CN106692169A - 人参皂甙Rg1在制备脊髓损伤修复药物的应用及大鼠脊髓损伤模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种人参皂甙Rg1在制备脊髓损伤修复药物的应用，本申请还公开了一种用于检测Rg1对脊髓损伤修复作用的大鼠脊髓损伤模型的构建方法，包括以下步骤：所有大鼠麻醉后取俯卧位固定于操作台；确定椎体序列；沿T10或T11棘突上缘作一长1.5cm‑2cm的后正中切口，分离深筋膜，显露棘突，钝性剥离双侧椎旁肌，将椎旁肌向两侧牵拉固定，继续钝性剥离T9或T10椎板；咬除T9或T10棘突及两侧椎板；将动脉血管夹两头对称置于暴露的脊髓两侧，并保证动脉夹头端触及椎体后缘，此时突然释放动脉夹，使脊髓遭受突然的夹闭损伤，2min后将动脉夹取下，进行造模。本发明的模型显示Rg1能对脊髓损伤直接起作用、促进神经功能修复，因而有进一步深入研究的迫切需要。

Description

人参皂甙Rg1在制备脊髓损伤修复药物的应用及大鼠脊髓损 伤模型的构建方法

技术领域

本申请属于生物工程领域，具体地说，涉及一种人参皂甙Rg1在制备脊髓损伤修复药物的作用及大鼠脊髓损伤模型的构建方法。

背景技术

脊髓损伤(spinalcordinjury，SCI)是临床常见的一种致残性严重创伤，其后果是神经元死亡及轴突断裂、神经支配功能的丧失，导致患者发生严重的生理、心理和社会交往的障碍，同时给社会和家庭带来沉重负担，其治疗是医学界长期的难题和研究热点。传统观点认为脊髓损伤后星形胶质细胞(astrocyte，AS)增殖、胶质瘢痕和空洞形成是阻碍损伤脊髓轴突有效再生和生长的主要因素。而近年来随着神经生理学、神经细胞生物学、分子生物学飞速发展，脊髓损伤的病理生理、修复机制的研究得以不断深入，最新研究表明脊髓损伤后AS反应和胶质瘢痕微环境对神经元存活、轴突再生、连接，甚至内源性神经干激活、分化均有重要作用，从而是决定脊髓损伤后神经结构和功能修复的关键因素。

活化AS、胶质瘢痕及其间促进修复和抑制性细胞因子共同构成的微环境是决定脊髓损伤修复的关键因素。因此，发展更好的药物或分子工具以合理干预脊髓损伤后AS各阶段病理生理应答并调控上述各种细胞因子分泌和表达，使之达到最佳平衡状态，启动内源性修复机制，充分发挥其对神经支持、保护作用及对轴突再生的促进作用，调控其成熟期的过度增殖，诱导新生的AS成线性排列，改善胶质瘢痕结构和微环境，为轴突再生和延长提供理想的支架和通道，是当前脊髓损伤修复研究的一个关键环节和迫切任务。

然而目前该领域研究大多建立在胶质瘢痕阻碍神经再生的理论之上，致力于单方面抑制AS活化和胶质瘢痕形成，用药物、体外诱导、基因技术等实验手段，只取得了有限成果，且过度抑制AS活化和胶质瘢痕形成，不利于甚至有碍脊髓损伤修复。

人参作为传统中药具有补气安神、增强神经系统功能的药效，对中枢神经系统有兴奋和抑制双重作用，其中植物甾醇人参皂甙Rg1(ginsenoside Rg1)是作用于神经系统的主要成分之一，其神经药理作用包括神经元的营养、保护、延缓凋亡，调节神经递质活性及抑制神经毒性、抗氧化应激和抗凋亡作用，可明显提高体外培养神经元及神经干细胞的存活率和增殖能力，并具有促进周围神经轴突生长作用。

虽然脊髓损伤的大体机制基本阐明，但是基于植物甾醇人参皂甙Rg1的治疗脊髓损伤的病理生理机制非常复杂，人们对此认识并不全面和深入，因而导致了一直困扰着临床医师对脊髓损伤的治疗，为了寻求新的、有效的治疗，更透彻地阐明脊髓损伤所涉及的复杂机制，更有效地评估脊髓损伤后干预手段的效果，需要有可靠性高、重复性好的符合临床的脊髓损伤模型，由于无法依靠临床开展系统的病理学研究，通过建立动物模型进行实验研究则显得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本申请针对上述的问题，提供了一种人参皂甙Rg1在制备脊髓损伤修复药物的应用及大鼠脊髓损伤模型的构建方法。

为了解决上述技术问题，本申请公开了一种人参皂甙Rg1在制备脊髓损伤修复药物的应用。

本申请还公开了一种用于检测Rg1对脊髓损伤修复作用的大鼠脊髓损伤模型的构建方法，包括以下步骤：

1)将大鼠麻醉并固定：所有大鼠经1mL/100g水合氯醛腹腔注射麻醉后取俯卧位固定于操作台；

2)确定椎体序列：用食指沿胸椎棘突从上至下触摸，感知一明显增大的棘突，为T10或T11棘突；

3)胸背部备皮，碘伏消毒、铺巾，沿T10或T11棘突上缘作一长1.5cm-2cm的后正中切口，分离深筋膜，显露棘突，钝性剥离双侧椎旁肌，用3-0丝线将椎旁肌向两侧牵拉固定，继续钝性剥离T9或T10椎板；用显微蚊钳咬除T9或T10棘突及两侧椎板，暴露硬脊膜并保持其完整性；

4)将动脉血管夹两头对称置于暴露的脊髓两侧，并保证动脉夹头端触及椎体后缘，此时突然释放动脉夹，使脊髓遭受突然的夹闭损伤，2min后将动脉夹取下，此过程中大鼠后肢痉挛性抽搐，尾巴向两侧快速摆动，持续数秒；充分止血后由内而外逐层缝合，碘伏棉球消毒并清除切口周缘血迹；将大鼠置于恒温台上复温，待麻醉清醒后，大鼠后肢及尾部出现软瘫，即造模成功，

5)术后护理。

进一步地，术后护理具体为：分笼饲养，术后每隔8h行人工排尿一次，挤压膀胱后及时清理会阴，保持会阴干燥，直至动物排尿反射恢复，期间观察大鼠状态，必要时为预防感染，每只大鼠肌注50mg/kg头孢唑啉，持续3天。

进一步地，动脉血管夹的夹闭力量为15g。

与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：

1)本发明建立的动物模型可靠性高；非常类似于绝大多数人体脊髓损伤的实际过程；本发明建立的动物模型重复性好。

2)根据本发明的模型证实Rg1可辅助嗅鞘细胞移植对脊髓损伤有间接治疗作用，而本发明的模型显示Rg1也能对脊髓损伤直接起作用、促进神经功能修复，因而有进一步深入研究的迫切需要。

3)本发明紧扣当前脊髓损伤研究的一个长期热点、难题和关键问题，建立“调控AS活化、平衡胶质瘢痕微环境，启动内源性机制促进脊髓损伤修复”的先进理念，改进了“抑制AS活化和胶质瘢痕增生”的传统治疗观念，更符合脊髓损伤修复的病理生理过程。

4)本发明针对当前医学难题，用现代研究手段深'探索、发掘传承数千年传统中医药的现实应用价值和机制，具有重要理论意义和现实价值，且Rg1作为传统中药单体成分，便于临床应用，前景广阔，潜力巨大。

当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是本申请14天后bcl-2，caspase-3的western检测结果及光密度分析；

图2是本申请14天后bcl-2，caspase-3的光密度分析；

图3是本申请血清学SOD检测结果；

图4是本申请血清学MDA检测结果；

图5是本申请3组大鼠在3d、7d、14d时GFAP免疫染色观察；

图6是本申请3组大鼠在3d、7d、14d时GFAP阳性染色面积的比较。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1

一种人参皂甙Rg1在制备脊髓损伤修复药物的应用。

其中，具体的药物是以人参皂甙Rg1为主成分，加入常规助剂，制备成注射液、胶囊、片剂、口服液等。

实施例2

一种用于检测Rg1对脊髓损伤修复作用的大鼠脊髓损伤模型的构建方法，包括以下步骤：

所有大鼠经10％水合氯醛腹腔注射(1mL/100g)麻醉后取俯卧位固定于操作台，确定椎体序列：用食指沿胸椎棘突从上至下触摸，感知一明显增大的棘突，通常为T10或T11棘突。胸背部备皮，碘伏消毒、铺巾，沿T10或T11棘突上缘作一长约1.5cm-2cm的后正中切口，分离深筋膜，显露棘突，钝性剥离双侧椎旁肌，用3-0丝线将椎旁肌向两侧牵拉固定，继续钝性剥离T9或T10椎板。用显微蚊钳咬除T9或T10棘突及两侧椎板，暴露硬脊膜并保持其完整性。将动脉血管夹(夹闭力量为15g)两头对称置于暴露的脊髓两侧，并保证动脉夹头端触及椎体后缘，此时突然释放动脉夹，使脊髓遭受突然的夹闭损伤，2min后将动脉夹取下，此过程中可见大鼠后肢痉挛性抽搐，尾巴向两侧快速摆动，持续数秒。充分止血后由内而外逐层缝合，碘伏棉球消毒并清除切口周缘血迹。将大鼠置于恒温台上复温，待麻醉清醒后，大鼠后肢及尾部出现软瘫，即造模成功。术后护理：分笼饲养，术后每隔8h行人工排尿一次，挤压膀胱后及时清理会阴，保持会阴干燥，直至动物排尿反射恢复，期间观察大鼠状态，必要时为预防感染，每只大鼠肌注头孢唑啉(50mg/kg)，持续3天。

基于上述用于检测Rg1对脊髓损伤修复作用的大鼠脊髓损伤模型，采用含有人参皂甙Rg1的药物研究人参皂甙Rg1促进大鼠急性脊髓损伤修复及相关机制，实验结果如图1-图6所示，本发明研究表明Rg1显著改善大鼠模型后肢运动功能：通过上调Bcl-2蛋白表达、下调Caspase-3蛋白表达抑制神经元凋亡；通过增强血清SOD活力、减少血清MDA含量发挥抗氧化应激作用；更重要的是Rg1减少GFAP阳性染色的AS数量和胶质瘢痕面积并减轻脊髓损伤区神经元坏死、炎性细胞浸润，改善了损伤局部微环境。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种人参皂甙Rg1在制备脊髓损伤修复药物的应用。

2.一种用于检测Rg1对脊髓损伤修复作用的大鼠脊髓损伤模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将大鼠麻醉并固定：所有大鼠经1mL/100g水合氯醛腹腔注射麻醉后取俯卧位固定于操作台；

2)确定椎体序列：用食指沿胸椎棘突从上至下触摸，感知一明显增大的棘突，为T10或T11棘突；

3)胸背部备皮，碘伏消毒、铺巾，沿T10或T11棘突上缘作一长1.5cm-2cm的后正中切口，分离深筋膜，显露棘突，钝性剥离双侧椎旁肌，用3-0丝线将椎旁肌向两侧牵拉固定，继续钝性剥离T9或T10椎板；用显微蚊钳咬除T9或T10棘突及两侧椎板，暴露硬脊膜并保持其完整性；

4)将动脉血管夹两头对称置于暴露的脊髓两侧，并保证动脉夹头端触及椎体后缘，此时突然释放动脉夹，使脊髓遭受突然的夹闭损伤，2min后将动脉夹取下，此过程中大鼠后肢痉挛性抽搐，尾巴向两侧快速摆动，持续数秒；充分止血后由内而外逐层缝合，碘伏棉球消毒并清除切口周缘血迹；将大鼠置于恒温台上复温，待麻醉清醒后，大鼠后肢及尾部出现软瘫，即造模成功，5)术后护理。

3.根据权利要求2所述的用于检测Rg1对脊髓损伤修复作用的大鼠脊髓损伤模型的构建方法，其特征在于，术后护理具体为：分笼饲养，术后每隔8h行人工排尿一次，挤压膀胱后及时清理会阴，保持会阴干燥，直至动物排尿反射恢复，期间观察大鼠状态，必要时为预防感染，每只大鼠肌注50mg/kg头孢唑啉，持续3天。

4.根据权利要求2所述的用于检测Rg1对脊髓损伤修复作用的大鼠脊髓损伤模型的构建方法，其特征在于，动脉血管夹的夹闭力量为15g。