードす
    るDNAプラスミドおよびメッセンジャーRNAからな
    る群より選択されるものである、請求項11に記載の医
    薬。
  13. 【請求項13】 前記プロモーターが、ラウス肉腫ウイ
    ルス長末端反復(RSV LTR)、骨髄増殖性肉腫ウ
    イルス長末端反復(MPSV LTR)、シミアンウイ
    ルス40前初期プロモーター(SV40 IEP)、メ
    タロチオネインプロモーターおよびヒトサイトメガロウ
    イルス前初期プロモーター(CMVIEP)からなる群
    より選択されるものである、請求項12に記載の医薬。
  14. 【請求項14】 前記組織が筋肉である、請求項11に
    記載の医薬。
  15. 【請求項15】 前記筋肉は骨格筋である、請求項14
    に記載の医薬。
  16. 【請求項16】 前記組織が皮膚である、請求項11に
    記載の医薬。
  17. 【請求項17】 前記組織が血液である、請求項11に
    記載の医薬。
  18. 【請求項18】 前記組織が体腔内のものである、請求
    項11に記載の医薬。
  19. 【請求項19】 前記ポリヌクレオチドは注射により前
    記組織に導入される、請求項11に記載の医薬。
  20. 【請求項20】 前記哺乳動物はヒトである、請求項1
    1に記載の医薬。
  21. 【請求項21】 前記治療ポリペプチドは前記組織の細
    胞によって生産される、請求項11に記載の医薬。
  22. 【請求項22】 前記治療ポリペプチドは、酵素、ホル
    モン、リンホカイン、受容体、成長因子、調節タンパク
    質、免疫調節因子および抗体からなる群より選択される
    ものである、請求項11に記載の医薬。
  23. 【請求項23】 前記治療ポリペプチドは、ヒト成長ホ
    ルモン、インスリン、インターロイキン−2、腫瘍壊死
    因子、神経成長因子、表皮増殖因子、組織プラスミノー
    ゲンアクチベーター、因子VIII:C、カルシトニ
    ン、チミジンキナーゼ、インターフェロン、顆粒球−マ
    クロファージコロニー刺激因子(GMCSF)およびエ
    リトロポエチンからなる群より選択されるものである、
    請求項22に記載の医薬。
  24. 【請求項24】 前記治療ポリペプチドはインターロイ
    キン−2である、請求項23に記載の医薬。
  25. 【請求項25】 前記治療ポリペプチドは免疫をもたら
    すポリペプチドであり、かつ前記治療効果は免疫原性の
    効果である、請求項11に記載の医薬。
  26. 【請求項26】 前記免疫をもたらすポリペプチドは、
    ウイルスタンパク質および腫瘍関連ポリペプチドからな
    る群より選択されるものである、請求項25に記載の医
    薬。
  27. 【請求項27】 前記ウイルスタンパク質は、ヒト免疫
    不全ウイルスタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質およ
    びヘルペスウイルスタンパク質からなる群より選択され
    るものである、請求項26に記載の医薬。
  28. 【請求項28】 前記免疫原性の効果は、体液性のもの
    であり、かつ抗体の生産をもたらすものである、請求項
    25に記載の医薬。
  29. 【請求項29】 前記免疫原性の効果は、細胞性のもの
    であり、かつ細胞障害性T細胞の生産をもたらすもので
    ある、請求項25に記載の医薬。
  30. 【請求項30】 前記免疫をもたらすポリペプチドまた
    はそのフラグメントは、クラスI主要組織適合性分子、
    クラスII主要組織適合性分子、およびクラスI主要組
    織適合性分子とクラスII主要組織適合性分子の組み合
    わせからなる群より選択される1つまたは複数の分子と
    共に、前記哺乳動物の細胞膜に運ばれるものである、請
    求項25に記載の医薬。
  31. 【請求項31】 前記ポリペプチドの生産は疾病の治療
    をもたらすものである、請求項11に記載の医薬。
  32. 【請求項32】 前記疾病はガンである、請求項31に
    記載の医薬。
  33. 【請求項33】 前記カチオン脂質は、第四級アンモニ
    ウム基および6〜30の炭素を有する1つまたは2つの
    飽和もしくは不飽和アルキル基を有するものである、請
    求項11に記載の医薬。
  34. 【請求項34】 前記カチオン脂質は、 式A) 【化1】 (式中、 R1およびR2は、同じかまたは異なり、かつC6〜C22
    アルキルまたはC6〜C 22アルケニルであり、 R3、R4およびR5は、同じかまたは異なり、かつ水
    素、C1〜C8アルキル、アリール、C7〜C11アラルキ
    ルであり、または、R3、R4およびR5の2つまたは3
    つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリジノ、ま
    たはモルホリノを形成することができ、 nは1〜8であり、かつXは製薬的に許容される陰イオ
    ンである)、および 式B) 【化2】 (式中、 R1およびR2は、同じかまたは異なり、かつC5〜C21
    アルキルまたはC5〜C 21アルケニルであり、 R3、R4およびR5は、同じかまたは異なり、かつ水
    素、C1〜C8アルキル、アリール、C7〜C11アラルキ
    ルであり、または、R3、R4およびR5の2つまたは3
    つが共同でキヌクリジノ、ピペリジノ、ピロリジノ、ま
    たはモルホリノを形成することができ、 nは1〜8であり、かつXは製薬的に許容される陰イオ
    ンである)からなる群より選択される式を有するもので
    ある、請求項33に記載の医薬。
  35. 【請求項35】 前記カチオン脂質は、N−(2,3−
    ジ−(9−(Z)−オクタデセニルオキシ))prop
    −1−イル−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロ
    リド(DOTMA)および1,2−ビス(オレオイルオ
    キシ)−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DO
    TAP)からなる群より選択されるものである、請求項
    34に記載の医薬。
  36. 【請求項36】 少なくとも1種の中性脂質をさらに含
    むものであり、 前記中性脂質と前記カチオン脂質は0%:100%〜7
    5%:25%の比率で混合されている、請求項11に記
    載の医薬。
  37. 【請求項37】 前記カチオン脂質と前記中性脂質との
    モル比は1:1である、請求項36に記載の医薬。
  38. 【請求項38】 前記中性脂質は、ホスファチジルコリ
    ン、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホ
    スファチジルコリン(DOPC)、ジオレオイルホスフ
    ァチジルグリセロール(DOPG)およびジオレオイル
    ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)からなる
    群より選択されるものである、請求項36に記載の医
    薬。
  39. 【請求項39】 前記カチオン脂質は、N−(2,3−
    ジ−(9−(Z)−オクタデセニルオキシ))prop
    −1−イル−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロ
    リド(DOTMA)および1,2−ビス(オレオイルオ
    キシ)−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DO
    TAP)からなる群より選択されるものであり、かつホ
    スファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミ
    ン、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、
    ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)
    およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
    (DOPE)からなる群より選択される少なくとも1種
    の中性脂質をさらに含むものである、請求項11に記載
    の医薬。
  40. 【請求項40】 治療または免疫原性処置のため脊椎動
    物の身体の組織に直接投与するための脂質/ポリヌクレ
    オチド複合体であって、 ポリヌクレオチドがトランスフェクションを促進するカ
    チオン脂質と複合化されたものであり、 前記ポリヌクレオチドは脊椎動物の細胞において治療ポ
    リペプチドの合成を誘導するものであり、 前記脂質/ポリヌクレオチド複合体は、脊椎動物の組織
    にインビボで導入されるとき、前記脊椎動物の細胞にト
    ランスフェクトされ、かつ、前記治療ポリペプチドは必
    要な治療効果をもたらすのに十分な量で発現される、脂
    質/ポリヌクレオチド複合体。
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