JP2003518941A - 安定化用ペプチド、ポリペプチド及びそれらを包含する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の目的は、ペプチドであって、それらを包含する抗体を還元性媒質、特に細胞質媒質においても安定化する、上記ペプチド、上記ペプチドの少なくとも１つを包含するポリペプチド、これらのポリペプチドを包含する抗体、並びに本発明のペプチド、ポリペプチド及び抗体をコードするポリヌクレオチドである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、標的分子と特異的に相互作用することができる分子に関する。

【０００２】 （従来技術の状態） 標的と特異的に相互作用することができる分子は当該技術分野において知られ
ている。 特に、抗体は、標的と相互作用することができることが知られている、溶解性
で安定な分子であり、同時に特異的かつ効果的でもある。 したがって、このような分子は、生物学、医療及び農業分野での非常に多くの
用途における標的分子の蓄積及び／又は発現をモジュレートするために用いられ
る。

【０００３】 これらの用途では、大きな安定性を有する抗体を有することが一般に望ましい
。 特に、例えば細胞質のような極度に還元性の環境において相互作用が行なわれ
る又は行なわれうる、特に安定な抗体を有することが必要な用途、例えば、細胞
内区画内で、 - マクロ分子間（例えば、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ型）の
相互作用をブロック又は安定化するために； - 活性部位をカバーし、基質を制限し又は酵素をその活性若しくは不活性な構造
においてブロックし、酵素機能をモジュレートするために； - タンパク質をそれらの正常な細胞区画に取り出す、例えば転写因子を細胞質中
に限定する、又は膜受容体を小胞体中に保留する、ために； - 関連する感染プロセスを妨げるために病原体由来分子と相互作用するように；
- 診断又は治療のためにｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞質分子（例えば、腫瘍遺伝
子産物）と結合するように、 行なわれる用途が存在する。

【０００４】 これらの特徴を示すとして、当該技術分野において知られる抗体の中では、ｓ
ｃＦｖ（Ｆ８）［ｓｃＦｖ（“単鎖可変フラグメント”）フォーマットでの改変
（engineered）抗体］は最も代表的な１つである（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等，
１９９３）。 ｓｃＦｖ（Ｆ８）は実際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの変性及び再生実験において
自由エネルギーの変化（ΔＧ）を測定することによって実証されるように、顕著
な分子安定性を示す（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等，１９９９）。

【０００５】 この分子はまた、 ・フォールディング（folding）における高い効率（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等
，１９９９）； ・細胞質内側における長い半減期（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等，１９９９）； ・抗原を認識して、ＡＭＣＶウイルスの複製を妨害する能力としての細胞質内で
の機能（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等，１９９３）； ・細菌及び植物細胞質における可溶性タンパク質としての高レベルの発現（Ｔａ
ｖｌａｄｏｒａｋｉ等，１９９９）； ・酵母“二ハイブリッド”系で行なわれる実験によって示されるように、ｉｎ
ｖｉｖｏで真核細胞の細胞質においてその抗原と相互作用する能力（Ｖｉｓｉｎ
ｔｉｎ等，１９９９） を有することを特徴とする。

【０００６】 このタンパク質の酸化還元状態に関する研究は、このタンパク質では細胞質内
側においてジスルフィド結合が形成されないことをさらに示している（Ｔａｖｌ
ａｄｏｒａｋｉ等，１９９９）。 ｓｃＦｖ（Ｆ８）はバイオテクノロジー用途、特に上記で指摘した用途のため
に非常に興味深い分子である。 しかし、このようなｓｃＦｖ（Ｆ８）は、ＡＭＣＶウイルスのみと相互作用しう
るので、比較的限定された用途分野しか有しない。

【０００７】 これに反して、その代わりに、ＡＭＣＶ以外の標的と相互作用しうる“ｓｃＦ
ｖ（Ｆ８）様”（機能的見地から）抗体は非常に興味深い。これらは細胞質にお
ける又は、安定性が与えられるならば、他の異なる環境における特異的な標的に
対する多くの用途を可能にする。

【０００８】 （発明の概要） 本発明の目的は、ペプチドであって、それらを包含する抗体に安定性と溶解性
とを与えることができる、上記ペプチドである。 本発明によると、このような目的は、配列番号：１〜配列番号：８の添付の配
列表に報告された配列から成る群から選択される配列を有することと、ｓｃＦｖ
抗体の可変部に包含されて、前記抗体を細胞質媒質中で溶解性及び安定性にする
ことを特徴とするペプチドによって達成される。

【０００９】 前記抗体を安定性及び溶解性にするためには、本明細書ではＨ−ＦＲペプチド
とも呼ばれる、配列、配列番号：１（Ｈ−ＦＲ１）、配列番号：２（Ｈ−ＦＲ２
）、配列番号：３（Ｈ−ＦＲ３）及び配列番号：４（Ｈ−ＦＲ４）を有するペプ
チドが、本明細書ではＨ−ＣＤＲペプチドとも呼ばれる、配列番号：７０（Ｈ−
ＣＤＲ１）、配列番号：７１（Ｈ−ＣＤＲ２）及び配列番号：７２（Ｈ−ＣＤＲ
３）の添付の配列表に報告された配列を有するペプチドに、配列番号：１（Ｈ−
ＦＲ１）−配列番号：７０（Ｈ−ＣＤＲ１）−配列番号：２（Ｈ−ＦＲ２）−配
列番号：７１（Ｈ−ＣＤＲ２）−配列番号：３（Ｈ−ＦＲ３）−配列番号：７２
（Ｈ−ＣＤＲ３）−配列番号：４（Ｈ−ＦＲ４）の順序で共有結合した、前記抗
体の重鎖の可変部（ＶＨ領域）に包含されるべきである。

【００１０】 図１に示した配置によると。この代わりに、Ｌ−ＦＲペプチドと一般的に呼ば
れる、配列、配列番号：５（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号：６（Ｌ−ＦＲ２）、配列
番号：７（Ｈ−ＬＲ３）及び配列番号：８（Ｌ−ＦＲ４）を有するペプチドが、
本明細書ではＬ−ＣＤＲペプチドとも呼ばれる、配列番号：７３（Ｌ−ＣＤＲ１
）、配列番号：７４（Ｌ−ＣＤＲ２）及び配列番号：７４（Ｌ−ＣＤＲ３）の添
付の配列表に報告された配列を有するペプチドに、配列番号：５（Ｌ−ＦＲ１）
−配列番号：７３（Ｌ−ＣＤＲ１）−配列番号：６（Ｌ−ＦＲ２）−配列番号：
７４（Ｌ−ＣＤＲ２）−配列番号：７（Ｌ−ＦＲ３）−配列番号：７５（Ｌ−Ｃ
ＤＲ３）−配列番号：８（Ｌ−ＦＲ４）の順序で共有結合して、図１に示した配
置に従って、前記抗体の軽鎖の可変部（ＶＬ領域）に包含されるべきである。 Ｈ−ＦＲ及びＬ−ＦＲペプチドは本明細書において一般的にＦＲｓ（フレームワ
ーク領域）ペプチドとも呼ばれる。

【００１１】 本発明のＦＲｓペプチドの利点は、これらが驚くべきことに、これらを上記順
序で包含する任意の抗体に溶解性及び安定性を与える能力を示すという事実であ
る。少なくともｓｃＦｖ型の抗体における前記安定化能力は、例えば細胞質のよ
うな還元性媒質においても前記抗体を安定性及び溶解性にすることができる。

【００１２】 Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等，１９９９に記載された方法に従ってこの配置を有
するｓｃＦｖ抗体によって得られた熱力学的安定性は、実際に、ｓｃＦｖ（Ｆ８
）のものとその大きさで同じ程度であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの変性及び再生反
応の自由エネルギーの値（ΔＧ）はｓｃＦｖ（Ｆ８）に関して記録されたものと
その幅で同じ程度である（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等，１９９９）。

【００１３】 特に、ｐＨ７．２では、ΔＧ値は７Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ以上であり、特に７．
８〜１０．５Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅの範囲を包含する値である。 本発明のＦＲｓペプチドを包含するＦｖ及びＤａｂ抗体でも同様な安定性に達
することができる。

【００１４】 いずれにせよ、上記ペプチドを包含する抗体の全てが重鎖又は軽鎖の可変部に
おける適当な包含の効果として安定である。特に、このことは、主鎖としてＩｇ
Ｇ若しくはＩｇＡのような免疫グロブリンの定常部又はＦａｂのような抗体の定
常部を用いた構築体に対して示され、前記構築体の安定性はいずれにせよ改良さ
れる。

【００１５】 本発明のＨ−Ｆｒペプチドの好ましい態様では、Ｈ−ＦＲ１（配列番号：１）
の位置２４のＸａａはＡｌａであり；Ｈ−ＦＲ２（配列番号：２）の位置１２の
ＸａａはＬｅｕであり；Ｈ−ＦＲ３（配列番号：３）の位置２のＸａａはＰｒｏ
であり；Ｈ−ＦＲ３（配列番号：３）の位置３のＸａａはＡｓｐであり；Ｈ−Ｆ
Ｒ３（配列番号：３）の位置１３のＸａａはＡｒｇであり；Ｈ−ＦＲ３（配列番
号：３）の位置１８のＸａａはＡｓｎであり；Ｈ−ＦＲ３（配列番号：３）の位
置２０のＸａａはＬｅｕであり；Ｈ−ＦＲ７（配列番号：７）の位置１２のＸａ
ａはＡｒｇであり；Ｈ−ＦＲ７（配列番号：７）の位置１５のＸａａはＰｈｅで
ある。

【００１６】 本発明によると、これらのペプチドの全ては、例えば組換えＤＮＡまた合成ポ
リペプチドの構築のような当該技術分野で知られた一連の慣用的な手法によって
製造されうる。

【００１７】 可変部にそれらを包含する抗体を安定化するペプチドを得るための適当な方法
は下記工程： - ポリペプチドをモノクローナル抗体から誘導する工程、 - 前記ポリペプチドを階層的（hierarchical）突然変異誘発、ミスのあるＰＣＲ
（error-prone PCR）、ＤＮＡシャフリング（DNA shuffling）又はリボソーム・
ディスプレイのような手法によって突然変異誘発する工程 を含み、本発明の目的に包含される。

【００１８】 或いは、前記ペプチドを例えばそれらをコードするポリヌクレオチドを翻訳す
ることによるような、化学合成によって誘導することができる。

【００１９】 本発明のＨ−ＣＤＲ及びＬ−ＣＤＲペプチドを本明細書ではＣＤＲｓ（相補性
決定領域）ペプチドと呼ぶ。本発明によるＣＤＲｓペプチドは、抗体の結合特異
性を決定する、抗体の領域ＶＨ及びＶＬの部分に対応する。特に、Ｈ−ＣＤＲｓ
ペプチドはＶＨの部分に対応し、Ｌ−ＣＤＲｓペプチドはＶＬの部分に対応し、
これらの部分は抗体の結合特異性を決定する。

【００２０】 ＣＤＲｓペプチドの構造的特徴は、上記配置に従ってペプチドＦＲｓに共有結
合したポリペプチドＶＨ及びＶＬに包含されるときに、これらのＣＤＲｓペプチ
ドがそれらを包含する抗体に、その安定性及び溶解性を変更することなしに特異
性を与えることができるような構造的特徴である。

【００２１】 したがって、それらの配列は、それらが包含される抗体が特異的に結合する抗
原に依存する。

【００２２】 抗体のＶＨ又はＶＬ領域として適したポリペプチドを誘導するために、抗体の
可変部として適し、予め定められた抗原に対して特異的なポリペプチドの誘導方
法であって、 - 重鎖の可変部として、添付の配列表に配列番号：８２として報告された配列を
有するポリペプチドを、及び軽鎖の可変部として、添付の配列表に配列番号：８
３として報告された配列を有するポリペプチドを有する抗体を製造する工程； - 前記抗体を前記抗原に接触させる工程； - 前記抗原に結合する抗体を選択する工程；及び - 前記抗原に結合する抗体の重鎖の可変部のポリペプチド及び／又は軽鎖の可変
部のポリペプチドを単離する工程 を含む前記方法を用いることができる。

【００２３】 本発明の目的であるこの方法は、好ましい態様において、 - 前記抗原に結合する前記抗体の可変部を配列決定する工程 をさらに含む。

【００２４】 本発明の方法の予め定められた抗原は興味深い任意の抗原、特にウイルス性抗
原、好ましいと考えられる、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｅ７又はＮＳ３タンパク質のよう
な、ＨＩＶ、ＨＣＶ及びＨＰＶに関連した抗原でありうる。ウシ血清アルブミン
、リゾチーム、ＡＭＣＶウイルス、“トマト・スポッテッド・ウイルト・ウイル
ス”又は“キウリモザイク病ウイルス”のような、他の抗原が、本発明の好まし
い実施態様において用いられる。

【００２５】 本発明の目的はさらに、一定の抗体の重鎖の可変部（ＶＨ）又は軽鎖の可変部
（ＶＬ）を構成するために適した、上記方法によって得られ得るポリペプチドで
ある。 本発明のポリペプチドに関して、抗体のＶＨ領域を構成するために適したポリ
ペプチドは本明細書ではＶＨポリペプチドとも呼ばれ、抗体のＶＬ領域を構成す
るために適したポリペプチドは本明細書ではＶＬポリペプチドとも呼ばれる。

【００２６】 特に、これに関して、下記ポリペプチド ＶＨ及びＶＬポリペプチドが本発明
の目的である： - 特定のＡＭＣＶ抗体、特にｓｃＦｖ（Ｆ８）のＶＨ及びＶＬ領域をそれぞれ構
成するＶＨ−Ｆ８（配列番号：３１）及びＶＬ−Ｆ８（配列番号：３２）； - リゾチームに対して特異的な抗体のＶＨ及びＶＬ領域をそれぞれ構成するＶＨ
−ＬＹＳ／Ｐ５（配列番号：３３）及びＶＬ−ＬＹＳ／Ｐ５（配列番号：３４）
； - リゾチームに対して特異的な抗体のそれぞれＶＨ及びＶＬ領域を構成するＶＨ
−ＬＹＳ／１１Ｅ（配列番号：３５）及びＶＬ−ＬＹＳ／１１Ｅ（配列番号：３
６）； - ウシ血清アルブミンに対して特異的な抗体のそれぞれＶＨ及びＶＬ領域を構成
するＶＨ−ＢＳＡ／９Ｆ（配列番号：３７）及びＶＬ−ＢＳＡ／９Ｆ（配列番号
：３８）； - “トマト・スポッテッド・ウイルト・ウイルス”に対して特異的な抗体のそれ
ぞれＶＨ及びＶＬ領域を構成するＶＨ−ＴＳＷＶ（ＢＲ０１）／６Ｈ（配列番号
：３９）及びＶＬ−ＴＳＷＶ（ＢＲ０１）／６Ｈ（配列番号：４０）；

【００２７】 - “トマト・スポッテッド・ウイルト・ウイルス”に対して特異的な抗体のそれ
ぞれＶＨ及びＶＬ領域を構成するＶＨ−ＴＳＷＶ（Ｐ１０５）／１Ｃ（配列番号
：４１）及びＶＬ−ＴＳＷＶ（Ｐ１０５）／１Ｃ（配列番号：４２）； - “キウリモザイク病ウイルス”に対して特異的な抗体のそれぞれＶＨ及びＶＬ
領域を構成するＶＨ−ＣＭＶ／４Ｇ（配列番号：４３）及びＶＬ−ＣＭＶ／４Ｇ
（配列番号：４４）； - “キウリモザイク病ウイルス”に対して特異的な抗体のそれぞれＶＨ及びＶＬ
領域を構成するＶＨ−ＣＭＶ／４Ｂ（配列番号：４５）及びＶＬ−ＣＭＶ／４Ｂ
（配列番号：４６）；及び - “キウリモザイク病ウイルス”に対して特異的な抗体のそれぞれＶＨ及びＶＬ
領域を構成するＶＨ−ＣＭＶ／２Ｇ（配列番号：４７）及びＶＬ−ＣＭＶ／２Ｇ
（配列番号：４８）。

【００２８】 本発明のポリペプチドに基づいて、特異的なＣＤＲｓペプチドを誘導すること
ができ、この特異的なＣＤＲｓペプチドはそれらを包含する抗体に結合特異性を
与える。

【００２９】 前記ＣＤＲｓペプチドは、予め定められた抗原に対する結合特異性を抗体に与
えるペプチドを誘導する方法によって誘導されることができ、この方法は下記工
程： - 重鎖の可変部として、配列表に配列番号：８２として報告された配列を有する
ポリペプチドを、及び軽鎖の可変部として、添付の配列表に配列番号：８３とし
て報告された配列を有するポリペプチドを有する抗体を製造する工程； - 前記抗体を前記抗原に接触させる工程； - 前記抗原に結合する抗体を選択する工程； - 前記抗原に結合する抗体の重鎖の可変部のポリペプチド及び／又は軽鎖の可変
部のポリペプチドを単離する工程；及び - 前記ポリペプチドから前記抗体に結合特異性を与える部分を単離する工程 を含む。

【００３０】 好ましい態様では、上記方法はさらに、 - 前記抗原に結合する前記抗体の可変部を配列決定する工程 を含む。 抗原は任意の抗原であることができ、好ましくは上記抗原でありうる。 本発明の目的はさらに、上記方法によって得られ得る全てのペプチドでもある
。

【００３１】 特に、 - それぞれ、配列、配列番号：９（Ｈ−ＣＤＲ１−Ｆ８）、配列番号：１０（Ｈ
−ＣＤＲ２−Ｆ８）、配列番号：１１（Ｈ−ＣＤＲ３−Ｆ８）、配列番号：１２
（Ｌ−ＣＤＲ１−Ｆ８）、配列番号：１３（Ｌ−ＣＤＲ２−Ｆ８）、配列番号：
１４（Ｌ−ＣＤＲ３−Ｆ８）を有して、抗体ｓｃＦｖ（Ｆ８）においてＡＣＭＶ
（アーティチョーク・モットル・クリンクル・ウイルス）に対する結合特異性を
与えるペプチドＣＤＲｓ； - 配列、配列番号：７８（Ｈ−ＣＤＲ１−ＬＹＳ／Ｐ５）、配列番号：７９（Ｈ
−ＣＤＲ２−ＬＹＳ／Ｐ５）、配列番号：１５（Ｈ−ＣＤＲ３−ＬＹＳ／Ｐ５）
、配列番号：８０（Ｌ−ＣＤＲ１−ＬＹＳ／Ｐ５）、配列番号：８１（Ｌ−ＣＤ
Ｒ２−ＬＹＳ／Ｐ５）及び配列番号：１６（Ｌ−ＣＤＲ３−ＬＹＳ／Ｐ５）を有
して、リゾチーム（特に、ニワトリ卵白のリゾチーム）に対する結合特異性を与
えるペプチドＣＤＲｓ が本発明の他の目的である。

【００３２】 本発明の目的はさらに、ＡＣＭＶとは異なる抗原に対する結合特異性を、図７
に示した配列によって、ＶＨ及びＶＬポリペプチド中に本来のＨ−ＣＤＲ３−Ｆ
８及びＬ−ＣＤＲ３−Ｆ８の代わりにそれらを、他のペプチド、Ｆ８のＨ−ＣＤ
Ｒ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ２と共に、及びペプチドＬ−ＣＤＲ１−Ｆ８
の代わりに包含されるＬ−ＣＤＲ１−ＭＵＴ（配列番号：７６）と共に包含する
抗体に与える、上記で定義したようなペプチドＨ−ＣＤＲ３及びＬ−ＣＤＲ３の
全てである。

【００３３】 これらのうちで、特に本発明の目的は、 - リゾチーム（Ｈ−ＣＤＲ３−ＬＹＳ／１１Ｅ、配列番号：１７及びＬ−ＣＤＲ
３−ＬＹＳ／１１Ｅ、配列番号：１８）、 - ウシ血清アルブミン（Ｈ−ＣＤＲ３−ＢＳＡ／９Ｆ、配列番号：１９及びＬ−
ＣＤＲ３−ＢＳＡ／９Ｆ、配列番号：２０）、 - “トマト・スポッテッド・ウイルト・ウイルス”核タンパク質（Ｈ−ＣＤＲ３
−ＴＳＷＶ（ＢＲ０１）／６Ｈ、配列番号：２１及びＬ−ＣＤＲ３−ＴＳＷＶ（
ＢＲ０１）／６Ｈ、配列番号：２２；Ｈ−ＣＤＲ３−ＴＳＷＶ（Ｐ１０５）／１
Ｃ、配列番号：２３及びＬ−ＣＤＲ３−ＴＳＷＶ（Ｐ１０５）／１Ｃ、配列番号
：２４）、及び - “キウリモザイク病ウイルス”（Ｈ−ＣＤＲ３−ＣＭＶ／４Ｇ、配列番号：２
５及びＬ−ＣＤＲ３−ＣＭＶ／４Ｇ、配列番号：２６；また、さらにＨ−ＣＤＲ
３−ＣＭＶ／４Ｂ、配列番号：２７及びＬ−ＣＤＲ３−ＣＭＶ／４Ｂ、配列番号
：２８；及び最後に、Ｈ−ＣＤＲ３−ＣＭＶ／２Ｇ、配列番号：２９及びＬ−Ｃ
ＤＲ３−ＣＭＶ／２Ｇ、配列番号：３０） に対する特異性を与えるペプチド Ｈ−ＣＤＲ３及びＬ−ＣＤＲ３である。

【００３４】 図７におけるＨ−ＣＤＲ３なる用語は、ＶＨ領域におけるペプチド Ｈ−ＣＤ
Ｒ３−ＬＹＳ／１１Ｅ、Ｈ−ＣＤＲ３−ＢＳＡ／９Ｆ、Ｈ−ＣＤＲ３−ＴＳＷＶ
（ＢＲ０１）／６Ｈ、Ｈ−ＣＤＲ３−ＴＳＷＶ（Ｐ１０５）／１Ｃ、Ｈ−ＣＤＲ
−ＣＭＶ／４Ｇ、Ｈ−ＣＤＲ３−ＣＭＶ／４Ｂの位置を示す。Ｌ−ＣＤＲなる用
語は、ＶＨ領域におけるペプチド Ｌ−ＣＤＲ３−ＬＹＳ／１１Ｅ、Ｌ−ＣＤＲ
３−ＢＳＡ／９Ｆ、Ｌ−ＣＤＲ３−ＴＳＷＶ（ＢＲ０１）／６Ｈ、Ｌ−ＣＤＲ３
−ＴＳＷＶ（Ｐ１０５）／１Ｃ、Ｌ−ＣＤＲ−ＣＭＶ／４Ｇ及びＬ−ＣＤＲ３−
ＣＭＶ／４Ｂの位置を示す。

【００３５】 Ｌ−ＣＤＲ１−ＭＵＴ（配列番号：７６）も本発明の目的を構成する。 上記ＣＤＲペプチドの全ては、サンプル中の興味深い分子の検出のために当該
技術分野で知られた手法によって使用することができ；前記使用は本発明の目的
に包含されると見なすべきである。

【００３６】 本発明の他の目的は、本発明の上記ＶＨ及びＶＬポリペプチドの少なくとも１
つを包含する全ての抗体によっても与えられる。 これに関して、ｓｃＦｖ型の改変抗体のみでなく、ＦＡｂ、Ｆｖ、ｄＡｂ型並
びに全ての免疫グロブリン、特にＩｇＧ及びＩｇＡ型の免疫グロブリンの改変抗
体も本発明の目的である。

【００３７】 特に、本発明の目的は、改変抗体ｓｃＦｖ（Ｆ８）（配列番号：４９）及びｓ
ｃＦｖ抗体：ｓｃＦｖ（Ｐ５）（配列番号：５０）、ｓｃＦｖ（ＬＹＳ１１Ｅ）
、ｓｃＦｖ（ＢＳＡ９Ｆ）、ｓｃＦｖ（ＢＲ０１−６Ｈ）、ｓｃＦｖ（Ｐ１０５
−１Ｃ）、ｓｃＦｖ（ＣＭＶ−４Ｇ）、ｓｃＦｖ（ＣＭＶ４Ｂ）及びｓｃＦｖ（
ＣＭＶ−２Ｇ）である。

【００３８】 このようなｓｃＦｖ抗体は、ＶＨ及びＶＬポリペプチドをそれぞれ、ＶＨポリ
ペプチドのカルボキシ末端にそのアミノ末端を介して共有結合した、及びＶＬポ
リペプチドのアミノ末端にそのカルボキシ末端を介して共有結合した、リンカー
と結合させることによって得られ得る（図２のダイアグラムを参照のこと）。

【００３９】 このリンカーは、ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドを結合させるために
適すると当該技術分野において知られた任意のリンカーのいずれかでありうる。
特に、添付の配列表に配列番号：５１として記載された配列を有するリンカーで
ありうる。

【００４０】 上記ペプチド及びポリペプチド又はそれらを含有する抗体の変異体の全ても、
本発明の目的に包含されると見なさなければならない。 これらの変異体は、 - 上記ＦＲ及びＣＤＲペプチド、ＶＨ及びＶＬポリペプチド並びにそれらを包含
する抗体のムテイン（muteine）、 - 上記ＦＲ及びＣＤＲペプチド、ＶＨ及びＶＬポリペプチド並びにそれらを包含
する抗体の少なくとも１つ、又は関連ムテインの少なくとも１つを包含する分子
、 - 上記ＦＲ及びＣＤＲペプチド、ＶＨ及びＶＬポリペプチド並びにそれらを包含
する抗体、又は関連ムテインの少なくとも１つのフラグメント若しくは一部、 - 上記ＦＲ及びＣＤＲペプチド、ＶＨ及びＶＬポリペプチド並びにそれらを包含
する抗体の少なくとも１つ又は関連ムテインの少なくとも１つを包含する分子の
フラグメント若しくは一部、 - 上記ＦＲ及びＣＤＲペプチド、ＶＨ及びＶＬポリペプチド並びにそれらを包含
する抗体の少なくとも１つから本質的に成る全て を包含する。

【００４１】 本発明のペプチド、ポリペプチド及び抗体並びに特に、添付の配列表に報告さ
れた配列を有するもの、の１つから直接的に又は間接的に誘導される各分子は、
- 上記ペプチド／ポリペプチドの変異体の場合には、少なくとも任意の細胞の細
胞質中で機能的及び安定性である抗体に含有されるときに； - 上記抗体の変異体の場合には、少なくとも細胞質区画において機能的及び安定
性である抗体自体であるときに 前記ペプチド、ポリペプチド及び抗体の１つから本質的に成ると見なされなけれ
ばならない。

【００４２】 本出願のために、上記ペプチド／ポリペプチド／抗体のムテインは本来のペプ
チド／ポリペプチド／抗体に類似しており、これは第１から第２の誘導を示唆し
うるようにである。

【００４３】 上記ペプチド／ポリペプチド／抗体の少なくとも１つ又はそのムテイン若しく
はそれを含有するより大きな分子の１つのフラグメントは、本発明のために、本
来のペプチド又はムテインの１つ以上のアミノ酸が切り取られている分子によっ
て与えられる。

【００４４】 これらのペプチド／ポリペプチド／抗体及び／又はムテインの少なくとも１つ
を含有するより大きな分子に関して、これらのペプチド及び／又はムテインとは
異なる分子部分はｓｃＦｖ（Ｆ８）の配列と部分的又は全体的に一致することが
できる。

【００４５】 これらの分子の全ては、例えば組換えＤＮＡまた合成ポリペプチドの構築のよ
うな当該技術分野で知られた一連の慣用的な手法によって製造されうる。

【００４６】 本発明の他の目的は、本発明のペプチド／ポリペプチド又はそれらの変異体を
コードするポリヌクレオチド（ポリデオキシリボヌクレオチド及びポリリボヌク
レオチドの両方）によって与えられる。特に、配列番号：５２（Ｈ−ＦＲ１−Ｆ
８）、配列番号：５３（Ｈ−ＦＲ２−Ｆ８）、配列番号：５４（Ｈ−ＦＲ３−Ｆ
８）、配列番号：５５（Ｈ−ＦＲ４−Ｆ８）、配列番号：５６（Ｌ−ＦＲ１−Ｆ
８）、配列番号：５７（Ｌ−ＦＲ２−Ｆ８）、配列番号：５８（Ｌ−ＦＲ３−Ｆ
８）、配列番号：５９（Ｌ−ＦＲ４−Ｆ８）、配列番号：６０（Ｈ−ＣＤＲ１−
Ｆ８）、配列番号：６１（Ｈ−ＣＤＲ２−Ｆ８）、配列番号：６２（Ｈ−ＣＤＲ
３−Ｆ８）、配列番号：６３（Ｌ−ＣＤＲ１−Ｆ８）、配列番号：６４（Ｌ−Ｃ
ＤＲ２−８）、及び配列番号：６５（Ｌ−ＣＤＲ３−Ｆ８）、配列番号：６６（
ＶＨ−Ｆ８）、及び配列番号：６７（ＶＬ−Ｆ８）、配列番号：７７（Ｌ−ＣＤ
Ｒ１−ＭＵＴ）として報告された配列を有するポリヌクレオチドが本発明の目的
に包含される。

【００４７】 本発明のペプチド／ポリペプチド、特に配列番号：６８（ｓｃＦｖ（Ｆ８））
及び配列番号：６９（ｓｃＦｖ（Ｐ５））として与えられた配列を有するものを
用いて得られた改変抗体をコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される
。

【００４８】 本発明の他の目的は、薬剤として用いるため、特に遺伝子療法、特に細胞内外
の環境における少なくとも１種類の分子の蓄積に関連した全ての病的状態の療法
、に適した薬剤組成物の調製のための本発明のペプチド／ポリペプチド、改変抗
体及び／又はポリヌクレオチドによって与えられる。この場合、特に、感染性、
腫瘍、代謝性及び免疫性（immunitary）（特に、自己免疫性）病状に関する。感
染性病状に関しては、特に、動物（例えば、ヒトにおけるＨＩＶ、特にＨＩＶ−
１、ＨＰＶ、ヘルペスウイルス若しくはＨＣＶウイルスに関連した病状参照）又
は植物（例えば、ＣＭＶ若しくはトマトにおけるＴＳＷＶウイルスに関連した病
状参照）のいずれかにおけるウイルスに関連した感染性病状に関する。

【００４９】 さらに、上記ペプチド、ポリペプチド、抗体及び／又はそれらの変異体の少な
くとも１種類の治療有効量、及び／又は上記ポリヌクレオチドの少なくとも１種
類の治療有効量と、製薬的に適当なビヒクルとを包含する薬剤組成物。

【００５０】 この製薬的に受容されるビヒクル、担体又は補助剤は、上記分子を含有する薬
剤組成物又は物質を製造するために適していると当該技術分野において知られた
、任意のビヒクル、担体又は補助剤でありうる。特に、本発明によると、このよ
うな担体は、タンパク質及び抗体に適切であると当業者によって用いられている
又はいずれにせよ知られている、液体又は固体の担体でありうる。

【００５１】 本発明の目的はさらに、ヒト、動物細胞内外の分子の蓄積に関連した病状の治
療方法であって、 - 上記抗体又はその変異体の治療有効量をそれを必要とする対象に投与する段階
を含む前記方法である。

【００５２】 特に、前記投与は癌若しくはそれに関連した病状を非経口的に治療するために
、又は当業者に知られた投与手法による、受動的免疫療法としての経口投与によ
って行なわれうる。

【００５３】 本発明の目的はさらに、ヒト、動物又は植物細胞の内外の分子の蓄積に関連し
た病状の治療方法であって、 - 本発明の抗体をコードする上記ポリヌクレオチド又はその変異体の治療有効量
をそれを必要とする対象に投与する段階 を含む前記方法である。

【００５４】 前記投与は、トランスフェクションに適したベクターに前記ポリヌクレオチド
を挿入することによって行なわれるべきである。本発明によると、任意のベクタ
ー、特に、ウイルス性ベクターであって、それを必要とする対象を治療するため
に当業者によって現在採用されている上記ベクターがこのために用いられうる。

【００５５】 本発明の他の目的は、ヒト、動物又は植物細胞の内外の分子の蓄積に関連した
病状を治療するための上記抗体及び／又はポリヌクレオチド又はそれらの変異体
の使用である。

【００５６】 これらの病状を診断するためのこれらの上記ペプチド／ポリペプチド／抗体又
はそれらの変異体の使用も、本発明の目的に包含される。 特に、このような分子は、酵素活性を有するタンパク質（即ち、アルカリホス
ファターゼ）又は例えばグリーン蛍光タンパク質のようなリポータータンパク質
をコードする遺伝子に融合して、診断用途に用いることができる。診断用途に適
当であると当該技術分野において知られた、他のリポーター遺伝子又はタンパク
質も同様に使用可能である。

【００５７】 本発明の抗体を用いることができる診断用途の中では、イメージングが特に好
ましい。 本発明の目的は、上記分子を試薬として包含する診断キット、特に、上記ポリ
ヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、抗体及び／又はそれらの変異体の少な
くとも１つを包含する少なくとも１種類の組成物を包含することを特徴とする、
感染性病状のための診断キットである。

【００５８】 新規な分子及び／又は関連する機能を同定するための上記抗体の使用も、本発
明の目的に包含される。 このような同定は、例えば、ゲノミクス及びプロテオミクスに関連した技術分
野において知られた手法によって行なわれうる。

【００５９】 特に、本発明の目的は、感染性病状の療法に用いられる分子を誘導するための
、上記ペプチド／ポリペプチド／抗体又はそれらの変異体の使用、及びこのよう
なペプチド／ポリペプチド／抗体又はそれらの変異体の少なくとも１つを試薬と
して包含する関連キットである。

【００６０】 本発明の他の目的はさらに、上記分子の少なくとも１つと、それらと化学的に
両立するビヒクルとを包含する、実験用途に適した組成物である。 この化学的に両立するビヒクルは、上記分子を含有する薬剤組成物又は物質の
ために適すると当該技術分野において知られた任意のビヒクルでありうる。

【００６１】 特に、本発明によると、このような担体は、タンパク質及び抗体に適当である
当業者によって用いられている又はいずれにせよ知られている液体又は固体担体
でありうる。 添付の図面を用いて、本発明をさらに詳しく説明する。

【００６２】 （発明の詳細な説明） 上述したように、本発明のペプチドはそれらを包含する抗体を還元性環境にお
いてさえも安定性にすることができる。 抗原との相補性を決定する領域（ＣＤＲｓ）とｓｃＦｖ（Ｆ８）抗体のフレー
ムワーク領域（ＦＲｓ）とは、技術水準において知られた基準による配列決定に
よって同定されている。

【００６３】 ｓｃＦｖ（Ｆ８）は、新規な特異性がループ移植（loop grafting）（“合理
的アプローチ”）によって又は突然変異と、レパートリー発生（repertoire gen
eration）による選択（“分子進化”）によってその上に工学的に作り出される
（engineered）足場（scaffold）として用いられてきた。細胞質環境における安
定性及び溶解性の維持と、ＡＭＣＶとは異なる結合特異性の獲得とを実証するた
めに、部位特異的突然変異誘発から誘導された抗体が分析されている。

【００６４】 “合理的アプローチ”では、ＣＤＲｓ及びＦＲｓ領域の両方の残基を、リゾチ
ームを認識するｓｃＦｖ（Ｄ１．３）の残基によって置換したが、“分子進化”
では、ＣＤＲ３領域の残基が行きあたりばったりで置換され、得られたｓｃＦｖ
の結合性をチェックした。これらの実験は、ｓｃＦｖ（Ｆ８）足場がＣＤＲｓ及
びＦＲｓ領域の両方における定められた残基（defined residue）の置換を許容
することを実証した、これらの領域は抗体ｓｃＦｖ（Ｆ８）の安定性保存に関し
て再定義することができる（特に、図３を参照のこと）。

【００６５】 “合理的置換”アプローチ 本発明者はｓｃＦｖ（Ｆ８）アミノ酸を、リゾチームを認識するｓｃＦｖ（Ｄ
１．３）のＣＤＲｓ及びＦＲｓのアミノ酸によって置換した。これらの置換は、
分子“モデリング”によって策定された理論的設計に基づいて各残基を修飾する
合理的方法で行われた。

【００６６】 このアプローチによると、ＶＨ及びＶＬの全てのＣＤＲｓを包含する、広範囲
なアミノ酸修飾が行なわれる。これらの領域を、リゾチーム、ウシ血清アルブミ
ン、トマト・スポッテッド・ウイルト・ウイルスとキウリモザイク病ウイルスの
核タンパク質、又は関心ある任意の他の標的分子でありうる、他の標的分子に結
合する“正常型”の他の抗体（特定の安定性又は細胞質機能性を示さない）の対
応領域によって置換した（“移植”として当該技術分野において知られる手法に
よって）。

【００６７】 図４に示したダイアグラムはｓｃＦｖ（Ｆ８）抗体移植のために適合させた突
然変異誘発方法を要約する。 リゾチーム結合性抗体を与えることを目的とした突然変異誘発に関連する図に
示した特定の場合の突然変異誘発産物の分析により、移植方法の成功を実証した
。実際に、得られたキメラ抗体（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５と名付けられる）は
、分子設計によって予測されたように、リゾチームを特異的に認識することがで
きた。同時に、分子安定性に影響を与えずに広範囲な突然変異をサポートするｓ
ｃＦｖ（Ｆ８）足場の能力が、特にＣＤＲｓレベルにおいて、実証された。実際
に、このアプローチによって得られた新規な結合性分子は、同系のｓｃＦｖ（Ｆ
８）と同様に、細胞の細胞質の還元性環境において溶解性及び機能性であること
を示した。

【００６８】 この結果、新たな抗原認識に関与する領域の正確なフォールディングを可能に
するように修飾された若干のＦＲｓ残基を除いて、ｓｃＦｖ（Ｆ８）のサポート
構造は実質的に変更されなかった。新たな抗原に対する結合能力を与えることが
できる配列を、タンパク質工学によって、それに移植することが可能である“中
心核”として機能することが可能な構造が同定された。 この中心核は発明の概要に述べたＦＲｓペプチドから構成される。

【００６９】 これらの突然変異体分子の性質は、本発明者によって、実施例においてさらに
詳しく説明され、例示される、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の
細胞周辺腔と細胞質の両方における発現の分析手法を用いて実証された。特に、
細菌細胞周辺腔における発現の分析は、移植された抗体が新たな抗原を認識する
能力を評価することを可能にした。その代わり、細菌細胞質における発現は還元
性環境におけるタンパク質溶解性及び機能性を分析することを可能にした。

【００７０】 リゾチーム特異性に関して突然変異誘発された抗体の場合には、総タンパク質
含量に関して標準化された細胞周辺腔抽出物に対して行なわれたＥＬＩＳＡ（酵
素結合イムノソルベント・アッセイ）が、Ｐ１（最低数の置換を有する突然変異
体）を除いて、全ての突然変異誘発産物がリゾチームを認識することができたこ
とを示している。フレームワーク中にｓｃＦｖ（Ｄ１．３）のＣＤＲｓと幾つか
の置換とを提示するＰ３突然変異体は最高の結合活性を示した。Ｐ３で観察され
たリゾチーム認識はｓｃＦｖ（Ｄ１．３）によって示されたものよりもやや低か
った（約１５％低い）。これらのデータを、種々な突然変異誘発産物の匹敵する
発現レベル及び、突然変異誘発産物と本来のｓｃＦｖ（Ｆ８）とｓｃＦｖ（Ｄ１
．３）との匹敵する発現レベルを示したウェスタン・ブロット分析と組み合わせ
た。これは、ＥＬＩＳＡで観察されたシグナルの相違が、異なる発現レベルによ
るのではなく、抗原に対する異なる特異性のみによるものであることを実証する
。

【００７１】 細菌細胞質における発現に関して、総タンパク質に関して標準化した抽出物に
対して実施したＥＬＩＳＡは、最高数のアミノ酸置換を特徴とするＰ５突然変異
体に関して高い活性を示した。各場合にｓｃＦｖ（Ｄ１．３）に関して測定され
た結合活性よりも高いが、乏しい結合活性もＰ３とＰ４に関して記録された。

【００７２】 この場合にも、ウェスタン・ブロット分析は細胞質において発現されたｓｃＦ
ｖ突然変異体の同等の発現を示し、このことは、ＥＬＩＳＡシグナルの相違が異
なるリゾチーム認識能力に起因することを再度立証する。

【００７３】 “分子進化”アプローチ 合理的置換アプローチから得られた徴候に基づいて、ｓｃＦｖ（Ｆ８）から誘
導された新規な分子のライブラリーは構築されている。 ライブラリー構築の始点は、ｓｃＦｖ（ＭＵＴ−ＶＬ１）、ＣＤＲｓにおいて
修飾されたｓｃＦｖ（Ｆ８）抗体の誘導体であった。ＶＬドメインのＣＤＲ１は
短縮されており、モデリング補助設計によって部分的に修飾されていた。さらに
、本来のｓｃＦｖのＶＨドメインの異常に長いＣＤＲ３から９個のアミノ酸を取
り除いた（図５参照）。

【００７４】 ＶＨ及びＶＨドメインの両方のＣＤＲ３の４アミノ酸位置における標的ランダ
ムＰＣＲ−突然変異誘発によって、構造的可変性を導入した。ＶＨの９５と９８
及びＶＬの９１と９４の間（これらを包含する）の残基をランダム化した変性オ
リゴヌクレオチドを用いた。突然変異誘発後に、推定される多様な、５ｘ１０⁷
の異なるファージクローンによるレパートリーが得られた。

【００７５】 このようにして得られた分子のプールを、本来（originally）ｓｃＦｖ（Ｆ８
）によって認識されるＡＭＣＶとは異なる抗原に対する選択のためにライブラリ
ー中のファージに取り付けた。基本構造として単一出発抗体（“単一足場ライブ
ラリー”）を用いて構築された、このライブラリーは、異なる特異性を有し、同
時にｓｃＦｖ（Ｆ８）分子の特有の特徴及び安定性（細胞質溶解性、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでの変性及び再生）を保有する抗体を生じた。これらの結論は、単離した
ｓｃＦｖ分子の塩化グアニジニウム変性及び再生研究によって得られた。大腸菌
細胞質における溶解性及び機能的分子としての同じＳｃＦｖフラグメントの発現
は、これらのタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏ系においても安定であることを立証し
た。

【００７６】 さらに、これらの幾つか（ＳｃＦｖ（ＣＭＶ）４Ｂ及びＳｃＦｖ（ＣＭＶ）４
Ｇ）に関しては、それらが植物の細胞質ゾルにおいても溶解性及び機能性分子と
して発現されることが判明している。ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）感染タバ
コ植物の溶解性フラクションにおけるＳｃＦｖ（ＣＭＶ）４Ｂ又はＳｃＦｖ（Ｃ
ＭＶ）４Ｇ抗体の存在は、これらの分子が、大抵の抗体とは異なって、植物細胞
質においてフォールドされ、安定であることを示す。トランジェニック・トマト
植物において同じ結果が得られて、還元性環境における正確なフォールディング
の可能性を立証した。これらの抗体はＣＭＶ集合及び／又は複製を妨害して、こ
のウイルスに対する改変された耐性を生じた（“プランティボディ仲介耐性（pl
antibody-mediated resistance）”）。

【００７７】 ライブラリーから単離され、特徴付けられた（後記表Ｉ参照）抗体のＶＨ及び
ＶＬドメインのＣＤＲ３配列は、上記位置における残基置換が全体的に行きあた
りばったり（casual）であることを示した。さらに、突然変異したＣＤＲ３にお
けるアミノ酸組成と分布は、アミノ酸の荷電と障害とがこれらのｓｃＦｖフラグ
メントのフォールディング及び溶解性に実質的に影響を与えないことを実証した
。

【００７８】 “単一足場ライブラリー”の構築及び分析から得られたデータは、本来の抗体
ｓｃＦｖ（Ｆ８）と同じ固有の安定性を有する多価抗体のプールを構築するため
にｓｃＦｖ（Ｆ８）の足場を用いることの可能性を示している。このライブラリ
ーは、細胞質における抗体の発現が必要とされるか又は分子安定性という特定の
特徴が重要である用途の全てに対して予定されている。

【００７９】 これらの実験の結果として、新規な結合特異性、特に発明の概要に述べた結合
特異性を有する安定な抗体分子が得られている。

【００８０】 結論 これらの実験アプローチの全ての結果を次の表Ｉに示したダイアグラムに要約
する。 この表では、行きあたりばったり（カジュアル）置換のアプローチによる突然
変異体の誘導の結果として得られた結果及び情報を報告する。非極性残基は二重
アンダーラインによって示し；電荷を有さない極性Ｒ基を有する残基は通常の文
字で示し；酸残基（負電荷）は破線のアンダーラインによって示し；塩基残基（
basic residues）（正電荷）は一重アンダーラインによって示す。

【００８１】

【００８２】 ａはｓｃＦｖ（Ｆ８）に関する場合には残基９５〜残基１００Ｊの位置を示し；
“単一足場ライブラリー”から単離されたクローンに関する場合には残基９５〜
残基９８の位置を示す（Ｋａｂａｔ等，１９９１による命数法）。 ｂは残基９１〜残基９４の位置を示す（Ｋａｂａｔ等，１９９１による命数法）
。

【００８３】 上記結果に基づいて、発明の概要に報告されたペプチド、ポリペプチド、抗体
は同じくそれに報告された方法に従って得られている。

【００８４】 それによって得られた抗体は特に改良された安定性に関して実証されており、
ＦＡＢ、Ｆｖ、ｄＡｂ、ＩｇＧ又はＩｇＡ型の抗体では、ＶＨ及びＶＬ領域にお
ける本発明のペプチドの存在による改良された安定性を示している。

【００８５】 今まで、本発明の一般的な説明を与えてきた。次に、以下の実施例を用いて、
範囲、特徴、利点及び操作方法を明確にするために、さらに詳細な説明を提供す
る。

【００８６】 （例） 例１：ｓｃＦｖ（Ｆ８）の配列決定 単鎖抗体ｓｃＦｖ（Ｆ８）は、植物ウイルスＡＭＣＶ（アンチチョーク・モッ
トル・クリンクル・ウイルス）の外皮タンパク質に対して向けられたＩｇＧ２ｂ
クラスのＭＡｂ（ハイブリドーマから分泌）から得られる。この抗体を得るため
に、Ｂａｌｂ／ｃマウスをこの精製ウイルスによって免疫化した。リンパ球を単
離し、ハイブリドーマを得るための手法は、文献（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ
１９８８）に報告された標準的手法であった。この抗体を発現するハイブリドー
マ系（hybridoma line）は、抗原に対するその高いアフィニティに基づいて、Ｅ
ＬＩＳＡによって選択した。この抗体の重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）の遺伝子を単
離するために、完全なｃＤＮＡを公開プロトコール（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等
，１９９３）に従って選択した。可変部（ＶＨとＶＬ）を可変部に対する普遍的
プライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅して、連続的
に種々な型のベクターにクローン化した（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等，１９９３
）。Ｓａｎｇｅｒ方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９）によってＳｅｑｕｅｎ
ａｓｅキット（ＵＳＢ）のプロトコールに従って配列を決定した。

【００８７】 例２：合理的アプローチにおける部位特異的突然変異誘発の測定 ｓｃＦｖ（Ｆ８）から誘導された、ｓｃＦｖ（Ｆ８）からＶＬのＣＤＲ１のみ
が分化され、アミノ酸組成において部分的に修飾され、４アミノ酸だけ減少した
、抗体をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＭＵＴ−ＶＬ１上で突然変異
誘発が行なわれた。

【００８８】 突然変異誘発のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（“Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔ
ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ”）系を、製造者から
与えられた指示に従って用いた。この系は、突然変異配列を含有する２種類の相
補的プライマーの、鋳型としてｐＭＵＴ−ＶＬ１を用いた酵素伸長（enzymatic
extension）に基づくものである。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を準
備するために、このプラスミドを変性して、対立するＤＮＡ鎖への２つのオリゴ
ヌクレオチドのアニーリングを可能にした。結果は、オリゴヌクレオチドを組み
入れて所望の突然変異を惹起した二重らせんを有するプラスミドである。

【００８９】 プラスミドベクターの精製のために用いた大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅの細菌スト
ックはメチル−トランスフェラーゼ活性を有する、それ故、細菌から抽出された
ＤＮＡプラスミドはメチル化を生じる。これに反して、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラ
ーゼの伸長によって得られた突然変異体プラスミドはメチル化を含有しない。こ
のことは、親プラスミド中のメチル化ＤＮＡの頻繁な特異的配列を認識するエン
ドヌクレアーゼ酵素ＤｐｎＩによる反応産物の消化による突然変異プラスミドの
選択を可能にした。反応産物は大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ中でトランスフェクトさ
れ、この場合、突然変異体プラスミドのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成中に生じた“ニッ
ク”部位が細胞修復系によってリン酸化される。

【００９０】 ２．５μｌの反応バッファー１０ｘ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｎｇ ＤＮ
Ａ鋳型、６２．５ｎｇの各プライマー、１．２５Ｕ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有する２５μｌ中で突然変異誘発反応を行なっ
た。 採用した条件は下記の通りであった：３０秒間の９５℃における変性；３０秒
間の９５℃における変性、１分間の５５℃におけるアニーリング及び７分間の６
８℃における酵素伸長：１８サイクル；この伸長を完成するための６８℃におけ
る５分間。この反応はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ装置を用いて行な
った。

【００９１】 反応産物を５Ｕの制限酵素ＤｐｎＩ（Stratagene）と共に３７℃において１時
間インキュベートして、アガロースゲル上での電気泳動に関して分析した。 突然変異誘発産物をｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にお
いてクローン化し、大腸菌ＸＬｉ−Ｂｌｕｅにおいて、分子生物学の慣用的方法
に従ってトランスフェクトした。突然変異誘発は配列決定によって実証された。

【００９２】 発現ベクターｐＤＮ３３２におけるクローニング（Ｎｅｒｉ等，１９９６）及
び細菌における発現の誘導後に、下記例に述べる手法に従って、突然変異配列に
よって発現されたタンパク質を分析した。

【００９３】 細胞質の還元性環境における抗体の機能性と溶解性をウェスタンブロッティン
グとＥＬＩＳＡを用いて、以下に述べるように、分析した。

【００９４】 例３：大腸菌細胞周辺腔において発現されたタンパク質の抽出 ｓｃＦｖ抗体を発現する大腸菌ＨＢ２１５１の単一コロニーを、１００μｇ／
ｍｌアンピシリンと２％グルコースを含有するＳＢ培地 ５０ｍｌ中に接種し、
３７℃において１６時間増殖させた。この予備培養物（preculture）を新鮮なＳ
Ｂ培地によって１リットルになるまで希釈し、３７℃においてさらに２時間振と
うした（Ａ_600nm＝０．７〜０．８まで）。次に、細胞を室温で３０００ｇにお
いて１５分間遠心分離した。

【００９５】 １００μｇ／ｍｌアンピシリンと１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＳＢ培地 １リ
ットル中に細菌沈降物を再懸濁させ、３０℃において３時間振とうすることによ
って、ｌａｃＺプロモーターの誘導が達成された。次に、培養物を４℃で３００
０ｇにおいて１５分間遠心分離して、細胞を沈降させた。

【００９６】 溶解性タンパク質を細菌細胞周辺腔から浸透圧“ショック”によって抽出した
。ペレット化した細胞を、プロテアーゼ阻害剤（“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ
”，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含有するＴＥＳバッファー溶液（０．５Ｍサッカ
ロース、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１
５ｍｌ中に再懸濁させた。

【００９７】 次に、２２．５ｍｌの１：５希釈ＴＥＳとプロテアーゼ阻害剤を加えた。この
細菌懸濁液を室温において１５分間緩やかに回転させた。次に、抽出物を４℃、
１５０００ｇにおいて２０分間遠心分離して、上澄み中に存在する細胞周辺腔タ
ンパク質を回収した。

【００９８】 例４：大腸菌細胞質におけるタンパク質発現 ａ．細胞内構築体の調製 細菌細胞質中にｓｃＦｖフラグメントを発現させるために、シグナル配列なし
構築体（signal sequenceless constructs）を調製した。ＰｅｌＢ分泌シグナル
を有さないｓｃＦｖ（Ｆ８）をコードする配列（Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ等，１
９９３）をｐＤＮ３３２ファージミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ部位において
クローン化して、ｐＤＮ−Ｆ８ｉｎｔｒａと名付けられたファージミドを得た。
ｓｃＦｖ（Ｆ８）遺伝子に対応する、ｐＤＮ−Ｆ８ｉｎｔｒａのＰｓｔＩ−Ｎｏ
ｔＩ７４４ｂｐフラグメントを、突然変異ｓｃＦｖ遺伝子の消化によって得られ
た類似体ＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ制限フラグメントによって置換することによって、
細胞内発現を予定されたｓｃＦｖ遺伝子の構築体が得られた。ｓｃＦｖ遺伝子の
ジグナル配列なしバージョンを含有するプラスミドを用いて、大腸菌ＨＢ２１５
１を形質転換した。

【００９９】 ｂ．大腸菌における組換えタンパク質の発現 ５０ｍｌの２ｘＴＹ−ＡＧに一晩培養物（overnight culture）をＡ_600nm＝０
．０５において接種した。細胞を３７℃においてＡ_600nm＝０．６まで増殖させ
、次に、これらをペレット化して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと０．４ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＳＢ培地 ５０ｍｌ中に再懸濁させた。３０℃における３
時間の誘導後に、細菌を２．５ｍｌの抽出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ヨードアセトアミド、ｐＨ８）中に回収し
、−２０℃において凍結／解凍し、次に氷上で１５０Ｗａｔｔ出力において３分
間超音波処理した（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０，Ｓｏｎｙｏ）。溶解性フラクシ
ョンを１８０００ｇにおける３０分間の遠心分離によって回収した。

【０１００】 封入体を含有するペレットを電気泳動バッファー（２０％グリセロール、２％
ＳＤＳ、０．０６Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．０２％ブロモフェノ
ールブルー、５％β−メルカプトエタノール）中に再懸濁させ、５分間ボイルし
、短時間の遠心分離後に得られた上澄みをポリアクリルアミドゲル上に負荷した
。

【０１０１】 例５：組換え抗体の分析 ａ．タンパク質濃度の測定 抽出物中に存在する総タンパク質の濃度をＢｉｏＲａｄ試薬と基準としてのウ
シ血清アルブミンとを用いて測定した。 精製後のｓｃＦｖの濃度を２８０ｎｍにおける吸光度に基づいて算出した。電
気泳動分離後に、硝酸銀又はクーマシーブルー染色方法によってタンパク質のバ
ンドを可視化した。

【０１０２】 ｂ．ポリアクリルアミド変性ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上での電気泳動 精製後に得られた抗体フラグメントの分析は、当該技術分野において知られた
プロトコールに従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行なった。２％ＳＤＳの存在下
、１２％の最終濃度でポリアクリルアミド（アクリルアミド／ビアクリルアミド ２９：１）を用いて分離ゲルを調製した。負荷バッファー（最終濃度：１０％
グリセロール、０．０６Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．０２５％ブロ
モフェノールブルー、２％ＳＤＳ及び５％β−メルカプトエタノール）をサンプ
ルに加えて、５分間ボイルした。ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ（ＢｉｏＲａｄ）装置
を１００Ｖｏｌｔにおいて用いて、電気泳動を行なった。

【０１０３】 ｃ．ウェスタン・ブロット分析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分離後に、次に、タンパク質をゲルからニトロセルロ
ース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ Ｓｕｐｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に１００Ｖｏｌ
ｔ、４℃において１時間かけてエレクトロトランスファーした（electro-transf
erred）。 次に、ニトロセルロース膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）と４％
スキムミルクを含有するＰＢＳバッファー（０．２Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄，０．２Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中に４℃において１６時間ブロックし
た。

【０１０４】 それぞれ、３０秒間、５分間、５分間のＰＢＳＴによる３回の洗浄及びＰＢＳ
中での５分間の洗浄後に、２．５μｇ／ｍｌモノクローナル抗体ａｎｔｉ−Ｆｌ
ａｇ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）を含有する、ＰＢＳ、２％スキムミルク（ＰＢＳＭ）
中で膜を室温において２時間インキュベートした。この膜を洗浄して、ビオチニ
ル化抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有するＰＢＳＭ中、室温にお
いて１時間インキュベートし、続いてストレプトアビジン−ホースラディッシュ
・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含むＰＢＳＭ中で
インキュベートすることによって、免疫検出（immunodetection）を実現した。
強化化学発光（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってシグナル発生が
得られた。

【０１０５】 ｄ．ＥＬＩＳＡ試験 Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）を１００μｌ炭酸
塩バッファー（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６）中の抗原（１００μｇ／
ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）と３μｇ／ｍｌ ＡＭＣＶ）によって４℃におい
て１６時間被覆した。 ＰＢＳＴによる３回洗浄とＰＢＳによる１回洗浄後に、プレートをＰＢＳＭに
よって３７℃において２時間ブロックした。次に、各穴を洗浄し、誘導細菌培養
物からの８０μｌ抽出物と、２．５μｇ／ｍｌのａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ２（Ｓ
ｉｇｍａ）含有ＰＢＳＭ ２０μｌとを充填した。これらのプレートを４℃にお
いて１６時間インキュベートして、洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ（ＫＰＬ
）にコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体を含有する各穴に、１００μｌ ＰＢ
ＳＭを加えた。これらのプレートを３７℃において１時間インキュベートして、
洗浄した。シグナル発生のために、ペルオキシダーゼ基質、ＡＢＴＳ（２’２’
−アジンビ（３−エチルベンズチアゾリン）スルホン酸）：Ｈ₂Ｏ₂（ＫＰＬ）の
１：１溶液 １００μｌを用いた。ＥＬＩＳＡリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ
Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ Ｐｌｕｓ）を用いて４０５ｎｍ吸光度においてシグナルを
測定した。

【０１０６】 例６：“単一足場”ライブラリーの構築とクローニング ファージ・ライブラリーを構築するための鋳型として、例２に述べたプラスミ
ドｐＭＵＴ−ＶＬ１を用いた。このライブラリーは、表Ｉに示した位置において
４つのアミノ酸残基をコードする配列のランダム修飾によって、ＶＨ及びＶＬの
ＣＤＲ３中に可変性を導入することによって得られた。このために、転写終止コ
ドンの導入を避けるように、及びＶＨのＣＤＲ３の長さを１３アミノ酸から４ア
ミノ酸に減ずるように設計された、部分的に変性されたオリゴヌクレオチドを合
成した。それぞれ、ＰＣＲによって、プライマーＶＨａとＶＨｆ、及びＶＬａと
ＶＬｆ（図６）を用いて、ＶＨ及びＶＬドメインのコーディング配列を独立的に
増幅させることにより、突然変異誘発を行なった。ＰＣＲの反応は次のように準
備した：５０μｌのインキュベーションバッファー １ｘＡｐｐｌｉｇｅｎｅ（
Ｏｎｃｏｒ）中の３００ｎｇ ｐＭＵＴ−ＶＬ１、０．４ｍＭ センス・プライ
マー（ＶＨａ又はＶＬａ）、０．８μＭ 変性アンチセンス・プライマー（ＶＨ
ｆ又はＶＬｆ）、２５０μＭの各ｄＮＴＰ；２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡ Ａｐｐ
ｌｉｇｅｎｅポリメラーゼ（Ｏｎｃｏｒ）を９４℃において加えた（高温スター
ト）。増幅反応を下記プログラムによって行なった：９４℃、３分間；９４℃、
１分間、６０℃、１分間、７２℃、１分間：２５サイクル；７２℃、２分間。増
幅産物をアガロースゲルから、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を用い、３０ｍｌの３ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．０で溶出して精製した。ｓｃＦｖ抗体のアセンブリを上記と同じ条件下で
のＰＣＲによって、５０μｌの１０反応に細分割する５００μｌの最終量で、１
０μｇの精製ＶＨ及びＶＬフラグメント、０．８μＭセンス・プライマー（ＶＨ
ａ）及び０．８μＭアンチセンス・プライマー（ＶＬｇ）を用いて、行なった。
アセンブルされたｓｃＦｖをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて精製した。ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ消化後に
、アセンブリの全産物をベクターｐＤＮ３３２においてクローン化した。

【０１０７】 ライゲーション産物を大腸菌ＴＧ１菌株中でのエレクトロポレーションによっ
て、下記条件：２００ｏｈｍ、２５ｍＦ、２．５ｋＶｏｌｔを用いてトランスフ
ェクトした。形質転換細胞を２ｘＹＴ＋２％グルコース＋アンピシリン１００ｇ
／ｍｌ上で選択した。Ｎｉｓｓｉｍ等（１９９４）によって述べられたプロトコ
ールに従って、ファージを作製した。

【０１０８】 例７：“単一足場”ライブラリーからの突然変異体の選択と、それらの性質の 分析 ａ．ライブラリーの選択 イムノチューブ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）上への抗原固定をＰＢＳ（８
ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ＋１ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ＋０．１５Ｍ
ＮａＣｌ）中又は炭酸塩バッファー５０ｍＭ（ＣＢ）中で、抗原に依存して１０
〜１００μｇ／ｍｌ間で変化する濃度において実施し、室温又は４℃において１
６時間インキュベートした。

【０１０９】 ４ｍｌのＰＢＳ＋２％ミルク（ＰＢＳ−Ｍ）中の１０¹²〜１０¹³ファージを各
選択サイクルに対して用いて、最初の３０分間は軽度に撹拌しながら、２時間イ
ンキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０による１０〜１５回洗浄と
、ＰＢＳによる１０〜１５回洗浄後に、１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンに
よって溶出を行なって、０．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０によ
って直ちに中和した。次に、このファージ懸濁液を用いて、１０ｍｌの指数関数
的増殖している大腸菌ＴＧ１菌株を感染させる（３７℃、３０分間）。遠心分離
後に、細菌を再懸濁させ、寒天培地：２ｘＹＴ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン
＋１％グルコース（２ｘＹＴ−ＡＧ）を含有するプレートでプレーティングした
（plated）。

【０１１０】 最後のパンニング・サイクル（panning cycle）から得られる単クローンの結
合力に関する特徴付けを、場合によっては、ファージの形態で発現されたクロー
ン及び溶解性ｓｃＦｖとして発現された他のクローンに対して行なった。

【０１１１】 ファージ・クローンの場合には、最後の選択サイクルから得られた９６単コロ
ニーを１５０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧに接種して、３０℃において１６時間撹拌し
ながら増殖させた。次に、１０ｍｌの各予備培養物のアリコートを用いて、１５
０ｍｌの２ｘＹＴ−ＡＧに、指数関数的増殖に達するまで、接種した。約１０¹¹ ｔ．ｕ．（形質転換単位（transforming unit））の“ヘルパー”ファージＶＣ
ＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって感染させ、３７℃において３０分間
インキュベートすることによって、ファージの産生が得られた。感染した細菌を
遠心分離し、１５０ｍｌの２ｘＹＴ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋２５μｇ
／ｍｌカナマイシン中に再懸濁させ、３０℃において１６時間インキュベートし
た。培養物上澄みをＥＬＩＳＡによって分析し、抗原をイムノチューブに対して
用いた条件と同じ条件下で固定した。３７℃において２時間インキュベートした
後に、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたモノクローナル抗体ａｎｔｉ−Ｍ
１３（ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＰＢＳ−Ｍ中で１：５０００で、３７℃において
１時間用いた。“ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質系”（ＫＰＬ）を用いて、比色
反応を発生させた。この予備選択から得られたポジティブ・クローンを、溶解性
ｓｃＦｖｓとしての機能性を立証するために、さらに分析した。この目的のため
に、ポジティブ・クローンからのプラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉ
ｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）によって抽出して、配列決定し、大腸菌ＨＢ２１
５１菌株中にトランスフェクトした。ＴＳＳ（１００ｍｌに対して：１ｇのバク
ト−トリプトン、０．５ｇの酵母抽出物、０．５ｇのＮａＣｌ、１０ｇのＰＥＧ ３３５０、５ｍｌのＤＭＳＯ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ６．５）中に０℃
において再懸濁させることによって、コンピテント細菌を作製した。ＤＮＡプラ
スミド（１〜５ｎｇ）を１ｍｌのコンピテント細胞に加えて、氷上で４５分間イ
ンキュベートした。４２℃において２分間短い衝撃を与えた後に、１ｍｌのＬＢ
を加えて、次に、細胞を３７℃において１時間撹拌してから、ＬＢ＋１００μｇ
／ｌアンピシリン上にプレーティングした。形質転換からの単コロニーの発現の
分析を、以下に述べる方法に従ってＥＬＩＳＡによって行なった。

【０１１２】 溶解性ｓｃＦｖとして選択するために、抗原上での最後のパンニングから溶出
した１０〜１００μｌのファージを用いて、大腸菌ＨＢ２１５１菌株の指数関数
的増殖にある細胞を感染させた。９６単コロニーを１５０μｌの２ｘＹＴ−ＡＧ
に撹拌しながら１６時間接種した。１０μｌの各予備培養物を１５０μｌの２ｘ
ＹＴ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋０．１％グルコース中で希釈し、３７℃
において１時間増殖させた。１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、１６時間インキュベート
することによって、タンパク質発現を誘導した。単培養（single culture）上澄
み［ＰＢＳ−Ｍ中の２．５μｇ／ｍｌのａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナ
ル抗体（Ｓｉｇｍａ）を含有］を３７℃において２時間インキュベートし、ＥＬ
ＩＳＡによって分析した。次に、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたウサギ
抗マウス抗体（ＫＰＬ）を、ＰＢＳ−Ｍ中で１：１００００に希釈して、３７℃
において１時間加えた。

【０１１３】 ｂ．交差反応性の分析 ＥＬＩＳＡスクリーニングから得られたポジティブ・クローンをさらに、選択
された抗原以外の抗原に対するそれらの結合特異性に関して分析した。ＳＢ−Ａ
（３５ｇ／ｌトリプトン＋２０ｇ／ｌ酵母抽出物＋５ｇ／ｌ塩化ナトリウム＋１
００μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．５）中の指数関数的増殖にある大腸菌Ｈ
Ｂ２１５１菌株５０ｍｌを、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって３０℃において３
時間誘導した。遠心分離後に、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ^TM，ＥＤ
ＴＡ−ｆｒｅｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含有するＴＥＳ（０．２Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋０．５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５Ｍサッカロース）５００μ
ｌ中に細胞を再懸濁させ、次に、１：５に希釈したＴＥＳ ７５０μｌを加え、
サンプルを室温において１０分間、オービタル撹拌しながら（in orbital agita
tion）インキュベートした。４℃、１８０００ｇにおける２０分間の遠心分離後
に上澄みとして得られたタンパク質抽出物を種々な抗原と共にＥＬＩＳＡ試験に
用いた。各ＥＬＩＳＡ穴中に、８０μｌの細胞周辺腔抽出物を装填し、次に２０ １ＰＢＳ＋１０％ミルクを装填した。上述したように、抗体ａｎｔｉ−ＦＬＡ
Ｇ Ｍ２を用いて、検出を行なった。

【０１１４】 ｃ．配列決定 ポシティブ選択したクローンからのプラスミドを両ＤＮＡ鎖で、３７３ＤＮＡ
シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、配列決定し
た。

【０１１５】 ｄ．ｓｃＦｖの精製 多量のｓｃＦｖを製造するために、大腸菌ＨＢ２１５１の単コロニーを、１０
０μｇ／ｍｌアンピシリンと２％グルコースを含有するＳＢ（ＳＢ−ＡＧ）１０
０ｍｌ中に接種した。３０℃における１６時間のインキュベーション後に、培養
物を９００ｍｌのＳＢ−ＡＧによって希釈し、さらに１時間撹拌した（Ｏ．Ｄ． ₆₀₀ ＝０．９まで）。遠心分離後に、ペレットをＳＢ−Ａ＋１ｍＭ ＩＰＴＧ中
に再懸濁させ、３０℃において３時間誘導した。遠心分離後に、細菌を１０ｍｌ
のＴＥＳ＋プロテアーゼ阻害剤中に再懸濁させ、次に、１５ｍｌの１：５希釈Ｔ
ＥＳ＋プロテアーゼ阻害剤を加えて、サンプルを室温において１０分間インキュ
ベートした。遠心分離（４℃、１８０００ｇにおいて２０分間）後に、上澄みを
回収し（フラクション１Ａ）、さらにタンパク質を抽出するために、ペレットを
１５ｍｌの５ｍＭ ＭｇＳＯ₄＋プロテアーゼ阻害剤中に再懸濁させた。室温に
おける１０分間のインキュベーション後に、第二の遠心分離工程を行ない、上澄
みをフラクション２Ａとして分離して維持した。フラクション１Ａと２ＡをＤｉ
ａｆｌｏ ＹＭ１０膜（Ａｍｉｃｏｎ）上での限外濾過によって独立的に濃縮し
て、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｃｔｉｇｅｎｅ）上又はＮｉ
−ＮＴＡ（ＱＩＡｇｅｎ）上でのアフィニティ・クロマトグラフィーによって、
製造者によって提案されたプロトコールに従って精製した。２８０ｎｍにおける
吸光度を読み取ることによって定量を行ない、タンパク質純度をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅと、続いてのＡｇＮＯ₃染色によって立証した。

【０１１６】 ｅ．熱力学的安定性の分析 （ｉ）ｓｃＦｖ突然変異体のアンフォールディングとリフォールディング研究 ２０℃においてＰＢＳ中の塩化グアニジニウム（ＧｄｍＣｌ）濃度（０〜４Ｍ
）を高めながら各ｓｃＦｖ突然変異体（３５μｇ／ｍｌ）をインキュベートする
ことによって、平衡アンフォールディング実験を２０℃において行なった。３時
間後に、特有の蛍光発光スペクトルが２０℃において記録された。アンフォール
ディングの可逆性を試験するために、突然変異体（０．７０ｍｇ／ｍｌ）をＰＢ
Ｓ中４Ｍ ＧｄｍＣｌ中で２０℃において３時間アンフォールディングさせた（
unfolded）。減少するＧｄｍＣｌ濃度を含有する、アンフォールディングに用い
た同じバッファーの溶液中での２０℃における２０倍希釈によって、リフォール
ディングが開始した。３時間後に、固有蛍光発光スペクトルが２０℃において記
録された。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ、
２ｍＭ ＤＴＴ及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中でＧｄｍＣｌ濃度（０〜４Ｍ）を高
めながら３５μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ（ＨＥＬ−１１Ｅ）を２０℃において３時間
インキュベートすることによって、還元性条件下での平衡アンフォールディング
実験を行なってから、蛍光発光スペクトルを記録した。リフォールディング実験
のためには、突然変異体（０．７０ｍｇ／ｍｌ）を４Ｍ ＧｄｍＣｌ、１８ｍＭ ＤＴＴ及び１．０ｍＭ ＥＤＴＡ中でｐＨ９．０において３時間アンフォール
ディングさせ、次に、溶液を減少するＧｄｍＣｌ濃度中に２５倍希釈し、３時間
後に、蛍光発光スペクトルを記録した。還元性条件下でリフォールディングさせ
た突然変異体の全ての機能性をＥＬＩＳＡによって試験した（上記参照）。

【０１１７】 （ｉｉ）データ分析 上昇するＧｄｍＣｌ濃度での固有蛍光発光スペクトルの変化を、次式によって
算出される強度平均化発光波長^-λ（Ｒｏｇｅｒ等，１９９３）として定量化し
た：

【０１１８】 式中、λｉとＩｉは発光波長とこの波長におけるその対応する蛍光強度である
。ｓｃＦｖ（Ｆ８）ＧｄｍＣｌ変性の基準及び遷移領域データは、次式によって
二状態（Ｓａｎｔｏｒｏ等，１９８８）直線補外モデル（ＬＥＭ）に適合した：

【０１１９】 式中、ΔＧ_unfoldは一定の変性剤濃度に対するアンフォールディングのための
自由エネルギー変化であり、ΔＧ^H2Oは変性剤の不存在下でのアンフォールディ
ングのための自由エネルギー変化であり、ｍは変性剤の単位濃度当りのΔＧ_{unfo lding} の変化を定量化する勾配表現であり、Ｒは気体定数であり、Ｔは温度であ
り、Ｋ_unfoldingはアンフォールディングの平衡定数である。このモデルは変性
剤濃度の関数としてシグナルを表現する：

【０１２０】 上記式中、Ｙｉは実測されたシグナルであり、Ｙ_NとＹ_Dはそれぞれ天然のタン
パク質と変性タンパク質に対応する基準線の切片であり、ｍ_Nとｍ_Dは対応する基
準線の勾配であり、［Ｘ］ｉはｉ回目の添加後の変性剤の濃度であり、ΔＧ^H2O
は変性剤の不存在下でのアンフォールディングの補外自由エネルギーであり、ｍ _g はΔＧアンフォールディング対［Ｘ］のプロットの勾配であり、Ｒは気体定数
であり、Ｔは温度である。［ＧｄｍＣｌ］_0.5は遷移の中間点における変性剤濃
度であり、式２によって次のように算出される：

【０１２１】 ｆ．アフィニティ測定 ＯＤ_280nm＝１．０の読取りが０．７ｍｇ／ｍｌのｓｃＦｖ濃度に対応するこ
とを仮定して、キウリモザイク病ウイルス（ＣＭＶ）に対するアフィニティ精製
ｓｃＦｖＧ４及びｓｃＦｖＢ４抗体を１００ｇ／ｍｌに濃縮した。表面プラスモ
ン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、結合特性を評価した。リアルタイム相互作用分析を
ＢＩＡｃｏｒｅＸバイオセンサー系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ
ＡＢ）において行なった。

【０１２２】 抗原を固定するためにＡｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇキット（Ｂｉａｃｏｒｅ
ＡＢ）を用いて、約５４００共鳴単位（ＲＵ）の精製ＣＭＶ（７ｍＭ酢酸塩バ
ッファーｐＨ４．０中２００ｎｇ／μｌ）をＣＭ５センサー・チップに結合させ
た。２０μｌ／分の連続流下で動的分析を行なった。各結合測定後に、表面を１
０ｍＭ ＨＣｌによって再生した。速度定数を、単一部位モデルに基づいて、Ｂ
ＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．１ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用い
て測定した。会合速度定数（ｋ_on）は、両ｓｃＦｖｓの６種類の濃度（１２０、
１５０、２５０、３００、４００及び４５０ｎＭ）の範囲にわたるＩｎ（ｄＲ／
ｄｔ）／ｔ対濃度のプロットから算出した。解離速度定数（ｋ_off）は、次式を
用いて、センサーグラム（sensorgram）の解離相から算出した：

【０１２３】 上記式中、Ｒｔ₀は抗体注入の完了後３０秒後の応答である。ｌｎ Ｒｔ／Ｒ
ｔ₀対（ｔ−ｔ₀）の線形プロットは、勾配の測定として、ｋ_offを直接生じる。
総アフィニティ定数（ｋ_D）はｋ_D＝ｋ_off／ｋ_onとして会合及び解離速度定数か
ら算出した。アフィニティ値はｓｃＦｖＧ４では６０ｎＭ、ｓｃＦｖＢ４では１
０ｎＭであった。

【０１２４】 例８：植物細胞質におけるタンパク質の発現 ａ．ＰＶＸ由来ベクターにおけるクローニングと、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎ
ａ植物における発現 本出願人は、ｓｃＦｖｓ構築体を、高い発現レベルを得るために、ジャガイモ
ウイルスＸ（ＰＶＸ）由来ベクター（Ｃｈａｐｍａｎ等，１９９２）を介して植
物に送達した。ｓｃＦｖ遺伝子の上流に認識部位ＣｌａＩ、ＳｐｈＩ及びＸｂａ
Ｉ（ＰＶＸ ＣＳＫ ｂａｃｋ＝ＴＴＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＴＴＧ ＣＡＴ Ｇ
ＣＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ）を
、下流に認識部位ＳａｌＩＩ（ＰＶＸ ｆｌａｇ＝ＴＣＣ ＧＴＣ ＧＡＣ Ｃ
ＴＡ ＣＴＴ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＴＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＴＣ）を
挿入するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、ｓｃＦｖｓをコードす
る配列を増幅した。次に、ｓｃＦｖ遺伝子をＣｌａＩ−ＳａｌＩフラグメントと
して、ｐＧＣ３ベクターの誘導体（Ｃｈａｐｍａｎ等，１９９２）であるベクタ
ーｐＰＶＸ２０１のポリリンカー（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ等，１９９５）中に挿入
した、このベクターはＰＶＸ外皮タンパク質二重サブゲノムプロモーター及びＣ
ａＭＶ（カリフラワー・モザイク病ウイルス）３５Ｓプロモーターの下流に工学
的に作り出された特有のクローニング部位を含有した。このようにして、ＰＶＸ
ｓｃＦｖ（Ｇ４）とＰＶＸｓｃＦｖ（Ｂ４）構築体が得られた。これらのプラス
ミドを接種材料として直接用いることができた。各構築体のＤＮＡ（４０μｇ）
を用いて、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物に３〜４葉期において植物当り２葉
に機械的に接種した。４種類の別々の実験を行ない、少なくとも１０の植物に各
構築体を感染させた。

【０１２５】 接種後通常７〜９日間で症状が上方の葉に現れた。症状が現れた葉を液体窒素
中で凍結させ、続いて、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ^TM，ＥＤＴＡ−
なし，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）のカクテルを含有するＰＢＳバッファー中でホモ
ジナイズした。２０，０００ｘｇにおいて４℃で３０分間遠心分離した後に、上
澄みを用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイと、基準としてのＢＳ
Ａとを用いることによって総溶解性タンパク質（ＴＳＰ）濃度を測定した。モノ
クローナル抗体ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ウェスタン
・ブロットを行なった。イムノブロットは溶解性フラクション中の、ｓｃＦｖＢ
４又はｓｃＦｖＧ４に相当する、３０Ｋ分子の存在を実証した。

【０１２６】 ｂ．トマト形質転換 続いて、ｓｃＦｖＢ４とｓｃＦｖＧ４遺伝子をＰＶＸｓｃＦｖ（Ｇ４）及びＰ
ＶＸｓｃＦｖ（Ｂ４）構築体からＸｂａＩ−Ｓａｌ Ｉフラグメントとして、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下のｐＢＩ由来ベクター中にサブクローン化し
た。次に、これらのプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ菌株ＥＨＡ１０５中に電気穿孔法によってトランスファーして、ミニア
チュアＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ栽培変種、Ｍｉｃｒｏ
−Ｔｏｍ（ミクロトマト）のリーフ・ディスク形質転換に用いた（Ｍｅｉｓｓｎ
ｅｒ等，１９９７）。トランスジェニック・ミクロトマト植物を本質的に既述さ
れているように再生した（ｖａｎ Ｒｏｅｋｅｌ等，１９９３）。

【０１２７】 植物の形質転換は両方の構築体に対する３種類の独立した実験を包含し、一次
形質転換体を機能的発現のために選択した。ｓｃＦｖＢ４及びｓｃＦｖＧ４抗体
に対応するシグナルをＥＬＩＳＡ及びイムノブロッティングの両方によって検出
した。特に、ＥＬＩＳＡ試験は次の手順に従って行なった：ＰＢＳ中の５μｇ／
ｍｌの精製ＣＭＶ抗原をマイクロタイター・プレート上に４℃においてＯ／Ｎ塗
布した。ＰＢＳ中の５％ミルクによってブロックした後に、溶解性植物抽出物（
上述したように得たもの）を４℃においてＯ／Ｎ添加した。モノクローナル抗体
ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２（２．５μｇ／ｍｌ）とウサギ抗マウスペルオキシダ
ーゼ・コンジュゲート抗体（ＫＰＬ）とを用いて、機能的結合を評価した。シグ
ナル発生に関しては、ＡＢＴＳ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（
ＫＰＬ）を用いた。組換え抗体を発現する幾つかのトランスジェニック植物が得
られており、ウイルスによって試験された。

【０１２８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明による抗体のＶＨ及びＶＬポリペプチド中の本発明のペプチドの配置を
示す。

【図２】 ｓｃＦｖ型の抗体における本発明のＶＨ及びＶＬポリペプチドの連結を示す。

【図３】 抗体の安定性という実際の特徴を変えないｓｃＦｖ（Ｆ８）配列の修飾の概略
図を示す。領域（ＦＲｓとＣＤＲｓ）はＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｌｔｄ）によって個別化され、番号付けはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ等，１
９９１）による。 灰色スクウェアに示した残基は、変化させずに維持しなければならない残基で
あり、黒色スクウェアに示した残基は、任意のアミノ酸によって置換されうる残
基であり、白色スクウェアに示した残基は以下のように修飾可能である： - 残基ＶＨ２４は、同等の化学的性質の残基によって置換可能である； - 残基ＶＨ４７は、同等の化学的性質の残基によって置換可能である； - 残基ＶＨ５２は、同等の化学的性質若しくは異なる化学的性質の残基によって
置換可能である、又は欠失によって削除されることができる； - 残基ＶＨ６０は、同等の化学的性質若しくは異なる化学的性質の残基によって
置換可能である； - 残基ＶＨ６１は、同等の化学的性質若しくは異なる化学的性質の残基によって
置換可能である； - 残基ＶＨ７１は、同等の化学的性質の残基によって置換可能である； - 残基ＶＨ７６は、同等の化学的性質の残基によって置換可能である； - 残基ＶＨ７８は、同等の化学的性質の残基によって置換可能である； - 残基ＶＨ１００〜１００Ｇは、同等の化学的性質若しくは異なる化学的性質の
残基によって置換可能である、又は欠失によって削除されることができる； - 残基ＶＬ２７Ｃ〜２９は、同等の化学的性質若しくは異なる化学的性質の残基
によって置換可能である、又は欠失によって削除されることができる； - 残基ＶＬ６８は、同等の化学的性質若しくは異なる化学的性質の残基によって
置換可能である； - 残基ＶＬ７１は、同等の化学的性質若しくは異なる化学的性質の残基によって
置換可能である。

【図４】 抗体ｓｃＦｖ（Ｆ８）のＶＨ及びＶＬポリペプチドの合理的置換によって用い
られた突然変異誘発方法の概略図を示す。ｓｃＦｖ（Ｆ８）配列の実際のアミノ
酸残基は通常の文字で示し、ｓｃＦｖ（Ｄ１．３）（Ｂｈａｔ等，１９９０）配
列のアミノ酸はアンダーライン付き文字で示す。ｓｃＦｖ（Ｆ８）の本来の配列
に対して行なわれた修飾（置換と欠失）がアンダーラインで標識されるように、
中間突然変異誘発の全ての産物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４）及び突然変異誘発
の最後の産物（Ｐ５）について配列を示す。

【図５】 ｓｃＦｖ（Ｆ８）の突然変異体の誘導のための行きあたりばったりの（カジュ
アル）突然変異のアプローチによって、ＶＬのＣＤＲ１に行なわれた修飾を示す
。

【図６】 例に述べたように、“単一足場”ライブラリーの構築のためのプライマーとし
て用いたオリゴヌクレオチドを示す。表現Ｎは任意のヌクレオチドを示し、表現
ＭはｄＡＴＰ又はｄＣＴＰヌクレオチドを示す。

【図７】 抗体のＶＨ及びＶＬポリペプチドにおける本発明のペプチドのレイアウトを示
す、ここでは結合特異性が特にＨ−ＣＤＲ３及びＬ−ＣＤＲ３ペプチドによって
与えられる。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年２月１日（２００２．２．１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００９】 前記抗体を安定性及び溶解性にするためには、本明細書ではＨ−ＦＲペプチド
とも呼ばれる、配列、配列番号：１（Ｈ−ＦＲ１）、配列番号：２（Ｈ−ＦＲ２
）、配列番号：３（Ｈ−ＦＲ３）及び配列番号：４（Ｈ−ＦＲ４）を有するペプ
チドが、本明細書ではＨ−ＣＤＲペプチドとも呼ばれる、配列番号：８８（Ｈ−
ＣＤＲ１）、配列番号：８９（Ｈ−ＣＤＲ２）及び配列番号：９０（Ｈ−ＣＤＲ
３）の添付の配列表に報告された配列を有するペプチドに、配列番号：１（Ｈ−
ＦＲ１）−配列番号：８８（Ｈ−ＣＤＲ１）−配列番号：２（Ｈ−ＦＲ２）−配
列番号：８９（Ｈ−ＣＤＲ２）−配列番号：３（Ｈ−ＦＲ３）−配列番号：９０
（Ｈ−ＣＤＲ３）−配列番号：４（Ｈ−ＦＲ４）の順序で共有結合した、前記抗
体の重鎖の可変部（ＶＨ領域）に包含されるべきである。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００１０】 図１に示した配置によると。この代わりに、Ｌ−ＦＲペプチドと一般的に呼ば
れる、配列、配列番号：５（Ｌ−ＦＲ１）、配列番号：６（Ｌ−ＦＲ２）、配列
番号：７（Ｈ−ＬＲ３）及び配列番号：８（Ｌ−ＦＲ４）を有するペプチドが、
本明細書ではＬ−ＣＤＲペプチドとも呼ばれる、配列番号：９１（Ｌ−ＣＤＲ１
）、配列番号：９２（Ｌ−ＣＤＲ２）及び配列番号：９３（Ｌ−ＣＤＲ３）の添
付の配列表に報告された配列を有するペプチドに、配列番号：５（Ｌ−ＦＲ１）
−配列番号：９１（Ｌ−ＣＤＲ１）−配列番号：６（Ｌ−ＦＲ２）−配列番号：
９２（Ｌ−ＣＤＲ２）−配列番号：７（Ｌ−ＦＲ３）−配列番号：９３（Ｌ−Ｃ
ＤＲ３）−配列番号：８（Ｌ−ＦＲ４）の順序で共有結合して、図１に示した配
置に従って、前記抗体の軽鎖の可変部（ＶＬ領域）に包含されるべきである。 Ｈ−ＦＲ及びＬ−ＦＲペプチドは本明細書において一般的にＦＲｓ（フレームワ
ーク領域）ペプチドとも呼ばれる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００２２】 抗体のＶＨ又はＶＬ領域として適したポリペプチドを誘導するために、抗体の
可変部として適し、予め定められた抗原に対して特異的なポリペプチドの誘導方
法であって、 - 重鎖の可変部として、添付の配列表に配列番号：１０１として報告された配列
を有するポリペプチドを、及び軽鎖の可変部として、添付の配列表に配列番号：
１０２として報告された配列を有するポリペプチドを有する抗体を製造する工程
； - 前記抗体を前記抗原に接触させる工程； - 前記抗原に結合する抗体を選択する工程；及び - 前記抗原に結合する抗体の重鎖の可変部のポリペプチド及び／又は軽鎖の可変
部のポリペプチドを単離する工程 を含む前記方法を用いることができる。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００２９】 前記ＣＤＲｓペプチドは、予め定められた抗原に対する結合特異性を抗体に与
えるペプチドを誘導する方法によって誘導されることができ、この方法は下記工
程： - 重鎖の可変部として、配列表に配列番号：１０１として報告された配列を有す
るポリペプチドを、及び軽鎖の可変部として、添付の配列表に配列番号：１０２
として報告された配列を有するポリペプチドを有する抗体を製造する工程； - 前記抗体を前記抗原に接触させる工程； - 前記抗原に結合する抗体を選択する工程； - 前記抗原に結合する抗体の重鎖の可変部のポリペプチド及び／又は軽鎖の可変
部のポリペプチドを単離する工程；及び - 前記ポリペプチドから前記抗体に結合特異性を与える部分を単離する工程 を含む。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３１】 特に、 - それぞれ、配列、配列番号：９（Ｈ−ＣＤＲ１−Ｆ８）、配列番号：１０（Ｈ
−ＣＤＲ２−Ｆ８）、配列番号：１１（Ｈ−ＣＤＲ３−Ｆ８）、配列番号：１２
（Ｌ−ＣＤＲ１−Ｆ８）、配列番号：１３（Ｌ−ＣＤＲ２−Ｆ８）、配列番号：
１４（Ｌ−ＣＤＲ３−Ｆ８）を有して、抗体ｓｃＦｖ（Ｆ８）においてＡＣＭＶ
（アーティチョーク・モットル・クリンクル・ウイルス）に対する結合特異性を
与えるペプチドＣＤＲｓ； - 配列、配列番号：９７（Ｈ−ＣＤＲ１−ＬＹＳ／Ｐ５）、配列番号：９８（Ｈ
−ＣＤＲ２−ＬＹＳ／Ｐ５）、配列番号：１５（Ｈ−ＣＤＲ３−ＬＹＳ／Ｐ５）
、配列番号：９９（Ｌ−ＣＤＲ１−ＬＹＳ／Ｐ５）、配列番号：１００（Ｌ−Ｃ
ＤＲ２−ＬＹＳ／Ｐ５）及び配列番号：１６（Ｌ−ＣＤＲ３−ＬＹＳ／Ｐ５）を
有して、リゾチーム（特に、ニワトリ卵白のリゾチーム）に対する結合特異性を
与えるペプチドＣＤＲｓ が本発明の他の目的である。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３５】 Ｌ−ＣＤＲ１−ＭＵＴ（配列番号：９４）も本発明の目的を構成する。 上記ＣＤＲペプチドの全ては、サンプル中の興味深い分子の検出のために当該
技術分野で知られた手法によって使用することができ；前記使用は本発明の目的
に包含されると見なすべきである。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４６】 本発明の他の目的は、本発明のペプチド／ポリペプチド又はそれらの変異体を
コードするポリヌクレオチド（ポリデオキシリボヌクレオチド及びポリリボヌク
レオチドの両方）によって与えられる。特に、配列番号：５２（Ｈ−ＦＲ１−Ｆ
８）、配列番号：５４（Ｈ−ＦＲ２−Ｆ８）、配列番号：５６（Ｈ−ＦＲ３−Ｆ
８）、配列番号：５８（Ｈ−ＦＲ４−Ｆ８）、配列番号：６０（Ｌ−ＦＲ１−Ｆ
８）、配列番号：６２（Ｌ−ＦＲ２−Ｆ８）、配列番号：６４（Ｌ−ＦＲ３−Ｆ
８）、配列番号：６６（Ｌ−ＦＲ４−Ｆ８）、配列番号：６８（Ｈ−ＣＤＲ１−
Ｆ８）、配列番号：７０（Ｈ−ＣＤＲ２−Ｆ８）、配列番号：７２（Ｈ−ＣＤＲ
３−Ｆ８）、配列番号：７４（Ｌ−ＣＤＲ１−Ｆ８）、配列番号：７６（Ｌ−Ｃ
ＤＲ２−８）、及び配列番号：７８（Ｌ−ＣＤＲ３−Ｆ８）、配列番号：８０（
ＶＨ−Ｆ８）、及び配列番号：８２（ＶＬ−Ｆ８）、配列番号：９５（Ｌ−ＣＤ
Ｒ１−ＭＵＴ）として報告された配列を有するポリヌクレオチドが本発明の目的
に包含される。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４７】 本発明のペプチド／ポリペプチド、特に配列番号：８４（ｓｃＦｖ（Ｆ８））
及び配列番号：８６（ｓｃＦｖ（Ｐ５））として与えられた配列を有するものを
用いて得られた改変抗体をコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 7/08 14/00 14/00 16/08 16/08 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，Ｓ Ｎ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ( ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，Ｔ Ｍ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，Ｂ Ｂ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ ，ＣＺ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フランコーニ、ロゼッラ イタリア国 アンギッラーラ サバツィ ア、ヴィア アルド モロ、９ (72)発明者 デシデリオ、アンジョーラ イタリア国 アンギッラーラ、サバツィ ア、ヴィア ジー、マッテオッティ、41 (72)発明者 タブラドラキ、パラスケヴィ イタリア国 ローマ、ヴィアーレ ビー、 ブオッツィ、５ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA07 BA43 BA51 CA04 DA01 DA06 EA01 EA04 GA11 HA12 4B064 AG27 CA02 CA11 CA19 CC24 CE12 DA01 DA11 DA20 4C085 AA13 AA14 BB11 CC21 CC23 EE01 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB05 ZB26 ZB31 ZC55 4H045 AA11 BA41 CA01 DA76 EA05 EA20 FA50 FA74 GA26

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１〜配列番号：８の添付の配列表に報告された配
   列から成る群から選択される配列を有すること、及び 抗体の可変部に包含されて、前記抗体を細胞質中に可溶性及び安定性にするこ
   とを特徴とするペプチドであって、 該ペプチドが、抗体の重鎖の可変部に包含される配列番号：１〜配列番号：４
   の配列を有し、配列番号：７０〜配列番号：７２の添付の配列表に報告された配
   列を有するペプチドに、配列番号：１−配列番号：７０−配列番号：２−配列番
   号：７１−配列番号：３−配列番号：７２−配列番号：４の順序で共有結合し、
   及び 該ペプチドが、抗体の軽鎖の可変部に包含される配列番号：５〜配列番号：８
   の配列を有し、配列番号：７３〜配列番号：７５の添付の配列表に報告された配
   列を有するペプチドに、配列番号：５−配列番号：７３−配列番号：６−配列番
   号：７４−配列番号：７−配列番号：７５−配列番号：８の順序で共有結合した
   、 上記ペプチド。
2. 【請求項２】 前記ペプチドが配列番号：１として添付の配列表に報告され
   、位置２４におけるＸａａがＡｌａである配列を有する； 前記ペプチドが配列番号：２として添付の配列表に報告され、位置１２におけ
   るＸａａがＬｅｕである配列を有する； 前記ペプチドが配列番号：３として添付の配列表に報告され、位置２における
   ＸａａがＰｒｏであり、位置３におけるＸａａがＡｓｐであり、位置１３におけ
   るＸａａがＡｒｇであり、位置１８におけるＸａａがＡｓｎである、及び／又は
   位置２０におけるＸａａがＬｅｕである配列を有する；あるいは 前記ペプチドが配列番号：７として添付の配列表に報告され、位置１２におけ
   るＸａａがＡｒｇである、及び／又は位置１５におけるＸａａがＰｈｅである配
   列を有する、請求項１記載のペプチド。
3. 【請求項３】 細胞質中で安定で溶解性及び予め定められた抗原に対して特
   異的である抗体の可変部として適したポリペプチドを誘導する方法であって、 - 重鎖の可変部として、配列表に配列番号：８２として報告された配列を有する
   ポリペプチドを、及び軽鎖の可変部として、添付の配列表に配列番号：８３とし
   て報告された配列を有するポリペプチドを有する抗体を製造する工程； - 前記抗体を前記抗原に接触させる工程； - 前記抗原に結合する抗体を選択する工程；及び - 前記抗原に結合する抗体の重鎖の可変部のポリペプチド及び／又は軽鎖の可変
   部のポリペプチドを単離する工程 を含む、上記方法。
4. 【請求項４】 - 前記抗原に結合する前記抗体の可変部を配列決定する工程
   をさらに含む、請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 前記抗原がＴａｔ、Ｒｅｖ、Ｅ７又はＮＳ３タンパク質であ
   る、請求項３又は４に記載の方法。
6. 【請求項６】 配列番号：８２又は配列番号：８３として添付の配列表に報
   告された配列を有するポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項３記載の方法によって得られ得るポリペプチド。
8. 【請求項８】 前記ポリペプチドが配列番号：３１〜配列番号：４８の添付
   の配列表に報告された配列から成る群から選択された配列を有する、請求項７記
   載のポリペプチド。
9. 【請求項９】 抗体に予め定められた抗原に対する結合特異性を与えるペプ
   チドを誘導する方法であって、 - 重鎖の可変部として、配列表に配列番号：８２として報告された配列を有する
   ポリペプチドを、及び軽鎖の可変部として、添付の配列表に配列番号：８３とし
   て報告された配列を有するポリペプチドを有する抗体を製造する工程； - 前記抗体を前記抗原に接触させる工程； - 前記抗原に結合する抗体を選択する工程； - 前記抗原に結合する抗体の重鎖の可変部のポリペプチド及び／又は軽鎖の可変
   部のポリペプチドを単離する工程；及び - 前記ポリペプチドから前記抗体に結合特異性を与える部分を単離する工程 を含む、上記方法。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の方法によって得られ得るペプチド。
11. 【請求項１１】 添付の配列表に配列番号：９〜配列番号：３０及び配列番
    号：７６として報告された配列から成る群から選択された配列を有するという事
    実を特徴とする、請求項１０記載のペプチド。
12. 【請求項１２】 重鎖の可変部として又は軽鎖の可変部として請求項７記載
    のポリペプチドを包含するという事実を特徴とする抗体。
13. 【請求項１３】 重鎖の可変部として、添付の配列表に配列番号：３１、配
    列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：
    ４１、配列番号：４３、配列番号：４５又は配列番号：４７として報告された配
    列を有するポリペプチドを、及び、軽鎖の可変部として、添付の配列表に配列番
    号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０
    、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６又は配列番号：４８として
    報告された配列を有するポリペプチドを包含するという事実を特徴とする、請求
    項１２記載の抗体。
14. 【請求項１４】 前記抗体がｓｃＦｖ、ＦＡＢ、Ｆｖ、ｄＡｂ、ＩｇＧ又は
    ＩｇＡである、請求項１２記載の抗体。
15. 【請求項１５】 前記抗体がｓｃＦｖ、ＦＡＢ、ＩｇＧ又はＩｇＡである、
    請求項１３記載の抗体。
16. 【請求項１６】 前記抗体がｓｃＦｖであり、重鎖の可変部及び軽鎖の可変
    部として包含されるポリペプチドがリンカーによって結合される、請求項１４又
    は１５に記載の抗体。
17. 【請求項１７】 前記リンカーが添付の配列表中に配列番号：５１として報
    告された配列を有する、請求項１６記載の抗体。
18. 【請求項１８】 請求項１２〜１７のいずれかに記載の抗体を得るための方
    法であって、 - 重鎖の可変部として配列表に配列番号：８２として報告された配列を有するポ
    リペプチド、及び軽鎖の可変部として添付の配列表に配列番号：８３として報告
    された配列を有するポリペプチドを有する抗体を製造する工程； - 前記抗体に前記抗原を接触させる工程；及び - 前記抗原に結合する抗体を選択する工程 を含む、上記方法。
19. 【請求項１９】 請求項１、２、１０及び１１のいずれか一項に記載のペプ
    チドをコードするという事実を特徴とするポリヌクレオチド。
20. 【請求項２０】 請求項６〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコー
    ドするという事実を特徴とするポリヌクレオチド。
21. 【請求項２１】 配列番号：５２〜配列番号：７７の添付の配列表に報告さ
    れた配列から成る群から選択される配列を有する、請求項２０記載のポリヌクレ
    オチド。
22. 【請求項２２】 請求項１２〜請求項１７のいずれか一項に記載の抗体をコ
    ードするという事実を特徴とするポリヌクレオチド。
23. 【請求項２３】 配列番号：６８〜配列番号：６９として添付の配列表に報
    告された配列から成る群から選択される配列を有する、請求項２２記載のポリヌ
    クレオチド。
24. 【請求項２４】 活性剤としての請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の
    抗体の治療有効量を、製薬的に受容される担体、ビヒクル又は補助剤と共に包含
    するという事実を特徴とする薬剤組成物。
25. 【請求項２５】 活性剤としての請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の
    ポリヌクレオチドの治療有効量を、製薬的に受容される担体、ビヒクル又は補助
    剤と共に包含するという事実を特徴とする薬剤組成物。
26. 【請求項２６】 薬剤として用いるための、請求項１２〜１７のいずれかに
    記載の抗体。
27. 【請求項２７】 ヒト又は動物の細胞の内又は外の分子の蓄積に関連した病
    状の治療用薬剤の製造のための、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の抗体
    の使用。
28. 【請求項２８】 薬剤として用いるための、請求項２５〜２９のいずれか一
    項に記載のポリヌクレオチド。
29. 【請求項２９】 ヒト又は動物の細胞の内又は外の分子の蓄積に関連した病
    状の遺伝子治療のための薬剤の製造のための、請求項１９〜２３のいずれか一項
    に記載のポリヌクレオチドの使用。
30. 【請求項３０】 ヒト、動物又は植物の細胞の内又は外の分子の蓄積に関連
    した病状の診断のための、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の抗体、及び
    ／又は請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
31. 【請求項３１】 試薬として、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の抗
    体及び／又は請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む
    診断キット。
32. 【請求項３２】 試薬として、請求項１０又は１１に記載のペプチドを含む
    診断キット。
33. 【請求項３３】 植物細胞の内又は外の分子の蓄積に関連した病状の治療の
    ための、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１９〜
    ２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。