FR2845918A1 - Preparations immunogenes et vaccinantes a base d'arn - Google Patents

Abstract

L'invention concerne le domaine de la vaccination ou celui de la stimulation immunitaire par administration d'acides nucléiques, plus particulièrement par administration d'ARN codant pour un ou plusieurs antigènes de microorganismes pathogènes. L'invention porte sur une préparation immunogène comprenant de l'ARN messager mature codant pour au moins un antigène d'un agent pathogène, le cas échéant stabilisé par des séquences stabilisatrices et/ou des facteurs de stabilisation tels que des inhibiteurs de Rnases. L'ARN des préparations de l'invention peut également être complexé avec au moins un peptide ou une protéine cationique, de préférence polycationique.

Description

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Préparations immunogènes et vaccinantes à base d'ARN L'invention concerne le domaine de la vaccination ou celui de la stimulation immunitaire par administration d'acides nucléiques, plus particulièrement par administration d'ARN codant pour un ou plusieurs antigènes de microorganismes pathogènes.

Les acides nucléiques sont des outils récents et d'importance croissante pour la vaccination prophylactique ou thérapeutique contre des maladies infectieuses ou malignes.

Typiquement, les vaccins à ADN sont des plasmides bactériens qui portent des gènes d'antigènes de tumeur ou de pathogène, lesquels gènes sont transcrits après injection dans l'hôte. Cette transcription est en général effectuée grâce à l'utilisation de promoteurs forts, notamment de promoteurs viraux (Liu, Fu et al.

1998). Ce type de vaccination offre une alternative aux méthodes traditionnelles d'immunisation in vivo par des virus vivants atténués et les risques qui y sont liés (Mandl, AberSe et al. 1998), ainsi qu'à l'immunisation avec des peptides, dont l'efficacité peut être limitée du fait de la variabilité génétique des populations (Deres, Schild et al. 1989).

Comme l'ARN est très sujet à l'hydrolyse par des ribonucléases ubiquitaires, les approches de vaccination par acide nucléique se sont jusqu'à présent concentrées sur l'utilisation d'ADN. L'utilisation d'ARN présente toutefois des avantages par rapport à celle de l'ADN, notamment sur le plan de la sécurité. En effet, l'administration d'ARN ne nécessite pas d'administrer in vivo des promoteurs dérivés de virus, et ne présente pas de risque d'intégration dans le génome. Au contraire, la vaccination par administration d'ADN peut entraîner une intégration dans le génome, aléatoire ou suite à un événement de recombinaison homologue, ce qui peut conduire à l'inactivation de gènes cellulaires, ou à un dérèglement de leur niveau d'expression. Dans le pire des cas, cette intégration peut être à l'origine d'une tumeur. Un autre risque potentiel de la vaccination par administration d'ADN est l'induction d'anticorps

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anti-ADN potentiellement pathogènes, notamment dans le cas des maladies auto-immunes telles que le lupus erythémateux. L'administration d'ARN, en particulier d'ARN messager, plutôt que d'ADN, à des fins d'immunisation, est donc a priori une approche plus sécuritaire (Lu, Benjamin et al. 1994).

Des résultats préliminaires, utilisant la p-galactosidase comme antigène modèle, dans le but premier d'examiner l'intérêt de l'ARN dans la vaccination anti-tumorale, ont montré que l'injection d'ARN pouvait conduire à une réponse immunitaire spécifique (Hoerr, Obst et al. 2000).

Les inventeurs ont maintenant établi, par des expériences effectuées avec des molécules d'ARN codant pour des antigènes pertinents sur les plans vaccinal et thérapeutique, que l'injection de molécules d'ARN pouvait effectivement conduire à une réponse immunitaire spécifique de ces antigènes. Ces résultats, présentés dans la partie expérimentale ci-après, ouvrent ainsi la voie à de nouvelles perspectives pour une vaccination sécuritaire et dont l'efficacité est indépendante du terrain génétique du sujet.

La présente invention porte en premier lieu sur une préparation immunogène comprenant de l'ARN messager mature, codant pour au moins un antigène d'un agent pathogène.

Avantageusement, l'ARN messager mature est non réplicatif.

On entend ici, par "ARN messager mature", toute molécule d'acide ribonucléique comprenant une séquence codante et qui soit coiffée et munie d'une queue poly-A. La séquence codante peut coder soit pour un antigène comprenant une protéine ou un peptide naturel, soit pour une molécule comprenant au moins un antigène, n'existant pas dans la nature, comme par exemple un polyépitope constitué d'une succession de peptides distribués à l'état naturel dans une ou plusieurs protéine(s).

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Dans le cadre de cette définition, les ribonucléotides constituant les molécules d'ARN messager mature des préparations de l'invention peuvent être des ribonucléotides naturels, ou modifiés, notamment pour présenter une résistance accrue aux RNases. Différents exemples de modifications sont présentés dans ce qui suit. A titre d'exemples d'analogues des ribonucléosides utilisables pour synthétiser les rriolécules d'ARN contenues dans les préparations de l'invention, on peut citer les diastéréoisomères Sp de ribonucléosides 5'-O-(1- thiotriphosphates), (Tohda, Chikazumi et al. 1994).

L'ARN messager mature selon l'invention, lorsqu'il s'agit d'une molécule dite naturelle, est cependant dans une forme isolée ou purifiée par rapport à la forme dans laquelle elle apparaît dans son contexte cellulaire naturel ou dans l'organisme qui la produit. Par molécule naturelle, on entend un ARN messager mature, identique dans sa structure à une séquence naturellement produite dans une cellule ou un organisme, notamment un organisme pathogène.

Comme envisagé plus haut, ainsi que dans les exemples qui suivent, l'ARN messager mature selon l'invention peut aussi être une séquence modifiée par rapport à une séquence naturellement produite dans une cellule. Il peut aussi s'agir d'une séquence recombinante.

Ainsi, les séquences et en particulier les domaines fonctionnels (notamment les régions codantes, la coiffe (cap), la queue poly-A) peuvent être d'origines distinctes dans une même molécule d'ARN messager mature. En particulier, ils peuvent provenir de séquences d'ADN différentes et/ou de différents organismes. Dans cette hypothèse, ils seront dits hétérologues.

Les ARN messagers matures des préparations de l'invention peuvent être obtenus par transcription in vivo, ou par transcription in vitro à partir d'une molécule d'ADN, par exemple en suivant le protocole décrit dans la partie expérimentale.

Ils peuvent cependant être préparés par toute autre méthode appropriée.

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Dans l'ensemble de ce texte, l'expression "agent pathogène" désigne les microorganismes pathogènes, ou leurs composants tels que leurs toxines que l'on sait ou l'on soupçonne d'intervenir dans le développement maladies chez les êtres humains ou animaux, comprenant les virus tels que les rétrovirus et par exemple les rétrovirus HIV, les virus, notamment ceux de l'hépatite tels que l'hépatite A, B ou C ou le virus de l'Ebola ou le virus du WestNile, les bactéries et les parasites tels que le plasmodium, mais aussi les agents non conventionnels tels que les prions.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'ARN messager mature consiste en une séquence codante qui est coiffée et munie d'une queue poly-A.

L'invention concerne en particulier une préparation immunogène comprenant le susdit ARN sous une forme compatible avec son administration à un hôte, notamment un patient chez lequel une protection contre un agent pathogène est recherchée, cette protection pouvant par exemple inclure une prévention de type vaccinale, ou un traitement, par exemple de type prophylactique ou curatif, à la suite d'une contamination par l'agent pathogène, cette contamination permettant de définir l'ARN utilisé dans la préparation immunogène.

Par l'expression "protection contre un agent pathogène", on entend la protection contre l'agent pathogène en tant que tel, ou la protection contre ses effets, directs ou indirects, chez l'hôte infecté par ledit agent.

Le terme "prophylaxie" désigne ici la vaccination préventive, tandis que les termes "traitement" et "amélioration" se rapportent à une intervention consécutive à l'infection. On parlera de "traitement" lorsque l'administration d'une préparation de l'invention permet l'éradication (clearance) de l'agent infectieux dans le patient et la guérison de celui-ci. Dans d'autres cas, la stimulation de la réponse immunitaire par l'administration de préparations immunogènes suivant l'invention ne permettra pas la guérison totale du patient, mais seulement une amélioration de son état clinique.

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Une préparation immunogène selon l'invention contient typiquement au moins les éléments suivants : un acide ribonucléique codant pour un antigène d'intérêt, un soluté comme par exemple de l'eau ou toute solution permettant de maintenir l'intégrité de l'acide nucléique, un adjuvant comme par exemple de l'alum, de l'adjuvant de Freund, des oligonucléotides avec des motifs CPG ou tout adjuvant connu de l'homme du métier et enfin tout élément stabilisateur connu de l'homme du métier, par exemple de la protamine.

La préparation immunogène selon l'invention est avantageusement une préparation formulée pour constituer une préparation thérapeutique, cette expression englobant le traitement ou la prévention d'une maladie survenant par suite d'une infection par l'agent pathogène.

Dans une réalisation préférée des préparations immunogènes de l'invention, la séquence de l'ARN messager comprend en outre des séquences de stabilisation, capables d'augmenter la demi-vie de l'ARN dans le cytosole.

Ces "séquences de stabilisation" peuvent provenir de n'importe quel ARN messager connu pour sa stabilité, ou être partiellement ou totalement synthétiques. A titre d'exemples de séquences de stabilisation utilisables dans l'invention, on peut citer les séquences transcrites et non traduites (UTR) du gène de la (3-globine (humain ou autre), ou la séquence consensus contenue dans le 3'UTR des ARN très stables codant l'a-globine, l'a(l)-collagène, la 15lipoxygenase et la tyrosine hydroxylase (Holcik and Liebhaber 1997), de formule générale (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC, où N symbolise un nucléotide quelconque, Py désigne une pyrimidide (T, U ou C), et x indique que le nucléotide précédent peut être répété une ou plusieurs fois (ainsi, Nx = x fois un nucléotide quelconque, qui peut varier) (Holcik and Liebhaber 1997). Une combinaison de ces séquences, ou leur association avec d'autres séquences, est bien entendu envisagée dans le cadre de la présente invention.

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Des préparations immunogènes comme celles définies ci-dessus, et dans lesquelles une partie au moins des séquences de stabilisation est sélectionnée parmi les séquences transcrites et non traduites (UTR) du gène de la p-globine et la séquence consensus (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC contenue dans le 3'UTR des ARNs codant l'a-globine, l'a(I)-collagène, la 15-lipoxygenase et la tyrosine hydroxylase, font donc également partie de l'invention.

Dans une autre réalisation préférée des préparations immunogènes selon l'invention, l'ARN messager comporte à son extrémité 3' une queue poly-A ayant plus de 30 résidus A en position 3'. De préférence, l'ARN messager ne comporte aucun résidu C en aval (c'est-à-dire en 3') desdits 30 résidus A.

Comme mentionné ci-dessus, des préparations immunogènes telles que décrites ci-dessus, et dans lesquelles l'ARN messager a été synthétisé en présence de ribonucléosides modifiés, de façon à résister à la dégradation par les Rnases, font partie intégrante de la présente invention. Dans une réalisation préférée de ces préparations, l'ARN messager comporte des phosphorothioates.

A l'opposé des séquences de stabilisation mentionnées plus haut, il existe dans certains gènes des séquences qui généralement déstabilisent les ARN. C'est le cas par exemple des séquences AU-riches appelées AURES et qui se trouvent dans le 3'UTR de nombreux ARNm instables (Caput, Beutler et al. 1986). Les séquences utilisées pour produire les molécules d'ARN inclues dans les préparations de l'invention devront donc, lorsque cela sera avantageux pour leur efficacité dans la composition immunogène et possible, être mutées de manière à ne plus contenir ces séquences de déstabilisation. De même, des sites reconnus par d'éventuelles endonucléases, tels que la séquence GAACAAG contenue dans le 3'UTR du gène codant le récepteur à la transférine, (Binder, Horowitz et al. 1994) pourront être éliminés des ARN utilisés dans l'invention.

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Une préparation immunogène telle que décrite ci-dessus, et dans laquelle l'ARN messager est essentiellement dépourvu de séquences de déstabilisation AURES, entre donc également dans le cadre de la présente invention. Un tel ARN messager sera de préférence également dépourvu de séquences GAACAAG reconnues par des endonucléases.

Par ailleurs, il est possible d'améliorer l'initiation ou l'élongation de la traduction à partir de l'ARN des préparations de l'invention, par exemple en mutant les codons qui correspondent à des espèces d'ARNt rares pour les remplacer par des codons correspondant à des ARNt abondants chez les mammifères, ou en ajoutant des séquences telles que la séquence dans le 5'UTR du gène codant la HSP 60 qui augmente la traduction de l'ARN (Vivinus, Baulande et al. 2001) . Ces modifications ont pour objectif de permettre une production accrue des protéines d'intérêt à partir de l'ARN, et augmenteraient ainsi l'efficacité de l'immunisation.

L'invention porte donc aussi sur une préparation immunogène comme décrite ci-dessus, dans laquelle l'ARN messager comporte en outre une séquence susceptible d'augmenter sa traduction.

Un autre objet de la présente invention est une préparation immunogène telle que celles décrites plus haut, comprenant en outre au moins un facteur de stabilisation de l'ARN, en particulier un inhibiteur de RNase. Un tel inhibiteur peut par exemple être choisi parmi les inhibiteurs naturels des Rnases tels que la Rnasin@ (Promega) qui est une protéine ubiquitaire naturelle de 460 acides aminés et qui existe en version injectable chez l'animal (Animal Injectable grade Recombinant Rnasin, Promega).

Il est par ailleurs possible de protéger l'ARN des préparations immunogènes de l'invention en le complexant avec des composés cationiques, de préférence polycationiques, comme par exemple un peptide ou une protéine cationique ou polycationique.

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Dans une réalisation préférée des préparations immunogènes mentionnées au paragraphe précédent, le peptide ou la protéine compléxé(e) à l'ARN est une protamine, une poly-L-lysine, une poly-L-arginine ou une histone.

Par ailleurs, il est possible d'augmenter l'immunogénicité des préparations de l'invention en y intégrant un ou plusieurs élément(s) adjuvant (s).

On appellera ici "élément adjuvant" tout composé chimique ou biologique susceptible de favoriser une réponse immunitaire spécifique dirigée contre le ou les antigène (s) codé (s) par les molécules d'ARN des préparations de l'invention. Plusieurs mécanismes peuvent être envisagés, correspondant à plusieurs types d'adjuvants. Par exemple, les composés favorisant l'endocytose de l'ARN par les cellules dendritiques constituent une première classe d'adjuvants possibles. D'autres composés, permettant la maturation des cellules dendritiques (par exemple, les lipopolysaccharides, le TNF-a ou le CD40-ligand), constituent une 'autre classe d'adjuvants possibles. De manière générale, tout agent immunomodulateur tel que les signaux de danger (LPS, GP96, oligonucléotides contenant des motifs CpG immunostimulants par exemple) ou des cytokines (GM-CSF par exemple) permettant d'augmenter et/ou d'orienter la réponse immunitaire contre l'antigène codé par l'ARN injecté, est ici considéré comme un élément adjuvant possible.

En particulier, une préparation immunogène telle que celles décrites plus haut, et comportant au moins un agent immunomodulateur choisi parmi les lipopolysaccharides (LPS), la glycoprotéine 96, des oligonucléotides contenant des motifs CpG et des cytokines, fait partie de la présente invention.

Un autre objet de la présente invention est de formuler des préparations immunogènes et/ou vaccinales dont la composition soit exactement définie, afin d'éviter tout risque d'effet secondaire lié à un élément mal identifié. Cela est notamment important pour éviter les risques de réactions allergiques violentes suite à l'injection d'un vaccin, liées parfois à des traces d'éléments utilisés dans les milieux de cultures employés dans le protocole de production du vaccin.

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Dans le cadre de la présente invention, il est possible de formuler des préparations immunogènes comprenant de l'ARN messager mature hautement purifié et un ou plusieurs adjuvant (s), purifié (s). "ARN messager mature hautement purifié" désigne ici un ARN préparé de telle façon que les protéines. les lipides et les fragments d'ADN ont été essentiellement éliminés.

Ceci peut être obtenu en effectuant plusieurs étapes d'extractions au phénol/chloroforme et plusieurs précipitations par l'acétate de sodium et l'éthanol, et par le chlorure de lithium. Ceci peut aussi être obtenu en une seule étape faisant spécifiquement appel à un procédé physique : colonne capable de fixer spécifiquement les acides nucléiques et de les relarguer dans des conditions ioniques ou de pH définies, ou encore colonnes de type HPLC échangeuses d'ions, d'affinités, exclusion de taille, hydrophobicité qui permettent de séparer les ARN des autres molécules nécessaires à la production d'ARN.

L'invention porte donc aussi sur une préparation immunogène telle que celles décrites ci-dessus, dans laquelle l'ARN messager est hautement purifié avant l'ajout du ou des éiérnent(s) adjuvant (s).

Dans une réalisation préférée des préparations immunogènes de l'invention, leur composition est formulée pour une administration cutanée ou intradermique.

Les préparations de l'invention ne sont pas limitées quant à la nature et au nombre des antigènes d'agents pathogènes codées par les molécules d'ARN. Par l'expression "antigène" on comprend dans le cadre de l'invention, toute molécule comprenant au moins un épitope. Avantageusement, un antigène selon l'invention est la molécule capable d'induire une réponse immunitaire, notamment par la production d'anticorps. Une préparation selon l'invention peut comprendre un type unique d'ARN messager de séquence exactement déterminée, ou au contraire comprendre plusieurs ARN différents, de séquences distinctes. A l'extrême, une préparation de l'invention peut

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comprendre un ensemble de molécules d'ARN obtenu à partir d'une banque d'ADN ou d'ARN, par exemple à partir d'une banque obtenue à partir d'une culture de cellules infectées par un agent pathogène. De plus, lorsqu'une composition de l'invention comprend des ARN messagers de séquences différentes, les séquences codantes de ces ARN peuvent correspondre soit à plusieurs antigènes différents (du même pathogène ou non), soit à un ou plusieurs antigéne(s), d'une part, et à des agents immunomodulateurs (par exemple, des cytokines), d'autre part.

L'invention porte donc également sur une préparation immunogène telle que celles décrites ci-dessus, dans laquelle l'ARN est un ensemble d'ARN messagers.

Par ailleurs, les préparations de l'invention peuvent avantageusement comprendre des ARN multicistroniques contenant des séquences IRES (Interna! Ribosome Entry site-); qui permettent la production, à partir d'une molécule d'ARN, de plusieurs protéines immunogènes d'intérêt ou, en plus de la (des) molécule(s) immunogénique (s), de cytokines capables de stimuler ou de polariser (Th1 ou Th2) la réponse immunitaire.

Des préparations immunogènes telles que décrites ci-dessus, et dans lesquelles une partie au moins des molécules d'ARN comprennent un site d'entrée interne du ribosome (IRES), constituent donc un autre aspect de l'invention.

Dans une réalisation préférée des préparations de l'invention comprenant un ensemble d'ARN messagers et/ou dans lesquelles une partie au moins des molécules d'ARN comprennent un IRES, une partie au moins des molécules d'ARN codent pour des cytokines capables de stimuler ou de polariser la réponse immunitaire.

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Dans les préparations de l'invention, la séquence codant pour au moins un antigène d'un agent pathogène des ARN peut coder soit pour un polyépitope, soit pour au moins une protéine virale ou bactérienne, entière ou tronquée.

Une des applications possibles des préparations selon l'invention est l'obtention de réponses immunogènes et immunitaires contre-l'hépatite B. En effet, 5 à 15% d'adultes ne répondent pas au vaccin recombinant actuel. Cette nonréponse, attribuée au type HLA, pourrait être surmontée par la vaccination à base d'ARN. Par ailleurs, on peut envisager une immunothérapie par vaccination ARN sur les 350 millions de porteurs chroniques du virus HBV. Les inventeurs ont montré que l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg) était un bon candidat pour stimuler une réponse contre ce virus (Loirat, Lemonnier et al. 2000).

Une préparation immunogène selon l'invention, dans laquelle une partie au moins des molécules d'ARN codent pour au moins un antigène de surface du virus de l'hépatite B, est donc une des réalisations préférées de l'invention.

Dans cette réalisation de l'invention, une partie au moins des molécules d'ARN peuvent coder pour les petite, les moyennes et grandes protéines d'enveloppe du virus de l'hépatite B.

Dans une réalisation préférée des préparations immunogènes décrites au paragraphe précédent, une partie au moins des molécules d'ARN ont la séquence pg-HBS-pgan, représentée à la Figure 1.

Une autre cible des préparations immunogènes de l'invention est le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Ainsi, dans une réalisation préférée de l'invention, une partie au moins des molécules d'ARN codent pour au moins un antigène du VIH et dans un mode préféré de réalisation de l'invention pour un polyépitope du VIH. En particulier, dans cette réalisation de l'invention, une partie au moins des molécules d'ARN peuvent avoir la séquence pg-HIV-HBS- pgan, représentée à la Figure 2. Dans cet exemple, le polyépitope lié à HBS

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comprend 13 épitopes HLA-A2 dérivés de différentes protéines du HIV-1. Il est également envisageable de lier à HBS un nombre plus important d'épitopes capables d'être présentés par de nombreuses molécules de classes # humaines, et dérivées de nombreuses protéines des virus HIV.

Le virus de l'hépatite C (HCV) est un-autre pathogène contre lequel il serait souhaitable de développer un vaccin ou au moins un moyen de stimuler une réponse immunitaire de l'hôte. Pour cela, l'utilisation d'un ARN codant pour la protéine CORE du virus HCV paraît intéressante. En effet, la protéine CORE du virus est la plus conservée parmi les génotypes de HCV. De plus, une réponse cellulaire contre la protéine CORE existe chez les patients infectés par HCV et est associée à une réponse favorable à la thérapie par interférons. L'utilisation d'ARN codant pour des protéines non-structurales ou structurales du virus pourrait s'avérer efficace aussi, ainsi que la combinaison d'ARN codant d'une part, pour CORE et, d'autre part, pour d'autres protéines.

Ainsi, dans une autre réalisation préférée des préparations immunogènes de l'invention, une partie au moins des molécules d'ARN codent pour la protéine CORE du virus de l'hépatite C.

L'invention porte également sur l'utilisation d'une préparation immunogène telle que celles décrites dans l'ensemble de ce texte, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prophylaxie, au traitement ou à l'amélioration d'une infection par un agent pathogène, en particulier par le VIH, le virus de l'hépatite B, le virus de l'hépatite C, le virus du sarcome de Rous, le parasite responsable du paludisme, ou les bactéries responsables de pneumoniae et éventuellement liées à l'accélération ou le déclenchement de maladies, notamment Chlamydia pneumoniae, qui est liée à l'augmentation des risques de maladies cardiovasculaires.

Un autre aspect particulièrement important de l'invention est un vaccin caractérisé en ce qu'il comprend n'importe laquelle des préparations immunogènes décrites dans l'ensemble du texte ci-dessus, et permettant

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d'obtenir chez un hôte, humain ou animal, une protection vis-à-vis d'un agent pathogène.

En particulier, un vaccin selon l'invention est caractérisé en ce que la protection est obtenue par une activation de lymphocytes T cytotoxiques CD8+ et/ou T auxiliaires CD4 spécifiques d'au moins un antigène codé par au moins ~une partie des molécules d'ARN de la préparation administrée, et/ou activation de lymphocytes B producteurs d'anticorps. Les anticorps anti-HBs sont la base de la prévention contre l'infection par HBV. La réponse T (auxiliaire et cytotoxique) est requise pour le contrôle d'une infection établie.

Les exemples et figures présentés ci-dessous, à titre non limitatif, permettront de mettre en évidence certains avantages et caractéristiques de la présente invention.

Légendes des figures Figure 1 : Séquence de l'ARN pg-HBS-pgan injecté (les uraciles sont représentés par la lettre T)
La séquence en majuscules code pour l'antigène HBS (S2.S).

Les codons d'initiation et de fin de traduction sont encadrés.

Les régions transcrites et non traduites (5' et 3' UTR de la p- globine) sont en gras.

Les séquences en minuscules en police normale sont des séquences n'ayant pas de pertinence particulière pour la vaccination ARN, provenant des plasmides.

La queue polyA - polyC est indiquée en italique.

La partie du site de restriction utilisé pour linéariser le plasmide avant la transcription est soulignée.

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Figure 2 : Séquence de l'ARN ssg-HIV-HBS-ssg[alpha]n injecté (les uraciles sont représentés par la lettre T)
La séquence en majuscules code pour le poly-épitope
HLA-A* 0201 HIV-HBS (les lettres majuscules en gras correspondent à la région HIV du poly-épitope HLA-A * 0201).

Les codons d'initiation et de fin de traduction sont encadrés.

Les régions transcrites et non traduites (5' et 3' UTR de la p- globine) sont lettres minuscules en gras.

Les séquences en minuscules en police normale sont des séquences n'ayant pas de pertinence particulière pour la vaccination ARN, provenant des plasmides.

La queue polyA - polyC est indiquée en italique.

La partie du site de restriction utilisé pour linéariser le plasmide avant la transcription est soulignée.

Figure 3 : Expérience de restimulation in vitro des CTL
Des souris BalB/c ont été sacrifiées 8 semaines après injection de
20 microgrammes d'ADN ou d'ARN dans les deux oreilles, ou 50 microgrammes d'ADN dans les deux pattes arrières après traitement à la cardiotoxine. Les splénocytes ont été restimulés in vitro avec un épitope HBS H-2d et testés dans une expérience de cytotoxicité contre des cibles transfectées exprimant l'antigène de surface HBs (P815/S) et des cellules P815 comme témoin négatif.

L'activité cytolytique spécifique a été testée par mesure de relargage de 5'Cr à court terme. Après 4 heures d'incubation à
37 C, les surnageants ont été collectés et comptés avec un compteur béta. Pour chaque courbe, l'axe vertical représente le pourcentage de lyse des cellules cibles (ou aussi pourcentage de cytotoxicité) par rapport à un témoin de lyse 0% et à un témoin de lyse 100%. Le pourcentage de cytoxicité = 100 * (cpm[cible+CTL]-

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cpm[cible seule])/(cpm[cible seule+ détergent])-cpm[cible seule], et l'axe horizontal indique le ratio effecteur/cible utilisé. Chaque courbe correspond aux splénocytes d'un animal.

Figure 4 : ELISPOTS IFN-y (Figure 4A) et IL-4 (Figure 4B) effectués sur des splénocytes prélevés comme dans l'expérience décrite en figure 3 (splénocytes prélevés au même moment que dans l'expérience décrite en fig. 3 mais sans restimulation in vitro des cellules T).

L'ordonnée représente le nombre de cellules productrices d'IFN-y (Figure 4A) et d'IL-4 (Figure 4B), pour 106 cellules.

En abscisse sont indiquées les différentes conditions d'immunisation des souris, et l'antigène utilisé pour la stimulation est indiqué par le remplissage de la colonne correspondante.

Figure 5 : ELISA spécifique pour examiner la réponse humorale anti- hépatite B
Deux mois après l'injection d'ADN ou d'ARN, du sang a été collecté de souris par ponction rétrobulbaire en utilisant des pipettes en verre héparinisées, et les séra récupérés par centrifugation ont été testés pour la présence d'anticorps anti-HBs et anti-preS2 par ELISA spécifique. Des particules recombinantes purifiées contenant la petite protéine S de HBV (1 g/ml) ou le peptide synthétique preS2 (120-145) (1 g/ml) ont été utilisées comme phase solide. Après blocage avec du PBST supplémenté avec 10% de sérum de veau fétal, des dilutions en série de sérum ont été ajoutées. Après lavage extensif, les anticorps liés ont été détectés en utilisant des immunoglobulines anti-souris (IgG totales) marquées avec de la peroxidase horseradish (Amersham,

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GB). Les titres d'anticorps ont été déterminés par la méthode des dilutions limites. Les sérums de souris ont été testés individuellement et les titres sont la moyenne d'au moins 3 déterminations. Les dilutions en dessous de 1/100 sont considérées comme négatives. Les titres anti-HBs sont exprimés comme des moyennes géométriques de groupe des erreurs standard (GMT SEM) de valeurs d'animaux individuels, qui sont elles-mêmes la moyenne d'expériences dupliquées ou tripliquées.

Figure 6 : ELISPOTS sur des splénocytes frais
Des souris HHD ont été injectées avec 20 microgrammes d'ADN, d'ARN ou d'ARN couplé à la protamine dans chaque oreille (i.o.), ou avec 50 migrogrammes d'ADN dans chaque patte arrière après traitement à la cardiotoxine (i.m.). Trois semaines après, les splénocytes ont été restimulés in vitro avec des peptides correspondant à des épitopes individuels, et la réponse immunitaire a été mesurée par mesure du relargage d'IFN-y en
ELISPOT.

La figure représente le nombre moyen de spots obtenus pour chaque peptide dans 5 souris.

Cette expérience a été réalisée en immunisant les souris avec Ja séquence de la figure 2.

Les constructions ADN ou ARN injectées chez la souris et utilisées pour l'immunisation codent pour des épitopes du VIH-1
A9M-Y/I9V-Y/I9L8S-Y/T9V-Y/V9L-Y/P10L-V11V-Y/P9L-S9L-
Y/E9V-L10V-L9V-Y/K9L-HBS protein.

Exemples

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Utilisation des ARNm pour l'obtention de réponses cellulaires et humorales contre des antigènes d'origine virale - 1 - Structure des ARN utilisables en vaccination Les ARNs utilisés dans les exemples ci-dessous contiennent les séquences 5# et 3' transcrites et non traduites (5' ou 3'UTR) de l'ARN codant la p-globine chez le xénope Ces séquences forment probablement des structures secondaires qui sont reconnues par des protéines cytosoliques. Elles permettent d'augmenter la demi-vie de l'ARN dans le cytosole.

II est toutefois possible que des ARNs ne contenant pas ces séquences de stabilisation soient efficaces pour la vaccination.

Par ailleurs, les séquences stabilisantes de la p-globine peuvent être remplacées par des séquences stabilisantes provenant d'autres ARN qui ont une longue vie dans le cytosole. Par exemple, la séquence consensus (C/U)CCANxCCC(U/A) PyxUC(C/U)CC contenue dans le 3'UTR des ARNs très stables codant l'a-globine, a(I)-collagène, la 15-lipoxygenase et la tyrosine hydroxylase (Holcik and Liebhaber 1997) pourrait être remplacée ou être ajoutée à la séquence 3'UTR de la p-globine utilisée dans les ARNs décrits cidessous.

De plus, la queue 3' polyA qui améliore la stabilité et la traduction de l'ARN peut être allongée et dépourvue de résidus C. Des ARNs ayant plus de 100 résidus A en position 3' et aucun résidu C en aval peuvent être avantageusement utilisés. Par ailleurs, de façon générale, l'augmentation du nombre de résidus C ou G contenus dans la totalité de l'ARN (sans entraîner de modifications dans la séquence en acides aminés de la protéine codée par l'ARN) est aussi une méthode de stabilisation des messagers et est également envisagée pour améliorer l'efficacité de l'immunisation par ARN.

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Une autre manière encore de stabiliser les ARN face aux RNases est de synthétiser ces ARN en présence de ribonucléotides modifiés, tels que les diastéréoisomères Sp de ribonucléosides 5'-O-(1-thiotriphosphates). Les ARN contenant des phosphorothioates résistent mieux que des ARN naturels à la dégradation par les RNases et sont efficacement traduits en protéines (Tohda, Chikazumi et al. 1994). Leur utilisation pour la formulation d'un vaccin est envisagée.

Comme mentionné plus haut, il est également possible d'éliminer certaines séquences connues pour déstabiliser les ARN.

Enfin, il faut envisager l'utilisation d'ARN multicistroniques contenant des séquences IRES (Internai Ribosome Entry site) qui permettent la production, à partir d'une molécule d'ARN, de plusieurs protéines immunogènes d'intérêt ou, en plus de la (des) molécule(s) immunogénique (s), de cytokines capables de stimuler ou de polariser (Th1 ou Th2) la réponse immunitaire.

2 - Adjuvants et additifs Les inventeurs ont observé qu'une purification très poussée des ARN utilisés pour l'immunisation des souris (en ajoutant des étapes de précipitation au chlorure de lithium) pourrait conduire à une moindre efficacité de l'immunisation.

Pour cette raison, la co-injection de l'ARN vaccinal avec des agents immunomodulateurs tels que les signaux de danger (LPS, GP96, oligonucléotides contenant des motifs CpG immunostimulants par exemple) ou des cytokines (GM-CSF par exemple) est donc également envisagée pour permettre d'augmenter et/ou de contrôler la réponse immunitaire contre l'antigène codé par l'ARN injecté.

L'utilisation de composés cationiques (protéiques ou non), tels que la protamine, pour condenser l'ARN et le protéger de la dégradation par des

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RNases est probablement avantageuse mais, comme il apparaît avec les résultats décrits ci-dessous, pas nécessaire.

3 - Antigènes utilisables en vaccination par ARN Les expériences décrites ci-dessous illustrent deux modes de réalisation possibles de l'invention en ce qui concerne la séquence nucléotidique introduite dans les constructions et codant pour un antigène. Ces deux modes sont d'une part, une séquence codant pour un polyépitope (en l'occurrence un polyépitope de HIV) et d'autre part, une séquence codant pour une protéine entière (ici, une protéine d'enveloppe de HBV).

Les cibles potentielles de la vaccination par injection d'ARN ne sont a priori pas limitées. A titre d'exemples non limitatifs d'antigènes utilisables dans ce type de vaccination, on peut citer des antigènes des virus des hépatites A, B ou C, des rétrovirus VIH, de Chlamidia Pheumoniae, du virus du sarcome de Rous, ou du parasite responsable du paludisme (hématozoaire de Layeran).

Pour le développement d'un vaccin ARN contre le virus de l'hépatite C, l'utilisation d'un ARN codant pour la protéine CORE du virus HCV paraît intéressante. En effet, la protéine CORE du virus est la plus conservée parmi les génotypes de HCV. De plus, une réponse cellulaire contre la protéine CORE existe chez les patients infectés par HCV et est associée à une réponse favorable à la thérapie par interférons. Cependant, l'utilisation d'ARN codant pour des protéines non-structurales ou structurales du virus pourrait s'avérer tout aussi efficace.

4 - Préparation des ARN La séquence de l'ARN pg-HBS-pgan est représentée à la figure 1.

La séquence de l'ARN ssg-HIV-HBS-ssg[alpha]n est représentée à la figure 2.

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Les séquences en minuscules en caractères gras sont les séquences 5' et 3' transcrites et non traduites (5' ou 3'UTR) de l'ARN codant la p-globine chez le xénope.

Les séquences codant pour les molécules HBS S2. S et HIV-polyepitope-HBS ont été extraites respectivement du plasmide pCMVHB-S2.S-d1 décrit par Marie-Louise MICHEL (Michel, Davis et al. 1995) et du plasmide pCMV-B10 par Husseyin FIRAT (Firat, Garcia-Pons et al. 1999). Les deux fragments possèdent un site Hindlll en amont du gène et un site NSi1 (rendu franc enzymatiquement) en aval. Ils ont été ligaturés dans un plasmide permettant de produire de l'ARN (ce plasmide contient un promoteur reconnu par la RNA polymérase SP6 ainsi que les séquences 5' et 3' non-traduites de l'ARN codant la p-globine du xénope, séparées par un site de clonage multiple), lui-même digéré par les enzymes Hindlll et Bglll (rendu franc enzymatiquement). La construction plasmidique résultante est linéarisée par Pstl, débarrassée ensuite de toutes protéines par extractions au phénochlorophorme, précipitée par l'éthanol plus acétate d'ammonium puis resuspendue dans de l'eau libre de Rnase. Ces ADN ont été transcrits en utilisant le kit SP6 mMESSAGE mMACHINETM de la compagnie Ambion. Ce kit est supposé produire des molécules d'ARN dont la plupart (80%) possèdent une structure CAP (m7G(5')ppp(5')G) en position 5'. Après traitement à la DNAse de la réaction de transcription, les ARNs sont précipités par le chlorure de lithium resuspendus dans de l'eau et quantifiés par densité optique à 260 nm. Ensuite, la préparation est débarrassée de traces de protéines par extraction au phénochlorophorme puis précipitation par éthanol plus acétate d'ammonium avant d'être resuspendue à 10 microgrammes par microlitre dans de l'eau libre de RNAse. Après une nuit d'incubation à 4 degrés, l'ARN est dilué à 1 microgramme par microlitre en utilisant un tampon Hepes (150 mM NaCI ; 10 mM Hepes Ph 7,5) libre de RNase.

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5 - Vecteur d'expression HBsAg, ARN-HBs et immunisation Le plasmide pCMV-S2. S contient une partie du domaine du génome de HBV codant pour l'enveloppe. Dans ce plasmide (Michel, Davis et al. 1995), les domaines de HBV preS2 et S ont été placés sous le contrôle transcriptionnel du promoteur précoce immédiat du cytomegalovirus humain (CMV-i.e.), permettant l'expression des petite et moyenne protéines d'enveloppe de HBV qui portent toutes les deux l'antigène de surface HBs (HBsAg).

L'ADN plasmidique utilisé pour l'immunisation in vivo a été préparé en utilisant des colonnes de purification d'ADN Qiagen (Endofree Plasmid Kit, Qiagen, Hilden, Allemagne).

Pour l'immunisation à base d'ADN, le vecteur d'expression de HBsAg, pCMVS2. S, a été injecté directement dans des muscles du tibia antérieur en cours de régénération comme décrit précédemment, ou directement dans la partie externe de l'oreille (ear pinna). Cinquante microlitres d'ADN à 1 mg/ml ont été injectés dans chaque tibia pour une quantité totale de 100 microgrammes d'ADN par souris. Vingt microlitres d'ADN à 1 mg/ml ont été injectés dans les deux oreilles pour une quantité totale de 40 microgrammes d'ADN par souris.

En ce qui concerne l'immunisation à base d'ARN, l'ARN codant pour HBsAg a été obtenu en utilisant un vecteur contenant un fragment sous-cloné du plasmide pCMV-S2.S et la SP6 polymérase. L'ARN a été produit suivant la méthode décrite dans la demande de brevet EP 1 083 232. Dans certaines expériences, l'ARN a été stabilisé en utilisant la protamine à un ratio de 1/1 grammes. Vingt microlitres d'ARN ont été injectés derrière chaque oreille de souris BALB/c pour un montant total de 40 microgrammes d'ARN par souris.

Pour l'immunisation, des groupes de 4 à 6 souris BALB/c femelles, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisés.

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6 - Induction des CTL Les rates ont été prélevées 52 jours après l'immunisation et les splénocytes ont été comptés et analysés pour déterminer la proportion relative de cellules T et B. Le pourcentage de CD8+ et CD4+ a été déterminé par analyse FACS de splénocytes frais en utilisant une coloration directe avec des anticorps antisouris CD8+ FITC et CD4+ PE (Pharmingen, San Diego, CA).

7 - Analyse des populations lymphocytairse de la rate après vaccination La proportion de cellules T CD8+ et CD4+ était comparable entre les groupes, cependant l'injection dans l'oreille semble conduire à un plus grand nombre de cellules B (voir tableau suivant).

<tb>
<tb>

Groupe <SEP> Splénocyte <SEP> Cellules <SEP> T <SEP> Cellules <SEP> T <SEP> CD4/CD8 <SEP> Cellules <SEP> B
<tb> s <SEP> CD4+ <SEP> CD8+
<tb> pCMVS2 <SEP> 91x106 <SEP> 19,8x106 <SEP> 13,3 <SEP> x106 <SEP> 1,5 <SEP> 49,5 <SEP> x106
<tb> ADN <SEP> i.m. <SEP> ~ <SEP> 31 <SEP> x106 <SEP> ~6,7 <SEP> x106 <SEP> ~2,0 <SEP> x106 <SEP> 17,4 <SEP> x106
<tb> (4 <SEP> souris)
<tb> pCMVS2S <SEP> 124 <SEP> x106 <SEP> 21 <SEP> x106 <SEP> 10,7 <SEP> x106 <SEP> 2 <SEP> 76,3 <SEP> x106 <SEP>
<tb> ADN/oreille <SEP> ~22 <SEP> x106 <SEP> ~3,9 <SEP> x106 <SEP> ~13,4 <SEP> x <SEP> 106
<tb> (4 <SEP> souris)
<tb> ARN- <SEP> HBs <SEP> 131 <SEP> x106 <SEP> 26,4 <SEP> x106 <SEP> 15,9 <SEP> x106 <SEP> 1,7 <SEP> 71,5 <SEP> x106
<tb> Oreille <SEP> ~19 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> ~4,0 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> ~ <SEP> 11 <SEP> x106
<tb> (6 <SEP> souris)
<tb> ARN-HBs <SEP> 117x106 <SEP> 21,8 <SEP> x106 <SEP> 15,6 <SEP> x106 <SEP> 1,4 <SEP> 71,8 <SEP> x106
<tb> + <SEP> ~17 <SEP> x106 <SEP> ~3,0 <SEP> x106 <SEP> ~4,5 <SEP> x106 <SEP> ~12,9 <SEP> x106
<tb> protamine
<tb> oreille,
<tb> (6 <SEP> souris)
<tb>
Analyse des populations lymphocytaires de la rate après vaccination.

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8 - Mesure de l'activité CTL La rate des souris a été prélevée 8 semaines après l'immunisation par ARN ou ADN. Les splénocytes ont été cultivés (10x106 par puits de plaque de 24 puits) dans du milieu alpha-MEM (Gibco) additionné de 10 mM d'Hepes, d'acides aminés non essentiels, de pyruvate de sodium (1 mM), de betamercaptoethanol (50 nM) et de 10% de sérum de veau fétal. Ces cellules ont été stimulées pendant cinq jours avec 1 microgramme/ml de peptide dérivé de S (acides aminés 28-39 à partir de la première méthionine de la petite protéine d'enveloppe) correspondant à l'épitope restreint au H-2 Ld. Les cellules effectrices ont été utilisées dans une expérience de cytotoxicité réalisée après 7 jours de culture. L'activité cytolytique des cellules a été testée dans des expériences de relargage de 51Cr à court terme contre des cibles transfectées exprimant HBsAg (P815/S) et des cellules P815 comme contrôle négatif. Après 4 heures d'incubation à 37 C, les surnageants ont été récoltés et comptés en utilisant un compteur béta. Les relargages spontanés et maximum ont été déterminés de puits contenant soit du milieu seul ou du milieu de lyse (5% Triton, 1 % SDS). La lyse spécifique a été calculée de la façon suivante : (relargage expérimental - relargage spontané)/(relargage maximum - relargage spontané) x 100 pour chaque expérience. La lyse spécifique a été calculée pour chaque point en triplicater. L'activité CTL a été déterminée pour chaque souris à différents ratios effecteur cible (effector to target, E/T).

9 - Recherche de lymphocytes T cytotoxiques après vaccination (Fig 3) Pour détecter les CTL, les splénocytes ont été activés in vitro pendant 7 jours avec le peptide Ld-restreint S-28-39, puis testés pour leur activité lytique sur des cellules p815/S transfectées avec HBs. Des cellules p815 non transfectées ont été utilisées comme contrôle. Les résultats sont présentés sur la Figure 3.

Les réponses cytotoxiques ont été détectées dans chaque groupe de souris immunisées. L'injection intramusculaire d'ADN dans le muscle prétraité a donné la lyse la plus forte des cellules cibles. Des cellules T cytotoxiques ont été

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trouvées dans 4/6 souris après injection d'ARN plus protamine, tandis que 5/5 et 6/6 souris avaient des cellules T cytotoxiques dans la rate après injection respectivement d'ADN ou d'ARN nu.

Ceci indique que l'injection d'ARN-HBs nu ou associé à la protamine est capable d'activer in vivo des cellules T cytotoxiques qui reconnaissent l'antigène HBs apprêté de manière endogène.

10 - Quantification de cellules T HBs spécifiques produisant de l'IFN-y Les cellules reiarguant de l'Interferon-gamma (IFN-y) ont été quantifiées par un essai immunospot spécifique d'une cytokine donnée (enzyme-linked immunospot, ou ELISPOT) après stimulation par des peptides ou par l'antigène HBs. Des plaques ELISA à fond plat en nitrocellulose (Multiscreen, Millipore, Molsheim, France) oht été couvertes avec 50 microlitres d'anticorps de rat antiIFN-y murin (5 g/ml, Pharmingen, San Diego, CA) sur la nuit à 4 C, puis saturées pendant 2 heures à 37 C avec du RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau fétal. Des splénocytes (1 x 106/puit dans des plaques de 96 puits), obtenus comme décrit ci-dessus dans les expériences d'activité CTL, ont été incubés 40 heures dans du milieu complet a-MEM à 37 C en présence de 5% de C02 en utilisant différentes stimulations antigéniques. Les cellules ont été incubées avec les peptides HBV-S (3 g/ml) ou avec des particules HBsAg (1 g/ml). Deux peptides restreints à la classe # dérivés de S (28-39 = 1-12-L et le peptide 15 = S362-372 W-11-L) et un peptide restreint à la molécule de CMH de classe Il dérivé de preS2 (preS 138-165) ont été utilisés pour l'activation. Le bruit de fond a été évalué avec des cellules dans le milieu. Les cellules ont été enlevées en tapotant les plaques, puis lysées avec de l'eau. Après lavage avec du PBS à 0,05% tween 20, un anticorps biotinylé de rat anti-IFN-y murin (1 g/ml, Pharmingen, San Diego, CA) a été ajouté pour une incubation à 90 minutes à température ambiante. Les puits ont été lavés comme ci-dessus avant l'incubation avec un conjugué phosphatase alkaline-streptavidine

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(Boehringer-Mannheim, Allemagne) à une dilution de 1 :1000 du PBS pendant 1 h 30 min. Ensuite, une solution à 2,3 mM de 5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate (BCIP) et de nitroblue tetrazolium (NBT) (Promega, Madison, WI) diluée dans une solution tampon alcaline, a été ajoutée. Lorsque les spots sont devenus visibles, la réaction a été arrêtée avec de l'eau et séchée à l'air. Le nombre de spots secrétant de l'IFN-y a été compté en utilisant un lecteur ELISPOT (Zeiss) et les résultats ont été exprimés comme valeur moyenne dans chaque groupe de cellules secrétant de l'IFN-y pour 106 cellules de rate.

Deux mois après l'immunisation, les cellules T spécifiques de HBs ont été détectées dans la rate de souris immunisées avec de l'ADN injecté seulement en intra-musculaire (Figure 4A). Ces cellules T produisaient de l'IFN-y après activation avec des peptides restreints à la classe 1 dérivés de S ou le peptide restreint à la classe Il dérivé de pre-S2. En contraste, aucun spot n'a été détecté après stimulation de cellules de rate dérivées de souris immunisées avec soit de l'ADN soit de l'ARN injecté dans l'oreille. Ceci suggère que des cellules T activées n'étaient pas présentes dans la rate de souris 2 mois après l'immunisation utilisant l'ARN ou l'ADN donnés par la voie de l'oreille.

Cependant, la détection de cellules T cytotoxiques après restimulation in vitro avec un peptide (voir Figure 3) indique que des cellules T mémoire ont été induites en utilisant soit l'ADN soit l'ARN et les deux voies d'immunisation.

Des résultats comparables ont été obtenus en utilisant une expérience d'ELISPOT IL-4 (Figure 4B). Peu de spots correspondaient à des cellules T activées secrétant de l'IL-4 après immunisation par l'ADN en intra-musculaire et reconnaissant soit le peptide de classe # dérivé de S, soit le peptide de classe Il dérivé de preS2. La forte proportion de cellules T secrétant l'IFN-gamma indique que la réponse T auxiliaire était orientée vers un profil Th1.

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11 -Réponse humorale Deux mois après l'injection d'ADN ou d'ARN, du sang a été collecté de souris par ponction rétrobulbaire en utilisant des pipettes en verre héparinisées, et les séra récupérés par centrifugation ont été testés pour la présence d'anticorps antr-HBs et anti-preS2 par ELISA spécifique. Des particules recombinantes purifiées contenant la petite protéine S de HBV (1 g/ml) ou le peptide synthétique preS2 (120-145) (1 g/ml) ont été utilisées comme phase solide.

Après blocage avec du PBST (tampon salin phosphate contenant 0,1% de Tween 20) suppiémenté avec 10% de sérum de veau fétal, des dilutions en série de sérum ont été ajoutées. Après lavage extensif, les anticorps liés ont été détectés en utilisant des immunoglobulines anti-souris (IgG total) marquées avec de la peroxidase horseradish (Amersham, GB). Les titres d'anticorps ont été déterminés par la méthode des dilutions limites. Les sérums de souris ont été testés individuellement et les titres étaient la moyenne d'au moins 3 déterminations. Les dilutions en dessous de 1/100 étaient considérées comme négatives. Les titres anti-HBs étaient exprimés comme des moyennes géométriques de groupe des erreurs standard (GMT SEM) de valeurs d'animaux individuels, qui étaient elles-mêmes la moyenne d'expériences dupliquées ou tripliquées.

Les anticorps spécifiques de HBsAg ou du domaine preS2 de la protéine moyenne de HBV ont été détectés par ELISA dans le sérum de 4 sur 4 souris huit semaines après injection intra musculaire de pCMV-S2. S (Figure 5). Ni l'ARN nu ni l'ARN combiné avec la protamine n'ont induit de production significative d'anticorps anti-HBs et anti-preS2 dans les souris injectées par la voie intra auriculaire. En contraste, de faibles titres d'anticorps anti-HBs ont été détectés dans le sérum de 2/4 souris injectées par la voie intra auriculaire avec de l'ADN. Ces résultats suggèrent que l'ADN a probablement persisté plus longtemps que l'ARN, permettant une production constante d'antigène HBs.

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12 - Vecteur d'expression HIV polyépitopes HBS, ARN HIV polyépitopes HBS et immunisation Le plasmide pCMV-B10 contient un polyépitope comportant 13 épitopes HLAA2 de HIV-1. Dans ce plasmide (Firat, Garcia-Pons et al. 1999), la séquence du polyépitope a été placée sous le contrôle-transcriptionnel du promoteur précoceimmédiat du cytomegalovirus humain (CMV-i.e.).

L'ADN plasmidique utilisé pour l'immunisation in vivo a été préparé en utilisant des colonnes de purification d'ADN Qiagen (Endofree Plasmid Kit, Qiagen, Hilden, Allemagne).

Pour l'immunisation à base d'ADN, le vecteur d'expression du polyépitope, pCMV-B10, a été injecté directement dans des muscles du tibia antérieur en cours de régénération comme décrit précédemment, ou directement dans la partie externe de l'oreille (ear pinna). Cinquante microlitres d'ADN à 1 mg/ml ont été injectés dans chaque tibia pour une quantité totale de 100 microgrammes d'ADN par souris. Vingt microlitres d'ADN à 1 mg/ml ont été injectés dans les deux oreilles pour une quantité totale de 40 microgrammes d'ADN par souris.

En ce qui concerne l'immunisation à base d'ARN, l'ARN codant pour le polyépitope a été obtenu en utilisant un vecteur contenant un fragment souscloné du plasmide pCMV-B10 et la SP6 polymérase. L'ARN a été produit suivant la méthode décrite dans la demande de brevet EP 1 083 232. Dans certaines expériences, l'ARN a été stabilisé en utilisant la protamine à un ratio de 1/1 grammes. Vingt microlitres d'ARN ont été injectés derrière chaque oreille de souris BALB/c pour un montant total de 40 microgrammes d'ARN par souris.

Pour l'immunisation, des groupes de 4 à 6 souris BALB/c femelles, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisés.

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13 - Quantification de cellules T spécifiques d'un épitope de HIV et produisant de l'IFN-y Les souris ont été sacrifiées 3 semaines après l'injection de l'ARN.

Les cellules relarguant de l'Interferon-gamma (IFN-y) ont été quantifiées par un ELISPOT tel que décrit plus haut après stimulation par les 13 épitopes HLA-A2 codés par le plasmide pCMV-B10. Des plaques ELISA à fond plat en nitrocellulose (Multiscreen, Millipore, Molsheim, France) ont été couvertes avec 50 microlitres d'anticorps de rat anti-IFN-y murin (5 g/ml, Pharmingen, San Diego, CA) sur la nuit à 4 C, puis saturées pendant 2 heures à 37 C avec du RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau fétal. Des splénocytes (1 x 106/puits dans des plaques de 96 puits), obtenus comme décrit ci-dessus dans les expériences d'activité CTL, ont été incubés 40 heures dans du milieu complet a-MEM à 37 C en présence de 5% de CO2 en utilisant différentes stimulations antigéniques. Les cellules ont été incubées séparément avec chacun des épitopes de HIV codés par le plasmide pÇMV-B10, ces épitopes étant présents à une concentration de 10 uM. Le bruit de fond a été évalué avec des cellules dans le milieu. Les cellules ont été enlevées en tapotant les plaques, puis lysées avec de l'eau. Après lavage avec du PBS à 0,05% tween 20, un anticorps biotinylé de rat anti-IFN-y murin (1 g/ml, Pharmingen, San Diego, CA) a été ajouté pour une incubation à 90 minutes à température ambiante. Les puits ont été lavés comme ci-dessus avant l'incubation avec un conjugué phosphatase alkaline-streptavidine (Boehringer-Mannheim, Allemagne) à une dilution de 1 :1000 du PBS pendant 1 h 30 min. Ensuite, une solution à 2,3 mM de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) et de nitroblue tetrazolium (NBT) (Promega, Madison, WI) diluée dans une solution tampon alcaline, a été ajoutée. Lorsque les spots sont devenus visibles, la réaction a été arrêtée avec de l'eau et séchée à l'air. Le nombre de spots secrétant de l'IFN-y a été compté en utilisant un lecteur ELISPOT (Zeiss) et les

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résultats ont été exprimés comme valeur moyenne dans chaque groupe de cellules secrétant de l'IFN-y pour 106 cellules de rate.

Les résultats sont présentés sur la figure 6.

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Claims (30)

1. REVENDICATIONS 1. Préparation irnmunogène comprenant de l'ARN messager mature codant pour au moins un antigène d'un agent pathogène.
2. 2. Préparation immunogène selon la revendication 1, dans laquelle l'ARN est un ARN messager mature non réplicatif.
3. 3. Préparation immunogène selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la séquence de l'ARN comprend en outre des séquences de stabilisation, capables d'augmenter la demi-vie de l'ARN dans le cytosole.
4. 4. Préparation immunogène selon la revendication 3, dans laquelle une partie au moins des séquences de stabilisation est sélectionnée parmi les séquences transcrites et non traduites (UTR) du gène de la p-globine et la séquence consensus (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC contenue dans le 3'UTR des ARNs codant l'a-globine, l'[alpha](I)-collagène, la 15-lipoxygenase et la tyrosine hydroxylase.
5. 5. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle l'ARN comporte à son extrémité 3' une queue poly-A ayant plus de 30 résidus A en position 3'.
6. 6. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle I ARN a été synthétisé en présence de ribonucléosides modifiés, de façon à résister à la dégradation par les RNases.
7. 7 Préparation immunogène selon la revendication 6, dans laquelle l'ARN comporte des phosphorothioates.
8. 8. Préparation imrnunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle l'ARN est essentiellement dépourvu de séquences de déstabilisation AURES et de séquences reconnues par des endonucléases.

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9. 9. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle l'ARN comporte en outre une séquence susceptible d'augmenter sa traduction.
10. 10. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant en outre au moins un facteur de stabilisation de l'ARN, en particulier un inhibiteur de RNase.
11. 11. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle i'ARN est complexé avec au moins un peptide ou une protéine cationique, de préférence polycationique.
12. 12. Préparation immunogène selon la revendication 11, dans laquelle le peptide ou la protéine est une protamine, une poly-L-lysine, une poly-L-Arginine, ou une histone.
13. 13. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comportant en outre un ou plusieurs élément(s) adjuvant(s).
14. 14. Préparation immunogène selon la revendication 13, comportant au moins un agent immunomodulateur choisi parmi les lipopolysaccharides (LPS), la glycoprotéine 96, des oligonucléotides contenant des motifs CpG et des cytokines.
15. 15. Préparation immunogène selon les revendications 13 et 14, dans laquelle l'ARN est hautement purifié avant l'ajout du ou des élément(s) adjuvant (s).
16. 16. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dont la composition est formulée pour une administration cutanée ou intra- dermique.
17. 17. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans laquelle l'ARN est un ensemble d'ARN messagers.

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18. 18. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans laquelle une partie au moins des molécules d'ARN comprennent un site d'entrée interne du ribosome (IRES).
19. 19. Préparation immunogène selon la revendication 17 ou 18, dans laquelle une partie au moins des molécules d'ARN codent pour des cytokines capables de stimuler ou de polariser la réponse immunitaire.
20. 20. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans laquelle la séquence codant pour au moins un antigène d'un agent pathogène code pour un polyépitope.
21. 21. Préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans laquelle la séquence de l'ARN codant pour au moins un antigène d'un agent pathogène code pour au moins une protéine virale ou bactérienne, entière ou tronquée.
22. 22. Préparation immunogène selon la revendication 21, dans laquelle une partie au moins des molécules d'ARN codent pour un antigène de surface du virus de l'hépatite B.
23. 23. Préparation immunogène selon la revendication 22, dans laquelle une partie au moins des molécules d'ARN codent pour les petite et moyenne protéines d'enveloppe du virus de l'hépatite B.
24. 24. Préparation immunogène selon la revendication 23, dans laquelle une partie au moins des molécules d'ARN ont la séquence représentée à la SEQ ID

    N 2.
25. 25. Préparation immunogène selon la revendication 20, dans laquelle une partie au moins des molécules d'ARN codent pour un polyépitope du VIH.
26. 26. Préparation immunogène selon la revendication 25, dans laquelle une partie au moins des molécules d'ARN ont la séquence représentée à la SEQ ID

    N 3.

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27. 27. Préparation immunogène selon la revendication 21, dans laquelle une partie au moins des molécules d'ARN codent pour la protéine CORE du virus de l'hépatite C.
28. 28. Utilisation d'une préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prophylaxie, au traitement ou à l'amélioration de l'état d'un patient à la suite d'une infection par le VIH, le virus de l'hépatite B, le virus de l'hépatite C, le virus du sarcome de Rous, le parasite responsable du paludisme, ou Chlamydia Pneumoniae.
29. 29.Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend une préparation immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, permettant d'obtenir chez un hôte, humain ou animal, une protection vis-à-vis d'un agent pathogène.
30. 30. Vaccin selon la revendication 29, caractérisé en ce que la protection est obtenue par une activation de lymphocytes T cytotoxiques et/ou auxiliaires et de lymphocytes B spécifiques d'au moins un antigène codé par au moins une partie des molécules d'ARN de la préparation.