CN103585275B - 用于治疗风湿骨病的中药组合物及中成药的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明用于治疗风湿骨病的中药组合物，各活性部位的质量百分比为：甘草皂苷40%～60%；甘草黄酮10%～20%；麻黄生物碱5%～20%；川牛膝皂苷5%～20%；马钱子生物碱5%～10%。根据该中药组合物制备中成药的方法包含以下步骤：⑴制备甘草皂苷；⑵制备甘草黄酮；⑶制备麻黄生物碱；⑷制备川牛膝皂苷；⑸制备马钱子生物碱；⑹配制活性部位组合物；⑺制作用于治疗风湿骨病的中成药；所述中成药包括胶囊、软胶囊、片剂。根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中成药能在镇痛抗炎、活血祛瘀和补中益气增强免疫力以及治疗寒湿淤阻经络所致的风湿性关节炎、关节痛中进行应用。

Description

用于治疗风湿骨病的中药组合物及中成药的制备方法和应用

技术领域

本发明属于中医药领域，涉及中药的成药，具体地涉及一种用于治疗风湿骨病的中药组合物及中药成药(以下简称“中成药”)的制备方法和应用。

背景技术

风湿性疾病，俗称“风湿病”，系风、寒、湿、创伤侵入人体，形成痹毒并附于人体骨骼，从而损伤骨骼和与骨骼相关的硬组织，致使肌、韧带、滑囊、筋膜的营养供给不良而导致的一类疾病。在该类疾病中，99％为风湿骨病，它是现今最为常见的慢性骨病之一。早在古时中医对该疾病就有相关描述。风湿属于中医“痹症”的范畴，在《素问·痹论》中就有“风寒湿三气杂至，合而为痹”之说，它从中医角度阐明了该疾病的发病机理是为阳气不足、腠理不密、风寒湿邪入侵等所致。近代医学研究也发现，风湿骨病的发病与寒冷、潮湿、疲劳、营养不良、创伤、精神等因素密切相关。

目前，治疗风湿骨病多以非手术治疗为主，常用非甾体类抗炎镇痛药物治疗以控制急性发作。自1899年阿司匹林问世以来，已有100余种非甾体抗炎镇痛药(NSAIDs)用于临床，他们巳成为治疗风湿性关节炎(RA)、骨关节炎(OA)以及各种轻到中度疼痛的一线用药，其中不少巳成为非处方药。根据药物对环氧化酶(COX)选择性的不同，将COX抑制剂分为四类：①COX-1特异性抑制剂，如小剂量阿司匹林。②COX非特异性抑制剂，如布洛芬、萘普生、吲哚美辛、大剂量阿司匹林等。③COX-2倾向性抑制剂，如吡罗昔康、伊索昔康、美洛昔康等。④COX-2特异性抑制剂，如塞来昔布、罗非昔布、伐地昔布。长期以来，上述药物的疗效已得到充分肯定，但是长期用药的安全性令人担忧。所述药物的毒副作用相对明显，患者难以长期耐受。因此，寻求有效理想的风湿治疗药物已成为近些年药物研究的热点。在中医药领域，用中药治疗风湿痹症已有悠久的历史。传统的治疗风湿骨病的中成药有风湿马钱片、通络止痛胶囊、益肾蠲痹丸、虎骨丸、血痹大易方、腰痛宁胶囊等。其中，风湿马钱片的药物组成为马钱子粉、僵蚕(炒)、乳香(炒)、没药(炒)、全蝎、牛膝、苍术、麻黄、甘草等9味药材。通络止痛胶囊的药物组成为防己、苦杏仁、黄柏、蚕砂、百部、薏苡仁、法半夏、连翘、滑石粉、通草、苦参、甘草等12味药材。益肾蠲痹丸的药物组成为地黄、当归、淫羊藿、骨碎补、蜂房、全蝎、蜈蚣等7味药材。虎骨丸的药物组成为乳香、没药(各另研)、赤芍药、熟地黄、当归、虎胫骨(酥炙黄、狗骨代)、血竭等7味药材。血痹大易方的药物组成为山药、牛膝、泽泻、地肤子、白术、干漆、蛴螬、狗脊、车前子、茵陈、山茱萸、干地黄、天雄等13味药材。腰痛宁胶囊的药物组成有马钱子粉、土鳖虫、川牛膝、甘草、麻黄、乳香(醋制)、没药(醋制)、全蝎、僵蚕(麸炒)、麸炒苍术等10味药材。

近些年来，用于治疗风湿骨病的新型中药的专利层出不穷：中国专利CN201110382506.X公开了由龙爪叶、穿山甲、吴茱萸、雄黄、白花蛇、当归、骨碎补、石菖蒲、络石藤、威灵仙、淫羊藿、路路通、大黄、蜈蚣、全蝎、丁香和过江龙共计17种药物组成的“一种治疗风湿和类风湿性关节炎的药物组合物”。中国专利文献CN01114363.0公开了一种由制马钱子、制川乌、制草乌、制鳌甲、宣木瓜、川牛膝和红花共计7种药物组成的“马钱子风湿散”。中国专利CN200610031135.X公开了一种由水蛭、秦艽、金银花和鱼腥草共计4种药物组成的“治疗类风湿病的中药注射液”。中国专利CN98112207.8公开了由乳香、没药、威灵仙、木鳖子、柳枝、蓖麻油、蜂蜡共计7种药物等配制而成的“风湿贴”。中国专利CN200410010720.2公开了一种主要由木香、桃仁、丹皮、赤芍、延胡索、半夏、茯苓、大黄、柴胡、荆芥、白术、知母、党参、熟地、防风、伸筋草、透骨草、乳香、没药、甘草共计20种药物组成的“治疗类风湿性关节炎的中药通络制剂”。

上述已有中成药及发明专利中所含药物种类繁多、成分复杂，其质量可控性差、安全隐患大、服用剂量大。并且采用的药材是全粉入药，含有很多非有效物质，其中某些药物存在毒副作用，不宜长期服用。因此，人们一直在努力改善抗风湿骨病中成药的药物组成，探索这些药物的作用机理。希望能提出组方简单、质量可控性强、毒副作用和服用剂量小的治疗风湿骨病的新型中药。

中药中的同类活性成分组群称为活性部位，可按照其分子结构的基本构架分为生物碱类、黄酮类、皂苷类、挥发油类等等。中药复方中的不同活性部位相互间的协同及拮抗作用是中药发挥药效的物质基础。因此，通过总结中医验方及中医配伍准则，设计合理的中药活性部位组成的中药组合物有望研制出功效显著、毒副作用和服用剂量小的治疗风湿骨病药物。

发明内容

本发明的目的在于发展中药的成药，提供一种用于治疗风湿骨病的中药组合物。所述组合物以甘草皂苷为君药，含有马钱子生物碱、麻黄生物碱、甘草黄酮和川牛膝皂苷，具有补肾健脾、散风祛湿、消炎止痛的功效。本发明的第二目的在于，根据所述用于治疗风湿骨病的中药组合物提供一种用于治疗风湿骨病的中成药的制备方法。本发明的第三目的在于提供所述用于治疗风湿骨病的中成药的应用。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。

一种用于治疗风湿骨病的中药组合物，其特征是，各活性部位的质量百分比为：

进一步，用于治疗风湿骨病的中药组合物，各活性部位的质量百分比为：

本发明用于治疗风湿骨病的中药组合物以甘草皂苷为君药，其占各原料成分的近一半或一半以上。甘草是豆科甘草属植物，其根和根茎是最常用的中药。甘草味甘、性平、无毒，主治五脏六腑寒热邪气，坚筋骨，长肌肉，倍气力，解毒，久服能轻身延年。甘草含有多种化学成分，主要成分为甘草酸、甘草黄酮。所述甘草酸又称甘草皂苷，具有抗炎、抗病毒和保肝解毒及增强免疫功能等作用。多数报道认为，甘草皂苷的抗炎机理与抑制前列腺素等介质的作用有关。甘草酸可能通过对花生四烯酸水解所需的磷脂酶A2的抑制来实现抑制前列腺素的合成与释放。另据日本学者TaKagi的报导，将我国东北甘草除去甘草甜素后得到一种黄酮类成分，命名为FM100(商品名为Aspallon)，具有抗实验消化性溃疡的作用及抗炎作用，已开发有成药上市。

所述甘草黄酮是甘草中的重要活性部位之一，主要存在于甘草根表皮以内的部分。前苏联学者在研究中发现了甘草黄酮具有较强的消炎和抗变态作用，比磺胺和抗生素的药效要好。日本学者小菅卓夫等人也相继从甘草中分离得到了有抗炎活性的黄酮类成分Liquiritin，其作用机理可能与对透明质酸酶的活性和对组胺释放的抑制作用有关。

本发明的中药组合物中含有川牛膝皂苷。所述川牛膝皂苷活性部位的苷元为齐墩果酸，属于五环三萜类化合物，是中药川牛膝的主要活性成分。现代药理研究发现：从川牛膝中提取的皂苷对大鼠蛋清性关节炎有促进炎性肿胀消退的明显作用；可有效降低大鼠全血粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数，具有明显的活血化瘀的作用；此外还具有消炎止痛的功效。

本发明的中药组合物中还含有两种生物碱：马钱子生物碱和麻黄生物碱。其中，马钱子生物碱为马钱子的主要活性部位，是一种吲哚类生物碱，含量约为3％～5％。近代药理实验表明：马钱子生物碱具有显著的镇痛、镇静的作用。小鼠扭体、小鼠热板及小鼠肌肉注射模型均证实：马钱子生物碱有显著的镇痛作用且其镇痛作用与M胆碱受体有一定的联系。所述麻黄生物碱与马钱子生物碱的作用相似，其中的麻黄碱可通过作用于α1-受体来提高中枢性痛觉阈值从而达到镇痛的作用。因此，以甘草皂苷为主，辅以马钱子生物碱及麻黄生物碱，可以增强本发明的中药组合物的镇痛作用，使其在治疗风湿骨病时表现出理想的治疗疗效。

为实现上述第二目的，本发明采取了以下技术方案。

一种根据所述中药组合物制备用于治疗风湿骨病的中成药的方法，其特征是，包含以下步骤：

(1)制备甘草皂苷

取甘草粉以氨性乙醇超声提取两次；过滤，旋蒸，离心；过HZ-816大孔树脂柱，收集乙醇洗脱液；旋蒸至干，干燥，称重；

所述甘草提取物中甘草皂苷的质量百分比为50％～95％；

(2)制备甘草黄酮

取甘草药材进行粉碎，用乙醇回流提取；离心、浓缩并脱色；先过D101大孔树脂柱，浓缩后过HZ915聚酰胺树脂柱；醇液减压浓缩干燥，称重；

所述甘草提取物中甘草黄酮的质量百分比为20％～80％；

(3)制备麻黄生物碱

称取麻黄药材进行粉碎，用乙醇回流提取；过滤，离心，减压浓缩；旋蒸至干，称重，制得麻黄生物碱；

所述麻黄提取物中麻黄碱的质量百分比为20％～70％；

(4)制备川牛膝皂苷

取川牛膝药材进行粉碎，用乙醇回流提取两次；过滤离心提取，旋蒸至浸膏；用去离子水溶解，过HZ-816大孔树脂柱，重复上样一次，收集乙醇的洗脱液；醇液旋蒸，干燥，称重；

所述川牛膝提取物中川牛膝皂苷的质量百分比为5％～30％；

(5)制备马钱子生物碱

称取马钱子药材进行粉碎，用乙醇回流提取；过滤，离心，减压浓缩；旋蒸至干，称重，制得马钱子生物碱；

所述马钱子提取物中马钱子碱的质量百分比为40％～95％；

(6)配制活性部位质量百分比

将步骤(1)-(5)制备的甘草皂苷、甘草黄酮、麻黄生物碱、川牛膝皂苷和马钱子生物碱按下述活性部位质量百分比进行配制：

(7)制作用于治疗风湿骨病的中药成药

将步骤(6)配制的活性部位混合物制备成胶囊、软胶囊和片剂。

进一步，将步骤(1)～步骤(5)制备的甘草皂苷、甘草黄酮、麻黄生物碱、川牛膝皂苷和马钱子生物碱按下述活性部位质量百分比进行配制：

为实现上述第三目的，本发明采取了以下技术方案。

根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中成药在镇痛抗炎、活血祛瘀和补中益气、增强免疫力中的应用，所述中成药具有去湿除寒、补肾健脾、活血通络的功效。

进一步，所述用于治疗风湿骨病的中成药在治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎以及关节痛中的应用。

本发明的积极效果是：

(1)按照“标本兼治”的原则，采用补肾健脾、通络止痛的治疗方案，在甘草皂苷抗炎、抗病毒和保肝解毒及增强免疫功能基础上，辅以一种黄酮(甘草黄酮)及一种皂苷(川牛膝皂苷)，两种生物碱(马钱子生物碱和麻黄生物碱)，在多个体外细胞模型中表现出有显著的疗效。

(2)根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中成药的药效经体外细胞实验结果证实：各浓度的药物均表现出显著的免疫、抗炎及活血作用；该组方对小鼠巨噬细胞生成PGE₂有明显的抑制作用，对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2水平具有明显的促进作用；对小鼠巨噬细胞产生IL-6和TNF-α亦有促进作用；对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞有显著的增殖作用，对该细胞的损伤有明显的修复作用。此外，所述中成药具有显著的活血祛瘀作用，能有效的增强人脐静脉内皮细胞释放NO的能力。

(3)根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中成药的药效经体外动物实验结果证实：该药物可显著抑制佐剂性关节炎大鼠的急性足爪肿胀和继发性足肿胀，提示该中药活性部位具有防治佐剂性关节炎的作用。

(4)综上所述，根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中成药在镇痛抗炎、活血祛瘀和补中益气增强免疫力等方面均有明显作用，对风湿骨病有良好疗效。

具体实施方式

以下继续介绍本发明用于治疗风湿骨病的中药组合物的具体实施方式，通过12个实施例来分析、检查和验证根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中成药的作用和功能。但是，本发明的实施不限于以下的实施方式。

实施例1

一种用于治疗风湿骨病的中药组合物，各活性部位的配方质量百分比如下：

根据本发明的中药组合物制备用于治疗风湿骨病的中成药的方法，包含以下步骤：

(1)制备甘草皂苷

①取甘草粉以0.5％氨性70％乙醇(以下所涉及到的试剂百分含量均为质量百分含量)超声提取两次，每次1小时；

②过滤离心提取，旋蒸至约300mL，加去离子水，静置过夜，离心；

③过HZ-816大孔树脂柱(依次使用1200mL去离子水，600mL30％乙醇，600mL50％乙醇，600mL70％乙醇洗脱)，收集70％乙醇洗脱液；

④醇液旋蒸至干，干燥，称重，通过高效液相色谱以单一标准品为衡量标准，测定甘草皂苷的含量为82.0％。

(2)制备甘草黄酮

①取甘草，粉碎后用乙醇回流提取2.5小时；

②将提取液离心、浓缩并脱色；

③先过D101大孔树脂柱(用乙醇洗脱)，将洗脱液减压浓缩；后过HZ915聚酰胺树脂柱(乙醇洗脱)；

④醇液减压浓缩干燥，分别获得甘草药材的总黄酮提取物，通过高效液相色谱以单一标准品为衡量标准，测得甘草黄酮的含量为69.94％。

(3)制备麻黄生物碱

称取麻黄药材进行粉碎，用乙醇回流提取；将提取液过滤，滤液在4000r/min转速下离心5min后取上清液减压旋蒸浓缩；定容后减压旋蒸至干，制得麻黄生物碱，测得其生物碱含量为42.0％。

(4)制备川牛膝皂苷

①取川牛膝药材进行粉碎，以8倍量浓度为80％的乙醇回流提取两次，提取时间分别为第一次3小时，第二次2小时；

②过滤离心提取，旋蒸至浸膏；

③用去离子水溶解，以2mL/min上HZ-816大孔树脂柱，重复上样一次：分别以4倍量浓度为10％的乙醇及浓度为95％的乙醇分别洗脱，收集95％乙醇的洗脱液；

④醇液旋蒸，获得川牛膝皂苷，用香草醛-冰醋酸比色法测得其皂苷含量为13.88％。

(5)制备马钱子生物碱

称取马钱子药材进行粉碎，用乙醇回流提取；将提取液过滤，滤液在4000r/min转速下离心5min后取上清液减压旋蒸浓缩；定容后减压旋蒸至干，制得马钱子生物碱，测得其生物碱含量为88.7％。

(6)配制活性部位质量百分比

将步骤(1)-(5)制备的甘草皂苷、甘草黄酮、麻黄生物碱、川牛膝皂苷和马钱子生物碱按用于治疗风湿骨病的中药组合物进行配制，各活性部位的质量百分比为：

(7)制作用于治疗风湿骨病的中药成药

将步骤(6)配制的活性部位制备成胶囊、软胶囊和片剂。

实施例2

根据本发明的中药组合物制备用于治疗风湿骨病的中药成药的方法，包含以下步骤：

制备方法和步骤基本同实施例1，与实施例1所不同的是：

将步骤(1)-(5)制备的甘草皂苷、甘草黄酮、麻黄生物碱、川牛膝皂苷和马钱子生物碱按用于治疗风湿骨病的中药组合物进行配制，各活性部位的质量百分比为：

实施例3

根据本发明的中药组合物制备用于治疗风湿骨病的中药成药的方法，包含以下步骤：

制备方法和步骤基本同实施例1，与实施例1所不同的是：

将步骤(1)-(5)制备的甘草皂苷、甘草黄酮、麻黄生物碱、川牛膝皂苷和马钱子生物碱按用于治疗风湿骨病的中药组合物进行配制，各活性部位的质量百分比为：

实施例4

根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中药成药对风湿骨病治疗作用的动物实验：了解本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞增殖的影响。

(1)受试药物：根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中药成药。

(2)受试动物：SD大鼠，6只，7日龄，雌雄各半。

(3)实验方法

取7日龄SD大鼠脱颈处死，浸泡于酒精质量百分含量为95％的酒精数分钟后取出，取出股骨头、肩关节及膝关节软骨组织，用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗数次，加入少量PBS剪碎，用0.2％的Ⅱ型胶原酶37℃消化，移取上清液作为单个细胞悬液接种于培养皿中培养，隔天换液。

待细胞基本长满后传代培养，传至第2代时，调整细胞浓度为1×10⁷/L，接种于96孔培养板内用于实验。每孔接种200μL细胞悬液，接种24h后将培养孔分为空白对照组、IL-1β对照组、受试样品组、阳性对照组，每样3复孔，分别更换相应的培养液：

①空白对照组：换DMEM(含5％FBS，0.02％吐温-80)；

②模型组：换DMEM(含10μg/L的IL-1β，0.02％吐温-80及5％FBS)；

③受试药物及阳性对照组：换DMEM(含10μg/L的IL-1β，0.02％吐温-80，5％FBS及各浓度药物或阳性药)；

将各组放入培养箱中继续培养48h用于细胞增殖检测。去除原有细胞培养基，每孔加入100μL全培养基及10μLCCK8溶液重悬，继续孵育，于给药后3h置于酶标仪450nm波长下测定每孔的光密度值(OD值)，对受试样品促增殖作用进行分析。

(4)实验结果

受试药物对IL-1β诱导的大鼠骨关节炎软骨细胞的增殖影响见表1。

表1.受试药物对IL-1β诱导的大鼠骨关节炎软骨细胞的增殖影响(O.D.)

表1中，**与模型组P<0.01，*与模型组P<0.05。

(5)实施例4的结果表明

由表1可见，模型组在加入IL-1β后，OD值较正常组明显降低，细胞数量显著减少，该现象说明IL-1β已有效诱导细胞发生过早衰老，大鼠骨关节退行性病变模型构建成功。同时，受试药物组在(0.08～9.77μg/mL)浓度范围内均显示出显著的细胞增殖作用，且呈剂量依赖性，并在浓度为9.77μg/mL时作用最为明显：增殖率为69.98％，达到其最大药效。由此可知，本发明用于治疗风湿骨病的中药组合物可有效治疗骨关节炎，可有效促进软骨细胞的增殖以缓解关节炎对关节造成的伤害。

实施例5

本实施例是在实施例4的基础上，对免疫调节作用所做的动物实验：以了解本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物对小鼠脾淋巴细胞免疫功能的影响。

(1)受试药物：根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中药成药。

(2)受试动物：C57小鼠，SPF级别，6～8周龄，10只雌性。

(3)实验方法

小鼠断颈，无菌取脾，用滤网磨碎后制备脾细胞悬液，保证原代细胞活性95％以上，调整细胞浓度至3×10⁶个/mL。加入ConA诱导脾淋巴细胞增殖，细胞经过受试药物处理，培养72h后用ELISA法测定细胞培养上清中IL-2含量。

(4)实验结果

①受试药物对小鼠脾细胞IL-2分泌的影响见表2。

表2.受试药物对小鼠脾细胞IL-2分泌的影响(O.D.)

受试药物浓度(μg/mL)	ConA组	受试药物组
			400	0.7430±0.1124	2.3593±0.0162**
200	0.7323±0.1276	2.2707±0.0174**
			100	0.6923±0.1585	1.2420±0.1450**
50	0.6847±0.2434	0.5660±0.0072Δ
			25	0.6467±0.2175	0.5283±0.0286Δ
12.5	0.7397±0.2045	0.5657±0.0068Δ
			6.25	0.8100±0.0726	0.6577±0.0102Δ
3.125	1.0157±0.1262	0.8970±0.0320Δ

表2中，**与ConA组P<0.01,Δ与ConA组P>0.05。

如表2所示，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物在100-400μg/mL浓度范围内均可对小鼠脾淋巴细胞的IL-2分泌水平有显著的正向调节作用，其中当浓度在400μg/mL时，其促进作用达到最强。该结果显示本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物在高浓度情况下可调动机体免疫应答，调节T淋巴细胞的生长与分化，通过增强机体免疫作用而达到治本的目的。

实施例6

本实施例是在实施例5的基础上，对Ana-1巨噬细胞免疫功能进行的细胞实验：以了解本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物对小鼠Ana-1巨噬细胞免疫功能、抗肿瘤的影响。

(1)受试药物：根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中药成药。

(2)受试细胞：Ana-1小鼠巨噬细胞

(3)实验方法

①将Ana-1小鼠巨噬细胞在37℃、5％CO₂条件下，用含10％小牛血清、青霉素(1×10⁵u·L^-1)及链霉素(100mg·L^-1)的DMEM培养液进行传代培养。实验用细胞均处于对数生长期。

②取需要的细胞量，加入需要体积的新鲜完全培养基重悬细胞，接种96孔板中，空白对照组及待测药物处理组(3.125；6.25；12.525；50；100；200μg·mL^-1)，于37℃，5％CO₂条件下培养。

③在加药前弃去旧培养液，用新鲜培养液洗涤3次，加入新鲜的待测药物孵育30min，用酶联法测定样品IL-6及TNF-α含量，每组重复3次，同时加入CCK8试剂，检测细胞活力状态。

(4)实验结果

①受试药物对Ana-1细胞的增殖影响见表3。

表3.受试药物对Ana-1细胞的增殖影响(OD值/A)

受试药物浓度(μg/mL)	空白组	受试药物组
			200	2.4860±0.0132	2.6337±0.0031**
100	2.3893±0.0441	2.6013±0.0393**
			50	2.1413±0.0499	2.4997±0.0508**
25	2.2173±0.1158	2.4557±0.0514**
			12.5	2.2487±0.0483	2.3743±0.0266**
6.25	2.5703±0.0080	2.4543±0.0083**
			3.125	2.4640±0.0151	2.2357±0.0862**

表3中，**与空白组P<0.01。

如表3所示，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物在12.5～200μg/mL浓度范围内皆对促进巨噬细胞增殖有显著影响，剩余浓度组细胞无明显死亡，该现象说明细胞活力状态良好。

②受试药物对Ana-1细胞产生TNF-α的影响见表4。

表4.受试药物对Ana-1细胞产生TNF-α的影响(OD值/A)

表4中，**与空白组P<0.01，*与空白组P<0.05，Δ与空白组P>0.05。

表4的结果显示：本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物在3.125～200μg/mL浓度范围内均可对小鼠脾淋巴细胞的TNF-α分泌水平有正向调节作用。TNF-α是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一，参与机体免疫应答和炎症反应。因此，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物在高浓度的情况下可调动机体免疫应答，增强机体免疫力，能更有效地治疗风湿骨病。

③受试药物干预Ana-1细胞产生IL-6的影响见表5。

表5.受试药物干预Ana-1细胞产生IL-6的影响(OD值/A)

受试药物浓度(μg/mL)	空白组	受试药物组
			200	0.1180±0.0090	0.1903±0.1320Δ
100	0.1233±0.0229	0.2673±0.1583Δ
			50	0.1057±0.0078	0.1545±0.3869**
25	0.1017±0.0194	0.1690±0.0771Δ
			12.5	0.0957±0.0119	0.1047±0.0035Δ
6.25	0.0997±0.0107	0.1040±0.0066Δ
			3.125	0.1183±0.0135	0.1630±0.0953Δ

表5中，**与空白组P<0.01，Δ与空白组P>0.05。

如表5所示，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物在3.125～200μg/mL浓度范围内均可增强小鼠脾淋巴细胞的IL-6分泌水平，且在50μg/mL浓度下，促进作用显著。IL-6能够活化T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，能使B细胞前体成为产生抗体的细胞；IL-6与集落刺激因子协同，能促进原始骨髓源细胞的生长和分化，增强自然杀伤细胞的裂解功能。因此，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物亦可调动机体免疫应答，带动原始骨髓源细胞及NK细胞的增殖与作用，具有标本皆治的功效。

实施例7

本实施例是在实施例6的基础上，对Ana-1巨噬细胞抗炎活性进行的评价实验：以了解本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物抑制小鼠Ana-1巨噬细胞产生PGE₂的能力。

(1)受试药物：根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中药成药。

(2)受试细胞：Ana-1小鼠巨噬细胞

(3)实验方法

①将Ana-1小鼠巨噬细胞在37℃、5％CO₂条件下，用含10％小牛血清、青霉素(1×10⁵u·L^-1)及链霉素(100mg·L^-1)的DMEM培养液进行传代培养。实验用细胞均处于对数生长期。

②取需要的细胞量，加入需要体积的新鲜完全培养基重悬细胞，接种96孔板中，设溶剂DMSO对照组、LPS处理组、阳性药物(环氧酶抑制剂NS-398)对照组及受试药物处理组(3.125；6.25；12.5；25；50；100；200；400μg·mL^-1)于37℃、5％CO₂培养。

③建立模型，加入诱导剂LPS(终质量浓度为1mg·L^-1)进行培养(溶剂DMSO对照组不加LPS)。

④药物处理，弃去旧培养液，用新鲜培养液洗涤3次，分别加入新鲜的受试药物孵育30min。

⑤检测，加入底物AA(终浓度为10μmol·L^-1)，37℃，温育20min，收集上清液，-20℃保存，用酶联法测定样品PGE₂含量,以反映各受试药物对COX-2酶活性的直接抑制作用，每组重复3次。

⑥活力检测，加入CCK8试剂，检测细胞活力状态。

(4)实验结果

①受试药物干预Ana-1细胞产生PGE₂的影响见表6。

表6.受试药物干预Ana-1细胞产生PGE₂的影响(OD/A)

表6中，**与LPS处理组P<0.01，*与LPS组P<0.05，△与LPS处理组P>0.05。

②受试药物对Ana-1细胞的增殖影响见表7。

表7.受试药物对Ana-1细胞的增殖影响(OD值/A)

受试药物浓度(μg/mL)	空白组	受试药物组
			400	3.6313±0.1415	3.5973±0.1544Δ
200	3.3247±0.0567	3.4423±0.0457Δ
			100	3.3033±0.0631	3.0760±0.1621*
50	2.7633±0.1876	2.6300±0.2292Δ
			25	2.8530±0.2390	2.6950±0.2202Δ
12.5	3.1083±0.0116	2.8637±0.0662*
			6.25	3.1890±0.0286	3.0687±0.0262Δ
3.125	3.3310±0.0287	3.1667±0.0150Δ

表7中，*与空白组组P<0.05，△与空白组P>0.05。

表6及表7分别为受试药物干预细胞后对细胞PGE₂及细胞增殖的影响。

由表6可知，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物在12.5～400μg/mL浓度范围内均对小鼠巨噬细胞生成PGE₂产生了抑制作用，随着药物浓度的增大，抑制作用增强。浓度在400μg/mL时抑制作用达到最强(74.40％)。为了探究PGE₂生成量减少是否与细胞的大量死亡有关，此实验模型还对细胞增殖进行了检测。

表7的结果显示，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物在浓度范围内细胞增殖趋势与空白组基本一致，并未出现细胞大量死亡的情况，因此，PGE₂的检测结果是可信的。由此可知，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物对风湿骨病有显著的抗炎疗效。

实施例8

本实施例是在实施例7的基础上，将本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物用于人脐静脉内皮细胞分泌NO的影响(心血管活性)的细胞实验，以了解其活血化瘀的功能。

(1)受试药物：根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中药成药。

(2)受试细胞：人脐静脉内皮细胞。

(3)实验方法

培养人脐静脉内皮细胞，用DMEM培养基对受试药物进行溶解和配置，所述人脐静脉内皮细胞经过不同浓度的受试药物的48～72小时处理(采用八个浓度，一个阴性对照药及一个阳性对照药，三复孔)。然后取细胞上清液，用CCK8试剂盒检测细胞的增殖；用NO试剂盒检测NO的释放。

(4)实验结果

①受试药物对人脐静脉内皮细胞的增殖影响见表8。

表8.用于治疗风湿骨病的中药组合物对人脐静脉内皮细胞的增殖影响(O.D.)

受试药物浓度(μg/mL)	空白组	受试药物组
			800	1.0760±0.0127	0.6460±0.0346**
400	0.8350±0.0099	0.9897±0.0316**
			200	0.7630±0.0976	1.2627±0.0378**
100	0.6845±0.0587	1.2130±0.0650**
			50	0.6960±0.0438	1.2447±0.0391**
25	0.6585±0.0361	1.1933±0.0437**
			12.5	0.7050±0.0566	1.2240±0.0053**
6.25	0.8145±0.0035	1.2073±0.0534**

表8中，**与空白组P<0.01。

由表8可知，受试药物浓度在6.25～400μg/mL范围内对人脐静脉内皮细胞皆有显著的增殖作用，且在浓度为25μg/mL时，增值率达到最大(81.25％)。该结果说明，在受试药物对人脐静脉内皮细胞的干预下，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物能有效地促进人脐静脉内皮细胞发生增殖，在活血化瘀、疏通经络方面具有一定的功效。

②组方干预人脐静脉内皮细胞分泌NO量见表9。

表9.用于治疗风湿骨病的中药组合物干预人脐静脉内皮细胞分泌NO量(uM)

受试药物浓度(μg/mL)	空白组	受试药物组
			800	32.1681±3.6071	31.5203±7.6497
400	27.1104±5.6017	38.9908±12.7529
			200	26.7200±1.6567	34.5020±12.6296
100	27.2778±1.2989	56.9790±29.2177*
			50	24.8234±0.3944	38.7942±17.2594
25	25.2696±1.6567	35.3866±15.0834
			12.5	22.9267±0.2367	22.5754±13.0243
6.25	29.5649±5.3644	49.1481±23.0915

表9中，*与空白组P<0.05。

表9中，受试药物在低浓度时对人脐静脉内皮细胞释放NO产生了促进作用。据文献记载，NO能够抑制血小板聚集与粘附，减少白细胞的聚集，防止血栓的形成；能抑制淋巴细胞增殖，抑制巨噬细胞的氧化产物，抑制肥大细胞的活性；在慢性感染和炎症时，激活巨噬细胞、白细胞产生的NO参与杀灭细菌、病毒、寄生虫、真菌、肿瘤细胞的作用，参与其他一系列的免疫过程。因此，实施例8的实验结果说明，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物不仅具有活血祛瘀、通经活络的功效，还能提高机体的免疫力，达到标本兼治的效果。

实施例9

在实施例4～8细胞实验的基础上，将本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物用于治疗佐剂性关节炎大鼠的动物实验，以观察治疗风湿骨病的中药组合物对佐剂性关节炎大鼠的原发性病变和继发性足跖肿胀的影响。

(1)受试药物：根据本发明的中药组合物制备的用于治疗风湿骨病的中药成药。

(2)受试动物：SD大鼠，SPF级别，6～8周龄，8只雄性。

(3)实验方法

①造模前，称量每只大鼠的体重，并记录，体重在180～220g之间。

②将16只大鼠随机分为4组，分别是空白组(4只)，模型组(4只)，受试药物组(4只)，阳性对照组(4只)。用排水法测定正常状态下大鼠右踝关节以下的容积(mL)，然后于每只大鼠左后足跖皮下注射sigma弗氏完全佐剂0.1mL致炎，分别于致炎后3、6、9、24h同法测量致炎足容积，以致炎前后差值作为肿胀度，观察受试药物对AA大鼠急性炎症的影响。分别于致炎后第6、11、13天观察非致炎足容积的变化。致炎前三天开始以灌胃方式给药，受试药物组给予组方药80mg/kg，阳性对照组给予雷公藤多苷片40mg/kg，空白组与模型组给予生理盐水10mL/kg，每日一次，连续给药至取材的前一天。

(4)实验结果

①受试药物对AA大鼠原发性炎症的影响见表10。

表10.受试药物对AA大鼠原发性炎症的影响

表10中，**与模型组P<0.01，*与模型组P<0.05。

由表10可知，大鼠致炎后3h，模型组、阳性对照组以及受试药物组中各给药动物致炎部位的肿胀度均高于空白组，但是并无统计学意义；致炎后6～24h，模型组大鼠致炎足相比于空白组显著性肿胀，阳性对照组以及受试药物组的致炎部位也发生明显肿胀，但是在9～24h肿胀度显著性低于模型组；受试药物组与阳性对照组的肿胀度并无显著性差异，因此提示：阳性对照药以及受试药物对AA大鼠的原发性足爪肿胀有明显的抑制作用，而且阳性药物并没有比受试药物的疗效更好。

②受试药物对AA大鼠继发性炎症的影响见表11。

表11.受试药物对AA大鼠继发性炎症的影响

表11中，*与模型组P<0.05。

由表11可知，对AA大鼠继发性足肿胀，受试药物组在给药第13天的肿胀度值显著低于模型组，这提示：受试药物组试验所用的剂量水平能够显著抑制AA大鼠继发性足爪肿胀。因此，实施例9的实验结果说明，本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物在试验所用的剂量水平上可以改善大鼠佐剂性关节炎的症状,控制AA大鼠足爪肿胀，降低炎症反应。这同时表明：本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物对大鼠AA原发性病变和继发性病变都有显著的抑制作用，具有防治关节炎的效果。

实施例10

在实施例1-9实验的基础上，取甘草皂苷21g、甘草黄酮7.2g、麻黄生物碱5g、川牛膝皂苷3.7g、马钱子生物碱2.8g，将本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物中的五个活性部位混合均匀，然后进行喷雾干燥，干燥后药物的含水率为3％～5％，干燥后得到治疗风湿骨病的中药药物，按照常规方法加入适量的乳糖、糖粉、甘露醇和糊精，粉碎过筛，以90％乙醇为粘合剂制成软材，20目筛制粒，在40～60℃条件下用烘箱烘干至含水率为2％～4％，然后用10目筛整粒再加入1％的硬脂酸镁混合，压制成片剂(每片剂含活性部位组合药物500mg)。

实施例11

在实施例10实验的基础上，取甘草皂苷21g、甘草黄酮7.2g、麻黄生物碱5g、川牛膝皂苷3.7g、马钱子生物碱2.8g，将本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物中的五个活性部位混合均匀，然后进行喷雾干燥，干燥后药物的含水率为3％～5％，干燥后得到治疗风湿骨病的中药药物，粉碎过100目筛，然后加入甘油加热至60～80℃搅拌制成混悬剂，以明胶压制、冷却、制成软胶囊1000粒。

实施例12

在实施例11实验的基础上，取甘草皂苷21g、甘草黄酮7.2g、麻黄生物碱5g、川牛膝皂苷3.7g、马钱子生物碱2.8g，将本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物中的五个活性部位混合均匀，然后进行喷雾干燥，干燥后药物的含水率为3％～5％，干燥后得到治疗风湿骨病的中药药物，最后按照常规方法加入适量的二氧化硅混合、填充，制作成胶囊剂(每粒胶囊含活性部位组合药物400mg)。

本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物，按“标本兼治”的原则，采用补肾健脾、通络止痛的治疗方案，在甘草皂苷抗炎、抗病毒和保肝解毒及增强免疫功能基础上，辅以甘草黄酮、川牛膝皂苷以及麻黄生物碱和马钱子生物碱，提出了用于治疗风湿骨病的中药组合物。经体外细胞实验证实：本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物具有显著的免疫、抗炎及活血作用：对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞有显著修复作用；对小鼠淋巴细胞及Ana-1巨噬细胞表现出显著的免疫调节作用；对小鼠Ana-1巨噬细胞的PGE₂分泌水平具有明显抑制作用；对人脐静脉内皮细胞NO分泌具有正向调节作用。本发明的用于治疗风湿骨病的中药组合物的药效经体内动物实验结果证实：可显著抑制佐剂性关节炎大鼠的急性足爪肿胀和继发性足肿胀，具有防治佐剂性关节炎的作用，能用于风湿骨关节炎的临床治疗。

Claims (4)

1.用于治疗风湿骨病的中药组方，其特征在于，各活性部位的质量百分比为：

甘草皂苷40%～60%；

甘草黄酮10%～20%；

麻黄生物碱10%～20%；

川牛膝皂苷5%～20%；

马钱子生物碱5%～10%。

2.一种根据权利要求1所述的中药组方制备用于治疗风湿骨病的中成药的方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）制备甘草皂苷

取甘草粉以氨性乙醇超声提取两次；过滤，旋蒸，离心；过HZ-816大孔树脂柱，收集乙醇洗脱液；旋蒸至干，干燥，称重；

所述甘草提取物中甘草皂苷的质量百分比为50%～95%；

（2）制备甘草黄酮

取甘草药材进行粉碎，用乙醇回流提取；离心、浓缩并脱色；先过D101大孔树脂柱，浓缩后过HZ915聚酰胺树脂柱；醇液减压浓缩干燥，称重；

所述甘草提取物中甘草黄酮的质量百分比为20%～80%；

（3）制备麻黄生物碱

称取麻黄药材进行粉碎，用乙醇回流提取；过滤，离心，减压浓缩；旋蒸至干，称重，制得麻黄生物碱；

所述麻黄提取物中麻黄碱的质量百分比为20%～70%；

（4）制备川牛膝皂苷

取川牛膝药材进行粉碎，用乙醇回流提取两次；过滤离心提取，旋蒸至浸膏；用去离子水溶解，过HZ-816大孔树脂柱，重复上样一次，收集乙醇的洗脱液；醇液旋蒸，干燥，称重；

所述川牛膝提取物中川牛膝皂苷的质量百分比为5%～30%；

（5）制备马钱子生物碱

称取马钱子药材进行粉碎，用乙醇回流提取；过滤，离心，减压浓缩；旋蒸至干，称重，制得马钱子生物碱；

所述马钱子提取物中马钱子碱的质量百分比为40%～95%；

（6）配制活性部位质量百分比

将步骤（1）-（5）制备的甘草皂苷、甘草黄酮、麻黄生物碱、川牛膝皂苷和马钱子生物碱按下述活性部位质量百分比进行配制：

甘草皂苷40%～60%；

甘草黄酮10%～20%；

麻黄生物碱10%～20%；

川牛膝皂苷5%～20%；

马钱子生物碱5%～10%；

（7）制作用于治疗风湿骨病的中成药

将步骤（6）配制的活性部位混合物制备成胶囊和片剂。

3.权利要求1所述的中药组方在制备治疗风湿骨病中成药中的应用，其特征在于，所述中成药具有镇痛抗炎、活血祛瘀和补中益气、增强免疫力的作用。

4.权利要求1所述的中药组方在制备治疗风湿骨病中成药中的应用，其特征在于，所述中成药具有治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎以及关节痛的作用。