ITRM990803A1 - Peptidi stabilizzanti, polipeptidi ed anticorpi che li comprendono. - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Campo della invenzione
La presente invenzione si riferisce al settore della ricerca di molecole capaci di interagire con specifiche molecole bersaglio per vari scopi applicativi, in particolare molecole capaci di interagire con molecole bersaglio anche all intemo di cellule procariotiche o eucariotiche.
Stato della tecnica
Vi sono molteplici applicazioni in biologia, medicina e agricoltura in cui è necessario, o comunque opportuno, poter disporre di uno strumento che consenta di modulare l’accumulo e/o la espressione di molecole bersaglio.
In particolare sono numerose le applicazioni in cui è opportuno o comunque necessario disporre di un tal strumento, capace di operare finanche all inte o di una cellula, o addirittura all inte o dei singoli specifici compartimenti intracellulari in modo efficace ed al contempo altamente specifico.
Ci si riferisce in tal senso a tutte le applicazioni in cui è necessario ovvero opportuno ad esempio:
• bloccare o stabilizzare interazioni tra macromolecole (del tipo proteinaproteina o proteina-DNA);
• modulare funzioni enzimatiche coprendo il sito attivo, sequestrando il substrato o bloccando un enzima nella sua conformazione attiva o inattiva;
• sottrarre proteine al loro abituale compartimento cellulare, per esempio sequestrando nel citoplasma fattori di trascrizione, oppure trattenendo nel reticolo endoplasmatico recettori di membrana;
• interagire con molecole di origine patogena in modo da interferire con il relativo processo infettivo;
• legare in vivo molecole citoplasmatiche a scopo diagnostico o terapeutico (ad esempio, prodotti di oncogeni).
all’ interno di una cellula.
Per ottenere questi risultati è necessario poter disporre di molecole, massimamente stabili e solubili, che siano al contempo capaci di interagire con molecole bersaglio di varia natura in modo efficace e specifico.
Molecole note in arte che mostrano tali caratteristiche sono gli anticorpi ingegnerizzati del tipo scFv ("single chain variable ffagment"), i quali al pari di altri anticorpi ingegnerizzati (FAb, Fv, dAb) sono stati ricavati da normali anticorpi tramite la tecnologia del DNA ricombinante.
Rispetto agli altri anticorpi ingegnerizzati gli anticorpi scFv si caratterizzano infatti per una maggiore versatilità. Tuttavia anche nel caso degli scFv non sempre è possibile ottenere molecole sufficientemente stabili da consentire una efficace interazione anche in ambienti estremamente riducenti come quello citoplasmatico.
In tal senso particolare rilievo ha uno specifico scFv, TscFv(F8), anticorpo ingegnerizzato per il virus AMCV (Tavladoraki et al 1993).
In esperimenti di denaturazione e rinaturazione in vitro scFv(F8) ha dimostrato infatti una notevole stabilità molecolare come mostrato dalla misurazione di variazioni di energia libera (AG) (Tavladoraki et al. 1999).
Esso si è dimostrato caratterizzarsi inoltre per:
• alta efficienza nel ripiegamento (Tavladoraki et al. 1999);
• lunga emivita all’interno del citoplasma (Tavladoraki et al. 1999);
• funzionalità nel citoplasma, in termini di capacità di riconoscimento deH’antigene e di interferenza con la replicazione del virus AMCV (Tavladoraki et al. 1993);
• alti livelli di espressione come proteina solubile nel citoplasma di batterio e di pianta (Tavladoraki et al. 1999);
• capacità di interagire in vìvo con il suo antigene nel citoplasma di cellule eucariotiche, come dimostrato da esperimenti di “two-hybrid System” in lievito (Visintin et al. 1999).
Tale anticorpo inoltre in seguito a studi sullo stato redox della proteina ha mostrato di non dare luogo alla formazione di ponti disolfuro nel compartimento citoplasmatico (Tavladoraki et al. 1999).
In tal senso scFv(F8) è tra tutti gli scFv una molecola con caratteristiche uniche, di notevole rilievo da un punto di vista applicativo, anche se il suo utilizzo è naturalmente limitato al solo virus AMCV verso cui è specificamente indirizzata la sua azione.
Risulta evidente quindi come esista in arte la esigenza di ricavare anticorpi ingegnerizzati che mostrino Le stesse particolari caratteristiche di stabilità di scFv(F8) (ed in conseguenza tutte le sue proprietà sopra elencate), capaci di interagire però con molecole bersaglio differenti da AMCV.
Ciò consentirebbe di utilizzare tali anticorpi in una serie innumerevole di applicazioni non solo all’interno del citoplasma della cellula, ma, date le caratteristiche di stabilità, in modo estremamente vantaggioso anche in ambienti differenti da quello citoplasmatico.
Non esistono attualmente in arte le informazioni che possano condurre ad un tale risultato. Non sono stati infatti ancora isolati anticorpi con caratteristiche analoghe a quelle di scFv(F8) e dello stesso scFv(F8) non sono ancora note le caratteristiche strutturali (residui aminoacidi in posizioni definite o interazioni tra aminoacidi nell’ambito della molecola) alla base di tali proprietà.
Ad esempio non è nota la sequenza di scFv(F8), non è noto quali regioni al suo interno conferiscano stabilità, e quali conferiscano la specificità per AMCV, né è possibile derivare tali informazioni sulla base di quanto descritto in arte.
Sommario della invenzione
La presente invenzione ha per oggetto peptidi generalmente qui denominati FRs (“Framework Regions”: regioni strutturali). Tali peptidi hanno mostrato sorprendentemente la capacità di conferire stabilità e solubilità in ambiente citoplasmatico ad un anticorpo che li comprenda come parti delle regioni variabili della catena pesante (in seguito denominate anche VH) e della catena leggera (in seguito denominate anche VL), legati covalentemente ai peptidi CDRs (“Complementarity Determing Regions”: regioni determinanti la complementarietà) H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3 aventi le sequenze riportate rispettivamente da SEQ E) NO: 70 a SEQ ID N. 75 nella lista di sequenze annessa, secondo la disposizione mostrata nella figura l.La particolare stabilità termodinamica acquisita da tali anticorpi é definita in termini di variazione di energia libera (AG) durante le fasi di denaturazione/rinaturazione in presenza di un agente denaturante (cloruro di guanidinio) secondo il procedimento descritto in Tavladoraki et al 1999.
Nel caso particolare di anticorpi ingegnerizzati del tipo scFv i peptidi FRs sopra riportati conferiscono alFanticorpo che li contiene, le stesse caratteristiche di stabilità proprie di scFv(F8) con valori di energia libera per la reazione di denaturazione e rinaturazione in vitro, dello stesso ordine di grandezza di quelli registrati per scFv(F8) (Tavladoraki et al. 1999). In particolare a pH 7,2 il AG assume valori maggiori o uguali a 7 Kcal/mole ed in particolare valori compresi tra 7,8 e 10,5 Kcal/mole.
I peptidi della presente invenzione che conferiscono stabilità in quanto parti strutturali della regione VH di un anticorpo sono in particolare i seguenti
- H-FR1 (SEQ ID NO: 1), H-FR2(SEQ ED NO: 2), H-FR3(SEQ ED NO: 3), H-FR4 (SEQ ID NO: 4) generalmente denominati peptidi H-FRs.
I peptidi della presente invenzione che conferiscono stabilità in quanto parti strutturali della regione VL di un anticorpo sono in particolare i seguenti:
- L-FR1(SEQ ID NO: 5), L-FR2 (SEQ ID NO: 6), L-FR3(SEQ ID NO: 7), L-FR4(SEQ ID NO: 8), generalmente denominati L-FRs.
I su menzionati peptidi CDRs della presente invenzione H-CDR1, H-CDR2, H-CDR-3, L-CDR1, L-CDR2, e L-CDR3, corrispondono alle parti delle regioni VH e VL dell’anticorpo che determinano la specificità di legame di detto anticorpo. Le loro caratteristiche strutturali sono tali che, laddove inclusi nei polipeptidi VH eVL legati covalentemente ai peptidi FRs nella disposizione mostrata nella figura 1, conferiscono specificità di legame all’anticorpo che li comprende senza alterarne la stabilità e la solubilità.
In particolare i peptidi CDRs che conferiscono la specificità di legame per il virus ACMV propria dell’anticorpo scFv(F8), aventi rispettivamente le sequenze SEQ ID NO: 9 (H-CDR1-F8), SEQ ID NO: 10 (H-CDR2-F8), SEQ ID NO: 11 (H-CDR3-F8), SEQ ID NO: 12(L-CDR1-F8), SEQ ID NO: 13 (L-CDR2-F8), e SEQ ID NO: 14 (L-CDR3-F8), ed i peptidi CDRs che conferiscono la specificità di legame per il lisozima (in particolare lisozima di albume di uovo di gallina), aventi rispettivamente le sequenze SEQ ID NO: 78 (H-CDR1-LYS/P5), SEQ ID NO: 79 (H-CDR2-LYS/PS), SEQ ID NO: 15 (H-CDR3-LYS/P5), SEQ ID NO: 80 (L-CDR1-LYS/P5), SEQ ID NO: 81 (L-CDR2-LYS/P5), e SEQ ID NO: 16 (L-CDR3-LYS/P5), costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione.
Parimenti sono oggetto della presente invenzione tutti peptidi H-CDR3 ed L-CDR3 che conferiscono specificità di legame per antigeni differenti da AMCV agli anticorpi che li includono nei polipeptidi VH e VL al posto dei peptidi H-CDR3-F8 ed L-CDR3-F8, unitamente agli altri peptidi H-CDR1, H-CDR2 ed L-CDR2 di F8 ed al peptide L-CDR1-MUT (SEQ ID NO:76) incluso al posto del peptide L-CDR1-F8, come mostrato in figura 8.
Tra di essi in particolare i peptidi H-CDR3 ed L-CDR3 che conferiscono specificità per il lisozima (H-CDR3-LYS/11E, SEQ ID NO: 17 ed L-CDR3-LYS/11E, SEQ ID NO: 18), per la sieroalbumina bovina (H-CDR3-BSA/9F, SEQ ID NO: 19 ed L-CDR3-BSA/9F, SEQ ID NO: 20), per la nucleoproteina del “tornato spotted wilt virus” (H-CDR3-TS WV (BRO 1 )/6H, SEQ ID NO: 21 ed L-CDR3-TSWV(BR01)/6H, SEQ ID NO: 22; così come H-CDR3-TSWV(P105)/1C, SEQ ED NO: 23 ed L-CDR3 -TS WV(P 105 )/ 1 C, SEQ ID NO: 24), e per il “cucumber mosaic virus” (H-CDR3-CMV/4G, SEQ ID NO: 25 ed L-CDR3-CMV/4G, SEQ ID NO: 26; ma anche H-CDR3-CMV/4B, SEQ ED NO: 27 ed L-CDR3-CMV/4B, SEQ ID NO: 28; ed infine H-CDR3 -CMV/2G, SEQ ED NO: 29 ed L-CDR3-CMV/2G, SEQ ED NO: 30). Lo stesso peptide L-CDR1-MUT costituisce oggetto della presente invenzione.
Oggetto della presente invenzione sono anche tutti i polipeptidi atti a costituire la regione variabile della catena pesante (VH) o la regione variabile della catena leggera (VL) di un anticorpo caratterizzati dal fatto di includere almeno uno dei peptidi secondo la rivendicazione 1, e dal fatto che strutturalmente connessi tra loro risultano in un anticorpo stabile e solubile. Al riguardo i polipeptidi atti a costituire la regione VH di un anticorpo sono denominati anche polipeptidi VH, mentre i polipeptidi atti a costituire la regione VL di un anticorpo sono denominati anche polipeptidi VL.
In particolare in tal senso costituiscono oggetto della presente invenzione i polipeptidi:
- VH-F8 (SEQ ID NO: 31) e VL-F8 (SEQ ID NO: 32) che costituiscono le regioni VH e VL rispettivamente, di anticorpi specifici per l’AMCV ed in particolare di scFv(F8);
- VH-LYS/P5 (SEQ ID NO: 33) e VL-LYS/P5 (SEQ ID NO: 34) che costituiscono le regioni VH e VL rispettivamente, di anticorpi specifici per il lisozima;
- VH-LYS/11E (SEQ ID NO: 35) e VL-LYS/1 1E (SEQ ID NO: 36), che costituiscono le regioni VH e VL rispettivamente di anticorpi specifici per il lisozima;
- VH-BSA/9F (SEQ ID NO: 37) e VL-BSA/9F (SEQ ID NO:38) che costituiscono le regioni VH e VL rispettivamente di anticorpi specifici per la sieroalbumina bovina;
- VH-T S WV (BRO 1 )/6H (SEQ ID NO: 39) e VL-TSWV(BR01)/6H(SEQ ID NO: 40), che costituiscono le regioni VH e VL rispettivamente di anticorpi specifici per il “tornato spotted wilt virus”;
- VH-TSWV(P105)/1C (SEQ ID NO: 41) e VL-TSWV(P1 05)/ 1C (SEQ ID NO: 42) che costituiscono le regioni VH e VL rispettivamente di anticorpi specifici per il “tornato spotted wilt virus”;
_ - VH-CMV/4G (SEQ ID NO: 43) e VL-CMV/4G(SEQ ID NO: 44), che costituiscono le regioni VH e VL rispettivamente di anticorpi specifici per il “cucumber mosaic virus”;
- VH-CMV/4B (SEQ ID NO: 45) e VL-CMV/4B(SEQ ID NO: 46), che costituiscono le regioni VH e VL rispettivamente di anticorpi specifici per il “cucumber mosaic virus”; e
- VH-CMV/2G (SEQ Π) NO; 47) e VL-CMV/2G(SEQ ID NO; 48), che costituiscono le regioni VH e VL rispettivamente di anticorpi specifici per il “cucumber mosaic virus”.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è dato anche da tutti gli anticorpi che comprendono almeno uno dei polipeptidi VH e VL della presente invenzione sopra menzionati.
In tal senso devono intendersi ricompresi non solo anticorpi ingegnerizzati del tipo scFv, ma anche anticorpi ingegnerizzati del tipo FAb, Fv, dAb oltre che tutte le immunoglobuline, in particolare quelle del tipo IgG ed IgA.
In particolare costituiscono oggetto della presente invenzione l’anticorpo ingegnerizzato scFv(F8) (SEQ ID NO: 49) e gli anticoipi del tipo scFv: scFv(P5) (SEQ ID NO: 50), scFv(LYSHE), scFv(BSA9F), scFv(BR01-6H), scFv(P105-lC), scFv(CMV-4G),scFv(CMV4B), ed scFv(CMV-2G), i quali risultano dalla connessione dei rispettivi polipeptidi VH e VL con un Iinker legato covalentemente con la estremità carbossiterminale del polipeptide VH mediante la sua estremità ammino-terminale, e con la estremità ammino-terminale del polipeptide VL mediante la sua estremità carbossi-terminale (vedi schema riportato nella figura 2). Tale Iinker può essere uno qualsiasi dei Iinker noti in arte, ed in particolare il Iinker avente la sequenza riportata come SEQ ID NO: 51 nella lista di sequenze annessa.
Sulla base di tutte le sequenze riportate nella lista annessa, devono comunque considerarsi comprese nell’oggetto della presente invenzione anche tutte le varianti dei peptidi e polipeptidi sopra menzionati o degli anticorpi che li contengono.
Tali varianti includono muteine dei peptidi/polipeptidi/anticorpi elencati, molecole comprendenti almeno uno dei peptidi/polipeptidi/anticorpi elencati e/o loro muteine, frammenti o parti dei peptidi/polipeptidi elencati o delle relative muteine, frammenti o parti di molecole che comprendono tali peptidi/polipeptidi/anticorpi e/o tali muteine, tutte queste in quanto possano essere considerate consistenti essenzialmente in almeno uno dei peptidi/polipeptidi/anticorpi elencati.
Deve considerarsi consistente essenzialmente in almeno uno dei peptidi/polipeptidi/anticorpi elencati nella lista di sequenze annessa ogni molecola derivata direttamente o indirettamente da almeno uno di essi la quale:
- nel caso delle varianti dei peptidi/polipeptidi sopra elencati sia contenuta in anticorpi funzionali e stabili almeno in ambiente citoplasmatico;
- nel caso delle varianti degli anticorpi sopra elencati costituisca essa stessa un anticorpo funzionale e stabile almeno in ambiente citoplasmatico.
Ai fini della presente domanda una muteina dei peptidi/polipeptidi/anticorpi elencati è un polipeptide analogo ad almeno uno dei peptidi/polipeptidi/anticorpi elencati, intendendosi per analogo un peptide/polipetide/anticorpo somigliante al peptide/polipetide/anticorpo di partenza in modo da suggerire una derivazione del secondo dal primo.
Un frammento di almeno un peptide/polipetide/anticorpo elencato o di una sua muteina o di una molecola più ampia che li comprende, è dato ai fini della presente invenzione da una molecola in cui uno o più amminoacidi del peptide o muteina di partenza sono stati troncati.
Per quanto riguarda la molecola più ampia che comprende almeno uno di tali peptidi/polipeptidi/anticorpi e/o le relative muteine, la porzione di molecola differente da tali peptidi do muteine può essere coincidente in tutto o in parte con la sequenza di scFv(F8).
Tutti questi peptidi possono essere prodotti tramite una serie di tecniche convenzionali note in arte quali ad esempio tecniche del DNA ricombinante ma anche costruzioni di polipeptidi sintetici.
Ulteriore oggetto della presente invenzione è dato da polinucleotidi (sia polideossiribonucleotidi che poliribonucleotidi) codificanti per i peptidi/polipeptidi della presente invenzione o per le loro varianti. In particolare i polinucleotidi aventi le sequenze riportate come SEQ ID NO: 52 (H-FR1-F8), SEQ ID NO: 53 (H-FR2-F8) , SEQ ID NO: 54 (H-FR3-F8), SEQ ID NO: 55 (H-FR4-F8), SEQ ID NO: 56 (L-FR1-F8), SEQ ID NO: 57 (L-FR2-F8), SEQ ID NO: 58 (L-FR3-F8), SEQ ID NO: 59 (L-FR4-F8), SEQ ID NO: 60 (H-CDR1-F8), SEQ Π) NO: 61 (H-CDR2-F8), SEQ ID NO: 62 (H-CDR3-F8), SEQ ID NO: 63 (L-CDR1-F8), SEQ ID NO: 64 (L-CDR2-8), e SEQ ID NO: 65 (L-CDR3-F8), SEQ ID NO: 66 (VH-F8), e SEQ ID NO: 67 (VL-F8), SEQ ID NO: 77 (L-CDR1-MUT).
Devono considerarsi compresi anche i polinucleotidi codificanti per gli anticorpi ingegnerizzati ottenuti utilizzando i peptidi/polipeptidi della presente invenzione ed in particolare quelli aventi le sequenze riportate come SEQ ED NO: 68 (scFv(F8) e SEQ ID NO: 69 (scFv(P5)).
Ulteriore oggetto della presente invenzione è dato dai peptidi/polipeptidi, anticorpi ingegnerizzati e/o polinucleotidi della presente invenzione, per uso come medicamento ed in particolare per la preparazione di farmaci utilizzabili in terapia genica, in particolare per la terapia di tutti gli stati patologici associati all’accumulo di almeno una molecola in ambienti intra ovvero extra cellulari. Ci si riferisce in particolare a patologie infettive tumorali, metaboliche ed immunitarie (in particolare quelle autoimmunitarie). Per quanto riguarda le patologie infettive in particolar modo quelle associate a virus, sia in animali (vedi ad esempio patologie associate al virus HIV o HCV in uomo), che in vegetali (vedi ad esempio le patologie associate ai virus CMV o TSWV in pomodoro).
Compreso nell’oggetto della presente invenzione è anche l’uso di tali molecole su menzionate per la diagnosi di tali patologie.
Inoltre devono considerarsi oggetto della presente invenzione: tutti gli usi delle molecole sopra menzionate, compreso l’uso per la derivazione di molecole da utilizzarsi nella terapia di patologie infettive; metodi diagnostici per patologie infettive caratterizzati dal fatto di comprendere in almeno una delle operazioni l’utilizzo di almeno un peptide, almeno un polipeptide, almeno un anticorpo, almeno una variante e/o almeno un polinucleotide tra quelli sopra descritti; un kit diagnostico per patologie infettive caratterizzato dal fatto di comprendere almeno una composizione comprendente almeno un polinucleotide, peptide, polipeptide anticorpo ingegnerizzato e/o variante tra quelle su menzionate.
Infine costituiscono oggetto della presente invenzione anche le composizioni farmaceutiche che comprendono una quantità terapeuticamente efficace di almeno un peptide, polipeptide, anticorpo e/o di una loro variante, do di un polinucleotide tra tutti quelli menzionati in precedenza ed un veicolo farmaceuticamente compatibile; tutte le composizioni di materia che comprendono almeno una della molecola sopra menzionate ed un veicolo ad essa chimicamente compatibile.
Tale veicolo farmaceuticamente e/o chimicamente compatibile può essere un qualunque veicolo noto in arte in quanto utilizzabile per composizioni farmaceutiche o di materia contenenti le molecole sopra menzionate.
La invenzione verrà meglio descritta con l’ausilio delle figure annesse.
Descrizione delle figure
La figura 1 mostra la disposizione dei peptidi della presente invenzione nei polipeptidi VH e VL di un qualsiasi anticorpo.
La figura 2 mostra la connessione dei polipeptidi VH eVL della presente invenzione in anticorpi del tipo scFv.
La figura 3 mostra lo schema riassuntivo delle modificazioni della sequenza di scFv(F8) che non alterano le caratteristiche di stabilità proprie deH’anticorpo. Le regioni (FRs e CDRs) sono individuate secondo AbM (Oxford Molecular Ltd) e la numerazione è secondo Kabat (Kabat et al 1991).
I residui riportati in caselle dal colore grigio sono i residui che devono restare immutati, i residui riportati in caselle dal colore nero sono i residui sostituibili con qualsiasi amminoacido, i residui riportati in caselle bianche sono modificabili come segue:
- il residuo VH 24 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica;
- il residuo VH 47 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica;
- il residuo VH 52 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica o di natura chimica diversa, ovvero è eliminabile per delezione;
- il residuo VH 60 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica o di natura chimica diversa;
- il residuo VH 61 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica o di natura chimica diversa;
- il residuo VH 71 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica;
- il residuo VH 76 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica;
- il residuo VH 78 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica;
- i residui VH 100-100G sono sostituibili con residui di equivalente natura chimica o di natura chimica diversa, ovvero sono eliminabili per delezione;
- i residui VL 27C-29 sono sostituibile con residui di equivalente natura chimica o di natura chimica diversa ovvero sono eliminabili per delezione;
- il residuo VL 68 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica o di natura chimica diversa;
- il residuo VL 71 è sostituibile con residui di equivalente natura chimica o di natura chimica diversa.
La figura 4 mostra uno schema riassuntivo della strategia di mutagenesi adottata tramite sostituzioni razionali dei polipeptidi VH e VL dell’anticorpo scFv(F8). I residui aminoacidici propri della sequenza di scFv(F8) sono riportati in caratteri normali, gli aminoacidi della sequenza di scFv(D1.3) (Bhat et al. 1990) sono riportati in caratteri sottolineati. Sono riportate le sequenze di tutti i prodotti di mutagenesi intermedia (PI, P2, P3 e P4) e del prodotto ultimo di mutagenesi (P5), in modo che le modifiche (sostituzioni e delezioni) apportate alla sequenza originaria di scFv(F8) siano contrassegnate da sottolineatura.
La figura 5 mostra la modifica apportata alla CDR1 della VL secondo l’approccio delle mutazioni casuali per la derivazione di mutanti di scFv(F8).
La figura 6 riassume i risultati e le informazioni ottenute in esito alla derivazione di mutanti mediante l’approccio delle sostituzioni casuali. I residui non polari sono riportati con caratteri doppiamente sottolineati, i residui con gruppi R polari privi di carica sono riportati in caratteri normali; i residui acidi (carica negativa) sono riportati con sottolineatura tratteggiata ed i residui basici (carica positiva) sono riportati con sottolineatura semplice.
La figura 7 mostra gli oligonucleotidi utilizzati come inneschi per la costruzione della libreria “monoscaffold” come descritta negli esempi. Il termine N indica qualsiasi nucleotide; il termine M indica il nucleotide dATP o dCTP.
La figura 8 mostra la disposizione dei peptidi della presente invenzione nei polipeptidi VH e VL di anticorpi in cui la specificità di legame è data in particolare dai peptidi H-CDR3 ed L-CDR3. In tal senso H-CDR3 ed L-CDR3 possono essere in particolare H-CDR3-LYS/11E ed L-CDR3-LYS/11E, rispettivamente in anticorpi specifici per il lisozima; H-CDR3-BSA/9F ed L-CDR3-BSA/9F, rispettivamente in anticorpi specifici per la si eroalbumina, H-CDR3-TSWV(BR01)/6H ed L-CDR3-TSWV(BR01)/6H rispettivamente o anche H-CDR3-TSWV(P105)/1C ed L-CDR3-TSWV(P105)/1C rispettivamente in anticorpi specifici per la nucleoproteina del “tornato spotted wilt virus”; e H-CDR3-CMV/4G ed L-CDR3-CMV/4G rispettivamente, oppure H-CDR3-CMV/4B ed L-CDR3-CMV/4B rispettivamente, ovvero H-CDR3-CMV/2G ed L-CDR3-CMV/2G rispettivamente, in anticorpi specifici per il “cucumber mosaic virus”.
descrizione dettagliata della invenzione
La identificazione delle molecole oggetto della presente invenzione è stata realizzata secondo la seguente strategia.
E’ stata innanzitutto ricavata la sequenza di scFv(F8) secondo le modalità descritte nell’ esempio 1.
Sulla base dei dati relativi alla sequenza sopra riportati, gli inventori hanno quindi inizialmente individuato le regioni CDRs determinanti la complementarietà con l’antigene rispetto alle regioni strutturali denominate FRs che non prendono contatto con l antigene secondo l’applicazione di criteri noti in arte.
In seguito sono stati condotti esperimenti di mutagenesi sito-diretta delle regioni FRs e CDRs come inizialmente individuate sia in maniera casuale che mirata, al fine di verificare se ed in quali condizioni fosse possibile mutare alcuni o tutti i residui di tali regioni per ottenere un costrutto con le stesse caratteristiche di stabilità e solubilità in ambiente citoplasmatico di scFvF8 ma con una specificità di legame per antigeni differenti da ACMV.
Tali esperimenti sono stati condotti mediante due approcci: un primo approccio detto “delie sostituzioni razionali” in cui i residui di entrambe le regioni (CDRs ed FRs) sono stati sostituiti con residui dell’ scFv(D 1.3) che riconosce il lisozima; un secondo approccio detto “delle sostituzioni casuali” con il quale i residui delle regioni CDR3 sono stati sostituiti casualmente e le proprietà dell’scFv risultante sono state verificate.
In esito a tali esperimenti non solo per ciascun residuo sono state individuate le possibili sostituzioni tollerate, ma le stesse regioni FRs e CDRs sono state ridisegnate e ridefinite in funzione della conservazione della stabilità dell’ anticorpo scFvF8. (vedi in particolare la figura 3)
Approccio delle sostituzioni razionali
Per giungere a questo scopo in prima battuta gli inventori hanno quindi provveduto ad effettuare sostituzioni degli aminoacidi di scFvF8 con aminoacidi delle CDRs del scFv(D1.3) che riconosce il lisozima. Tali sostituzioni sono state apportate in modo razionale sui residui della struttura scFv(F8), modificata sulla base di un disegno teorico formulato mediante “modelling” molecolare.
Secondo questo approccio sono state operate modificazioni amminoacidiche estese comprendenti tutte e tre le CDRs di VH e VL, in maniera da sostituirle (con la tecnica denominata in arte “grafting”) con le corrispondenti regioni di un altro anticorpo di “tipo normale” (che non presenta particolare stabilità o funzionalità citoplasmatica), che lega il lisozima.
Tale strategia ha consentito di ottenere mutanti intermedi diversificati dalla struttura originale del scFv(F8), e come prodotto di mutagenesi ultima un anticorpo chimerico con le regioni CDRs dell’ anticorpo scFv(D1.3) e le regioni FRs del scFv(F8) modificate in alcuni residui che, secondo il modello previsionale, erano necessari a garantire il corretto ripiegamento delle CDRs trapiantate.
Lo schema riportato in figura 4 riassume la strategia di mutagenesi adottata per il “grafting” dei polipeptidi VH e VL dell’ anticorpo scFv(F8). L’analisi dei prodotti di mutagenesi ha permesso di dimostrare il successo del trapianto di specificità operato sulla struttura portante dell ’anti corpo scFv(F8), essendo gli anticorpi chimerici P2, P3, P4 e P5 in tal modo ricavati in grado di riconoscere specificamente il lisozima, come previsto dal disegno molecolare. Al tempo stesso è stata dimostrata la capacità della struttura portante di scFv(F8) di sopportare estese mutazioni, in particolare a livello delle CDRs, senza perdere le caratteristiche di stabilità molecolare, valutate come solubilità e funzionalità citoplasmatica.
In ogni caso ad eccezione di pochi residui delle “frameworks”, modificati per consentire il corretto ripiegamento delle regioni deputate al riconoscimento del nuovo antigene, la struttura portante del scFv(F8) non è stata alterata.
In conseguenza è stata identificata la struttura capace di funzionare da “nucleo centrale” e su cui poter innestare mediante ingegneria proteica nuove regioni capaci di fare acquisire al “nucleo centrale” la capacità di legame per nuovi antigeni. Tale nucleo centrale è composto dai peptidi FRs descritti nel sommario della invenzione. Ciò in seguito all’analisi delle nuove molecole leganti ottenute in esito a tale approccio che si sono dimostrate ottimi anticorpi di tipo intracellulare, destinati a tutte applicazioni per le quali sono richiesti particolari requisiti di stabilità molecolare.
Le proprietà di tali molecole mutanti sono state infatti verificate dagli inventori mediante le tecniche di analisi della espressione nel periplasma e nel citoplasma di Escherichia coli, meglio esplicitate ed esemplificate negli esempi.
In particolare la analisi della espressione nel periplasma batterico ha consentito di analizzare la capacità di riconoscimento del nuovo antigene, la analisi della espressione nel citoplasma batterico ha invece consentito di verificare la conservazione delle caratteristiche di solubilità proteica e di funzionalità in ambiente riducente, tipiche dell’ originario scFv(F8).
In particolare per quanto riguarda la espressione nel periplasma batterico, il saggio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) effettuato su estratti periplasmatici normalizzati per proteine totali ha evidenziato capacità di riconoscimento del lisozima da parte di tutti i prodotti di mutagenesi, fatta eccezione per PI, il mutante con il minor numero di sostituzioni. Il mutante con attività di legame più alta è il risultato P3, che presenta le CDRs del scFv(D1.3), oltre ad alcune sostituzioni nelle frameworks. I segnali ELISA su lisozima registrati per P3 sono di poco inferiori a quelli ottenuti per il scFv(D1.3) (di circa il 15%). Tali dati sono stati integrati da quelli dell’analisi per Western blotting che ha rivelato livelli di espressione di scFv confrontabili nei vari prodotti di mutagenesi e tra i vari prodotti di mutagenesi e gli originali scFv(F8) e scFv(D1.3), indicando che le differenze di segnale osservate in ELISA sono da attribuire esclusivamente alla diversa specificità per l’antigene, piuttosto che a diversi livelli di espressione dell’ anticorpo.
Per quanto riguarda la espressione nel citoplasma batterico, l’ELISA effettuata su estratti normalizzati per proteine totali ha in questo caso dato come risultato una più elevata attività per il mutante P5, caratterizzato dal maggior numero di sostituzioni aminoacidiche. Una debole attività di legame, in ogni caso superiore a quella misurabile per il scFv(D1.3), è stata registrata anche per P3 e P4. Con le dovute differenze imputabili al diverso sistema di analisi (antigeni diversi immobilizzati su piastra ELISA), 1 l’intensità del segnale del P5 citoplasmatico è del tutto confrontabile a quello, normalmente valutato come eccezionalmente forte, del scFv(F8) citoplasmatico.
Anche nel caso dei mutanti espressi in forma citoplasmatica dalla analisi Western si evince una equivalente espressione dei prodotti di mutagenesi, confermando che, ancora una volta, le differenze di segnale ELISA sono imputabili a diversa capacità di riconoscimento del lisozima (almeno nel sistema sperimentale adottato).
Approccio delle sostituzioni casuali
Utilizzando i risultati ottenuti dall’ approccio di sostituzioni razionali, gli inventori hanno costruito un repertorio di nuove molecole, derivate da scFv(F8), a cui sono stati sostituiti quattro residui aminoacidici, in tutte le possibili combinazioni, a livello di posizioni definite delle CDR3 sia del dominio VH che del dominio VL. In particolare sono state mutagenizzate le posizioni 95, 96, 97 e 98 della VH e 91, 92, 92, e 94 della VL. Inoltre per la preparazione del repertorio sono state operate delezioni per ridurre due CDRs, in modo da riportarle alle dimensioni medie registrate per la maggior parte degli anticorpi finora descritti. In particolare, la CDR3 della VH è stata ridotta di 9 aminoacidi (eliminando per delezione i residui in posizione 99, 100, 100 A, 100B, 100C, 100D, 100E, 100F, 100G) e la CDR1 della VL è stata ridotta di 4 aminoacidi (eliminando per delezione i residui in posizione 27C, 27D, 28 e 29) e modificata come riportato in figura 5.
Il repertorio di molecole cosi selezionate è stato montato su fago in una libreria per la selezione su antigeni diversi da AMCV, originariamente riconosciuto dal scFv(F8). Questa “library”, costruita quindi utilizzando come struttura base quella di un unico anticorpo di partenza (“monoscaffold library”), ha fornito anticorpi con specificità diverse, che preservano allo stesso tempo le caratteristiche di stabilità proprie della molecola scFv(F8), (solubilità citoplasmatica, denaturazione e rinaturazione in vitro). A queste conclusioni si è pervenuti analizzando gli spettri di emissione della fluorescenza intrinseca delle molecole scFv isolate, in condizioni di denaturazione e rinaturazione proteica all’ equilibrio, a concentrazioni crescenti dell’agente denaturante cloruro di guanidinio. L’espressione degli stessi frammenti scFv nel citoplasma di cellule di Escherichia coli sotto forma di molecole solubili e funzionali ha confermato la stabilità di queste proteine anche in un sistema di analisi in vivo.
La sequenza delle CDR3 di VH e VL degli anticorpi isolati dal repertorio e caratterizzati (tabella riportata in figura 6) ha evidenziato che la sostituzione dei residui nelle posizioni su citate è del tutto casuale e non influenza la funzionalità, nè altera la stabilità molecolare.
I dati ottenuti dalla costruzione e dalla analisi della “monoscaffold library” hanno dimostrato la possibilità di utilizzare la struttura portante del scFv(F8) per costruire un repertorio di anticorpi multivalenti con le stesse peculiari caratteristiche biochimiche dell’anticorpo di partenza scFv(F8), da destinare a tutte le applicazioni in cui sia richiesta l’espressione di anticorpi nel citoplasma, ovvero ove siano necessarie particolari caratteristiche di stabilità molecolare.
In esito a tali esperimenti sono state inoltre ottenute una serie di molecole anticorpali mantenenti inalterate le caratteristiche di stabilità dell’originario scFv(F8), e con una nuove specificità di legame, anch’esse descritte nel sommario della invenzione.
Conclusioni
I risultati di tutti questi approcci sperimentali sono riassunti nello schema riportato nella figura 6.
In conseguenza di tali informazioni sulle possibilità di modificazione dei singoli residui dell’anticorpo scFv(F8) sono stati individuati i peptidi FRs, CDRs, i polipeptidi VH e VL di cui al sommario della invenzione.
Si è data finora della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l’aiuto dei seguenti esempi, verrà ora fornita una descrizione più dettagliata di sue specifiche forme di realizzazione, finalizzate a far meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalità operative Esempi
Esempio 1 : Determinazione della sequenza di scFvfF81 L'anticorpo a singola catena scFv(F8) deriva da un anticorpo monoclonale (secreto da un ibridoma) della classe IgG2b diretto contro la proteina del capside del virus vegetale AMCV (artichoke mottle crinkle virus). Per ottenere questo anticorpo, topi di razza Balb/c sono stati immunizzati con il virus purificato e le tecniche per isolare i linfociti e ottenere l'ibridoma sono state quelle standard riportate in letteratura (Harlow and Lane 1988). La linea di ibridoma che esprimeva questo anticorpo é stata selezionata mediante ELISA sulla base della sua alta affinità per l'antigene. Per isolare i geni della catena pesante (H) e leggera (L) di questo anticorpo sono stati selezionati i cDNA completi secondo il protocollo riportato (Tavladoraki et al. 1993). Le regioni variabili (VH e VL) sono state amplificate mediante PCR (polymerase chain reaction) utilizzando inneschi (“primers”) universali per le regioni variabili e successivamente clonate in diversi tipi di vettori (Tavladoraki et al. 1993). La sequenza é stata determinata secondo il metodo Sanger (Sambrook et al 1989) seguendo il protocollo del kit Sequenase (USB).
Esempio 2: Determinazione della mutagenesi sito-specifica
La mutagenesi è stata effettuata sul plasmide pMUT-VLI, contenente il gene che codifica per un anticorpo derivato dal scFv(F8), dal quale si differenzia unicamente per la CDR1 della VL, modificata parzialmente nella composizione aminoacidica e ridotta di quattro aminoacidi.
E’ stato utilizzato il sistema di mutagenesi della Stratagene (“Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit”), seguendo le indicazioni fomite dalla casa produttrice. Questo sistema si basa sulla estensione enzimatica di due inneschi complementari recanti le mutazioni desiderate, utilizzando come stampo il DNA plasmidico da mutagenizzare. Il plasmide, contenente la sequenza da mutare, è stato denaturato al calore per permettere l’appaiamento dei due oligonucletidi sintetici ai filamenti opposti del DNA del vettore, in modo da innescare la reazione di estensione della Pfu DNA-polimerasi. Il risultato è un plasmide a doppia elica, che ha incorporato gli oligonucleotidi recanti la mutazione desiderata.
Il ceppo batterico di E. Coli XLl-Blue utilizzato per la purificazione del vettore plasmidico ha attività metil-transferasica, pertanto il DNA stampo estratto da batterio risulta metilato. Al contrario i plasmidi mutanti ottenuti per estensione della Pfu DNA-polimerasi, non recano siti di metilazione. Ciò ha permesso di selezionare i plasmidi recanti le mutazioni desiderate per semplice digestione dei prodotti di reazione con un enzima endonucleasico Dpnl che riconosce specifiche sequenze di DNA metilato frequenti nel plasmide parentale che viene quindi spezzettato. I prodotti della reazione sono stati trasfectati in cellule competenti di E. Coli XLl-Blue dove i siti “nick”, prodottisi durante la sintesi in vitro del plasmide mutante vengono fosforilati ad opera dei sistemi di riparazione cellulari.
La reazione di mutagenesi è stata effettuata in un volume finale di 25 μΐ contenente: 2,5 μΐ di tampone di reazione lOx, dNTP per una concentrazione finale di 2,5 mM ciascuno, 10 ng di DNA stampo, 62,5 ng di ciascun oligonucletide innesco, 1,25 U di Pfu DNA polimerasi (Stratagené).
Le condizioni adottate sono state le seguenti: un primo ciclo di denaturazione a 95°C di 30”, seguito da 18 cicli, ciascuno suddiviso in tre fasi: denaturazione del DNA a 95°C per 30”, appaiamento degli inneschi a 55°C per Γ ed estensione enzimatica a 68°C per 7’, infine 5’ a 68°C per completare l’estensione. La reazione è stata effettuata con un apparecchio Perkin Elmer/Cetus.
I prodotti della reazione sono stati incubati 1 ora a 37°C con 5 U dell’enzima di restrizione Dpnl (Stratagene) e analizzati per elettroforesi su gel di agarosio.
I prodotti di mutagenesi sono stati clonati nel vettore pGEM-7Zf(+) (Promega) e trasfectati in E. Coli XLl-Blue, secondo le metodiche convenzionali di biologia molecolare.
L’avvenuta mutagenesi è stata verificata mediante sequenziamento. I prodotti proteici ottenuti in seguito a mutagenesi sono stati analizzati in seguito clonaggio in vettore di espressione pDN332 (Neri et al.
1996) e induzione di espressione in batterio, secondo tecniche descritte negli esempi successivi.
La funzionalità degli anticorpi e la solubilità in ambiente riducente citoplamatico è stata analizzata mediante Western blotting ed ELISA in particolare come descritto nei seguenti esempi.
Esempio 3: Analisi della espressione di proteine nel periplasma di E. teli
Per l’espressione di proteine nel ceppo di E. Coli HB2151, cellule prelevate da una singola colonia ricombinante con una punta sterile, sono state risospese in 50 mi di mezzo di coltura SB contenente ampicillina (100 pg/ml) e glucosio al 2% e cresciute 16 ore a 30°C in agitazione (250 rpm).
Un litro di terreno di coltura SB è stato inoculato con un volume della precoltura tale da ottenere una concentrazione cellulare corrispondente ad una densità ottica a 600 nm pari a 0,2. La coltura è stata fatta crescere a 30°C in agitazione (250 rpm) fino ad avere un valore di densità ottica di 0,80,9 e quindi centrifugata a temperatura ambiente a 3000 x g per 15’.
L’induzione del promotore lacZ è stata ottenuta risospendendo il precipitato batterico in 1 litro di terreno di coltura SB contenente ampicillina 100 pg/ml e IPTG 1 mM e lasciando la coltura in incubazione a 30°C per 3 ore.
La coltura è stata quindi centrifugata a 3000 x g per 15’ a 4°C per sedimentare le cellule.
L’estrazione delle proteine dal periplasma batterico è stata ottenuta per “shock” osmotico delle cellule batteriche. Il “pellet” di cellule batteriche è stato risospeso in 15 mi di una soluzione tampone TES, (saccarosio 0,5 M, Tris-HCl 0,2 M, EDTA 0,5 mM, pH8,0) contenente inibitori di proteasi (“Complete Mini”, Boehringer Mannheim).
Sono stati quindi aggiunti 22,5 mi di una soluzione diluita di TES 1 :5 ed inibitori di proteasi. La sospensione batterica è stata sottoposta a lenta rotazione per 15’ a temperatura ambiente. L’estratto è stato poi centrifugato a 15000 x g, a 4°C per 20’ per recuperare le proteine periplasmatiche presenti nel supematante.
Esempio 4: Analisi della espressione di proteine nel citoplasma di E.
Coli
a. Espressione di proteine ricombinanti in E. Coli
Per l’espressione di proteine nel ceppo di E. Coli HB2151, cellule prelevate da una singola colonia ricombinante con una punta sterile, sono state risospese in 5 mi di mezzo di coltura SB contenente ampicillina (100 pg/ml) e glucosio al 2% e cresciute 16 ore a 30°C in agitazione (250 rpm).
100 mi di terreno di coltura SB sono stati inoculati con un volume della precoltura tale da ottenere una concentrazione cellulare corrispondente ad una densità ottica a 600 nm pari a 0,2. La coltura è stata fatta crescere a 30°C in agitazione (250 rpm) fino ad avere un valore di densità ottica di 0,8-0,9 e quindi centrifugata a temperatura ambiente a 3000 x g per 15’.
L’induzione del promotore lacZ è stata ottenuta rispondendo il precipitato batterico in 100 mi di terreno di coltura SB contenente ampicillina 100 pg/ml e LPTG 1 mM e lasciando la coltura in incubazione a 30°C per 3 ore.
La coltura è stata quindi centrifugata a 3000 x g per 15’ a 4°C per sedimentare le cellule.
L’estrazione delle proteine dal citoplasma batterico è stata ottenuta per rottura meccanica delle cellule batteriche mediante sonicazione.
Il “pellet” batterico è stato risospeso in 500 μΐ di tampone di sonicazione (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,3 M, EDTA 5 mM, pH 8,0), contenente inibitori di proteasi congelato in azoto liquido e immediatamente scongelato in acqua a temperatura ambiente.
Per completare la lisi batterica le cellule sono state sottoposte a sonicazione in 3 applicazioni di 1’ alla potenza di 150 W, con apparecchio Soniprep 150 (Sonyo).
I campioni sono stati quindi centrifugati a 20000 x g per 15’ a 4°C ed è stato prelevato il supematante corrispondente alla frazione citoplasmatica, mentre il “pellet”, contenente i corpi inclusi, è stato analizzato separatamente.
Per analizzare le proteine contenute nei corpi inclusi, i “pellet” rimasti dopo estrazione citoplasmatica sono stati risospesi in tampone di caricamento (glicerolo 20%, SDS 2%, Tris-HCl pH 6,8 0,06 M, blue di bromofenolo 0,02%, b-mercaptoetanolo 5%). I campioni sono stati quindi bolliti 5’ e centrifugati 2000 x g per 15’ ed il supematante è stato corso su gel di poliacrilammide.
Esempio 5: Analisi degli anticorpi ricombinanti a.Determinazione della concentrazione proteica
La concentrazione delle proteine totali presenti negli estratti è stata determinata utilizzando il reagente BioRad e la sieroalbumina bovina a concentrazioni note come standard.
La concentrazione dei scFv dopo purificazione è stata calcolata dal valore di assorbanza dei campioni alla lunghezza d’onda di 280 nm. Le bande proteiche sono state visualizzate mediante metodo di colorazione delle proteine con nitrato d’argento o con blue di Coomassie.
b. Elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide (SDS-PAGE) L’analisi dei frammenti anticorpali ottenuti dopo purificazione è stata effettuata mediante SDS-PAGE secondo protocollo noto in arte. Il gel di separazione è stato preparato ad una concentrazione finale di poliacrilammide (acrilammide/bisacrilammide 29:1) del 12% in presenza di SDS 2%. Ai campioni da analizzare sono stati aggiunti (concentrazioni finali): glicerolo 10%, Tris-HCl 0,06 M pH6,8, blu di bromofenolo 0,025% SDS 2% e b-mercaptoetanolo 5%. Prima del caricamento i campioni proteici sono stati sottoposti a bollitura per 5’ per favorire la denaturazione. La corsa elettroforetica è stata effettuata su apparato MiniProtean (BioRad) ad una differenza di potenziale costante di 400 Volt.
c. Analisi di Western blot
Dopo separazione su SDS-PAGE le proteine sono poi state trasferite dal gel su un foglio di nitrocellulosa (Hybond-C Super, Amersham) sottoponendo le proteine ad una differenza di potenziale costante di 100 Volt per 1 ora a 4°C.
La membrana di nitrocellulosa è stata posta in agitazione in una soluzione bloccante (latte scremato 4% in PBST) a 4°C per 16 ore. Dopo tre lavaggi in PBST della durata rispettivamente di 30”, 5’, 5’, e un lavaggio di 5’ in PBS, la membrana è stata incubata in una soluzione di latte scremato al 2% in PBS contenente Fanti corpo monoclonale di topo anti-FlagM2 (Sigma) alla concentrazione di 8 μg/ml, per 2 ore a temperatura ambiente in leggera agitazione. La membrana è stata di nuovo lavata 3 volte con PBST e una volta con PBS ed è stata quindi posta in incubazione 1 ora a temperatura ambiente in PBS e latte scremato al 2%, con un anticorpo di capra diretto contro le IgG murine, coniugato alla biotina, (Amersham) alla diluizione di 1:5000.
Dopo una nuova serie di lavaggi, la membrana è stata incubata per un’ora a temperatura ambiente con perossidasi coniugata alla streptavidina (Amersham). Quindi sono stati ripetuti i lavaggi. /
Infine la membrana è stata impregnata con 2 mi di soluzione per la rivelazione delle proteine per chemioluminescenza (ECL Plus-Amersham). Tale sistema consiste neH’emissione di luce a seguito della ossidazione del luminolo, in presenza di attivatori chimici, da parte della perossidasi. Il segnale è stato rivelato in seguito a esposizione della membrana su una lastra fotografica (Hyperfilm-ECL, Amersham).
Gli antigeni lisozima (Sigma) e virus AMCV purificato sono stati immobilizzati su piastre ELISA (Nunc) in 100 μΐ di tampone di carbonato (NaHC03 50 mM pH9,6), alla concentrazione di 100 pg/ml e 3 pg/ml rispettivamente a 4°C per 16 ore..
Dopo 3 lavaggi con tampone PBST (NaH2P04 0,2 M, Na2HP04 0,2 M, NaCl 0,15 M, Tween-20 0,1%) e 1 lavaggio con PBS (NaH2P04 0,2 M, Na2HP04 0,2 M, NaCl 0,15 M), le piastre sono state bloccate con una soluzione PBS, gelatina 0,1% e latte scremato 2% per 2 ore a 37°C. Le piastre sono state lavate successivamente 3 volte con PBST e 1 volta con PBS.
A ciascun pozzetto sono stati aggiunti 80 μΐ di estratto da colture batteriche indotte e 20 μΐ di una soluzione PBS, latte scremato (Dicofarm) 10% e l’anti corpo monoclonale di topo anti-FlagM2 (Sigma) alla concentrazione di 2,5 μg/ml. Le piastre sono state incubate 16 ore a 4°C, quindi lavate 3 volte con PBST e 1 volta con PBS. A ciascun pozzetto sono poi stati aggiunti 100 μΐ di latte scremato 2% in PBS contenente un anticorpo “anti-mouse” di capra coniugato alla perossidasi (KPL) alla diluizione di 1:10000. Le piastre sono state incubate a 37°C per un’ora, lavate 3 volte con PBST e 1 volta con PBS e in ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 μΐ di soluzione 1:1 di substrato della perossidasi, ABTS [acido 2’2<,>-azinobis(3-etilbenztiazolin)sulfonico]: H202 (KPL).
Le misure di assorbanza sono state effettuate alla lunghezza d’onda di 405 mm, mediante lettore ELISA (Labsystem Multiscan Plus), a vari intervalli di tempo dall’inizio della reazione.
Esempio 6: Costruzione e clonaggio della libreria “monoscaffold” ' Per la costruzione della libreria fagica è stato utilizzato come stampo il plasmide pMUT-VLl descritto nell’esempio 2. La libreria è stata ottenuta introducendo variabilità nelle CDR3 della VH e della VL, attraverso la modifica casuale della sequenza che codifica per quattro residui aminoacidici nelle posizioni indicate nella fig. 6. A questo scopo sono stati sintetizzati inneschi oligonucleotidici parzialmente degenerati, disegnati in modo da non introdurre segnali di interruzione della trascrizione e da ridurre la lunghezza della CDR3 della VH da 13 a 4 codoni. La mutagenesi è stata effettuata mediante PCR, amplificando indipendentemente le sequenze codificanti per i domini VH e VL, utilizzando, rispettivamente, i inneschi VHa e VHf e VLa e VLf (Fig. 7). La reazione di PCR è stata preparata come segue: 300 ng pMUT-VLl, 0.4 mM innesco senso (VHa o VLa), 0.8 μΜ innesco antisenso degenerato (VHf o VLf), 250 μΜ di ciascun dNTP, in 50 μΐ di tampone di incubazione lx Appligene, (Oncor); 2.5 U di Taq DNA polimerasi Appligene, (Oncor) sono stati aggiunti a 94°C (hot start). La reazione di amplificazione è stata condotta secondo il seguente programma: 94°C per 3 minuti; 25 cicli: 94°C per 1 minuto, 60°C per 1 minuto, 72°C per 1 minuto; 72°C per 2 minuti. I prodotti di amplificazione sono stati purificati da gel di agarosio, utilizzando il QLAquick Gel Extraction Kit (QIAgen), eluendo in 30 mi di 3 mM Tris/HCI pH8.0. L’assemblaggio degli anticorpi scFv è stato effettuato mediante PCR alle stesse condizioni sopra descritte, usando 10 pg di ciascun frammento genico codificante per la VH e la VL purificati, 0.8 μΜ innesco senso (VHa) e 0.8 μΜ innesco antisenso (VLg), per un volume finale di 500 μΐ suddiviso in 10 reazioni da 50 μΐ. I scFv assemblati e amplificati sono stati purificati usando il QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen). Dopo digestione Nco\-Not\, l’intero prodotto di assemblaggio è stato clonato nel vettore pDN332.
I prodotti di Iigazione sono stati transfectati per elettroporazione nel ceppo TGl di E. Coli, adottando i seguenti parametri: 200 ohm, 25 mF, 2.5 kVolt. I trasformanti sono stati selezionati su 2xYT 2% glucosio ampicillina 100 pg/ml. I fagi sono stati preparati secondo il protocollo descritto da Nissim et al. (1994).
Esempio 7: selezione dei mutanti dalla libreria “monoscafTold” ed analisi delle loro proprietà
a. Selezione della libreria
L’immobilizzazione degli antigeni su immunotubi (Maxisorp, NUNC) è stata effettuata in PBS (8mM Na2HPO4-12H20 ImM NaH2PO4'H20 0,15M NaCl) o in tampone carbonato 50mM (CB), alla concentrazione compresa tra 10 e 100 pg/ml in relazione alPantigene, incubando per 16 ore a temperatura ambiente o a4°C.
10^2-10^ fagi in 4 mi di PBS 2% latte (PBS-M) sono stati usati per ciascun ciclo di selezione, lasciando in incubazione per 2 ore, di cui i primi 30 minuti in leggera agitazione. Dopo 10-15 lavaggi con PBS 0,1% Tween20 e 10-15 lavaggi con PBS, è stata effettuata l'eluizione con 1 mi di 100 mM trietilammina, immediatamente neutralizzati con 0,5 mi di 1 M Tris/HCl pH8.0. La sospensione fagica è stata quindi usata per infettare 10 mi di una coltura di E. Coli ceppo TGl in crescita esponenziale, in bagno a 37°C per 30 minuti. Dopo precipitazione in centrifuga i batteri sono stati risospesi e piastrati su piastre contenenti terreno agarizzato: 2xYT 100 pg/ml ampicillina 1% glucosio (2xYT-AG).
La caraterizzazione per capacità di legame di singoli cloni derivanti dalFultimo ciclo di panning è stata effettuata in alcuni casi su cloni espressi sotto forma di fago e in altri su cloni espressi come scFv solubile.
Nel caso della selezione su fago, 96 singole colonie ottenute daH'ultimo ciclo di selezione sono state inoculate in 150 mi di 2xYT-AG e lasciate crescere a 30°C in agitazione per 16 ore. Quindi un’aliquota di IO mi di ciascuna pre-coltura è stata usata per inoculare 150 mi di 2xYT-AG, lasciando crescere per 1 ora a 37°C in modo da ottenere una crescita esponenziale. La produzione di fagi è stata otenuta infetando con circa 10H tu di fago Tielper’ VCSM13 (Stratagene) e lasciando in incubazione a 37°C senza agitazione per 30 minuti. I bateri infettati sono stati precipitati, risospesi in 150 mi di 2xYT 100 pg/ml ampicillina 25 pg/ml kanamicina e incubati in agitazione 16 ore a 30°C. I supematanti di coltura sono stati analizzati in saggio ELISA, utilizzando piastre su cui è stato immobilizzato l'antigene in esame nelle stesse condizioni usate per gli immunotubi. Per rivelare la presenza di fagi leganti, dopo 2 ore di incubazione a 37°C, è stato utilizzato un anticorpo monoclonale anti-M13 coniugato alla perossidasi (Pharmacia) 1:5000 in PBS-M, 1 ora a 37°C. La reazione colorimetrica è stata sviluppata usando "ABTS peroxidase substrate System” (KPL). I cloni positivi ottenuti da questa selezione preliminare sono stati ulteriormente analizzati per verificare la funzionalità del scFv soto forma solubile. A questo scopo i plasmidi sono stati estratti dai cloni positivi mediante il QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN), sequenziari e trasfectati in E. Coli ceppo HB2151. Le cellule batteriche sono state rese competenti per risospensione a 0°C in TSS (per 100 mi: 1 gr bacto-triptone, 0.5 gr estratto di lievito, 0.5 gr NaCl, 10 gr PEG 3350, 5 mi DMSO, 50 mM MgCl2, pH6.5). Ad 1 mi di cellule competenti sono stati aggiunti 1-5 ng di plasmide, lasciando ad incubare su ghiaccio per 45 minuti. Dopo un breve shock a 42° C per 2 minuti, è stato aggiunto 1 mi di LB, quindi le cellule sono state messe in agitazione a 37°C per 1 ora e piastrate su LB 100 pg/l ampicillina. L’analisi di espressione di singole colonie da trasformazione è stata effettuata per ELISA, secondo le modalità descritte di seguito.
Per la selezione della proteina in forma solubile, 10-100 μΐ di fagi eluiti dall’ultimo ciclo di selezione su antigene sono stati usati per infettare cellule di E. Coli ceppo HB2151 in crescita esponenziale. 96 singole colonie, ottenute in seguito a piastramento sono state messe in coltura in 150 μΐ di 2xYT-AG per 16 ore in agitazione. 10 μΐ di ciascuna pre-coltura sono stati diluiti in 150 μΐ di 2xYT 100 pg/ml ampicillina 0.1% glucosio e lasciati crescere in agitazione a 37°C per 1 ora. L’espressione proteica è stata ottenuta durante 16 ore mediante aggiunta di 1 mM IPTG. I singoli supematanti di coltura sono stati analizzati per saggio ELISA, incubando insieme a 2.5 pg/ml di un anticorpo monoclonale di topo anti-FLAG M2 (Sigma) in PBS-M per 2 ore a 37°C, seguito da un anticorpo di coniglio anti-topo (KPL) coniugato alla perossidasi diluito 1:10000 in PBS-M per 1 ora a 37°C.
b. Analisi di cross-reattività
I cloni risultati positivi in seguito alla selezione sui vari antigeni sono stati analizzati su antigeni diversi da quello usato per la selezione, al fine di valutare la specificità di riconoscimento. 50 mi di coltura di E. Coli HB2151 in crescita esponenziale in SB-A (35 g/1 triptone 20g/l estratto di *;lievito 5 g/1 cloruro di sodio 100 pg/ml ampicillina, pH7.5) sono stati indotti a 30°C per 3 ore mediante aggiunta di 1 mM IPTG. Dopo centrifugazione, le cellule sono state risospese in 500 μΐ di TES (0.2 M Tris-HC1 pH8 0.5 mM EDTA 0.5 M saccarosio) contenente inibitori di proteasi (Complete^M^ EDTA-free, Boehringer), quindi sono stati aggiunti 750 μΐ di TES diluito 1:5 con inibitori di proteasi e il campione è stato incubato in agitazione orbitale per 10 minuti a temperatura ambiente. L’estratto proteico, ottenuto come supematante in seguito a centrifugazione di 20 minuti a 18000 g a 4°C, è stato utilizzato in saggio ELISA con diversi antigeni immobilizzati nelle stesse condizioni usate per gli immunotubi. In ciascun pozzetto ELISA sono stati caricati 80 μΐ di estratto periplasmatico più 20 μΐ PBS 10% latte. Il rilevamento del segnale è stato effettuato mediante l’anticorpo anti-FLAG M2, come descritto. ;c. Sequenziamento ;I plasmidi estratti dai cloni positivi ottenuti da ciascuna selezione sono stati sequenziali su entrambi i filamenti di DNA mediante 373 DNA Sequencer (Applied Biosystems). ;d. Purificazione dei scFv ;Per produrre alte quantità di scFv una singola colonia di E. Coli HB2151 è stata inoculata in 100 mi di SB contenente 100 pg/ml ampicillina e 2% glucosio (SB-AG). Dopo 16 ore di crescita a 30°C, la coltura è stata diluita con 900 mi di SB-AG e lasciata in agitazione per un’altra ora (fino a O.D.goo <= >0-9). Le cellule, precipitate per centrifugazione, sono state risospese in SB-A 1 mM IPTG e indotte per 3 ore 30°C. Dopo centrifugazione, i batteri sono stati risospesi in 10 mi di TES inibitori di proteasi, quindi sono stati aggiunti 15 mi di TES diluito 1:5 inibitori di proteasi e il campione è stato incubato in agitazione per 10 minuti a temperatura ambiente. In seguito a centrifugazione per 20 minuti a 18000 g a 4°C, il supematante è stato recuperato (frazione 1A) e il pellet è stato risospeso in 15 mi di 5 mM MgSC>4 inibitori di proteasi per una ulteriore estrazione di proteine, lasciando in agitazione per 10 minuti a temperatura ambiente. Il supematante ottenuto dopo una seconda centrifugazione è stato conservato separatamente come frazione 2 A. Le frazioni 1A e 2 A sono state concentrate indipendentemente per ultrafiltrazione su membrana Diaflo YM10 (Amicon) e purificate per cromatografia di affinità su protein-L Sepharose (Actigene) o su Ni-NTA (QIAgen), seguendo il protocollo suggerito dalle case produttrici. La quantizzazione delle frazioni di purificazione è stata effettuata per lettura dell’assorbanza a 280 nm e la purezza è stata verificata su SDS-PAGE. ;e. Analisi di stabiltà termodinamica ;Al fme di valutare la stabilità termodinamica delle molecole anticorpali isolate dalla libreria F8, sono stati condotti esperimenti di denaturazione e rinaturazione proteica all’equilibrio a pH7.2 a concentrazioni crescenti di cloruro di guanìdinio quale denaturante, in presenza e in assenza dell’agente riducente di-tio-DL-treitolo (DTT), effettuando misure degli spettri di emissione intrinseca delle molecole. I dati ottenuti sono stati inoltre confrontati con la stessa analisi precedentemente effettuata per Γ anticorpo scFv(F8) usato come stampo per la preparazione della libreria (Tavladoraki et al., 1999). ;f Espressione citoplasmatica ;Per otenere l’espressione nel citoplasma baterico degli anticorpi isolati dalla libreria, la sequenza del gene scFv(F8) mancante della sequenza segnale è stata clonata nei siti HindDI-Notl di pDN332 (pDN-F8intra) (Fig. 3). I costruti dei geni codificanti per i scFv da libreria F8 in versione priva di sequenza segnale sono stati realizzati sostituendo il frammento di restrizione Pstl-Notl, corrispondente alla sequenza codificante il scFv(F8) in pDN-F8intra, con l’analogo prodotto di restrizione di 705 bp corrispondente all’ORF dei scFv isolati. I plasmidi ottenuti sono stati trasfectati in E. Coli HB2151. ;L’induzione dell'espressione dell’anticorpo è stata effettuata come descritto nell’esempio 4. ;Riferimenti bibliografici ;Harlow E., & Lane D. (1988) in Antibodies :a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press , New York. ;- Kabat E. A., Wu T. T., Perry H. M., Gotesmann K. S., & jodler C. (1991) ‘Sequences of Proteins of Immunological Interest’. 5^ ed. US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office. ;Neri D., Petrul H., Winter G., Light Y., Marais R., Britton K. E., & Creighton A. M. (1996) in Nature Biotechnology 14: 485-490 ;- Nissim A., Hoogenboom H. R., Tomlison I. M., Flynn G., Midgley C., Lane D. & Winter G. (1994) in The Embo Journal , 13: 692-698. ;Sambrook J., Fritsch E.F., & Maniatis T. (1989) in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). ;- Tavladoraki P., Benvenuto E., Trinca S., De Martinis D., Cattaneo A., & Galeffi, P. (1993) in Nature 366: 469-472. ;- Tavladoraki P., Girotti A., Donini M., Arias F. J., Mancini C., Morea V., Chiaraluce R., Consalvi V., & Benvenuto E. (1999) in European Journal of Biochemistry 262: 617-624. ;- Visintin M., Tse E., Axelson H., Rabbitts T.H., & Cattaneo A. (1999) Proc. Natl.Acad. Sci. 96: 11723-11728. ;- Bhat T.N.Bentley G.A., Fischman T.O., Boulot G., e Poljak R.G. (1990) in Nature 347: 483-485. ;STA DI SEQUENZE ;INFORMAZIONI GENERALI: ;(i) DEPOSITANTE: ;(ii) TITOLO DELL’INVENZIONE: ;(iii) NUMERO DI SEQUENZE: ;(iv) INDIRIZZO DI CORRISPONDENZA: ;(A) DESTINATARIO: Società Italiana Brevetti ;(B) INDIRIZZO: Piazza di Pietra, 39 ;(C) CITTÀ: Roma ;(D) PAESE: Italia ;;(E) CODICE POSTALE: 1-00186 ;(v) FORMA LEGGIBILE AL CALCOLATORE: ;;(A) TIPO DI SUPPORTO: ;. (B) COMPUTER: IBM PC compatibile ;(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS Rev. 5.0 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 6.0 ;(viii) INFORMAZIONI SULL’AGENTE ;(A) NOME: Tonon, Gilberto(Ing.) ;(B) RIFERIMENTO: ;(ix) INFORMAZIONI PER TELECOMUNICAZIONI ;;(A) TELEFONO: 06/695441 ;;(B) TELEFAX: 06/69544830 ;;(C) TELEX: 612287 ROPAT ;(1) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 1: ;(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 25 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(D) TIPOLOGIA: lineare ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(vi) ORIGINE: ;(A) ORGANISMO: sequenza sintetica ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(A) NOME: H-FR1 ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 24 è Ala o un amminoacido non polare ;(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 1 : ;Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Xaa Ser ;20 25 ;;(2) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 2: ;(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 14 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(A) NOME: H-FR2 ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 12 è Leu o un amminoacido non-polare ;(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 2: ;Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Xaa Val Ala 1 5 10 ;;(3) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 3: ;(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 39 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(D) TIPOLOGIA: lineare ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(vi) ORIGINE: ;(A) ORGANISMO: sequenza sintetica ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(A) NOME: H-FR3 ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 2 è Pro, un amminoacido nori-polare o un amminocido polare privo di carica (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 3 è Asp, un amminoacido acido o un amminoacido polare privo di carica; (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 13 è Arg o un amminoacido basico ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 18 è Asn, o un amminoacido polare privo di carica ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 20 è Leu o un amminoacido non-polare ;(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 3: ;Tyr Xaa Xaa Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Xaa Asp Asn Ala 1 5 10 15 Lys Xaa Thr Xaa Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr ;20 25 30 ;Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg ;35 ;;(4) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 4: ;(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 11 amminoacidi ;(B) TIPO: ammino acidi ca ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(A) NOME: H-FR4 ;(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 4: ;Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser ;1 5 10 ;;(5) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 5: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 23 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(D) TIPOLOGIA: lineare ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(vi) ORIGINE: ;(A) ORGANISMO: sequenza sintetica ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(A) NOME: L-FR1 ;(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 5: ;Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1_ 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys ;20 ;;(6) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 6: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 15 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(A) NOME: L-FR2 ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: ;(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 6: ;Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 ;;(7) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ED NO: 7: ;(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 32 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(D) TIPOLOGIA: lineare ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(vi) ORIGINE: ;(A) ORGANISMO: sequenza sintetica ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;! (A) NOME: L-FR3 ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 12 è Arg, un amminoacido basico o un amminoacido polare privo di carica (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 15 è Phe, un amminoacido non polare o un amminoacido polare privo di carica (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 7: ;Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Xaa Thr Asp Xaa Thr 1 5 10 15 ;Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys ;20 25 30 ;;(8) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 8: ;(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 11 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(A) NOME: L-FR4 ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: ;(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 8: ;Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg ;1 5 10 ;;(9) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 9: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 10 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(D) TIPOLOGIA: lineare ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(vi) ORIGINE: ;(A) ORGANISMO: sequenza sintetica ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(A) NOME: H-CDR1-F8 ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: ;(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 9: ;Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser ;1 5 10 ;;(10) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 10: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 10 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(11) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI ;(A) NOME: H-CDR2-F8 ;(D) ALTRE INFORMAZIONI: ;(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ED NO: 10: ;Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe ;1 5 10 ;;;(11) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 11 : ;(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA ;(A) LUNGHEZZA: 16 amminoacidi ;(B) TIPO: amminoacidica ;(C) NUMERO DI CATENE: singola ;(D) TIPOLOGIA: lineare ;(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide ;<* >(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR3-F8
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 11:
Arg Arg Asn Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
(12) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 12:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 15 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR1-F8
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 12:
Arg Ala Ser Giu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15
(13) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 13: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE: sequenza sintetica
(A) ORGANISMO:
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME:L-CDR2-F8
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 13: Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser
1 5
(14) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 14: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3-F8
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 14:
Gin Gin Ser Asn Giu Asp Pro Trp Thr
1 5
(15) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 15: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 8 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR3-LYS/P5
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 15: Giu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr
1 5
(16) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 16: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3-LYS/P5
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 16: Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
(17) INFORMAZIÓNI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 17: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR3-LYS/11E
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 17: Thr Arg Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5
(18) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 18: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3-LYS/11E
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 18: Gin Gin Val Thr Tyr Lys Pro. Trp Thr
1 5
(19) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 19: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR3-BSA/9F
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 19: Giu Arg Trp Asp Phe Asp Tyr
1 5
(20) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 20:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3-BSA/9F
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 20: Gin Gin Ala Leu Ser Pro Pro Trp Thr
1 5
(21) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ED NO: 21:
- ,(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR3-TSWV(BR01)/6H
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ED NO: 21 : Asn Trp Arg Arg Phe Asp Tyr
1 5
(22) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ED NO: 22: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3-TSWV(BR01)/6H
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 22: Gin Gin Gly Ala Ser De Pro Trp Thr
1 5
(23) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 23: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR3-TSWV(P105)/1C
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 23: Gly Arg His Lys Phe Asp Tyr
1 5
(24) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 24: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3-TSWV(P105)/1C
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 24: Gin Gin Tyr Gly Arg Arg Pro Trp Thr
1 5
(25) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 25: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR3 -CM V/4G
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ED NO: 25: Asn Asn Trp Ser Phe Asp Tyr
1 5
(26) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 26: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3-CMV/4G
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 26: Gin Gin Gly Gin Arg Lys Pro Trp Thr
1 5
(27) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 27: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR3-CMV/4B
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 27: Asn Asn Tyr Ser Phe Asp Tyr
1 5
(28) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 28: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3 - CMV/4B
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 28: Gin Gin Gly Arg Arg Ala Pro Trp Thr
1 5
(29) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 29: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR3-CMV/2G
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 27: Val Thr Tyr Asn Phe Asp Tyr
1 5
(30) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 30: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3-CMV/2G
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ED NO: 30:
Gin Gin Ser Arg Arg Pro Pro Trp Thr
1 5
(31) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 31 : (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 124 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VH-F8
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 31:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Asn Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Gly Tyr Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
(32) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 32:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 112 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VL-F8
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 32:
Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Giu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu He Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Giu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn
85 90 95
Giu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
100 105 110
(33) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 33: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 116 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidi
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VH-LYS/P5
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 33:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Trp Val
35 40 45
Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Giu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
(34) ENF.ORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 34:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 108 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidi
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VL-LYS/P5
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 34:
Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
100 105
(35) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 35: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 116 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VH-LYS/11E
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 35:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Mei Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Arg Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
(36) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 36: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 108 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VL-LYS/11E
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 36:
Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Giu Ser Val His Asn Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Thr Tyr Lys Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
100 105
(37) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 37: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 116 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VH-BSA/9F
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 37:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 <~ >55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Giu Arg Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
(38) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ED NO: 38:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 108 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VL-BSA/9F
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 38:
Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Giu Ser Val His Asn Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Leu Ser Pro Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
100 105
(39) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 39: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 116 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VH-TSWV(BR01)/6H
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 39:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Trp Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
1.1S.
(40) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 40:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 108 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VL-TSWV(BR01)/6H
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 40:
Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Giu Ser Val His Asn Tyr
20 25 30
Met His Tip Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Ala Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
100 105
(41) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 41 : (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 116 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VH-TSWV(P105)/1C
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 41 :
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg His Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
(42) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 42: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 108 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VL-TSWV(P105)/1C
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 42:
Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Giu Ser Val His Asn Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Arg Arg Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
100 105
(43) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ED NO: 43: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 116 amminoacidi
(B) TIPO: animino acidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VH-CMV/4G
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 43:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Asn Trp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
(44) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 44:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 108 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VL-CMV/4G
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 44:
Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Giu Ser Val His Asn Tyr
20 25 30
Met His Tip Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Sei Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Gin Arg Lys Pro Tip 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
100 105
(45) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 45: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 116 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VH-CMV/4B
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 45:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Asn Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Sér
115
(46) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 46:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 108 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VL-CMV/4B
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 46:
Asp He Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Giu Ser Val His Asn Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Arg Arg Ala Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
100 105
(47) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 47: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA .
(A) LUNGHEZZA: 116 amminoacidi
(B) TIPO: ammino acidi ca
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VH-CMV/2G
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 47:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Thr Tyr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
(48) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 48: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 108 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: VL-CMV/2G
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 48:
Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Giu Ser Val His Asn Tyr
20 25 30
Mei His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Arg Arg Pro Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
100 105
(49) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 49: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 247 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polipeptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: sFv(F8)
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 49:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Leu Val
35 40 45
Ala Thr He Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 _ 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Asn Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Gly Tyr Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Giu Leu 130 135 140
Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr 145 150 155 160 Ile Ser Cys Arg Ala Ser Giu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe
165 170 175
Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Giu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Giu Ala 210 215 220
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Giu Asp Pro Tip 225 230 235 240 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg
245 250
(50) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 50: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 239 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polipeptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: scFv(P5)
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 50:
Gin Val Gin Leu Gin Giu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Giu Trp Val
35 40 45
Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Val Lys 50 <" >55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Giu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Giu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Ile Giu Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val 130 135 140
Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile 145 150 155 160 His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys
165 170 175
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ala Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Pro
195 200 205
Val Giu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser 210 215 220
Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Giu Ile Lys Arg 225 230 235
(51) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 51 : (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 16 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di un linker per anticorpi scFv
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 51 :
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15
(52) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 52: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 75 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per H-FR1-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 52:
CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGG GGA GAC TTA GTG CAG CCT 42 GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT 75
(53) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 53:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 42 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per H-FR2-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 53:
TGG GTT CGC CAG ACT CCA GAC AAG AGG CTG GAG TTG GTC GCA 42
(54) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 54:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 117 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per H-FR3-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 54:
TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC 42 AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG AAG 84 TCT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GCA AGA 117
(55) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 55:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 33 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per H-FR4-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ED NO: 55:
TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 33
(56) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 56:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 69 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per L-FR1-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 56:
GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT 42 CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC 69
(57) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 57:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 45 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per L-FR2-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 57:
TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC 42 TAT 45
(58) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 58:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 96 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per L-FR3-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 58:
GGG ATC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAC 42 TTC ACC CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA 84 ACC TATTAC TGT 96
(59) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 59:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 33 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per L-FR4-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 59:
TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTC GAG ATC AAA CGG 33
(60) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ED NO: 60:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 30 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per H-CDR1-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ED NO: 60:
GGA TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT 30
(61) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 61 :
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 30 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per H-CDR2-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 61:
ACC ATT AAT AGT AAT GGT GGT AGC ACC TTT 30
(62) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 62:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 48 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per H-CDR3-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 62:
AGA AGG AAT TAC CCC TAT TAC TAC GGT AGT AGA GGC TAC 42 TTT GAC TAC 48 (63) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 63:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 45 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per L-CDR1-F8
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 63:
AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT AGT TAT GGC AAT AGT TTT ATG 42 CAC 45
(64) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 64:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 21 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per L-CDR2-F8
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 64:
CGT GCA TTA AAT CT A GAA TOT 21
(65) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 65:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 27 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per L-CDR3-F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 65:
CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCG TGG ACG 27
(66) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 66:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 374 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per VH- F8 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 66:
CAG TGC AGC TGC AGG AGT CTG GGG GAG ACT TAG TGC AGC CTG 42 GAG GGT CCC TGA AAC TCT CCT GTG CAG CCT CTG GAT TCA CTT 84 TCA GTA GCT ATG GCA TGT CTT GGG TTC GCC AGA CTC CAG ACA 126 AG A GGC TGG AGT TGG TCG CAA CCA TTA ATA GTA ATG GTG GTA 168 GCA CCT TTT ATC CAG ACA GTG TGA AGG GCC GAT TCA CCA TCT 210 CCA GAG ACA ATG CCA AGA ACA CCC TGT ACC TGC AAA TGA GCA 252 GTC TGA AGT CTG AGG ACA CAG CCA TGT ATT ACT GTG CAA GAA 294 GAA GGA ATT ACC CCT ATT ACT ACG GTA GTA GAG GCT ACT TTG 336 ACT ACT GGG GCC AAG GG A CC A CGG TCA CCG TCT CCT C A 374
(67) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 67:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 336 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per VL-F8
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 67:
GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT 42 CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 84 GTT GAT AGT TAT GGC AAT AGT ITT ATG CAC TGG TAC CAG CAG 126 AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CGT GCA TTA 168 AAT CTA GAA TCT GGG ATC CCT GCC AGG TTC AGT GGC ,AGT GGG 210 TCT AGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT 252 GAT GAT GTT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG GAT 294 CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTC GAG ATC AAA CGG 336
(68) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 68:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 756 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per scFv(F8) (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 68:
CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGG GGA GAC TTA GTG CAG CCT 42 GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT 84 TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTT CGC CAG ACT CCA GAC 126 AAG AGG CTG GAG TTG GTC GCA ACC ATT AAT AGT AAT GGT GGT 168 AGC ACC TTT TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC 210 TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG AGC 252 AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GCA AGA 294 AGA AGG AAT TAC CCC TAT TAC TAC GGT AGT AGA GGC TAC TTT 336 GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT 378 GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG 420 GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT 462 CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 504 GTT GAT AGT TAT GGC AAT AGT TTT ATG CAC TGG TAC CAG CAG 546 AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CGT GCA TTA 588 AAT CTA GAA TCT GGG ATC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG 630 TCT AGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT 672 GAT GAT GTT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG GAT 714 CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTC GAG ATC AAA CGG ..756
(69) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 69:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 71 1 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: polinucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per scFv(P5) (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 69:
CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGG GGA GAC TTA GTG CAG CCT 42 GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GTC TCT GGA TTC AGT 84 TTG ACT GGC TAT GGC GTG AAT TGG GTT CGC CAG ACT CCA GAC 126 AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ATG ATT TGG GGT GAT GGT AAC 168 ACC GAT TAT AAT TCC AGT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC 212 AAA GAC AAT GCC AAG AGC ACC GTG TAC CTG CAA ATG AGC AGT 254 CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GCA AGA GAA 296 AGG GAT TAC CGC CTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC 338 ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT 380 GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CCA GCT 420 TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC 462 AGA GCC AGT GGA AAT ATT CAT AAT TAT TTG GCC TGG TAC CAG 504 CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAC TCC TCA TCT ATT ATA CAA 546 CAA CTC TAG CAG ATG GGA TCC CTG CCA GGT TCA GTG GCA GTG 588 GGT CTG GGA CAG ACT ACA CCC TCA CCA TTA ATC CTG TGG AGG 630 CTG ATG ATG TTG CAA CCT ATT ACT GTC AGC ACT TTT GTC GAC 672 TCC GAG GAC GTT CGG TGG AGG CAC CAA GCT CGA GAT CAA ACG 710 G 711
(70) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 70:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 10 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(B) NOME: H-CDR1
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 1 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 2 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 3 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 4 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 5 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 6 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 7 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D). ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 8 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 9 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 10 è un qualsiasi amminoacido
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 70: Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
(71) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 71 : (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 10 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidi ca
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(C) NOME: H-CDR2
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 1 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 2 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 3 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 4 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 5 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 6 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 7 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 8 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 9 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 10 è un qualsiasi amminoacido
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 71 : Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
(72) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 72: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 16 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) NOME: H-CDR3
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 1 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 2 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 3 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 4 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 5 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 6 è
un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 7 è
un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 8 è
un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 9 è
un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 10 è
un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 11 è
un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE « INFORMAZIONI: Xaa in posizione 12 è un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 13 è
un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 14 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 15 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 16 è
un qualsiasi amminoacido
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 72:
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15
(73) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ED NO: 73:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 15 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGENE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(E) NOME: L-CDR1
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 1 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 2 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 3 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 4 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 5 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 6 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 7 è un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 8 è un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 9 è un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 10 è un qualsiasi amminoacido, ed è eliminabile per delezione (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 11 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 12 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 13 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 14 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 15 è un qualsiasi amminoacido
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 73:
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15
(74) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ED NO: 74: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(F) NOME: L-CDR2
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 1 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 2 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 3 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 4 è
un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 5 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 6 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 7 è un qualsiasi amminoacido
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ED NO: 74: Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
(75) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 75: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 9 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR3
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 1 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 2 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 3 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 4 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 5 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 6 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 7 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 8 è un qualsiasi amminoacido
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: Xaa in posizione 9 è un qualsiasi amminoacido
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 75 Γ Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
(76) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 76: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 11 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR1-MUT
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 76:
Arg Ala Ser Giu Ser Val His Asn Tyr Met His
1 5 10
(77) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 77:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 33 bp
(B) TIPO: acido nucleico
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: oligonucleotide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(D) ALTRE INFORMAZIONI: DNA codificante per L-CDR1-MUT (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 77:
AGA GCC AGT GAA AGT GTT CAT AAT TAT ATG CAC 33
(78) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 78:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 10 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISMO: sequenza sintetica
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(B) NOME: H-CDR1-LYS/P5
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 78:
Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn
1 5 10
(79) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 79: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 16 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: H-CDR2-LYS/P5
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ED NO: 79:
Mei Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Val Lys Gly 1 5 10 15
(80) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 80: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 11 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: L-CDR1-LYS/P5
(D) ALTRE INFORMAZIONI:
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ID NO: 80:
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
(81) INFORMAZIONI SULLA SEQUENZA SEQ ID NO: 81: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 7 amminoacidi
(Β) TIPO: amxninoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) TIPOLOGIA: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide
(vi) ORIGINE: sequenza sintetica
(A) ORGANISMO:
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME:L-CDR2-LYS/P5
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ ED NO: 81: Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp
1 5
Claims (41)
- RIVENDICAZIONI 1. Peptidi denominati H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3 ed L-FR4, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate rispettivamente da SEQ ID NO: 1 a SEQ ED N: 8 nella lista di sequenze annessa, e dal fatto che inclusi nelle regioni VH e VL di un anticorpo legati covalentemente a peptidi denominati H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3 aventi le sequenze riportate rispettivamente da SEQ ID NO: 70 a SEQ ID N. 75 nella lista di sequenze annessa, secondo la disposizione mostrata nella figura 1, rendono detto anticorpo stabile e solubile in ambiente citoplasmatico.
- 2. Peptidi denominati H-CDR1-F8, H-CDR2-F8, H-CDR-3-F8, L-CDR1-F8, L-CDR2-F8, ed L-CDR3-F8, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate nella lista di sequenze annessa rispettivamente da SEQ ED NO: 9 a SEQ ID NO: 14, e dal fatto che inclusi nelle regioni VH e V.L di un anticorpo legati covalentemente ai peptidi di cui alla rivendicazione 1 secondo la disposizione mostrata nella figura 1 conferiscono a detto anticorpo specificità per il virus AMCV.
- 3. Peptidi denominati H-CDR1-LYS/P5, H-CDR2-L Y S/P5 , H-CDR-3-LYS/P5, L-CDR1-LYS/P5, L-CDR2-LYS/P5, ed L-CDR3-LYS/P5, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate nella lista di sequenze annessa rispettivamente come SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ED NO: 15, SEQ ID NO: 80, SEQ ED NO: 81, e SEQ ED NO: 16, e dal fatto che inclusi nelle regioni VH e VL di un anticorpo legati covalentemente ai peptidi di cui alla rivendicazione 1 secondo la disposizione mostrata nella figura 1, conferiscono a detto anticorpo specificità per il lisozima.
- 4. Peptidi denominati H-CDR3-LYS/11E e L-CDR3-LYS/1 1E, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate nella lista di sequenze annessa rispettivamente come SEQ ED NO: 17 e SEQ ID NO: 18, e dal fatto che inclusi nelle regioni VH e VL di un anticorpo legati covalentemente ai peptidi H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3 ed L-FR4 di cui alla rivendicazione 1, ai peptidi H-CDR1-F8, H-CDR2-F8, ed L-CDR2-F8 di cui alla rivendicazione 2, ed al peptide L-CDR1-MUT avente la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 76 secondo la disposizione mostrata nella figura 8, conferiscono a detto anticorpo specificità per il lisozima.
- 5. Peptidi denominati H-CDR3-BSA/9F ed L-CDR3-BSA/9F, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate nella lista di sequenze annessa come rispettivamente SEQ ID NO: 19 e SEQ ED NO: 20, e dal fatto che inclusi nelle regioni VH e VL di un anticorpo legati covalentemente ai peptidi H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3 ed L-FR4 di cui alla rivendicazione 1, ai peptidi H-CDR1-F8, H-CDR2-F8, ed L-CDR2-F8 di cui alla rivendicazione 2, ed al peptide L-CDR1-MUT avente la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 76 secondo la disposizione mostrata nella figura 8, conferiscono a detto anticorpo specificità per la sieroalbumina bovina.
- 6. Peptidi denominati H-CDR3-TSWV(BR01)/6H ed L-CDR3-TSWV(BR01)/6H, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate nella lista di sequenze annessa rispettivamente come SEQ ED NO: 21 e SEQ ID NO: 22, e dal fatto che inclusi nelle regioni VH e VL di un anticorpo legati covalentemente ai peptidi H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3 ed L-FR4 di cui alla rivendicazione 1, ai peptidi H-CDR1-F8, H-CDR2-F8, ed L-CDR2-F8 di cui alla rivendicazione 2, ed al peptide L-CDR1-MUT avente la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ DD NO: 76 secondo la disposizione mostrata nella figura 8, conferiscono a detto anticorpo specificità per la nucleoproteina del “tornato spotted wilt virus”.
- 7. Peptidi denominati H-CDR3-TSWV(P105)/1C ed L-CDR3-TSWV(PI05)/1C, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate nella lista di sequenze annessa rispettivamente come SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, e dal fatto che inclusi nelle regioni VH e VL di un anticorpo legati covalentemente ai peptidi H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3 ED L-FR4 di cui alla rivendicazione 1, ai peptidi H-CDR1-F8, H-CDR2-F8, ed L-CDR2-F8 di cui alla rivendicazione 2, ed al peptide L-CDR1-MUT avente la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 76 secondo la disposizione mostrata nella figura 8, conferiscono a detto anticorpo specificità per la nucleoproteina del “tornato spotted wilt virus”.
- 8. Peptidi denominati H-CDR3-CMV/4G ed L-CDR3-CMV/4G, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate nella lista di sequenze annessa rispettivamente come SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO; 26, e dal fato che inclusi nelle regioni VH e VL di un anticorpo legati covalentemente ai peptidi H-FRI, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3 ed L-FR4 di cui alla rivendicazione 1, ai peptidi H-CDR1-F8, H-CDR2-F8, ed L-CDR2-F8 di cui alla rivendicazione 2, ed al peptide L-CDR1-MUT avente la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 76 secondo la disposizione mostrata nella figura 8, conferiscono a detto anticorpo specificità per il “cucumber mosaic virus”
- 9. Peptidi denominati H-CDR3-CMV/4B ed L-CDR3-CMV/4B, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate nella lista di sequenze annessa rispettivamente come SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28, e dal fatto che inclusi nelle regioni VH e VL di un anticorpo legati covalentemente ai peptidi H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3 ed L-FR4 di cui alla rivendicazione 1, ai peptidi H-CDR1-F8, H-CDR2-F8, ed L-CDR2-F8 di cui alla rivendicazione 2, ed al peptide L-CDR1-MUT avente la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ED NO: 76 secondo la disposizione mostrata nella figura 8, conferiscono a detto anticorpo specificità per il “cucumber mosaic virus”
- 10. Peptidi denominati H-CDR3-CMV/2G ed L-CDR3-CMV/2G, caratterizzati dal fatto di avere le sequenze riportate nella liste di sequenze annessa rispettivamente come SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30, e dal fatto che inclusi nelle regioni VH e VL di un anticorpo legati covalentemente ai peptidi H-FR1, H-FR2, H-FR3, H-FR4, L-FR1, L-FR2, L-FR3 ed L-FR4 di cui alla rivendicazione 1, ai peptidi H-CDR1-F8, H-CDR2-F8, ed L-CDR2-F8 di cui alla rivendicazione 2, ed al peptide L-CDR1-MUT avente la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 76 secondo la disposizione mostrata nella figura 8, conferiscono a detto anticorpo specificità per il “cucumber mosaic virus”
- 11. Polipeptidi atti a costituire la regione variabile della catena pesante (VH) o la regione variabile della catena leggera (VL) di un anticorpo caratterizzati dal fatto di includere almeno uno dei peptidi secondo la rivendicazione 1, e dal fatto che strutturalmente connessi tra loro risultano in un anticorpo stabile e solubile.
- 12. Polipeptidi secondo la rivendicazione 11, in cui detto polipeptide corrispondente alla regione VH ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 31, detto polipeptide corrispondente alla regione VL ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 32 e P anticorpo risultante è specifico per il virus AMCV.
- 13. Polipeptidi secondo la rivendicazione 11, in cui detto polipeptide VH ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 33, detto polipeptide VL ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 34 e l’anticorpo risultante è specifico per il lisozima.
- 14. Polipeptidi secondo la rivendicazione 11, in cui detto polipeptide VH ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 35, detto polipeptide VL ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 36 e l’antìcorpo risultante è specifico per il lisozima.
- 15. Polipeptidi secondo la rivendicazione 11, in cui detto polipeptide VH ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ED NO: 37, detto polipeptide VL ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 38 e l’anticorpo risultante è specifico per la sieroalbimina bovina.
- 16. Polipeptidi secondo la rivendicazione 11, in cui detto polipeptide VH ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 39, detto polipeptide VL ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 40 e Panticorpo risultante è specifico per il “tornato spotted wilt virus”.
- 17. Polipeptidi secondo la rivendicazione 11, in cui detto polipeptide VH ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 41, detto polipeptide VL ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 42 e Fanticorpo risultante è specifico per il “tornato spotted wilt virus”.
- 18. Polipeptidi secondo la rivendicazione 11, in cui detto polipeptide VH ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 43, detto polipeptide VL ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 44 e Fanticorpo risultante è specifico per il “cucumber mosaic” virus.
- 19. Polipeptidi secondo la rivendicazione 11, in cui detto polipeptide VH ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 45, detto polipeptide VL ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ED NO: 46 e Fanticorpo risultante è specifico per il “cucumber mosaic” virus.
- 20. Polipeptidi secondo la rivendicazione 11, in cui detto polipeptide VH ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 47, detto polipeptide VL ha la sequenza riportata nella lista di sequenze come SEQ ID NO: 48 e Fanticorpo risultante è specifico ρετ il “cucumber mosaic” virus.
- 21. Anticorpo caratterizzato dal fatto di comprendere quali regioni VH e VL almeno uno dei polipeptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 20.
- 22. Anticorpo secondo la rivendicazione 21, in cui detto anticorpo è un scFv FAB, Fv, dAb, IgG o IgA.
- 23. Anticorpo secondo la rivendicazione 21, in cui detto anticorpo è un scFv ed i polipeptidi VH e VL sono connessi da un linker.
- 24. Anticorpo secondo la rivendicazione da 23, in cui detto linker ha la sequenza riportata nella lista di sequenze annessa come SEQ ID NO: 51.
- 25. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detto anticorpo comprende i polipeptidi secondo la rivendicazione 12.
- 26. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detto anticorpo comprende i polipeptidi secondo la rivendicazione 13.
- 27. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detto anticorpo comprende i polipeptidi secondo la rivendicazione 14.
- 28. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detto anticorpo comprende i polipeptidi secondo la rivendicazione 15.
- 29. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detto anticorpo comprende i polipeptidi secondo la rivendicazione 16.
- 30. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detto anticorpo comprende i polipeptidi secondo la rivendicazione 17.
- 31. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detto anticorpo comprende i polipeptidi secondo la rivendicazione 18.
- 32. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detto anticorpo comprende i polipeptidi secondo la rivendicazione 19.
- 33. Anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detto anticorpo comprende i polipeptidi secondo la rivendicazione 20.
- 34. Polinucleotidi caratterizzati dal fatto di codificare per almeno un peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10.
- 35. Polinucleotidi caratterizzati dal fatto di codificare per almeno un polipeptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 20.
- 36. Polinucleotidi caratterizzati dal fatto di codificare per almeno un anticorpo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 33.
- 37. Composizione farmaceutica caratterizzata dal fatto di comprendere come principio attivo una quantità terapeuticamente efficace di almeno uno dei peptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, dei polipeptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 20, degli anticorpi ingegnerizzati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 33, e/o dei polinucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 34 a 36 in un veicolo farmaceuticamente compatibile.
- 38. Peptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, polipeptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 20, anticorpi ingegnerizzati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 33, e/o polinucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 34 a 36, per uso come medicamento
- 39. Uso dei peptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, dei polipeptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 20, degli anticorpi ingegnerizzati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 33, e/o dei polinucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 34 a 36, per la preparazione di farmaci utilizzabili in terapia genica.
- 40. Uso peptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, dei polipeptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 20, degli anticorpi ingegnerizzati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 33, e/o dei polinucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 34 a 36, per la preparazione di farmaci utilizzabili per il trattamento di patologie di vegetali o animali associate all’accumulo di almeno una molecola in ambiente intracellulare o extracellulare.
- 41. Uso dei peptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, dei polipeptidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 20, degli anticorpi ingegnerizzati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 33, e/o dei polinucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 34 a 36, per la diagnosi di patologie di vegetali o animali associate all’ accumulo di almeno una molecola in ambiente intracellulare o extracellulare.
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