CN114450410A - 使用从头设计的共定位依赖蛋白开关的超特异性细胞靶向 - Google Patents

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麦克·约瑟夫·拉约伊
罗伯特·A·兰甘
大卫·贝克
吉莉安·露丝·布鲁菲
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Abstract

本发明公开了一种可隔离生物活性肽和/或结合域，使其处于非活性(“关闭”)状态，直到与称为钥匙的第二设计多肽结合，仅当蛋白开关组分在结合到其目标共定位时，所述多肽诱导激活(“打开”)所述生物活性肽或结合域的构象变化的蛋白开关、此蛋白开关的组分及其用途。

Description

使用从头设计的共定位依赖蛋白开关的超特异性细胞靶向
交叉引用
本申请要求于2019年5月16日提交的序列号为62/848802的美国临时专利申请以及2020年1月21日提交的序列号为62/964016的美国临时专利申请的优先权，通过引用将其全部并入本发明。
联邦资助声明
本发明是在国家科学基金授予的批准号为CHE-1629214、国防威胁降低局授予的批准号为HDTRA1-18-1-0001和美国国立卫生研究院授予的批准号为R01CA114536的政府资助下进行的。政府对这项发明拥有一定的权利。
通过EFS-WEB以电子方式提交的序列表参考
本申请包括一个名为“19-851-PCT_Sequence-Listing_ST25.txt”的以电子文本文件形式提交的序列列表，其大小(字节)为32MB，并于2020年5月14日创建。根据37 CFR§1.52(e)(5)，本电子文件中包括的信息通过引用完整并入本申请。
背景技术
生理擅长整合多种信号以控制功能；然而，自然系统为了特定功能高度进化，使它们难以重新调整。能够将结合事件和预测响应组合进行整合的工程系统仍然是一个突出的挑战。这种系统对于基于表面标志物组合识别的靶向细胞特别有用：大多数哺乳动物细胞类型与其他组织的不同之处在于其表面上存在的标志物组合。
发明内容
一方面，本发明提供了体外、离体或体内提高细胞选择性的方法，包括：
(a)将细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽(cage polypeptide)接触，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区(latchregion)，其中，所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在不与钥匙多肽(keypolypeptide)共定位(colocalization)的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于细胞上或细胞内的第一细胞部分；和
(b)将所述细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合到存在于所述细胞上或细胞内的第二细胞部分，
其中，所述第一细胞部分和所述第二细胞部分不同或相同。
另一方面，本发明提供了体外、离体或体内提高相互作用的细胞选择性的方法，包括：
(a)将两个或多个细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中，所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在不与钥匙多肽共定位的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于所述两个或多个细胞之间的突触(synapse)上的第一细胞部分；和
(b)将所述两个或多个细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合到存在于所述两个或多个细胞之间的突触上的第二细胞部分，
其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分相同或不同。
再一方面，本发明提供了体外、离体或体内靶向异质细胞(两种以上不同细胞类型)的方法，其中第一细胞部分和第二细胞部分存在于第一细胞上，第一细胞部分和第三细胞部分存在于第二细胞上，包括：
(a)将两个或多个细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，并且其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在不与钥匙多肽共定位的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于所述两个或多个细胞上或内的第一细胞部分；
(b)将所述两个或多个细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在共定位时，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第二结合域能够结合到存在于还包含所述第一细胞部分的细胞上的第二细胞部分，以及
(c)将所述两个或多个细胞与融合到第三结合域的第二钥匙多肽接触，其中在共定位时，所述第二钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活一种或多种生物活性肽，其中所述第三结合域能够结合到存在于包括第一细胞部分的细胞上的第三细胞部分，
其中，所述第一细胞部分、第二细胞部分和第三细胞部分不同，并且包括第二细胞部分的细胞和包括第三细胞部分的细胞不同。
一方面，本发明提供了体外、离体或体内降低脱靶活性的方法，包括：
(a)将两个或多个细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，并且其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在不与钥匙多肽共定位的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于细胞上的第一细胞部分；
(b)将所述两个或多个细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在共定位时，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第二结合域能够结合到存在于还包含所述第一细胞部分的细胞上的第二细胞部分，以及
(c)将所述两个或多个细胞与融合到第三结合域的诱饵笼多肽接触，其中所述诱饵笼多肽包括诱饵结构区，所述诱饵结构区在与所述钥匙多肽和所述第一笼多肽共定位后，能够优先结合到所述第一钥匙多肽，其中所述第三结合域能够结合到存在于包含第一细胞部分和第二细胞部分的细胞上的第三细胞部分。
另一方面，本发明提供了包括(i)融合到第一结合域的第一笼多肽和(ii)融合到第二结合域的第一钥匙多肽的蛋白复合物，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中所述第一钥匙多肽结合到所述笼结构区上，其中所述一种或多种生物活性肽被激活，并且其中，所述第一结合域结合存在于细胞上或细胞内或两个相互作用细胞的突触上的第一细胞部分，所述第二结合域结合存在于细胞上或细胞内或两个相互作用细胞的突触上的第二细胞部分，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分不同或相同。
另一方面，本发明提供了包括(i)融合到第一结合域的第一钥匙多肽和(ii)融合到第二结合域的诱饵笼多肽的蛋白复合物，其中所述第一钥匙多肽结合到所述诱饵笼多肽上，其中，所述第一结合域结合存在于细胞上或细胞内或两个相互作用细胞的突触上的第一细胞部分，所述第二结合域结合存在于细胞上或细胞内或两个相互作用细胞的突触上的第二细胞部分，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分不同或相同。
在一方面，本发明提供的组合物包括：
(a)融合到第一结合域的第一笼多肽或编码该第一笼多肽的多核苷酸，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中，所述结构区与所述闩区相互作用，以在不与钥匙多肽共定位的情况下阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于细胞上或细胞内的第一细胞部分；和
(b)融合到第二结合域的第一钥匙多肽或编码该钥匙多肽的多核苷酸，其中在与所述第一笼多肽共定位后，第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合存在于所述细胞上或细胞内的第二细胞部分，
其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分不同或相同。
另一方面，本发明提供的组合物包括：
(a)第一笼多肽，其包括(i)结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，以及(iii)第一结合域，其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性；
(b)第一钥匙多肽，其能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述钥匙多肽包括第二结合域，
其中，所述第一结合域和所述第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，(ii)相同细胞表面上的相同部分，(iii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触上的相同部分；和
(c)任选地，当所述一种或多种生物活性肽被激活时，结合到所述一种或多种生物活性肽的一种或多种效应物。
另一方面，本发明提供的组合物包括：
(a)一种或多种表达载体，其编码和/或细胞表达：
(i)第一笼多肽，其包括(i)结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，以及(iii)第一结合域，其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性；和
(ii)第一钥匙多肽，其能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述钥匙多肽包括第二结合域，
其中，所述第一结合域和第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，(ii)相同细胞表面上的相同部分，(iii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触上的相同部分：和
(b)任选地，当所述一种或多种生物活性肽被激活时，结合到所述一种或多种生物活性肽的一种或多种效应物，和/或编码所述一种或多种效应物的一个或多个核酸。
一方面，本发明提供了用于细胞靶向的方法，包括：
(a)接触含有细胞的生物样本，所述细胞具有：
(i)笼多肽，其包括(i)结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，以及(iii)靶向目标细胞的第一结合域，其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性；和
(ii)钥匙多肽，其包括靶向目标细胞的第二结合域，其中所述第一结合域和所述第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，(ii)相同细胞表面上的相同部分，(iii)相接触的两个细胞之间的突触的不同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触的相同部分；
其中，所述接触发生持续一段时间并在以下条件下发生：促进所述笼多肽和所述钥匙多肽与目标细胞结合，并促进所述钥匙多肽与所述笼结构区的结合，以仅当所述笼多肽和所述钥匙多肽共定位于目标细胞时置换所述闩区并激活所述一种或多种生物活性肽；
(b)在促进一种或多种效应物与一种或多种激活的生物活性肽结合以产生效应物-生物活性肽复合物的条件下，将所述生物样品与一种或多种效应物接触；和
(c)任选地检测所述效应物-生物活性肽复合物，其中所述效应物-生物活性肽复合物提供生物样品中目标细胞的测量值。
另一方面，本发明提供了非天然存在的多肽，其包括：
(a)螺旋束，其包括2到7个α螺旋组成；和
(b)一个或多个结合域；
其中所述螺旋束和所述一个或多个结合域不同时存在于天然存在的多肽中。
另一方面，本发明提供了非天然存在的多肽，其包括：
(a)包括与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自不包括任选氨基酸残基的、SEQ ID NO：27359-27392、1-49、51-52、54-59、61、65、67-14317、27094-27117、27120-27125、27278至27321氨基酸序列、或表7、表8或表9中所列的笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的N端和/或C端60个氨基酸是任选的；和
(b)一个或多个结合域。
在一个方面，本发明提供了非天然存在的多肽，其包括
(a)包括与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27359-27392、1-49、51-52、54-59、61、65、67-14317、27094-27117、27120-27125、27278至27321的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，不包括闩区中的氨基酸残基；和
(b)一个或多个结合与域。
一方面，本发明提供了非天然存在的多肽，其包括与选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列(包括任选氨基酸残基)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或与选自SEQ ID NO：27393-27398的氨基酸序列70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，包括任选氨基酸残基。
附图说明
图1a-图1g.一个从头设计的蛋白开关在细胞表面执行“与”逻辑。a.细胞表面计算逻辑运算的能力可以提高靶向选择性，为异质组织提供灵活性，避开健康组织。b.用于创建共定位依赖的闩正交笼-钥匙蛋白(Co-LOCKR)的新笼设计结构；x射线晶体结构(白色)与计算设计模型(绿色)匹配，所有主链原子的RMSD为
Figure BPA0000315860050000071
横截面显示了疏水残基的不对称堆积(红色)和不对称氢键网络(蓝色方框)。c.共定位依赖蛋白开关的示意图，其被调整使得笼和钥匙在溶液中不相互作用，但在表面上共定位时强烈相互作用。Co-LOCKR亚单位通过靶向结构域与表面结合。d.流式细胞术在表达Her2-eGFP、EGFR-iRFP、两者均表达或两者均不表达的K562细胞混合群体中鉴别Her2+/EGFR+细胞。e.示意图描述了当笼和钥匙在同一细胞表面上共定位时，效应蛋白招募发生的“与”逻辑。f.图1c中的混合K562细胞群与111nM靶向Her2的笼、111nM靶向EGFR的钥匙和50nM Bcl2-AF594一起孵育。仅在K562/Her2/EGFR细胞中观察到Bcl2结合。g.图1c中的混合K562细胞群与一系列靶向Her2的笼和靶向EGFR的钥匙的稀释液一起孵育。此外，将50nM Bcl2-AF594与Co-LOCKR(实线)共同孵育或在洗涤细胞后添加(虚线)。图中灰色阴影区域表示非共定位激活，其中过量的笼和钥匙在与靶细胞的结合中竞争过了笼-钥匙-Bcl2复合物(在溶液中形成)。据报道，Bcl2结合与用3000nM靶向Her2的笼、3000nM靶向EGFR的钥匙和50nM Bcl2-AF594培养的K562细胞有关。
图2a-图2d.调整Co-LOCKR灵敏度。a.具有黄色Bim功能肽的Co-LOCKR设计模型。三种掩藏的疏水性氨基酸突变为丙氨酸或丝氨酸，以削弱笼-闩亲和力，从而有利于笼-钥结合。b.与未突变的母体变异体相比，被调整的Co-LOCKR变异体表现出更强的共定位依赖性激活。使用图1c中的K562细胞混合群体，通过流式细胞术评估招募Bcl2-AF594的CL_CHKE变体。所示数据代表12.3nM CL_CHKE，图8c显示了每个变体的完整稀释系列。c.HEK293T细胞系的共聚焦显微镜显示，Co-LOCKR开关仅在Her2和EGFR共定位的情况下招募Bcl2-AF680效应蛋白。每个细胞系在成像前用CL_CHKE(I269S笼)和Bcl2-AF680孵育。NucBlueTM是一种核染色剂，eGFP表示Her2定位，mCherryTM表示EGFR定位，AF680表示Bcl2结合以响应Co-LOCKR激活，白色表示Her2 eGFP和EGFR mCherryTM信号的交叉。比例尺为10μm。图15a-图15c中包括这些图像的未删减版本。d.热图显示AF680信号(Co-LOCKR激活)与eGFP(Her2)和mCherryTM(EGFR)像素强度的对比。计算基于图15a中未删减的293T/Her2/EGFR图像。
图3a-图3d.Co-LOCKR在混合细胞群中执行二输入和三输入逻辑运算。a.用Co-LOCKR为两个表达Her2、EGFR和EpCAM不同组合的K562细胞群体招募Bcl2-AF594。用于每个细胞系的标志表达以及笼和钥匙靶向结构域的身份(identity)在每个条形图下方示出。红色突出显示表示基于相对抗原表达的Bcl2-AF594信号的预期幅度。b.[Her2 AND (EGFR OREpCAM)]逻辑机制示意图。c.[Ag1 AND (Ag2 OR Ag3)]逻辑组合用于招募Bcl2-AF594。d.[Her2 AND EpCAM NOT EGFR]逻辑机制示意图。诱饵充当海绵来隔离钥匙，从而阻止笼激活。e.CL_CHKEpDE用于招募Bcl2-AF594。将亲代笼(左)与I287A笼(右)进行比较。与CL_CHKEp相比，CL_CHKEpDE的信号幅度降低，可能是因为诱饵竞争溶液中的钥匙进行结合；然而，仍然有足够的信号来计算[Her2 AND EpCAM NOT EGFR]逻辑。对于所有分图，群体1为[K562/EpCAMlo、K562/EGFR/EpCAMlo、K562/EpCAMlo/Her2和K562/EGFR/EpCAMlo/Her2]，群体2为[K562/EpCAMlo、K562/EGFR/EpCAMlo、K562/EpCAMhi/Her2和K562/EGFR/EpCAMhi/Her2]。误差棒表示K562和K562/EGFR的6个独立重复的标准误差(SEM)，以及所有其他的3个独立重复的标准误差。
图4a-图4c.Co-LOCKR的计算设计。a.Langan等人(9)概述了LOCKRa是如何设计的。将现有的同源三聚体(10)连接到单个多肽链中，并且调整笼/LOCKR连接处，以便钥匙结合进行诱导激活。b.Co-LOCKR的计算设计。除现有氢键网络和笼-闩连接处涉及的残基外，所有侧链均从LOCKRa骨架上移除。一个新的Rosetta设计运行搜索不对称氢键网络，然后搜索不对称设计的核心和表面残基。由此产生的螺旋束被缩短以减少聚集，并且笼-闩和笼-钥匙连接处被调整以实现共定位依赖。通过重新设计Co-LOCKR笼来去除Bim功能肽，并调整其与钥匙的亲和力，从而产生诱饵。LOCKRa和Co-LOCKR的横截面图显示了用新的氢键网络(左图)或不对称疏水填充(packing)(右图)替换C3对称疏水填充的堆芯重新设计。d.LOCKRa和Co-LOCKR共有60.8％的序列一致性(用Geneious软件游离端间隙全局比对成对序列一致性)。
图5.重新设计LOCKR笼可减少聚集。Langan等人(9)使用SuperdexTM 75-Engress10/300 GL柱(GE)通过尺寸排阻色谱法评估了LOCKRa笼和不对称LOCKR(asymLOCKR)笼(上图)以及从其闩C端删除0、7或10个残基的三种新的Co-LOCKR笼变体(下图)。
图6a-图6c.Co-LOCKR系统由基于可逆蛋白相互作用的热力学机制控制。在同一表面上共定位笼和钥匙会导致局部浓度大幅提高，从而改变结合平衡。根据热力学机理，络合物可以在溶液(a)或表面(b)上形成。我们的流式细胞术数据显示，溶液中出现的任何预复合Co-LOCKR蛋白都不会导致单个抗原靶细胞的明显染色。c.共定位将反应曲线向左移动，以便在较低浓度的Co-LOCKR蛋白下发生激活。
图7a-图7b.笼和诱饵的强度可以通过调整的笼-闩、笼-钥匙、诱饵-闩和诱饵-钥匙连接处来调整。笼-闩和笼-钥匙连接处的残基呈橙色。Bim以洋红色显示。我们通过用小的亲水性氨基酸或丝氨酸替换大的疏水性氨基酸，合理地降低了这些界面的亲和力。a.处于“关闭”构象的笼侧视图。b.钥匙的侧视图。c.处于“关闭”构象的笼横截面。
图8a-图8e.笼-闩连接处的突变可预测地调整Co-LOCKR开关的灵敏度。a.有黄色Bim功能肽的Co-LOCKR设计模型。三种掩藏的疏水性氨基酸突变为丙氨酸或丝氨酸，以削弱笼-LOCKR亲和力，从而有利于笼-钥匙结合。此分图由图2a重新生成而来。b.使用生物膜层干涉技术((Octet))评估与共定位无关的激活。评估CL_CHKE稀释系列与固定在链霉亲和素八肽末端的生物素化Bcl2的结合。更多的破坏性突变提高了开关的灵敏度。c.与母体Co-LOCKR变异体相比，被调整的Co-LOCKR变异体表现出更大的共定位依赖性激活灵敏度和响应性。使用图1c中的混合K562细胞群，通过流式细胞术评估CL_CHKE变体的稀释系列。Bcl2-AF594被招募到K562/Her2/EGFR细胞(实线)，与K562、K562/Her2和K562/EGFR细胞的结合最小(虚线表示最大的脱靶结合信号)。更多的破坏性突变提高了开关的灵敏度，I269S变体表现出最大的开关激活。母体变异体的靶向结合峰值约为37nM，突变变异体的靶向结合峰值约为12nM。d.在流式细胞术之前，通过在较大体积中培养细胞，I269S变体的开关激活在低CL_CHKE浓度下得到增强。e.当2nM的CL_CHKE I269S变体与目标细胞在较大的孵育体积中孵育时，靶开关而不是脱靶开关激活提高。
图9a-图9c.在表达Her2-eGFP、EGFR-iRFP、表达两者或均不表达两者的K562细胞混合群体中，评估共定位依赖性激活的Co-LOCKR变异体。通过Bcl2-AF594结合测定，混合、连续稀释Co-LOCKR笼变体和钥匙，并评估靶向激活(a)、脱靶激活(b)和特异性(靶向/最大脱靶激活，c)。变体I269S具有最高的靶向激活，亲代笼具有最低的脱靶激活，变体I287A具有最佳倍比的靶向特异性。对于母体变体，靶向结合在约37nM的笼和钥匙处达到峰值，而对于调整变体，靶向结合在约12nM的笼和钥匙处达到峰值。每个条形图代表一个数据点。
图10a-图10b.K562和Raji肿瘤细胞上EGFR、EpCAM和Her2的表达水平。流式细胞术分析所示K562(a)或Raji(b)细胞系上EGFR(红色)、EpCAM(蓝色)和Her2(绿色)的表达。所有抗体均用于PE通道，以允许使用Quantibrite珠对表面分子的数量进行定量。
图11a-图11c.Co-LOCKR“与”逻辑根据表面抗原的组合区分癌细胞系。a.直接融合到Bim的靶向结构域用于测量基于Bcl2-AF594的Her2、EGFR和EpCAM的相对表达。b.Co-LOCKR根据内源性抗原表达水平区分A431(Her2low/EGFRhigh/EpCAMlow)和SKBR3(Her2high/EGFRlow/EpCAMlow)。K562/Her2/EGFR/EpCAMKO细胞作为特异性对照。通过Bcl2-AF594招募来测定Co-LOCKR激活。c.与化学计量活化机制一致，Co-LOCKR信号受较少表达的表面抗原数量的限制。此外，当其中一种抗原在高水平表达时，激活信号比当两种抗原低水平表达时更高。这表明Co-LOCKR可以作为一个阈值门来避免低抗原表达的细胞。事实上，这可能解释了图3a中表达高水平EpCAM的K562细胞的优先靶向性。纵轴是通过Co-LOCKR对Bcl2-AF594的招募，横轴是在逻辑运算中通过靶向较低表达抗原的Bim-DARPin对Bcl2-AF594的招募。
图12.在表达Her2-eGFP、EGFR-iRFP、表达两者或均不表达两者的K562细胞混合群体中使用单链抗体进行Co-LOCKR靶向。通过抗Her2单链抗体靶向Her2的笼I269S与通过抗EGFR单链抗体靶向EGFR的钥匙结合。通过Bcl2-AF594结合测定，连续稀释该混合物并评估其特异性靶向共表达Her2和EGFR的K562细胞的能力。实线为未洗涤，虚线为在分析后30分钟内洗涤。
图13a-图13b.调整笼和诱饵变体以执行[Her2AND EpCAM NOT EGFR]逻辑。a.具有强笼-闩连接的笼示出弱“与”激活和严密的“非”失活，而具有弱笼-闩连接的笼示出强“与”激活和漏失的(leaky)“非”失活。这些结果表明，笼活性可被调整以实现所需的生物功能。例如，变体I287A、I287S和I269S对[Her2AND EpCAMlow]表现出更高的灵敏度，同时在存在EGFR的情况下最小程度地降低漏失，而亲代笼对[Her2AND EpCAMlow非EGFR]表现出更好的失活。b.可以调整诱饵以减少“非”失活的漏失。对具有不稳定突变或截断以削弱闩的诱饵变体在混合细胞群：K562/EpCAMlow(灰色)、K562/EGFR/EpCAMlow(黄色)、K562/Her2/EpCAMlow(紫色)和K562/Her2/EpCAMlow/EGFR(棕色)上执行[Her2AND EpCAM非EGFR]逻辑的能力进行评估。最强的诱饵(如G24)表现出最小的漏失，但减少了K562/Her2/EpCAMhigh的靶向性，可能是由于不依赖于共定位的钥匙结合；最弱的诱饵(如Box1C1)显示出K562/Her2/EpCAMhigh的最高靶向性以及K562/Her2/EpCAMhigh/EGFR上的大量漏失。每个条柱代表n＝1个样本。
图14a-图14d.调整笼和诱饵变体以执行[Her2AND EpCAM NOT EGFR]逻辑。针对0nM、5nM或20nM的EGFR诱饵1或EGFR诱饵G31测试不同的钥匙和笼浓度。在没有诱饵的情况下，紫色的“中靶”线对应于K562/EpCAMhi/Her2期望的“与”信号，棕色的“脱靶”线对应于诱饵必须去掉的K562/EGFR/EpCAMhi/Her2非期望的“与”信号。使用5nM EGFR诱饵G31作为非门增强了靶向结合信号，同时最小程度地提高K562/EGFR/EpCAMhi/Her2的非期望靶向性。这些结果与假设一致，即溶液中的诱饵-钥匙结合应最小化，以保持Co-LOCKR信号。a.5nM钥匙EpCAM，5nM Her2笼。b.5nM钥匙EpCAM、5nM Her2笼EpCAM I287A。c.20nM钥匙EpCAM，20nMHer2笼。对图3e中描述的原始情况做了注释。d.20nM钥匙EpCAM、20nM Her2笼I287A。
图15a-图15c.Co-LOCKR靶向HEK293T细胞表达Her2和EGFR的Co-LOCKR共聚焦显微镜图像。a.用于生成图2c-图2d的未裁剪293T/Her2/EGFR图像(绿色为Her2-eGFP，红色为EGFR-mCherry，蓝色为Bcl2-AF680)。b.伪彩色(psueudocolored)的未裁剪293T/Her2/EGFR图像，如图2c所示(白色是Her2 eGFP和EGFR mCherryTM的交叉点，蓝色是NucBlueTM，品红色是Bcl2-AF680)。上图的比例尺为20μm，下图的比例尺为10μm。c.通过共聚焦显微镜评估所有细胞系的未裁剪图像和染色状况。比例尺为20μm。
图16.流式细胞术测定DARPin结合物亲和力。将N端融合到Bim的抗Her2或抗EGFRDARPins与Bcl2-AF594进行预复合，并从300nM经3倍连续稀释到0.4nM。该稀释系列用于对在50μl孵育体积的室温下表达Her2-eGFP、EGFR-iRFP或表达两者或均不表达两者1小时的K562细胞的混合群体进行标记。然后在添加有0.1％牛血清白蛋白的PBS中洗涤细胞，并在LSRII流式细胞仪上分析。DARPin的表观Kd约为10nM，这与Co-LOCKR的激活受DARPin结合亲和力的限制的假设一致。
具体实施方式
如本发明所述，本发明所述的多肽和组合物可用于创建“蛋白开关”，其中笼多肽和钥匙多肽包括结合到不同靶点的结合域，钥匙多肽结合到笼多肽，并且仅当不同的靶点紧密相关时触发生物活性肽的激活，使得笼和钥匙多肽在结合到其靶点时共定位。
靶向特异性一直是生物医学领域长期的一个问题。尽管针对特定细胞类型的靶向治疗剂的目标由来已久，但缺乏针对明确识别所需细胞类型的抗原精确组合的通用解决方案。能够进行多输入整合的自然系统被硬编码为难以模块化重新分配的特定生物输出。本发明公开的方法、组合物和多肽是模块化的，因为它们由整合两种靶抗原共定位的从头设计的多肽组成，以便有条件地暴露可招募任意效应物功能的生物活性肽。在这项工作之前，不可能产生这种系统，所述系统能够整合靶细胞表面上两种或两种以上抗原的共定位，从而有条件地暴露一种可以模块化招募任意效应物功能的生物活性肽。此外，以前不可能设计出这种从头的蛋白，所述蛋白在它们被共定位之前，能够在非活性构象中隔离生物活性肽。最后，以前不可能调整蛋白致动器(actuator)的灵敏度以招募适当数量的效应物。
所述方法可包括使用本发明公开的任何实施方案或实施方案组合的多肽、核酸、载体、细胞和/或组合物。在各种实施方案中，该方法包括用上文和实施方案中详细描述的任何实施方案或实施方案的组合，对与、或和/或非逻辑门进行使用。
I定义
本发明引用的所有参考文献全部通过引用合并。如本发明所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数引用。
如本发明所使用的，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)，苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
本发明任何方面的所有实施方案都可以组合使用，除非上下文另有明确规定。
本发明实施方案的描述并非旨在详尽无遗或将本发明限制为所公开的精确形式。虽然本发明描述本发明的具体实施方案和实施例是说明目的，但如相关领域的技术人员将认识到的，在本发明的范围内可以进行各种等效修改。
这些多肽是“非天然存在的”，因为在任何天然存在的多肽中都找不到整个多肽。应当理解，多肽的组分可以是天然存在的，包括但不限于可包括在一些实施方案中的生物活性肽。
所述笼多肽包括2到7个α螺旋的螺旋束。在各种实施方案中，螺旋束包括3-7、4-7、5-7、6-7、2-6、3-6、4-6、5-6、2-5、3-5、4-5、2-4、3-4、2-3、2、3、4、5、6或7个α螺旋。
本发明的螺旋束笼多肽的设计可以通过任何合适的方法进行。在一个非限制性实施方案中，RosettaTM程序中的BundleGridSamplerTM可用于基于卷绕线圈的Crick表达式生成主干几何体，并允许对卷绕线圈表达式参数值的规则网格进行高效并行采样，这可以通过使用任何合适的方法设计氢键网络，然后进行RosettaTM侧链设计来补充。在另一非限制性实施方案中，基于总分、未饱和氢键数量以及蛋白核心空腔缺乏的最佳评分设计可被选择用于螺旋束笼多肽设计。
每个α螺旋可以为适合预期用途的任何适当长度和任何氨基酸组成。在一个实施方案中，每个螺旋的长度独立地为18到60个氨基酸。在各种实施方案中，每个螺旋在长度上独立地为18-60、18-55、18-50、18-45、22-60、22-55、22-50、22-45、25-60、25-55、25-50、25-45、28-60、28-55、28-50、28-45、32-60、32-55、32-50、32-45、35-60、35-55、35-50、35-45、38-60、38-55、38-50、38-45、40-60、40-58、40-55、40-50或40-45个氨基酸。
在一些方面，本发明公开的多肽包括接头(linker)。在一些方面，接头包括一个或多个氨基酸，例如，氨基酸接头或肽接头。在一些方面，所述接头将第一α螺旋连接到第二α螺旋。连接每个α螺旋的氨基酸接头可以具有适合预期用途的任何适当长度或任何氨基酸组成。在一个非限制性实施方案中，每个氨基酸接头的长度独立地在2到10个氨基酸之间，不包括可与接头融合的任何其他功能序列。在各种非限制性实施方案中，每个氨基酸接头的长度独立地为3-10、4-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10、2-9、3-9、4-9、5-9、6-9、7-9、8-9、2-8、3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、2-7、3-7、4-7、5-7、6-7、2-6、3-6、4-6、5-6、2-5、3-5、4-5、2-4、3-4、2-3、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在所有实施方案中，所述接头可以是结构化的或柔性的(例如，poly-GS)。这些接头可编码进一步的功能序列，包括但不限于蛋白酶切割位点或分割(split)内含子系统的一半(参见下面的序列)。
所述一个或多个结合域可以是适合预期用途的任何多肽结合域。在一个实施方案中，所述一个或多个结合域包括细胞表面蛋白结合多肽。在另一实施方案中，所述螺旋束通过任何合适的连接多肽接头或非多肽接头连接到一个或多个结合域。在一个实施方案中，所述螺旋束通过任何合适的多肽接头连接到一个或多个结合域，包括但不限于上述螺旋域之间的接头。
在一些方面，所述一种或多种笼多肽和钥匙多肽还包括连接笼多肽或钥匙多肽和一个或多个结合域的接头。在一些方面，所述笼多肽包括将所述笼多肽连接到结合域的接头。在一些方面，所述钥匙多肽包括将所述钥匙多肽连接到结合域的接头。可以使用本领域已知的任何接头。在一些方面，所述接头包括一个或多个氨基酸。在某些方面，接头是可切割的。在一些方面，接头是本发明公开的任何接头。
下面更详细地描述了所述一个或多个结合域的附加实施方案。
此第一方面的多肽包括称为“闩区”的区域，其可用于插入生物活性肽。因此，所述笼多肽包括闩区和结构区(即：不是笼多肽闩区的剩余部分)。当所述闩区经修饰以包含一种或多种生物活性肽时，所述笼多肽的结构区与闩区相互作用以阻止所述生物活性肽的活性。在笼多肽和钥匙多肽共定位，而结合域结合到其靶标上(如下所述)后，在被钥匙多肽激活时，闩区与其结构区的相互作用分离，以暴露生物活性肽，从而允许所述肽发挥功能。
本发明所用的“生物活性肽”是任何长度或任何氨基酸组成的任何肽，其能够选择性地结合到特定的靶点(即：能够结合到“效应物”多肽)。此类生物活性肽可包括非活性构象中的所有三种二级结构：α-螺旋、β-链和环。这方面的多肽可用于控制多种功能肽的活性。利用严密的、可诱导的控制来利用这些生物功能的能力是有用的，例如，在工程细胞(功能的可诱导激活、工程复杂的逻辑行为和回路等)、开发传感器、开发基于可诱导蛋白的疗法以及制造新的生物材料方面。生物活性肽的其他细节如下所述。
所述闩区可存在于笼多肽的任一末端附近。在一个实施方案中，将闩区放置在C-端螺旋上，以便定位生物活性肽，以最大程度地掩藏需要隔离的功能残基，保持生物活性肽处于非活性状态，同时掩藏疏水残基并促进极性肽的溶剂暴露/补偿氢键残基。在各种实施方案中，所述闩区可包括N端或C端部分的笼多肽中单个α螺旋的一部分或全部。在各种其他实施方案中，所述闩区可包括笼多肽中的第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七α螺旋的一部分或全部。在其他实施方案中，所述闩区可包括笼多肽中两个或多个不同α螺旋的全部或部分；例如，一个α螺旋的C端部分和下一个α螺旋的N端部分，所有两个连续的α螺旋，等等。
本发明所用的“突触”是两个相互作用的细胞之间的连接处，通常涉及连接处的蛋白-蛋白接触。免疫突触是抗原呈递细胞或靶细胞与T/B细胞或自然杀伤细胞等淋巴细胞之间的界面。神经元突触是两个神经细胞之间的连接处，由一个微小的间隙组成，脉冲通过神经递质的扩散。例如，当检测到彼此接触而非不接触的细胞时，该实施方案特别有用。例如，我们可以只识别与特定靶细胞相互作用的T细胞，但避免所有非相互作用的T细胞。
在本申请中，术语“多肽”在其最广泛的意义上用于指代亚单位氨基酸序列。本发明的多肽可包括L-氨基酸+甘氨酸、D-氨基酸+甘氨酸(其在体内抵抗L-氨基酸特异性蛋白酶)，或D-和L-氨基酸+甘氨酸的组合。本发明所述的多肽可以化学合成或重组表达。所述多肽可与其他化合物连接以促进体内半衰期的提高，例如通过聚乙二醇化、HES化、磷酸化、糖基化，或可作为Fc融合或在去免疫变体中产生。如本领域技术人员所理解的，这种连接可以是共价或非共价的。
“效应物”是在与生物活性肽相互作用时执行生物活性的任何分子、核酸、蛋白、核蛋白复合物或细胞。示例性生物活性可包括结合、荧光团招募、毒素招募、免疫调整剂招募、蛋白水解、酶活性、信号蛋白(例如，细胞因子、趋化因子)释放、细胞死亡诱导、细胞分化诱导、核导入/导出、泛素化和荧光团/生色团成熟。
II本发明的组合物
本发明涉及一种开关系统，其可提高体外、体内或离体靶细胞特异性。特别地，该系统可以位于组织内、细胞间、细胞突触内或需要提高靶特异性的细胞内。在一些方面，本发明的组合物能够提高细胞对治疗的选择性。在一些方面，本发明的组合物能够提高相互作用的细胞对治疗的选择性。在一些方面，本组合物能够靶向异质细胞(两种以上不同的细胞类型)进行治疗，其中第一细胞部分和第二细胞部分存在于第一细胞上，第一细胞部分和第三细胞部分存在于第二细胞上。在一些方面，所述组合物还能够减少治疗的脱靶活性。因此，在一些方面，本组合物可为需要治疗的受试者提供准备，以使受试者能更好地对治疗作出响应，提高治疗的疗效，和/或降低由于非特异性结合(或漏失)而产生的毒性。
Ag1 AND Ag2
在一些方面，本发明能够提高包括至少两种不同细胞标志物(Ag1部分AND Ag2部分)的细胞的选择性。通过靶向表达两个不同部分的细胞，可以取消选择仅包括一个部分(Ag1 OR Ag2)的细胞。在一些方面，所述组合物包括：
(a)融合到第一结合域的第一笼多肽，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中，所述结构区与所述闩区相互作用，以在不与钥匙多肽共定位的情况下阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于细胞上或细胞内的第一细胞部分；和
(b)融合到第二结合域的第一钥匙多肽，其中在与第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合存在于所述细胞上或细胞内的第二细胞部分，
其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分不同或相同。
在一些方面，本发明包括：
(a)编码融合到第一结合域的第一笼多肽的多核苷酸，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中，所述结构区与所述闩区相互作用，以在不与钥匙多肽共定位的情况下阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于细胞上或细胞内的第一细胞部分；和
(b)编码融合到第二结合域的第一钥匙多肽的多核苷酸，其中在与第一笼多肽共定位后，第一钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合存在于所述细胞上或细胞内的第二细胞部分，
其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分不同或相同。在一些方面，编码第一笼多肽的多核苷酸和编码第二多肽的多核苷酸位于同一载体上。在一些方面，编码第一笼多肽的多核苷酸和编码第二多肽的多核苷酸位于不同载体上。
在一些方面，所述第一细胞部分和所述第二细胞部分不同。在一些方面，所述第一细胞部分和所述第二细胞部分相同。
对于要被激活的所述一种或多种生物活性肽(例如，暴露于效应物的或能够在下游传递其信号的活性肽)，功能性笼多肽和钥匙多肽需要共定位。仅仅表达功能性笼多肽和钥匙多肽是不够的。例如，在一些方面，与共定位后笼和钥匙多肽的结合相比，功能性笼多肽(例如，第一笼多肽)与溶液中钥匙多肽的结合激活一种或多种生物活性肽的效率更低。因此，在某些方面，第一笼多肽和钥匙多肽的共定位提高了高表达细胞部分的细胞的选择性。
在一些方面，所述第一笼多肽和第一钥匙多肽的共定位提高了第一笼多肽和第一钥匙多肽的局部浓度，并改变了结合平衡，有利于在第一笼多肽和第一钥匙多肽之间形成复合物。
为了使两个细胞部分足够接近(例如，非常接近)以允许结合第一细胞部分的笼多肽和结合第二细胞部分的钥匙多肽共定位，两个细胞部分可由于直接或间接形成复合物(例如，同一复合物中的两种蛋白，如Her2EGFR异二聚体或与LAT或Zap70复合物中的CD3ζ；染色体上两个非常接近的DNA序列；mRNA上两个非常接近的RNA序列)而共定位。在这种情况下，所述第一部分的至少一个分子必须与所述第二部分的至少一个分子共定位以产生共定位。或者，所述两个细胞部分可以借助在相同亚细胞区室中被表达足够的数量而共定位(例如，在细胞膜中表达的两种诸如Her2和EGFR、Her2和EpCAM等跨膜蛋白)。在一些方面，所述细胞表达第一细胞部分和/或第二细胞部分，每个细胞至少约100个拷贝，每个细胞至少约200个拷贝，每个细胞至少约500个拷贝，每个细胞至少约1000个拷贝，每个细胞至少约1500个拷贝，每个细胞至少约2000个拷贝，每个细胞至少约2500个拷贝，每个细胞至少约3000个拷贝，每个细胞至少约3500个拷贝，每个细胞至少约4000个拷贝，每个细胞至少约4500个拷贝，每个细胞至少约5000个拷贝，每个细胞至少约5500个拷贝，每个细胞至少约6000个拷贝，每个细胞至少约6500个拷贝，或者每个细胞至少约7000个拷贝。在一些方面，第一细胞部分和/或第二细胞部分表达约500至约10000个拷贝/细胞、约1000至约10000个拷贝/细胞、约2000至约100000个拷贝/细胞、约3000至约10000个拷贝/细胞、约4000至约10000个拷贝/细胞、约5000至约10000个拷贝/细胞，约1000至约9000个拷贝/细胞，约2000至约90000个拷贝/细胞，约3000至约9000个拷贝/细胞，约4000至约9000个拷贝/细胞，约5000至约9000个拷贝/细胞，约1000至约8000个拷贝/细胞，约2000至约80000个拷贝/细胞，约3000至约8000个拷贝/细胞，约4000至约8000个拷贝/细胞，约5000至约8000个拷贝/细胞，约1000至约7000个拷贝/细胞，约2000至约70000个拷贝/细胞，约3000至约7000个拷贝/细胞，约4000至约7000个拷贝/细胞，约5000至约7000个拷贝/细胞，约1000至约6000个拷贝/细胞，约2000到60000个拷贝/细胞，约3000到6000个拷贝/细胞，约4000到6000个拷贝/细胞，约5000到6000个拷贝/细胞。在一些方面，所述细胞表达第一细胞部分和/或第二细胞部分至少约5000个拷贝至约6000个拷贝、约7000个拷贝或约8000个拷贝。在一些方面，所述第一笼多肽和所述第一钥匙多肽共定位，从而形成复合物并激活所述一种或多种生物活性肽。
在一些方面，所述第一细胞部分和所述第二细胞部分存在于所述细胞表面上。在某些方面，所述第一细胞部分和所述第二细胞部分存在于所述细胞的细胞质内。在一些方面，所述第一细胞部分和所述第二细胞部分存在于细胞核内。在一些方面，所述第一细胞部分和所述第二细胞部分存在于细胞的分泌途径内，包括内质网(ER)和高尔基体。
Ag1 AND (Ag2 OR Ag3)
本发明还可以通过利用各种细胞标志物同时靶向两个以上的细胞。例如，本发明可以允许靶向异质细胞类型的治疗，超过2种(Ag1 AND(Ag2 OR Ag3))、超过3种(Ag1 AND(Ag1 AND(Ag2 OR Ag3 OR Ag4))、超过4种(Ag1 AND(Ag2 OR Ag3 OR Ag4 OR Ag5))、超过5种(Ag1 AND(Ag2 OR Ag3 OR Ag4 OR Ag5 OR Ag6))等。在一些实施方案中，(Ag1 OR Ag2)AND Ag3可以通过将多个结合域靶向到不同的多个细胞，并将一个具有单一结合域的钥匙多肽靶向到相同的细胞来实现。在其它实施方案中，(Ag1 OR Ag2)和(Ag3 OR Ag4)可以通过靶向具有多个结合域的多个笼多肽和具有多个结合域的多个钥匙多肽来实现。
在一些方面，所述组合物包括：
(a)融合到第一结合域的第一笼多肽或编码所述第一笼多肽的多核苷酸，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中，所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在不与钥匙多肽共定位的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于第一细胞上或内的第一细胞部分(细胞类型I，例如，表达Ag1 AND Ag2的细胞)；
(b)融合到第二结合域的第一钥匙多肽或编码所述第一钥匙多肽的多核苷酸，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合存在于所述第一细胞上或内的第二细胞部分；和
(c)融合到第三结合域的第二钥匙多肽或编码所述第二钥匙多肽的多核苷酸，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第二钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第三结合域能够结合存在于还包含所述第一细胞部分的第二细胞(细胞类型II，例如，表达Ag1 AND Ag3的细胞)上或内的第三细胞部分，其中所述第一细胞部分、所述第二细胞部分和所述第三细胞部分不同。
在一些方面，所述第一钥匙多肽包含第三结合域，其中所述第二结合域和/或第三结合域结合到(i)同一细胞表面上与所述第一结合域不同的部分，或(ii)在相接触的两个细胞之间的突触上与所述第一结合域不同的部分，其中，在与所述第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第三结合域能够结合到还包含所述第一细胞部分的所述细胞上或细胞内的第三细胞部分，其中，所述第三细胞部分不同于所述第一细胞部分或所述第二细胞部分。
在一些方面，所述组合物还包括：
(d)至少一种第二笼多肽，其包括(i)第二结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的第二闩区，以及(iii)第六结合域，其中所述第二结构区与所述第二闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，
其中，所述第一钥匙多肽和/或所述第二钥匙多肽能够结合到所述第二结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，并且
其中，所述第六结合域和/或第一结合域结合到(i)同一细胞表面上与所述第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的所述第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分。例如，此类组合物可用于通过同时将具有不同结合域的2个笼多肽靶向多个细胞并将具有单个结合域的一个钥匙多肽靶向这些相同细胞来实现(Ag1 OR Ag2)AND Ag3。
在一些方面，所述组合物可还包括多个钥匙多肽：第四钥匙多肽、第五钥匙多肽、第六钥匙多肽或第七钥匙多肽，以提高对所述第一细胞和/或第二细胞的选择性。例如，用于第一细胞的组合物可还包括可进一步提高第一细胞选择性的附加钥匙多肽：第四钥匙多肽、第五钥匙多肽、第六钥匙多肽或第七钥匙多肽。在一些方面，用于第二细胞的组合物还包括可进一步提高第二细胞选择性的附加钥匙多肽：第四钥匙多肽、第五钥匙多肽、第六钥匙多肽或第七钥匙多肽。本发明所述的每个附加钥匙多肽可融合到结合域，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第三钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第三结合域能够结合到所述细胞上或细胞内存在的细胞部分，所述细胞还包括所述第一细胞部分。在一些方面，单个钥匙多肽可融合到两个或多个结合域，使得相同的钥匙多肽可靶向细胞类型I和细胞类型II。
(Ag1 AND Ag2)NOT Ag3
本发明还可指导治疗以避开正常(健康)细胞，仅仅只是通过利用各种细胞标志物靶向病变细胞，例如肿瘤细胞，从而降低脱靶向细胞特异性或毒性。因此，本发明可使治疗避免靶向表达独特细胞标志物的正常细胞类型。例如，如果正常细胞表达Ag3而患病细胞不表达，则可构建用于本发明的组合物以避开表达Ag3的细胞。
在一些方面，所述组合物包括：
(a)融合到第一结合域的第一笼多肽或编码所述第一笼多肽的多核苷酸，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中，所述结构区与所述闩区相互作用以在不与钥匙多肽共定位的情况下阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于细胞上或细胞内的第一细胞部分；
(b)融合到第二结合域的第一钥匙多肽或编码所述第一钥匙多肽的多核苷酸，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合存在于所述细胞上或细胞内的第二细胞部分；和
(c)融合到一个或多个结合域(“诱饵结合域”)的一种或多种诱饵笼多肽或编码所述诱饵笼多肽的多核苷酸，其中每个诱饵笼多肽包括诱饵结构区，在与所述第一钥匙多肽和第一笼多肽共定位时，能够优先结合到所述第一钥匙多肽，其中每个诱饵结合域能够结合到包括第二细胞部分的所述细胞中的细胞部分(“诱饵细胞部分”)。在一些方面，所述诱饵结合域能够结合到包括第一细胞部分和第二细胞部分的所述细胞中的细胞部分(“诱饵细胞部分”)。在某些方面，每个诱饵细胞部分仅存在于健康细胞上。在一些方面，每个诱饵笼多肽在与所述第一钥匙多肽共定位后结合到所述第一钥匙多肽，使得所述第一钥匙多肽不结合到第一笼多肽，并且其中所述第一笼多肽中的一种或多种生物活性肽未被激活。
任何第一笼多肽均可作为任何第二笼多肽的诱饵多肽，前提是所述第一笼多肽对所述钥匙多肽的亲和力高于所述第二笼多肽。
本发明所述的所有方面的组合物和方法可包括使用包含多个结合域的单个诱饵笼多肽，或每个具有一个(或多个)结合域的多个诱饵笼多肽，以避免具有不同诱饵细胞部分(例如，1 AND 2 NOT(3 OR 4)逻辑)的细胞。
在一些方面，所述诱饵笼多肽与所述钥匙多肽(例如KD)的结合亲和性比所述第一笼多肽与所述钥匙多肽的结合亲和性强(例如KD)(例如，更低)诸如至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍，至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍，至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍或至少约1000倍。在一些方面，所述诱饵笼多肽包括至少一个α螺旋、至少两个α螺旋、至少三个α螺旋、至少四个α螺旋或至少五个α螺旋。在一些方面，所述诱饵笼多肽还包括诱饵闩区。在某些方面，所述诱饵闩区不起作用。在一些方面，所述诱饵闩区不包括任何生物活性肽。在某些方面，不存在所述诱饵闩区。在一些方面，所述诱饵闩区包括非功能性生物活性肽。在一些方面，所述诱饵闩区包括具有独特生物功能的功能性生物活性肽。作为非限制性示例，所述笼多肽可包含具有免疫刺激功能的生物活性肽，而所述诱饵笼多肽包含具有免疫抑制功能的生物活性肽。
示例性的的Co-LOCKR系统
在第四方面中，本发明提供的组合物包括：
(a)第一笼多肽，包括(i)结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，以及(iii)第一结合域，其中所述结构区与闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性；
(b)第一钥匙多肽，其能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述钥匙多肽包括第二结合域，
其中，所述第一结合域和第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，(ii)相同细胞表面上的相同部分，(iii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触上的相同部分；和
任选地，当所述一种或多种生物活性肽被激活时，结合到所述一种或多种生物活性肽的一种或多种效应物。
本发明所公开的组合物，在以下示例中也称为“Co-LOCKR系统”，包括至少笼多肽和至少钥匙多肽，其可作为诸如执行“AND(与)”、“OR(或)”以及“NOT(非)”布尔逻辑运算及其组合的近距离激活从头设计的蛋白开关，以响应蛋白结合事件的精确组合。只有在满足所有逻辑条件时，开关才会通过构象变化激活。所述系统在实施例中被证明可提供哺乳动物细胞的超特异性靶向，这些细胞仅通过其表面标志物的精确组合就可在复杂细胞群中被区分。“与”门可通过将笼多肽靶向一种抗原以及将钥匙多肽靶向另一种抗原来实现。“阈值”门可通过将笼多肽和钥匙多肽靶向同一抗原来实现(这可以通过结合到相同表位的结合域上或结合到相同抗原上不同表位的结合域上)。“或”门可以通过将笼多肽或钥匙多肽靶向两种不同的抗原来实现。“非”门可通过补充诱饵笼多肽来实现，所述诱饵笼多肽可隔离钥匙多肽并阻止其与笼多肽相互作用。附加的笼多肽、钥匙多肽和诱饵笼多肽也可被包括以建立所需的逻辑运算(例如，抗原1AND抗原2NOT抗原3、抗原1AND抗原2OR抗原3)。
因此，在一个实施方案中，所述第一结合域和所述第二结合域结合到(i)同一细胞表面上的不同部分，或(iii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。在该实施方案中，所述组合物可用于建立和门。
在另一实施方案中，所述第一结合域和所述第二结合域结合到(ii)相同细胞表面上的相同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触上的相同部分。在该实施方案中，所述组合物可用于建立阈值门。
在一个实施方案中，(c)所述第一钥匙多肽包括第三结合域，其中第二结合域和/或所述第三结合域结合到(i)与同一细胞表面上的第一结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第一结合域不同的部分。在另一实施方案中，第二结合域和第三结合域结合到不同细胞表面上的不同部分。在这些实施方案中，所述组合物可用于建立1AND2OR3逻辑门，前提是由第一结合域结合的部分存在于这些细胞之一上。
在另一实施方案中，所述组合物还包括(d)至少一种能够结合到第一笼结构区的第二钥匙多肽，其中所述钥匙多肽包括第四结合域，其中第二结合域和/或第四结合域结合到(i)同一细胞表面上与第一结合域不同的部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上与第一结合域不同的部分。在一个实施方案中，第二结合域和第四结合域结合到(i)同一细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。在另一实施方案中，第二结合域和第四结合域结合到不同细胞表面上的不同部分。在这些实施方案中，所述组合物可用于建立1 AND 2OR 3逻辑门，前提是由第一结合域结合的部分存在于这些细胞之一上。
在另一实施方案中，所述第一笼多肽还包括第五结合域，其中第五结合域和/或第一结合域结合到(i)与同一细胞表面上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分。在一个实施方案中，第五结合域和第一结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。在该实施方案中，所述组合物可用于基于单个笼多肽上存在的附加结合域建立或逻辑门，具体地说是[(1 OR 5)AND(2OR 3)]逻辑门。
在一个实施方案中，所述组合物还包括(e)至少一种第二笼多肽，其包括(i)第二结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的第二闩区，以及(iii)第六结合域，其中，所述第二结构区与所述第二闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，其中所述第一钥匙多肽和/或所述第二钥匙多肽能够结合到所述第二结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第六结合域和/或第一结合域结合到(i)同一细胞表面上与第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分。在一个实施方案中，所述第六结合域和第一结合域结合到(i)不同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。在这些实施方案中，所述组合物可用于基于存在于第二笼多肽上的附加结合域建立或逻辑门。在此实施方案中，可能存在两个单独但相同的笼多肽，每个多肽连接到一个不同的结合域。在另一个此类实施方案中，两个笼多肽可以是不同的笼多肽，它们都被相同的钥匙多肽激活，并且各自连接到一个不同的结合域。
在另一实施方案中，所述组合物还包括(f)诱饵笼多肽，其包括(i)诱饵结构区，(ii)诱饵闩区，其任选地进一步包含一种或多种生物活性肽，以及(iii)第七结合域，其中所述诱饵结构区与所述第一钥匙多肽和/或所述第二钥匙多肽相互作用以阻止它们结合到所述第一笼多肽和/或所述第二笼多肽，并且其中所述第七结合域结合到与所述第二结合域、第三结合域和/或第四结合域相同的细胞表面上的部分。在一个实施方案中，所述第七结合域以与第二结合域、第三结合域和/或第四结合域结合到的部分同等或更高水平结合到细胞上的部分。在该实施方案中，所述组合物可用于基于诱饵笼多肽结合到与钥匙多肽的靶标相同细胞上的不同靶标来建立“非(NOT)”逻辑门。在该实施方案中，所述组合物可用于例如建立1 AND 2 NOT 7逻辑，前提是由第一和第二结合域结合的部分存在于同一细胞中。在一个实施方案中，所述诱饵笼多肽不包括生物活性肽。例如，该实施方案可用于建立1AND 4 NOT 7逻辑(前提是由第一和第四结合域结合的部分存在于同一细胞上)，或5AND 4NOT 7逻辑(前提是由第五和第四结合域结合的部分存在于同一细胞上。此类和/或非实施方案要求至少笼多肽、至少钥匙多肽和至少一种诱饵笼多肽。
在所述组合物的所有这些实施方案的一个实施方案中，所述第一结合域、第二结合域、第三结合域(当存在时)、第四结合域(当存在时)、第五结合域(当存在时)、第六结合域(当存在时)和/或第七结合域(当存在时)包括能够结合存在于细胞表面的部分的多肽，所述存在于细胞表面的部分包括蛋白、糖和脂质。在一个实施方案中，所述一种或多种结合蛋白包括细胞表面蛋白结合多肽。
上述所有组合物均描述为多肽组合物。本发明还提供包括表达载体和/或细胞的组合物，所述表达载体和/或细胞表达上述组合物中所述的笼多肽和钥匙多肽，因此可用于相同目的(例如，建立与上述对应多肽组合物相同的逻辑门)。因此，在第五方面，本发明提供的组合物包括：
(a)一种或多种表达载体，其编码和/或细胞表达：
(i)第一笼多肽，包括(i)结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，以及(iii)第一结合域，其中所述结构区与闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性；和
(ii)能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽的第一钥匙多肽，其中所述钥匙多肽包括第二结合域，
其中，所述第一结合域和第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，(ii)相同细胞表面上的相同部分，(iii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触上的相同部分；和
(b)任选地，当所述一种或多种生物活性肽被激活时结合到所述一种或多种生物活性肽的一种或多种效应物，和/或编码所述一种或多种效应物的一个或多个核酸。
所述一种或多种表达载体可包括编码每个单独多肽的单独表达载体，可包括编码两个或多个单独多肽的表达载体，或适合预期用途的其任何组合。所述表达载体可包括将所述多肽的核酸编码区操作性地连接到能够影响基因产物表达的任何控制序列的任何合适的表达载体。类似地，所述细胞可以是能够表达所述多肽的任何原核或真核细胞；所述细胞可包括能够表达所有所述多肽的单个细胞、能够表达每个单独多肽的单独细胞或其任何组合。
在一个实施方案中，所述第一钥匙多肽包括第三结合域，其中第二结合域和/或第三结合域结合到(i)与同一细胞表面上的第一结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第一个结合域不同的部分。在另一实施方案中，所述第二结合域和第三结合域结合到不同靶细胞表面上的不同部分。
在一个实施方案中，所述组合物还包括(c)编码和/或表达至少能够结合到所述第一笼结构区的第二钥匙多肽的表达载体和/或细胞，其中所述钥匙多肽包括第四结合域。
其中，所述第二结合域和/或第四结合域结合到(i)同一细胞表面上与第一结合域不同的部分，或(ii)在相接触的两个细胞之间的突触上与第一结合域不同的部分。在另一实施方案中，其中所述第二结合域和第四结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。
在另一实施方案中，所述第一笼多肽还包括第五结合域，其中所述第五结合域和/或第一结合域结合到(i)与同一细胞表面上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分。在一个实施方案中，所述第五结合域和第一结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。
在另一实施方案中，所述组合物还包括(d)编码和/或表达至少第二笼多肽的表达载体和/或细胞，所述第二笼多肽包括(i)第二结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的第二闩区，以及(iii)第六结合域，其中，所述第二结构区与所述第二闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，
其中，所述第一钥匙和/或所述第二钥匙多肽能够结合到所述第二结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，以及
其中，所述第六结合域和/或第一结合域结合到(i)同一细胞表面上与第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第二结合域、第三结合域和/或第四个结合域不同的部分。在一个实施方案中，所述第六结合域和第一结合域结合到(i)不同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。
在另一实施方案中，所述组合物还包括(e)编码诱饵笼多肽的表达载体和/或表达诱饵笼多肽的细胞，所述诱饵笼多肽包括(i)诱饵结构区，(ii)任选地进一步包含一种或多种生物活性肽的诱饵闩区，以及(iii)第七结合域，其中所述诱饵结构区与所述第一钥匙多肽和/或所述第二钥匙多肽相互作用以阻止它们结合到所述第一和/或所述第二笼多肽，并且其中所述第七结合域结合到与所述第二结合域、第三结合域、和/或第四结合域相同的细胞表面上的部分。在一个实施方案中，所述第七结合域和第一结合域和/或第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。在另一实施方案中，所述第七结合域以与第二结合域、第三结合域和/或第四结合域结合到的部分相等或更高的水平结合到细胞上的部分。
在一个实施方案中，所述第一结合域、第二结合域、第三结合域(存在时)、第四结合域(存在时)、第五结合域(存在时)、第六结合域(存在时)和/或第七结合域(存在时)包括能够结合存在于细胞表面的部分的多肽，所述存在于细胞表面的部分包括蛋白、糖和脂质。在一个实施方案中，所述一种或多种结合蛋白包括细胞表面蛋白结合多肽。
笼和钥匙多肽
本发明公开的多肽可作为以非活性状态隔离生物活性肽的笼多肽(直到被结合到笼多肽的钥匙多肽激活，如本发明所述)，其中所述结合域可用于将所述多肽靶向结合域所结合的实体上。在一个实施方案中，所述多肽是“蛋白开关”(连同适当的钥匙多肽)的一部分，其中所述笼多肽和所述钥匙多肽包括结合到不同靶点的结合域，所述钥匙多肽结合到笼多肽，并且仅当不同的靶标紧密相连时触发所述生物活性肽的激活，使得所述笼多肽和钥匙多肽在结合到其靶标时共定位。
在一些方面，所述笼多肽包括螺旋束，其包括2到7个α螺旋；其中所述螺旋束融合到一个或多个结合域；其中所述一个或多个结合域和所述螺旋束不均存在于同一天然存在的多肽中。
在每个实施方案中，每个笼多肽的N端和/或C端的60个氨基酸可以是任选的，因为所述末端60个氨基酸残基可以包括可以修饰的闩区，例如通过用生物活性肽替换闩的全部或一部分。在一个实施方案中，所述N端60个氨基酸残基是任选的；在另一实施方案中，所述C端60个氨基酸残基是任选的；在另一实施方案中，每个所述N端60个氨基酸残基和C端60个氨基酸残基都是任选的。在一个实施方案中，这些任选的N端和/或C端60残基不包括在确定百分序列同一性中。在另一实施方案中，任选残基可包括在确定百分序列同一性中。
在一些方面，所述第一笼多肽包括不多于5个α螺旋、不多于4个α螺旋、不多于3个α螺旋或不多于2个α螺旋，其中所述结构区包括至少一个α螺旋，所述闩区包括至少一个α螺旋。在一些方面，所述第一笼多肽的结构区包括一个α螺旋。在一些方面，所述第一笼多肽的结构区包括两个α螺旋。在一些方面，所述第一笼多肽的结构区包括三个α螺旋。
在一些方面，进一步修饰所述第一笼多肽、第一钥匙多肽、第二钥匙多肽和/或诱饵多肽以改变(i)疏水性，(ii)氢键网络，(iii)与每种多肽的结合亲和力，和/或(iv)其任何组合。在一些方面，对所述笼多肽和/或钥匙多肽进行修饰以降低疏水性。在某些方面，所述闩区发生突变以降低疏水性。例如，已知疏水性氨基酸：甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。在一些方面，一个或多个疏水性氨基酸被极性氨基酸例如丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)取代。在一些方面，所述第一笼多肽的闩区和结构区之间的界面包括与极性氨基酸残基的比率在1∶1和10∶1之间，例如，1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1的疏水性氨基酸。在一些方面，所述闩区与结构区之间的界面包括疏水性氨基酸与极性氨基酸残基之比为1∶1。在一些方面，所述闩区与结构区之间的界面包括疏水性氨基酸与极性氨基酸残基之比为2∶1。在一些方面，所述闩区与结构区之间的界面包括疏水性氨基酸与极性氨基酸残基之比为3∶1。在一些方面，所述闩区与结构区之间的界面包括疏水性氨基酸与极性氨基酸残基之比为4∶1。在一些方面，所述闩区和结构区之间的界面包括疏水性氨基酸与极性氨基酸残基之比为5∶1。在一些方面，所述闩区和结构区之间的界面包括疏水氨基酸与极性氨基酸残基之比为6∶1。在一些方面，所述闩区和结构区之间的界面处包括与极性氨基酸残基比率为7∶1的疏水氨基酸。在一些方面，所述闩区和结构区之间的界面包括疏水性氨基酸与极性氨基酸残基之比为8∶1。在一些方面，所述闩区和结构区之间的界面包括与极性氨基酸残基比率为9∶1的疏水氨基酸。在一些方面，所述闩区和结构区之间的界面包括与极性氨基酸残基之比为10∶1的疏水性氨基酸。
在一些方面，所述闩区中的1、2、3个或更多的大的疏水残基，例如异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸，突变为丝氨酸、苏氨酸或小一点的疏水氨基酸残基，例如缬氨酸(如果起始氨基酸是异亮氨酸或亮氨酸)或丙氨酸。
在一些方面，所述第一笼多肽包括位于所述第一笼多肽的闩区和结构区之间的界面处的掩藏氨基酸残基，其中所述界面处的掩藏氨基酸残基具有包括参与氢键的氮原子或氧原子的侧链。
在一些方面，本发明提供了非天然存在的多肽，其包括：
(a)包括与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自不包括任选氨基酸残基的SEQ ID NO：27359-27392、1-49、51-52、54-59、61、65、67-14317、27094-27117、27120-27125和27278-27321氨基酸序列或表7、表8或表9中列出的笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的N端和/或C端60个氨基酸是任选的；和
(b)一个或多个多肽结合域。
在一个实施方案中，所述非天然存在的多肽包括：
(a)包括与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27359-27392、1-49、51-52、54-59、61、65，67-14317、27094-27117、27120-27125、27278至27321的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，不包括闩区中的氨基酸残基；和
(b)一个或多个多肽结合域。
在另一实施方案中，非天然存在的多肽包括：
(a)包括与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列或表7、表8或表9中列出的笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的N端和/或C端60个氨基酸是任选的；和
(b)一个或多个多肽结合域。
在另一个实施方案中，所述多肽具有与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27359-27392、1-49、51-52、54-59、61、65、67-14317、27094-27117、27120-27125、27278至27321的氨基酸序列或表7、表8或表9中列出的的笼多肽的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，包括任何任选氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述非天然存在的多肽包括：
(a)包括与所公开的不包括任选氨基酸残基的选自SEQ ID NO：27359-27392的笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，以及
(b)一个或多个多肽结合域。
在另一实施方案中，所述多肽包括与公开的选自SEQ ID NO：27359-27392的笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选残基。
表1
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表2.其他示例性的笼多肽(另请参见SEQ ID NO：92-14317、27094-27117、27120-27125、27728-27321以及表7、表8和表9中列出的笼多肽)。
示例性的参考笼多肽；用括号[]表示的闩区
●6His-MBP-TEV、6His-TEV和灵活的接头序列在文本中加下划线
●融合功能域(DARPin、分隔的内含子组分和荧光蛋白)为粗体文本
●功能肽为斜体加下划线的文本
●已突变为任何氨基酸以调整响应性的典型位置为下划线粗体文本。这些位置是示例性的，而不是能够调整响应性的残基的详尽列表。
●可被移除以调整响应性的C-端子序列包括在括号内。从C-末端开始，包括在括号内的一(1)至所有个残基到都可以被去除，并可去除其中的连续残基。
●括号中的所有序列都是任选的。
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在另一个实施方案中，本发明提供了非天然存在的多肽，其包括与选自SEQ IDNO：27359-27392的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选氨基酸残基。在一个实施方案中，所述多肽还包括一个或多个结合域。在另一个实施方案中，所述多肽包括连接该多肽和一个或多个结合域(如本发明所公开的)的氨基酸接头。
如本发明所公开的，本发明的示例性多肽已被鉴定并进行了突变分析。此外，从相同示例性多肽开始的不同设计在保持相同预期功能的同时产生了不同的氨基酸序列。在各种实施方案中，给定氨基酸可被具有类似物理化学特征的残基取代，例如，用一个脂肪族残基取代另一个(例如，将异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸替换成另一个)，或用一个极性残基取代另一个(例如，在赖氨酸和精氨酸之间；谷氨酸和天冬氨酸之间；或天冬酰胺和谷氨酰胺之间)。其他此类保守替换也是已知的，例如具有类似疏水性特征的整个区域的替换。包括保守氨基酸替换的多肽可在本发明所述的任何一种分析中进行测试，以确认保留了所需的活性。氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分组(A.L.Lehninger，Biochemistry，second ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975))：(1)非极性：丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)；(2)不带电极性：甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(3)酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；(4)碱性：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。或者，天然存在的残基可以根据共同的侧链性质分为以下几类：(1)疏水性：去甲亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；(3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；(4)减性：组氨酸、赖氨酸、精氨酸；(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；(6)芳香族：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。非保守替换需要将这些类中的一个类的成员替换为另一个类的成员。特定的保守替换包括，例如；丙氨酸转化为甘氨酸或丝氨酸；精氨酸转化为赖氨酸；天冬酰胺转化为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸转化为谷氨酸；半胱氨酸转化为丝氨酸；谷氨酰胺转化为天冬酰胺；谷氨酸转化为天冬氨酸；甘氨酸转化为丙氨酸或脯氨酸；组氨酸转换成天冬酰胺或谷氨酰胺；将异亮氨酸转换为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸转换为异亮氨酸或缬氨酸；赖氨酸转化为精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酰胺；蛋氨酸转换成亮氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸转化为蛋氨酸、亮氨酸或酪氨酸；丝氨酸转化为苏氨酸；苏氨酸转换成丝氨酸；色氨酸转化为酪氨酸；酪氨酸转化为色氨酸；和/或将苯丙氨酸转换为缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。
在一些方面，所述笼多肽包括本发明所公开的任何组合物或方法的一种或多种笼多肽的闩区和结构区之间的界面。在本发明第一和第二方面的多肽的一个实施方案中，闩区和结构区之间的界面残基主要是(即：50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或更大)疏水残基。在一个实施方案中，所述界面残基主要为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸残基。在另一实施方案中，所述多肽的闩区和结构区之间的界面包括与极性氨基酸残基的比率在1∶1和10∶1之间的疏水性氨基酸。可根据适合的预期用途来“调整”所述笼多肽，以改变闩区和结构区之间的相互作用强度。在一个实施方案中，所述闩区中的1、2、3或更多大疏水残基(包括但不限于异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸)突变为丝氨酸、苏氨酸或小一些的疏水氨基酸残基，包括但不限于缬氨酸(如果起始氨基酸残基为异亮氨酸或亮氨酸)或丙氨酸。在该实施方案中，所述调整减弱了结构区的闩亲和力。在一些方面，所述笼多肽(例如，第一笼多肽)包括位于所述笼多肽的闩区和结构区之间的界面处的掩藏氨基酸残基。在另一实施方案中，所述界面处掩藏的氨基酸残基包括具有侧链的氨基酸残基，所述侧链包括参与氢键的氮原子或氧原子。所述调整可以包括提高或减少界面上氢键的数量。所述调整可以包括改变氨基酸以提高或减少界面的疏水性。所述调整可包括改变氨基酸以减少界面的疏水堆积(例如，用丙氨酸替换亮氨酸)。所述调整可以包括引入氨基酸变化，从而在界面中产生掩藏的不满意氢键(例如，用丝氨酸替换亮氨酸)。基于本发明的教导，本领域技术人员将理解，这种调整可以根据期望的结构区闩区域亲和力采取任意数量的形式。
在某些实施方案中，本发明第一和第二方面的多肽包括至少一个α螺旋中的一种或多种生物活性肽，例如在闩结构域中，其中一种或多种生物活性肽能够选择性地结合到定义的靶标。如本发明所述，本发明所公开的第一和第二方面的非天然存在的多肽可以用作以非活性状态隔离生物活性肽的笼多肽(直到被结合到笼多肽的钥匙多肽激活，如本发明所述)，并且其中所述结合域可用于将所述多肽靶向与所述结合域结合的实体。在一个实施方案中，所述多肽是“蛋白开关”(连同适当的钥匙多肽)的一部分，其中所述笼多肽和所述钥匙多肽包括结合到不同靶标的结合域，所述钥匙多肽结合到笼多肽，并且仅当不同的靶点紧密相关时触发生物活性肽的激活，使得笼和钥匙多肽在结合到其靶标时共定位。
任何结合域均可用于适合预期用途的情况。在非限制性实施方案中，所述一种或多种生物活性肽可包括一种或多种选自SEQ ID NO：60、62-64、66、27052、27053、27059-27093的生物活性肽。
表3
Figure BPA0000315860050000881
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Figure BPA0000315860050000901
第三方面，本发明提供了钥匙多肽，其包括连接到一个或多个结合域的钥匙域，其中所述钥匙多肽能够特异性结合到本发明第一和/或第二方面的任何实施例的笼多肽。如本发明所述，本发明所公开的第一和第二方面的非天然存在的多肽可以用作以非活性状态隔离生物活性肽的笼多肽(直到被结合到笼多肽的钥匙多肽激活，如本发明所述)，并且其中所述结合域可用于将所述多肽靶向与所述结合域结合的实体。在一个实施方案中，所述多肽是“蛋白开关”(连同适当的钥匙多肽)的一部分，其中所述笼多肽和所述钥匙多肽包括结合到不同靶点的结合域，所述钥匙多肽结合到笼多肽，并且仅当不同的靶点紧密相关时触发生物活性肽的激活，使得笼和钥匙多肽在结合到其靶点时共定位。因此，在一个实施方案中，所述钥匙多肽特异性结合到笼多肽并激活一种或多种生物活性肽。在各种非限制性实施方案中，所述钥匙多肽包括：
(a)包括与本发明公开的钥匙多肽的氨基酸序列(不包括任选氨基酸残基)、选自SEQ ID NO：27393-27398、14318-26601、26602-27015、27016-27050和27322-27358的钥匙多肽和表7、表8和/或表9中列出的钥匙多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽；和
(b)一个或多个结合域。
表4
Figure BPA0000315860050000911
在另一个实施方案中，非天然存在的多肽包括具有与选自SEQ ID NO：26602-27050和27322至27358的钥匙多肽氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，如下所述。
●钥匙序列为普通文本
●6His-MBP-TEV、6His-TEV，柔性接头序列为带下划线的文本
●粗体斜体序列是MBP_钥匙生物素化所必需的任选残基
●括号中的所有序列都是任选的
●在非任选钥匙序列的N端或C端，任意数量的连续氨基酸都可以被删除，以调整反应性
表5
Figure BPA0000315860050000921
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在特定实施方案中，所述钥匙多肽包括与表6、表7(SEQ ID NO：27127至27277之间的奇数SEQ ID NO多肽)、表8和/或表9中钥匙多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一具体实施方案中，所述钥匙多肽包括与表8中钥匙多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一具体实施方案中，所述钥匙多肽包括与表9中钥匙多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在上述每一个的一个实施方案中，可在不含任选N-末端和C-末端60个氨基酸的情况下确定一致性百分比；在另一实施方案中，可使用任选的N-和C-末端60个氨基酸来确定一致性百分比。
表6
Figure BPA0000315860050001492
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Figure BPA0000315860050002041
A.结合域
在本发明多肽的各种实施方案中，所述多肽包括一个或多个(即，1、2、3或多个)结合域。任何合适的结合域都可用于预期用途。在一个实施方案中，所述一个或多个结合域包括细胞表面蛋白结合多肽。在一个实施方案中，所述细胞表面蛋白结合多肽位于肿瘤细胞上。在另一实施方案中，所述细胞表面蛋白结合多肽为癌蛋白。在另一实施方案中，所述一个或多个结合域非限制性选自针对待结合细胞表面部分的抗原结合多肽，包括但不限于Fab′，F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG、重组单链Fv片段(scFv)、VH单结构域、二价或双特异性分子、双价抗体、三价抗体和四价抗体；DARPins；纳米抗体(nanobody)；亲和抗体(affibody)；NS1抗体类似物(monobody)；抗肌生成抑制素(adnectin)；α抗体(alphabody)；白蛋白结合域；Adhiron；Affilin；Affimer；Affitin/Nanofitin；抗运载蛋白(anticalin)；Armadillo重复蛋白；Atrimer/Tetranectin；Avimer/Maxibody；Centyrin；Fynomer；人组织因子途径抑制物(Kunitz domain)；Obody/OB-fold；Pronectin；Repebody；和计算设计的蛋白。在另一实施方案中，所述细胞表面蛋白结合域结合到非限制性地选自肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、白细胞、淋巴细胞、T细胞、调整性T细胞、效应T细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、记忆T细胞、自身反应T细胞、耗竭性T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、心肌细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、中枢神经系统细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、细菌细胞和酵母细胞的细胞上的细胞表面蛋白。在又一实施方案中，所述细胞表面蛋白结合域结合到非限制性地选自Her2、EGFR、EpCAM、B7-H3、ROR1、GD2、GPC2、αvβ6、Her3、L1CAM、BCMA、GPCR5d、EGFRvIII、CD20、CD22、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD27、CD28、CD30、CD33、CD48、IL3RA、血小板组织因子、CLEC12A、CD82、TNFRSF1B、ADGRE2、ITGB5、CD96、CCR1、PTPRJ、CD70、LILRB2、LTB4R、TLR2、LILRA2、ITGAX、CR1、EMC10、EMB、DAGLB、P2RY13、LILRB3、LILRB4、SLC30A1、LILRA6、SEMA4A、TAG72、FRα、PMSA、间皮素、LIV-1、CEA、MUC1、PD1、BLIMP1、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、CD39、Nectin-4、癌症标志物、健康组织标志物和心脏标志物的细胞表面蛋白。
在非限制性实施方案中，所述一个或多个结合域包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
表10
Figure BPA0000315860050002061
Figure BPA0000315860050002071
在进一步的非限制性实施方案中，具有结合域的笼多肽包括与非限制性选自SEQID NO：27404-27446的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
表11
Figure BPA0000315860050002072
Figure BPA0000315860050002081
Figure BPA0000315860050002091
Figure BPA0000315860050002101
Figure BPA0000315860050002111
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Figure BPA0000315860050002161
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Figure BPA0000315860050002181
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Figure BPA0000315860050002241
Figure BPA0000315860050002251
在一个实施方案中，所述多肽包括与非限制性选自SEQ ID NO：27404-27446的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选残基。在另一实施方案中，所述多肽包括与非限制性选自SEQ ID NO：27404-27446的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，不包括任选残基。
如本发明所公开，被本发明的多肽隔离的生物活性肽位于闩区内。所述闩区用每个笼多肽序列中的括号表示。可将所述生物活性肽添加到闩区而不移除闩区的任何残基，或可替换笼支架闩区中的一个或多个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)氨基酸残基以产生最终多肽。因此，所述闩区可在包括生物活性肽后被显著修饰。在一个实施方案中，在确定百分比序列同一性时不包括任选残基。在另一实施方案中，所述闩区残基可包括在确定百分比序列同一性中。在另一个实施方案中，在确定百分比序列同一性时可以不包括每个任选残基和闩残基。
在该第二方面的一个实施方案中，多肽是根据第一方面的任何实施方案或实施方案的组合的多肽，并且还包括具有与本发明公开的所列参考笼多肽的氨基酸序列具有所需的40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述多肽还包括笼多肽的闩区内(或替换)的生物活性肽。
所述笼多肽可以是笼诱饵多肽(即：不含生物活性肽)。例如，见SEQ ID NO：1-17、2034-14317和表7、表8和/或表9中列出的某些笼多肽，或可还包括笼支架多肽闩区中的隔离生物活性肽(与笼支架多肽融合)，如本发明更详细所述(例如，参见编号SEQ ID NO：18-49、51-52、54-59、61、65、67-2033、27094-27117、27120-27125和表7、8和/或9中列出的某些笼多肽)。在特定实施方案中，所述笼多肽包括与表7、表8和/或表9中笼多肽的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在另一具体实施方案中，所述笼多肽包括与表8中笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一具体实施方案中，所述笼多肽包括与表9中笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中的每一个实施方案中，在确定百分序列同一性时不包括任选的N-末端和/或C-末端60残基。在另一实施方案中，所述任选残基可包括在确定百分序列同一性中。
在本发明公开的钥匙多肽的一个实施方案中，所述多肽包括与选自SEQ ID NO：27448-27459的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的。在一个实施方案中，序列同一性的确定包括任选残基；在另一实施方案中，序列同一性确定不包括任选氨基酸残基。
表12
Figure BPA0000315860050002271
Figure BPA0000315860050002281
Figure BPA0000315860050002291
Figure BPA0000315860050002301
在一些方面，所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括：
(a)包括与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27359-27392、1-49、51-52、54-59、61、65、67-14317、27094-27117、27120-27125和27278-27321氨基酸序列(不包括任选氨基酸残基；或与表7、表8或表9中所列的笼多肽的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的N端和/或C端60个氨基酸是任选的；和
(b)一个或多个第一、第五、第六或第七结合域。
在一些方面，所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括：
(a)包括与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽(不包括任选氨基酸残基)；和
(b)一个或多个第一、第五、第六或第七结合域。
在一些方面，第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括沿其长度与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列(包括任选氨基酸残基)。
在一些方面，所述第一钥匙多肽和/或第二钥匙多肽包括：
(a)包括与选自SEQ ID NO：27393-27398、14318-26601、26602-27015、27016-27050、27322-27358的氨基酸序列以及表7、表8和/或表9中所列的钥匙多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽；和
(b)一个或多个第二、第三或第四结合域。
在一些方面，所述第一钥匙多肽和/或第二钥匙多肽包括：
(a)包括与选自SEQ ID NO：27393-27398或SEQ ID NO：27394-27395(不包括任选残基)的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列的多肽；和
(b)一个或多个第二、第三或第四结合域。
在本发明任何实施方案或实施方案组合的组合物的一个实施方案中，所述一种或多种生物活性肽可包含一种或多种选自SEQ ID NO：60、62-64、66、27052、27053、27059-27093的生物活性肽。
核酸
一个方面，本发明提供了编码本发明所公开的每个方面的任何实施方案或实施方案的组合的多肽的核酸。所述核酸序列可包括单链或双链RNA或基因组或cDNA形式的DNA，或DNA-RNA杂交，其中每一种可包括化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。此类核酸序列可包括用于促进编码多肽的表达和/或纯化的附加序列，包括但不限于polyA序列、修饰Kozak序列、编码表位标签、编码输出信号和分泌信号、编码核定位信号，以及编码质膜定位信号的序列。对于本领域技术人员来说，基于本发明的教导，哪些核酸序列将编码本发明的多肽将是显而易见的。
另一方面，本发明提供了表达载体，所述表达载体包括与合适的“控制序列”操作性连接的本发明任何方面的核酸。“表达载体”包括可操作地将核酸编码区或基因连接到能够影响基因产物表达的任何控制序列的载体。可操作地连接到本发明的核酸序列的“控制序列”是能够影响核酸分子表达的核酸序列。所述控制序列不需要与核酸序列相邻，只要它们起到引导其表达的作用。因此，例如，在启动子序列和核酸序列之间可以存在插入的未翻译但转录的序列，并且启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。其他此类控制序列包括但不限于增强子、内含子、多聚腺苷酸化信号、终止信号和核糖体结合位点。这种表达载体可以是任何类型，包括但不限于质粒和基于病毒的表达载体。用于在哺乳动物系统中驱动所公开核酸序列的表达的控制序列可以是组成性的(由多种启动子中的任何一种驱动，包括但不限于CMV、SV40、RSV、肌动蛋白、EF、EF1α、MND、MSCV)或可诱导的(由多种诱导启动子驱动，包括但不限于四环素、蜕皮激素、类固醇响应)。所述表达载体必须可作为游离体(episome)或通过整合到宿主染色体DNA中在宿主生物体中复制。在各种实施方案中，所述表达载体可包括质粒、基于病毒的载体或任何其他合适的表达载体。
细胞
在另一方面中，本发明提供了包含本发明所公开的核酸、表达载体(即：外体或染色体整合)或多肽的细胞，例如宿主细胞、治疗性细胞或靶细胞，其中所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。可使用包括但不限于细菌转化、磷酸钙共沉淀、电穿孔或脂质体介导、DEAE-葡聚糖介导、聚阳离子介导或病毒介导的转染等技术，瞬时或稳定地将细胞工程化以整合本发明的表达载体。在一个实施方案中，所述病毒载体包括腺病毒载体、痘苗病毒载体、AAV载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、α病毒载体或其任何组合。在另一实施方案中，所述细胞包括：
(a)编码本发明所述笼多肽的任何实施方案或实施方案的组合的多肽的第一核酸，其可操作地连接到第一启动子；和
(b)编码本发明钥匙多肽的任何实施方案或实施方案组合的多肽的第二核酸，其中，当所述笼和钥匙通过其各自的结合域结合到靶标而共定位时，所述钥匙多肽能够结合到所述笼多肽的结构区以诱导所述笼多肽中的构象变化，其中所述第二核酸可操作地连接到第二启动子。
在一些方面，所述细胞可以是体外细胞。在某些方面，这些细胞是体内细胞。在某些方面，这些细胞是离体细胞。
在一个这种的实施方案中，所述细胞可包括编码核酸的单个笼多肽和编码核酸的单个钥匙多肽，或可包括多个(即：2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)第一和第二核酸，每个第二核酸可编码能够结合到结构区并诱导由多个第一核酸编码的不同笼多肽的构象变化的钥匙多肽。在另一实施方案中，每个第二核酸可编码能够结合到结构区并诱导由多个第一核酸编码的多个笼多肽的构象变化的钥匙多肽。
本发明提及的细胞可以是用于治疗的靶细胞或治疗性细胞。在某些方面，所述靶细胞可以是肿瘤细胞。在某些方面，所述靶细胞可以是健康细胞。在一些方面，所述第一细胞部分、第二细胞部分或两者存在于健康细胞上或健康细胞内。在一些方面，所述第一细胞部分、第二细胞部分或两者存在于疾病细胞上或内。在一些方面，所述第一细胞部分、第二细胞部分或两者存在于肿瘤细胞或癌细胞上或细胞内。在一些方面，所述第一细胞部分、第二细胞部分或两者存在于免疫细胞上或免疫细胞内。在一些方面，所述第一细胞部分、第二细胞部分或两者均存在于选自白细胞、淋巴细胞、T细胞、调整性T细胞、效应T细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、记忆T细胞、自身反应T细胞、耗尽性T细胞、自然杀伤性T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞及其任何组合的细胞上或细胞内。在一些方面，所述第一细胞部分、第二细胞部分或两者存在于选自心肌细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、CNS细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、细菌细胞、酵母细胞、及其任何组合的细胞上或细胞内。
结合域/细胞部分
任何合适的结合域都可在本发明的组合物中使用，只要适用于预期用途。在一些方面，所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七结合域非限制性地选自针对待结合细胞表面部分的抗原结合多肽，包括但不限于Fab′，F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG、重组单链Fv片段(scFv)、VH单结构域、二价或双特异性分子，双价抗体、三价抗体和四价抗体；DARPins；纳米抗体(nanobody)；亲和抗体(affibody)；NS1抗体类似物(monobody)；adnectin；α抗体(alphabody)；白蛋白结合域；Adhiron；Affilin；Affimer；Affitin/Nanofitin；抗运载蛋白(anticalin)；Armadillo重复蛋白；Atrimer/Tetranectin；Avimer/Maxibody；Centyrin；Fynomer；人组织因子途径抑制物(Kunitz domain)；Obody/OB-fold；Pronectin；Repebody；和计算设计的蛋白及其任何组合。
在另一实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七结合域结合到非限制性的选自肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、白细胞、淋巴细胞、T细胞、调整性T细胞、效应T细胞、CD4+效应T细胞，CD8+效应T细胞、记忆T细胞、自身反应T细胞、耗竭性T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、心肌细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、CNS细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、细菌细胞和酵母细胞的细胞上的细胞表面蛋白。
在另一个实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七结合域结合到非限制性的选自Her2、EGFR、EpCAM、B7-H3、ROR1、GD2、GPC2、αvβ6、Her3、L1CAM、BCMA、GPCR5d、EGFRvIII、CD20、CD22、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD27、CD28、CD30、CD33、CD48、IL3RA、血小板组织因子、CLEC12A、CD82、TNFRSF1B、ADGRE2、ITGB5、CD96、CCR1、PTPRJ、CD70、LILRB2、LTB4R、TLR2、LILRA2、ITGAX、CR1、EMC10、EMB、DAGLB、P2RY13、LILRB3、LILRB4、SLC30A1、LILRA6、SEMA4A、TAG72、FRα、PMSA、间皮素、LIV-1、CEA、MUC1、PD1、BLIMP1、CTLA4、LAG3、TIGIT、CD39、结合素-4(nectin-4)、癌症标志物、健康组织标志物和心脏标志物的细胞表面蛋白。在另一实施方案中，所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七结合域包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在本发明任何实施方案或实施方案组合的组合物的一个实施方案中，(i)所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽；和(ii)所述第一和/或第二钥匙多肽，包括至少笼多肽和至少钥匙多肽，其包括分别与同一行或7、8或9中的一行中的笼多肽和钥匙多肽的氨基酸序列(即：表格第2行第1列中的每个笼多肽可与表格第2行第1列中的每个钥匙多肽一起使用，依此类推)至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是每个笼多肽和每个钥匙多肽还包括一个或多个结合域。
在一个实施方案中，所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括：
(a)与非限制性选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选氨基酸残基或不包括任选氨基酸残基；和
(b)一种结合域，其包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述第一钥匙多肽和/或第二钥匙多肽包括：
(a)与选自SEQ ID NO：27393-27398或27394-27395的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选氨基酸残基或不包括任选氨基酸残基；和
(b)一种结合域，其包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括与选自SEQ ID NO：27404-27446的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述第一钥匙多肽和/或第二钥匙多肽包括与选自SEQ ID NO：27448-27459的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，(i)所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括与选自SEQ ID NO：27404-27446的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和(ii)所述第一钥匙多肽和/或第二钥匙多肽包括与选自SEQ ID NO：27448-27459的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
效应物
在一些方面，对本发明有用的效应物包括一个或多个结合部分。在一些方面，所述效应物包括其抗体或抗原结合片段、T细胞受体、DARPin、双特异性或二价分子，双价抗体、三价抗体和四价抗体；纳米抗体(nanobody)；亲和抗体(affibody)、NS1抗体类似物(monobody)、adnectin、α抗体(alphabody)、白蛋白结合域、Adhiron、Affilin、Affimer、Affitin/Nanofitin；抗运载蛋白(anticalin)；Armadillo重复蛋白；Atrimer/Tetranectin；Avimer/Maxibody；Centyrin；Fynomer；人组织因子途径抑制物(Kunitzdomain)；Obody/OB-fold；Pronectin；Repebody；和计算设计的蛋白；诱导蛋白水解的蛋白酶、泛素连接酶、激酶、磷酸酶和/或效应物；或其任何组合。在一些方面，其抗原结合部分包括Fab′，F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG、重组单链Fv片段(scFv)和/或VH单结构域。
在某些方面，所述效应物是治疗性细胞。在一些方面，所述治疗性细胞包括免疫细胞。在某些方面，所述细胞选自T细胞、干细胞、NK细胞、B细胞或其任何组合。在某些方面，所述干细胞是一种诱导多能干细胞。
在一些方面，施用所述效应物杀死包含第一结合部分和第二结合部分的细胞，造成包含第一结合部分和第二结合部分的细胞中的受体信号(例如，细胞因子)；结果在包含第一结合部分和第二结合部分的细胞附近产生信号分子(例如，细胞因子、趋化因子)；或造成包含第一结合部分和第二结合部分的细胞分化。
在一些方面，施用所述效应物在包含第一结合部分和第二结合部分的细胞中诱导受体信号传导(例如，细胞因子)。在一些方面，施用所述效应物导致在包含第一结合部分和第二结合部分细胞附近产生信号分子(例如，细胞因子、趋化因子)，包括但不限于在肿瘤中释放CD4+T细胞因子以支持CD8+T细胞效应物功能。在一些方面，施用所述效应物在包含第一结合部分和第二结合部分的细胞中诱导分化。
本发明的其他方面涉及一种或多种包括本发明所公开组合物的细胞。在一些方面，所述细胞还包括本发明公开的效应物。在某些方面，所述细胞是肿瘤细胞或癌细胞。在某些方面，所述细胞是免疫细胞。在一些方面所述，细胞选自白细胞、淋巴细胞、T细胞、调整性T细胞、效应T细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、记忆T细胞、自身反应T细胞、衰竭性T细胞、自然杀伤性T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞及其任何组合。在一些方面，所述细胞选自心肌细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、CNS细胞、神经元、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、细菌细胞、酵母细胞及其任何组合。
在一些实施方案中，本发明的第四和第五方面的组合物不包括效应物，因为近距离依赖的结合甚至可以在没有效应物蛋白的情况下被检测。在本发明第四和第五方面的任何实施例的组合物的一个实施方案中，存在效应物。可使用适合预期用途的任何效应物。在某些方面，所述效应物结合到一种或多种生物活性肽。在一个实施方案中，所述效应物非限制性选自Bcl2、GFP1-10、小分子、抗体、抗体-药物缀合物、免疫原性肽、蛋白酶、T细胞受体、细胞毒性剂、荧光团、荧光蛋白、细胞粘附分子、内吞受体、吞噬受体、磁珠、和凝胶过滤树脂，以及具有与选自SEQ ID NO：27460-27469的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
表13
Figure BPA0000315860050002371
Figure BPA0000315860050002381
Figure BPA0000315860050002391
III.发明的方法
本发明的一些方面涉及体外、离体或体内提高细胞选择性的方法。本发明的其他方面涉及体外、离体或体内提高相互作用的细胞选择性的方法。本发明的其他方面涉及体外、离体或体内靶向异质细胞(两种以上不同细胞类型)的方法。本发明的其他方面涉及体外、离体或体内降低脱靶活性的方法。
在一些方面，本发明涉及一种提高细胞选择性的方法，所述方法包括体外、体内或离体表达本发明公开的第一笼多肽和本发明公开的第一钥匙多肽。在一些方面，本发明涉及一种提高细胞选择性的方法，其包括在体外、体内或离体添加本发明公开的第一笼多肽和本发明公开的第一钥匙多肽。所述第一笼多肽和一种或多种钥匙多肽可一起(同时)或单独地在体外、体内或体外添加到细胞中。本发明的一些方面涉及一种在体外、离体或体内提高细胞选择性的方法，包括(a)将细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触(例如，表达或添加)，以及(b)将细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触(例如，表达或添加)。在一些方面，所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区。
本发明的一些方面涉及一种体外、离体或体内提高相互作用的细胞选择性的方法，包括：(a)将两个或多个细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽在不与钥匙多肽共定位的情况下的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于在两个或多个细胞之间的突触上的第一细胞部分；和(b)将所述两个或多个细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在与所述第一笼多肽共定位时，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第二结合域能够结合到存在于两个或多个细胞之间的突触上的第二细胞部分。
在一些方面，所述方法还包括将融合到第三结合域的第二钥匙多肽与也表达第一细胞部分的两个或多个细胞的突触接触，其中在与第一笼多肽共定位后，所述第二钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第三结合域能够结合到存在于两个或多个细胞的突触上的第三细胞部分。
在一些方面，所述方法还包括将两个或多个具有融合到一个或多个诱饵结合域的一种或多种诱饵笼多肽的细胞与所述两个或多个细胞接触，其中每个诱饵笼多肽包括诱饵结构区，在与第一钥匙多肽和第一笼多肽共定位时，能够优先结合到第一钥匙多肽，其中每个诱饵结合域能够结合到两个或更多细胞突触中的诱饵细胞部分。
本发明的一些方面涉及一种体外、离体或体内靶向异质细胞(即，两种以上不同细胞类型)的方法，其中所述第一细胞部分和第二细胞部分存在于第一细胞上，所述第一细胞部分和第三细胞部分存在于第二细胞上，包括：(a)使两个或多个细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在不与钥匙多肽共定位的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于所述两个或多个细胞上或内的第一细胞部分；(b)将所述两个或多个细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在共定位时，第一钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活一种或多种生物活性肽，其中所述第二结合域能够结合到存在于还包括第一细胞部分的细胞上的第二细胞部分，和(c)将所述两个或多个细胞与融合到第三结合域的第二钥匙多肽接触，其中在共定位时，所述第二钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第三结合域能够结合到存在于包括第一细胞部分的细胞上的第三细胞部分。
在一些方面，所述方法还包括将两个或多个细胞与融合到一个或多个诱饵结合域的一种或多种诱饵笼多肽接触，其中每个诱饵笼多肽包括诱饵结构区，所述诱饵结构区在与第一钥匙多肽、第二钥匙多肽和/或第一笼多肽共定位时，能够优先结合到第一钥匙多肽或第二钥匙多肽，其中每个诱饵结合域能够结合到包括第一细胞部分和第二细胞部分的细胞中的诱饵细胞部分。
本发明的一些方面涉及一种在体外、离体或体内降低脱靶活性的方法，包括(a)使两个或多个细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在不与钥匙多肽共定位的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于细胞上的第一细胞部分；(b)将所述两个或多个细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在共定位时，所述第一钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中第二结合域能够结合到还包括第一细胞部分的细胞上存在的第二细胞部分，和(c)将所述两个或多个细胞与融合到第三结合域的诱饵笼多肽接触，其中所述诱饵笼多肽包括诱饵结构区，所述诱饵结构区在与所述钥匙多肽和所述第一笼多肽共定位后，能够优先结合到第一钥匙多肽，其中第三结合域能够结合到包括第一细胞部分和第二细胞部分的细胞中的第三细胞部分。在某些方面，所述第三细胞部分仅存在于健康细胞上。
本发明所用“接触”是指使第一元件与第二元件接触的任何方式。在一些方面，接触包括直接将第一元件(例如多肽)添加到第二元件(例如细胞)，例如通过将蛋白添加到细胞培养物中。在一些方面，所述接触包括通过在目标细胞中或在与目标细胞处于相同培养物中的细胞中编码蛋白的核苷酸来表达诸如蛋白的第一元件。在一些方面，同时执行(a)细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽的接触，以及(b)细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽的接触。在一些方面，在接触(b)之前执行接触(a)。在一些方面，在接触(a)之前执行接触(b)。在一些方面，所述接触包括引入编码多肽(例如，第一笼多肽、第一钥匙多肽、第二钥匙多肽和诱饵笼多肽)的多核苷酸。
本发明公开的方法提高了细胞对目标细胞的选择性。在一些方面，所述第一笼多肽和钥匙多肽的共定位提高了高度表达第一细胞部分和第二细胞部分的细胞的选择性。在一些方面，所述第一笼多肽和钥匙多肽的共定位提高了高度表达第一和第二细胞部分的细胞的选择性。在一些方面，所述第一笼多肽和钥匙多肽的共定位提高了高度表达第一和第二细胞部分的细胞以及高度表达第一和第三细胞部分的细胞的选择性。
在另一方面，本发明提供了将效应物靶向细胞的方法，包括将含有细胞的生物样品与本发明任何实施例或实施例组合的多肽、核酸、载体、细胞和/或组合物接触。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于细胞靶向的方法，包括：
(a)将含有细胞的生物样品与以下物质进行接触：
(i)笼多肽，其包括(i)结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，以及(iii)靶向相关细胞的第一结合域，其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性；和
(ii)钥匙多肽，其包括靶向所述关注细胞的第二结合域，其中所述第一结合域和所述第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，(ii)相同细胞表面上的相同部分，(iii)相接触的两个细胞之间的突触的不同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触的相同部分；
其中，接触发生一段时间并在促进笼多肽和钥匙多肽与相关细胞结合，以及促进钥匙多肽与笼结构区的结合的条件下发生，以仅当笼多肽和钥匙多肽共定位于目标细胞时置换所述闩区并激活所述一种或多种生物活性肽；
(b)在促进所述一种或多种效应物与所述一种或多种活化生物活性肽结合以产生效应物-生物活性肽复合物的条件下，将所述生物样品与一种或多种效应物接触；和
(c)任选地检测效应物-生物活性肽复合物，其中效应物-生物活性肽复合物提供生物样品中目标细胞的测量值。
本发明的其他方面涉及为需要治疗的受试者做准备的方法，包括施用本发明所公开的组合物。本发明的一些方面涉及为需要治疗的受试者做准备的方法，包括施用本发明所公开的细胞。
一些方面涉及治疗需要治疗的受试者的疾病或状况的方法，包括向受试者施用效应物，其中还向受试者施用本发明公开的组合物。在一些方面，效应分子的施用杀死包括第一结合部分和第二结合部分的细胞，在包括第一结合部分和第二结合部分的细胞中引起受体信号(例如，细胞因子)；在包括第一结合部分和第二结合部分的细胞附近引起信号分子(例如，细胞因子、趋化因子)的产生；或引起包括第一结合部分和第二结合部分的细胞分化。本发明公开的任何效应物可用于该方法中。在一些方面，所述效应物结合到一种或多种生物活性肽。在一些方面，所述效应物包括其抗体或抗原结合片段、T细胞受体、DARPin、双特异性或二价分子，双价抗体、三价抗体和四价抗体；纳米抗体；亲和抗体、NS1抗体类似物、adnectin、α抗体、白蛋白结合域、Adhiron、Affilin、Affimer、Affitin/Nanofitin；抗运载蛋白；Armadillo重复蛋白；Atrimer/Tetranectin；Avimer/Maxibody；Centyrin；Fynomer；人组织因子途径抑制物；Obody/OB-fold；Pronectin；Repebody；计算设计的蛋白；或其任意组合。在某些方面，效应物包括其抗体或抗原结合片段。在一些方面，其抗原结合部分包括Fab′，F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG、重组单链Fv片段(scFv)和/或VH单结构域。
在一些方面，所述效应物是治疗性细胞。在一些方面，所述治疗性细胞包括T细胞、干细胞、NK细胞、B细胞或其任何组合。在一些方面，所述治疗性细胞包括免疫细胞。在一些方面，所述治疗性细胞包括T细胞。在一些方面，所述治疗性细胞包括干细胞。在某些方面，所述干细胞是一种诱导多能干细胞。在一些方面，所述治疗性细胞包括NK细胞。
实施例
概述
自然生物系统通过硬编码为特殊功能的翻译后信号级联整合多个蛋白结合输入；一个能够通过构象转换整合多个结合输入的合成系统可能是预测性控制多种生物功能的通用解决方案。我们描述了近距离激活从头蛋白开关的计算设计，所述开关执行“与”、“或”和“非”布尔逻辑运算及其组合，以对蛋白结合事件的精确组合做出响应。只有在满足所有逻辑条件时，开关才会通过构象变化来激活，并且高分辨率X射线晶体结构证实了该设计模型。我们证明了该系统对于哺乳动物细胞的超特异性靶向的实用性，这些细胞在复杂的细胞群体中仅通过表面标志物的精确组合来区分。我们的工作表明，从头设计的蛋白可以在细胞表面进行计算，将多种不同的结合相互作用整合到单个生物输出中。
我们着手从头开始设计一个概括性的蛋白系统，该系统能够执行复杂的逻辑以响应组合结合事件。我们的目标是建立一个模块化系统，能够在组件接近时计算布尔逻辑运算的组合(‘与’、‘或’、‘非’)，并驱动单个结合交互(binding interaction)作为输出(图1a)。这种系统对于调整细胞核、细胞质和细胞表面广泛的细胞交互具有广泛的用途。在此，我们开发了这样一个系统并将其应用于细胞靶向应用：我们试图使用布尔逻辑来区分细胞亚群，以将多个蛋白结合输入集成到单个输出生物功能中，利用抗原在细胞表面结合的特性提高结合蛋白的局部浓度。为了使该系统普遍有用，驱动必须是模块化的，并且独立于目标抗原标识。
我们开始设计新的蛋白开关，其致动域(actuation domain)通过接近额外设计的组件被激活。我们设计了在溶液中激活的蛋白开关：闩正交笼-钥匙蛋白(LOCKR)开关由一个结构“笼”蛋白组成，该结构使用“闩”结构域以非活性构象隔离功能肽，直到结合一个单独的“钥匙”蛋白诱导构象变化，允许与“效应物”蛋白结合。笼、钥匙和效应物以三向平衡结合，开关的灵敏度可以通过调整笼-闩和笼-钥匙的相对亲和力来调整。我们设计了新的LOCKR蛋白，使其在溶液中具有惰性，并且只有当笼和钥匙共定位时才会被强烈激活。我们设计了具有较短螺旋、改进的疏水填充和额外氢键网络的新型LOCKR开关，以促进螺旋之间的相互作用特异性(图4a-c和方法部分的计算蛋白设计部分提供了设计过程的详细描述)。新设计几乎为100％单体，与其他示例性LOCKR开关相比，聚合显著减少(图5a)。新设计改进的溶液行为使我们能够解析
Figure BPA0000315860050002441
射线晶体结构，该结构与设计模型(图1b，表16)非常匹配，在新设计的氢键网络(图1b)中，所有主链原子的均方根差(RMSD)为
Figure BPA0000315860050002442
所有侧链重原子的均方根差(RMSD)为
Figure BPA0000315860050002443
我们以新的设计为出发点，开发了共定位依赖的LOCKR(Co-LOCKR)开关(图1c)。为了将输出功能装配到Co-LOCKR中，我们选择Bim-Bcl2对作为肽蛋白结合的模型系统(12)。Bim作为一种隔离肽编码到闩中；Bcl2被用作效应物。然后，我们添加了靶向结构域，这些结构域招募Co-LOCKR笼和表达靶抗原的细胞的钥匙。虽然靶向结构域应与表达其靶抗原的任何细胞结合，但只有同时具有这两种抗原的细胞才能招募笼和钥匙蛋白，从而实现共定位依赖性激活(图1d-图1e)。Co-LOCKR通过基于可逆蛋白-蛋白相互作用的热力学机制启动；因此，复合物的形成可能发生在溶液(图6a)或表面(图6b)，其中笼钥匙共定位提高了局部浓度，并改变了结合平衡以利于复合物的形成(图6c)。我们在下面展示了使用Co-LOCKR开关来对包括荧光团的效应蛋白的招募进行调整。
为了评估Co-LOCKR靶向共表达表面抗原精确组合的细胞的能力，我们通过结合表达Her2-eGFP、EGFR-iRFP或两者均不表达的四个K562细胞系，开发了混合群体流式细胞术分析(图1d)。我们使用设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)结构域(13，14)分别靶向Her2和EGFR的笼和钥匙。如果系统按设计运行，则只有同时表达Her2和EGFR的细胞才能激活Co-LOCKR并结合Bcl2：笼中含有分离的Bim肽，其暴露需要钥匙。我们将这种Co-LOCKR配置称为CL_CHKE；在该术语中，“CL”指的是Co-LOCKR，CH表示笼靶向的是Her2，KE表示钥匙靶向的是EGFR(表17)。当混合的细胞群与笼和钥匙(3μM至1.4nM)等摩尔稀释系列共同孵育，并在添加AlexaFluorTM594标记的Bcl2(Bcl2-AF594)之前清洗时，观察到了Her2/EGFR细胞的预期S型结合曲线，但在单独表达任一蛋白的细胞中没有观察到(图1f)。当细胞与笼、钥匙和Bcl2-AF594共同孵育而不洗涤时，同样仅对Her2/EGFR细胞观察到结合，但Bcl2-AF594信号在111nM CL_CHKE处达到峰值，在较高浓度下降低；游离笼和钥匙可能与溶液中形成的笼-钥匙-Bcl2竞争与有限数量的表面Her2和EGFR蛋白的结合。
接下来，我们试图调整Co-LOCKR激活的动态范围，以提高共定位依赖的激活灵敏度和响应性。我们最初的设计是为了最大化笼-闩亲和力，以确保共定位依赖性，这让我们不禁要问，削弱笼-闩亲和力是否可以在不影响计算逻辑能力的情况下提高信号强度。通过缩短闩以产生“立足点”，调整了先前LOCKR具开关的灵敏度，但这也促进了聚合(图5b)。因此，我们将重点放在合理设计的突变上，以调整Co-LOCKR系统的相对相互作用亲和力，使其依赖于共定位(图7a-c)。我们在SEQ ID NO：27359(I287A、I287S、I269S)或笼(L209A)多肽的闩区突变大的疏水残基，以削弱笼-闩亲和力(图2a)。生物膜层干涉表明，破坏性突变的提高提高了反应性(图8b)，流式细胞术显示，调整笼-闩界面增强了共定位依赖性激活：调整后的CL_CHKE变体在相同的K562/Her2/EGFR细胞上显示出更大的Bcl2-AF594荧光(图2b，图8c)。即使在低纳摩尔浓度的CL_CHKE中，也会发生共定位依赖性激活，这可能受到小培养体积中可用的LOCKR蛋白数量的限制(图8d-e)。单独表达Her2或EGFR的细胞很少观察到效应物结合，这表明Co-LOCKR可以避免以反式(in trans)的方式靶向附近的细胞。在测试的开关中，I269S表现出最大的激活(图9a)，亲代Co-LOCKR设计表现出最低的脱靶激活(图9b)，I287A表现出最高倍数的特异性(图9c)。
共聚焦显微镜也观察到亚细胞水平的共定位依赖性激活。CL_CHKE将Bcl2-AF680招募到HEK293T/Her2/EGFR细胞的质膜上，而非HEK293T/Her2或HEK293T/EGFR上(图2c)。在显示共定位Her2-eGFP和EGFR-iRFP信号的质膜区域之间存在密切的对应关系，并伴有Co-LOCKR激活(图2c，第6列，图2d中定量)。
为了评估Co-LOCKR的灵活性，我们尝试特异性地靶向三种癌症相关抗原(Her2、EGFR和EpCAM)的替代成对组合。这些抗原中的每一种都通过工程化K562细胞系或人类癌细胞系以不同的水平表达(图10a、图11a)。使用I269S变体最大限度地检测低水平的抗原，我们发现(1)Co-LOCKR可以在每种情况下区分正确的一对抗原，(2)Bcl2结合的程度与两种靶抗原中低表达的表达水平相对应(图3a、图11b-c)，与共定位依赖活化的化学计量结合机制一致。综上所述，这些结果证明了Co-LOCKR的模块性，其以多种不同表达水平产生的抗原为靶点。虽然我们选择DARPin作为靶向结构域，以便能够容易地表达Co-LOCKR变体，但任何结合结构域都可以被替代，包括单链可变片段(图12)。
一种真正通用的原位定位任何细胞类型的技术需要更复杂的逻辑，包括“与”、“或”和“非”操作的组合。原则上，Co-LOCKR的共定位依赖激活机制应该特别适合于实现这一点。“或”逻辑可能通过添加第二个钥匙来实现，该钥匙融合到针对替代表面标记的结合域(图3b)。“非”逻辑可以通过添加融合到靶向待避开的表面标记的结合域的诱饵蛋白来实现；诱饵充当海绵来隔离钥匙，从而阻止笼激活(图3d)。
使用Her2、EGFR和EpCAM作为模型抗原(Ag)，我们首先探索了细胞表面的[Ag1 AND(Ag2 OR Ag3)]逻辑(图3b)。为了评估Co-LOCKR靶向的可组合性，我们测试了所有三种组合：[Her2和(EGFR或EpCAM)]，[EGFR和(Her2或EpCAM)]以及[EpCAM和(Her2或EGFR)]。在所有情况下，正确的细胞亚群的靶向水平与限制性靶抗原一致(图3c)。例如，CL_CEKHKEp靶向细胞表达EGFR/EpCAMlo 10倍于背景，Her2/EGFR/EpCAMlo 59倍于背景，Her2/EGFR/EpCAMhi56倍于背景，但在缺少至少一种抗原的细胞上表现出最小的脱靶激活(图3c的中间面板)。
接下来，我们使用CL_CHKEpDE(D代表诱饵)和同一组模型抗原探索[Ag1 AND Ag2NOTAg3]逻辑(图3d)。与预期的化学计量活化机制相一致，Ag3需要以高于Ag2的水平表达，以使过多的诱饵可以隔离钥匙的所有分子：将诱饵靶向高表达EGFR完全消除了靶向低水平而非高水平EpCAM的钥匙的活化。笼-闩亲和力(图3d、图13a)和诱饵-钥匙亲和力(图13b、图14a-图14d)可以很容易地调整，以最小化漏失或最大化激活。
使用Co-LOCKR执行复杂逻辑运算的能力提供了以前的靶向选择技术所没有的控制水平和灵活性。此外，通过合理设计的点突变来调整响应性的能力使Co-LOCKR能够快速优化，适用于广泛的应用。
与目前的方法不同，Co-LOCKR在表达顺式抗原精确组合的单个细胞上计算逻辑，专门针对靶细胞定向细胞毒性，而不损害仅提供靶抗原子集的相邻脱靶细胞。实现复杂逻辑的能力(例如[Ag1 AND (Ag2 OR Ag3)](图3c)和[Ag1 AND Ag2 NOTAg3](图3d)是Co-LOCKR独有的，无法通过现有技术实现。
通常，Co-LOCKR系统的效能来自多个相干或竞争输入的集成，这些输入决定了单个响应的幅度。通过钥匙结合提高闩上功能肽的输出信号暴露，并通过诱饵竞争对抗。原则上，每个分子的数量没有限制，允许任意复杂的逻辑运算。尽管我们目前的工作重点是描述该系统并证明其在体外改善基于T细胞的癌症免疫治疗的能力，但在任何需要通过细胞表面计算进行近距离激活或特异性靶向的环境中，Co-LOCKR系统对于工程生物学来说都是强大的。
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方法
计算蛋白设计
新型LOCKR开关的设计
首先，LOCKRa(SEQ ID NO：6)的骨架被用作Rosetta蛋白设计软件的输入坐标。闩残基、笼上与闩接触的残基(由RosettaTM中的Interface By Vector残基选择器定义)和现有氢键网络固定在其输入转子流量计的坐标上，而剩余残基位置重新设计如下：使用HBNetTM设计额外的氢键网络；其次，进行RosettaDesignTM计算以优化疏水性填充，同时使用原子对每个侧链氢键的重原子束缚来维持新的氢键网络。该设计程序产生了一种新的不对称笼框架(scaffold)，称为AsymLOCKR。然后，我们通过目视检查将螺旋束截短12个残基，将螺旋与SGS接头重新连接，并将几个暴露于表面的精氨酸和赖氨酸残基突变为谷氨酸以降低pI，从而创建了该设计的较短版本(图1b)。最后，我们将Bim序列编码到闩中，以将这些框架转换为LOCKR。较短的版本(SEQ ID NO：27359)用作母体Co-LOCKR。下面提供了用于执行这些设计计算的RosettaScriptsTM XML文件。
设计用于调整笼-闩-钥匙的相对亲和力，以实现共定位依赖的激活
我们合理地将SEQ ID NO：27359(I287A、I287S、I269S)或笼(L209A)中的大的疏水残基突变为丙氨酸或丝氨酸，以削弱笼-闩界面并提高Co-LOCKR灵敏度。我们删除了钥匙N端或C端的几个氨基酸，以削弱笼-钥匙界面，降低Co-LOCKR灵敏度/漏失。
优化Bcl2的设计
对原生Bcl2进行了重新设计，以改善其溶液行为和稳定性。首先，跨膜结构域的C端32个残基被删除，Bcl2第35～91位残基之间的长环被同源Bcl-xL35～50位残基取代，如前所述(30)。使用RosettaTM和PROSSTM(31)进行额外突变，以改善疏水堆积和稳定性。合理地进行额外的表面突变以提高溶解度并去除糖基化位点。
实验方法
细菌蛋白的表达和纯化
含有编码所需基因的pET21质粒的大肠杆菌Lemo21TM(DE3)细胞在添加50μg ml-1羧苄青霉素的3ml Luria-Bertani(LB)培养基中培养过夜(10-16小时)，并在37℃下以225rpm的转速振荡。将起始培养物添加到添加了羧苄青霉素的500ml Studier TBM-5052自诱导培养基中，在37℃下生长4-7小时，然后在18℃下再生长18-24小时。通过在5000g 4℃下离心15分钟获得细胞，并将其重新悬浮在20mL裂解缓冲液中(室温下25mM Tris pH 8.0，300mM NaCl，20mM咪唑，1mg ml-1溶菌酶(来自鸡蛋，Sigma L6876)，0.1mg ml-1 DNase I(来自牛胰腺，Sigma DN25)。细胞在1mM苯甲磺酰氟(PMSF)存在下通过微流控进行裂解。裂解物通过在4℃下以24000g离心30分钟进行澄清，并通过2ml镍氮三乙酸琼脂糖(Ni NTA，Qiagen，30250)在裂解缓冲液中预平衡。用15个柱体积(CV)的洗涤缓冲液(室温下25mMTris pH 8.0，300mM NaCl，40mM咪唑)洗涤固定化蛋白两次，用5CV高盐洗涤缓冲液(室温下25mM Tris pH 8.0，1M NaCl，40mM咪唑)洗涤一次，用15CV洗涤缓冲液再次洗涤，然后用10ml洗脱缓冲液(室温下25mM Tris pH 8.0，300mM NaCl，250mM咪唑)洗脱。然后浓缩洗脱的蛋白(
Figure BPA0000315860050002531
离心过滤装置，10kDa NMWL)，并用Tris缓冲盐(TBS；室温下25mM Tris pH 8.0，150mM NaCl)中的SuperdexTM 7510/300GL(GE)尺寸排阻柱通过FPLC凝胶过滤进一步纯化。将含有非聚集蛋白的部分汇集、浓缩并添加甘油至10％v/v的终浓度，然后在280nm处通过吸光度进行定量(NanodropTM)，等分，并在液氮中快速冷冻。蛋白等分样在-80℃下稳定。
X射线结晶学
对于结晶学筛选，在SEC/FPLC之前，先通过TEV切割去除六聚组氨酸标签，然后进行Ni-NTA亲和层析。将纯化的蛋白样品浓缩至约12mg ml-1，并使用JCSG+和JCSG Core I-IV筛网(Qiagen)在带有主动湿度室的Mosquito 5-板位晶体培养机器人(ttplabtech)上进行筛选。在2至14天后，通过坐滴蒸汽扩散(sitting drop vapor diffusion)获得晶体，蛋白溶液与储存溶液的滴比为1∶1、2∶1和1：2。产生用于结构测定的晶体的条件为0.2M酒石酸二钠、20％(w/v)PEG 3350且不添加冷冻保护剂。
X射线数据收集和结构测定
蛋白晶体形成环状并在液氮中快速冷冻。数据集收集于劳伦斯伯克利国家实验室的先进光源(Advanced Light Source at Lawrence Berkeley National Laboratory)，光束线为8.2.1和8.2.2。使用XDS(34)对数据集进行索引和缩放，使用PHASERTM(35)从PhenixTM软件包(36)中的分子置换(MR)获得相位信息；设计模型用于最初的MR搜索。MR后，使用Phenix.autobuild(37)改进模型；通过将就地重建(rebuild-in-place)设置为假(false)，并使用模拟退火以及启动和转换相位(prime-and-switch phasing)，努力减少模型偏差。COOTTM(38)和PhenixTM的修正迭代手动构建生成最终模型。根据Phenix.Xtriage的报告，数据中存在非晶体学平移对称性，这使结构修正变得复杂，并可能解释所报告的高于预期的R值。使用PhenixTM(36)计算了理想几何体的钥匙长、角度和二面体的RMSD。最终模型的总体质量采用钼概率法(39)进行评估。表16总结了衍射数据和修正统计数据。
Bcl2标记
对于BLI实验，根据制造商(Avidity)说明书，使用BirA对具有C端Avi和6x His标签的野生型非优化Bcl2进行酶生物素化，通过Ni NTA纯化，洗脱到TBS中，浓缩，在液氮中快速冷冻，并在-80℃下储存。对于流式细胞术实验，带有C端半胱氨酸的Bcl2通过Ni-NTA和凝胶过滤纯化，如上所述，向缓冲液中添加0.5mM TCEP。合并含有Bcl2单体的所有馏分，在添加有2％甘油和1mM TCEP的TBS中浓缩至100μM，并在4℃下用5倍摩尔过量的Alexa FluorTM594 C5马来酰亚胺(Invitrogen A10256)或Alexa FluorTM 680 C2马来酰亚胺(InvitrogenA20344)标记过夜。然后标记反应过夜透析到添加了10％甘油的TBS中，并通过如上所述的凝胶过滤进行纯化。将含有单体蛋白的部分汇集、浓缩并补充甘油至10％v/v的最终浓度，然后在280nm处通过吸光度进行定量、等分并在液氮中快速冷冻。蛋白等分试样在-80℃下稳定。解冻后，蛋白等分试样在4℃下储存长达一周。
生物膜层干涉(BLI)
BLI在带有链霉亲和素(SA)涂层生物传感器的
Figure BPA0000315860050002541
系统(ForteBio)上进行，并使用ForteBio数据分析软件版本9.0.0.10进行分析。分析缓冲液为HBS-EP+缓冲液(10mMHEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％v/v表面活性剂P20，0.5％脱脂奶粉，室温pH7.4)。使用0.5nm的设定(programmed)阈值将生物素化Bcl2蛋白偶联(loaded)到SA尖端。将偶联的生物传感器浸入HBS-EP+缓冲液中获得基线；将偶联的生物传感器浸入含有一系列LOCKR笼和钥匙浓度的孔中，观察缔合动力学。通过将针尖浸入HBS-EP+缓冲孔(用于获得基线)观察解离动力学。对于图2和图8b-e，同时稀释笼和钥匙，以保持1∶1的化学计量比。
哺乳动物蛋白的表达和纯化
如前所述(40)，使用Daedalus系统制备单链抗体靶向的Co-LOCKR蛋白(抗Her2_笼_I269S和钥匙_抗EGFR-scFv)。蛋白在HisTrapTM FF粗蛋白纯化柱(GE货号17528601)上纯化，然后进行尺寸排阻色谱(GE Superdex 200 10/300 GL)分析并在添加了5％甘油的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中洗脱。
细胞培养
K562(CCL-243)、Raji(CCL-86)、A431(CRL-1555)和HEK293T(CRL-3216)细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。293T LentiX细胞购自Clontech。SKBR3细胞是DavidHockenbery(Fred Hutchinson癌症研究中心)赠送的。K562和Raji细胞在添加了5％胎牛血清(FBS)、1mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES和100U ml-1青霉素/链霉素的RPMI-1640(Gibco)中培养。A431、SKBR3、HEK293T和LentiX细胞在添加了10％FBS、1mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES、100U ml-1青霉素/链霉素和1mM丙酮酸盐的高糖DMEM(Gibco)中培养。原代人T细胞在CTL培养基中培养，该培养基由RPMI-1640和10％人血清、2mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES、100U ml-1青霉素/链霉素和50μM L-1β-巯基乙醇组成。所有细胞在37℃和5％CO2下培养，并使用MycoAlertTM支原体检测试剂盒(Lonza)每两个月检测一次是否存在支原体。
K562和HEK293T细胞系的产生
使用线性25kDa聚乙烯亚胺(PEI；Polysciences)瞬时转染psPAX2(AddgenePlasmid#12260)、pMD2.G(Addgene Plasmid#12259)包装质粒以及编码Her2 eGFP、EGFRiRFP(K562细胞)或EGFR mCherryTM(HEK293T细胞)的慢病毒载体。两天后，将病毒上清液以8000g离心浓缩18小时，并用4μg·ml-1聚布伦(Sigma)添加到K562细胞或HEK293T中。流式细胞仪检测表明，Her2-eGFP和EGFR-iRFP细胞株的转化率为98％，Her2-eGFP/EGFR-iRFP细胞株的转化率为88％。
由于K562细胞内源性表达低水平的EpCAM，EpCAM敲除(KO)细胞系是通过
Figure BPA0000315860050002551
系统(IDT)的核感染产生的。在无核酸酶双链缓冲液中重组靶向人类EpCAM基因(Hs.Cas9.EpCAM.1.AA和Hs.Cas9.EpCAM.1.AB，IDT)的预先设计的crRNAs，以等摩尔浓度与tracrRNA混合，加热至95℃退火5分钟，然后缓慢冷却至室温。将crRNA-tracrRNA双链体与S.p.Cas9核酸酶V3和Cas9电穿孔增强剂在室温下结合并复合15分钟。将RNP复合物添加到K562细胞系中，并根据制造商的说明，使用4D Nucleofector mCherryTM(Lonza)，使用SF细胞系缓冲液和FF-120程序进行核转染。四天后，对EpCAM染色阴性的细胞进行FAC分选，纯度大于99％。
通过使用CalPhosTM哺乳动物转染试剂盒(Clontech)瞬时转染含有pPAX2、pMD2.G和编码人EpCAM的慢病毒载体(UniProt：P16422，氨基酸1-314)的LentiX细胞制备表达EpCAM的慢病毒，将Her2-eGFP、Her2-eGFP/EGFR-iRFP和亲代K562细胞用上述表达EpCAM的慢病毒转导高EpCAM K562细胞系。转染两天后，使用0.45μm PES注射器过滤器(微孔)过滤病毒上清液。五天后，对EpCAM、EGFR或Her2高染色的转导细胞进行FAC分选，纯度大于95％。使用编码膜栓的Bim-eGFP融合蛋白(mIgK信号肽、GS接头、Bim肽、SGSG接头、eGFP、PDGFR跨膜结构域)的慢病毒以相同方式生成表达Bim-eGFP的K562细胞，在转导后五天FACS分选表达eGFP的细胞。
流式细胞术和细胞表型分析
用1∶100稀释的荧光团结合单克隆抗体对细胞进行染色，这些单克隆抗体针对从ThermoFisher或Biolegend购买的人类EGFR(AY13)、EpCAM(9C4)、HA1.1(16B12)或Her2(24D2)。适当时，细胞也用同型对照荧光团结合抗体染色。对于Bcl2-AF594结合测定，将K562细胞系组合成具有相同数量的每种细胞类型的混合群体。由于EpCAM未标记荧光蛋白，因此在图3中对每个逻辑运算评估了两个不同的群体：一个“低EpCAM”群体包括K562/EpCAMlo、K562/Her2 eGFP/EpCAMlo、K562/EGFR iRFP/EpCAMlo和K562/EGFR iRFP/EpCAMlo，另一个“高EpCAM”群体包括K562/EpCAMlo、K562/Her2 eGFP/EpCAMhi，K562/EGFR-iRFP/EpCAMlo和K562/EGFR-iRFP/EpCAMhi。使用流动缓冲液(20mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2和1％BSA)清洗细胞混合物，并将其等分到V型底板中，每个孔20万个细胞。除非另有说明，样品在室温下与50nM Bcl2-AF594孵育1小时，笼、钥匙和/或诱饵在最终浓度为20nM孵育1小时。样品在150μl流动缓冲液中洗涤一次，然后在分析前15-30分钟在150μl流动缓冲液中重悬。
数据通过LSRII或FACSCelesTM(BD Biosciences)获取。使用FACSAria IITM(BDBiosciences)对K562细胞进行FACS纯化。根据制造商的说明书，使用QuantibriteTM珠(BDBiosciences)测定K562细胞表面EGFR、EpCAM和Her2分子的绝对数量。使用FlowJoTM(Treestar)分析所有流式细胞术数据。
共聚焦显微镜
HEK293T细胞在37℃和5％CO2(ibidi 80826)条件下在ibidi μ-玻片8孔盖玻片中培养1天。在高糖、HEPES、无酚红DMEM(Gibco 21063029)中进行细胞染色和培养。根据制造商的说明(Invitrogen R37605)，用Invitrogen分子探针NucBlueTM Live ReadyProbesTM试剂对细胞核进行染色。细胞在含有1％BSA、20nM Her2_笼-I269S、20nM钥匙_EGFR和50nMBcl2-AF680的培养基中在37℃和5％CO2下培养1-2小时。图像在徕卡SP8X共焦显微镜上采集，并在Fiji进行分析。
共聚焦显微镜热图分析
Fiji的mCherryTM、eGFP和AF680通道分别被指定了红色、绿色和蓝色(RGB)假彩色。使用自定义python脚本(请参阅补充资料)，ImageIO python库用于读取RGB PNG文件，SciPy python库用于从伪彩色像素强度生成二维组合统计，MatplotlibTM库用于将结果可视化为热图。
统计分析
使用PrismTM(GraphPad)进行统计分析。使用普通的单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett’s post-hoc分析来比较Co-LOCKR诱导的靶向性(图3a、c、e)和CAR T细胞细胞因子的产生(图4)。对于“与”靶向选择，将对照组设置为双阴性细胞系；对于“或”和“非”靶向选择，将对照组设置为三阴性细胞系。图中仅显示了满足α＝0.05的统计显著截止值的p值。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001，****表示p＜0.0001。
表16.X射线结晶学数据收集和修正统计。括号中显示了最高分辨率shell的统计信息。
Figure BPA0000315860050002581
Figure BPA0000315860050002591
表17.Co-LOCKR逻辑。
Figure BPA0000315860050002601
Figure BPA0000315860050002611
Figure BPA0000315860050002621
Figure BPA0000315860050002631
Figure BPA0000315860050002641
Figure BPA0000315860050002651
Figure BPA0000315860050002661
Figure BPA0000315860050002671
Figure BPA0000315860050002681
Figure BPA0000315860050002691
Figure BPA0000315860050002701
Figure BPA0000315860050002711
Figure BPA0000315860050002721
所有氨基酸序列
模块化序列：
1.Co-LOCKR由一种或多种笼多肽、一种或多种钥匙多肽和一种或多种诱饵多肽组成，其中
a.所述笼多肽由一个或多个模块化靶向部分、一个或多个模块化Co-LOCKR笼结构域和任选的一个或多个模块化Co-LOCKR接头组成
b.所述钥匙多肽由一个或多个模块化靶向部分、一个或多个模块化Co-LOCKR钥匙域和任选的一个或多个模块化Co-LOCKR接头组成
c.所述诱饵多肽由一个或多个模块化靶向部分、一个或多个模块化Co-LOCKR诱饵结构域和任选的一个或多个模块化Co-LOCKR接头组成
模块化靶向部分：见表10
表14
Figure BPA0000315860050002731
模块化Co-LOCKR笼域：见表1。
Co-LOCKR笼和诱饵蛋白：见表11。
模块化Co-LOCKR钥匙域：见表4。
Co-LOCKR钥匙蛋白：见表12。
效应蛋白：见表13。
表15
Figure BPA0000315860050002741
表16
Figure BPA0000315860050002742
Figure BPA0000315860050002751
Figure BPA0000315860050002761
Figure BPA0000315860050002771
Figure BPA0000315860050002781
Figure BPA0000315860050002791

Claims (223)

1.一种在体外、离体或体内提高细胞选择性的方法，包括
(a)将细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中，所述结构区与所述闩区相互作用，以在不与钥匙多肽共定位的情况下阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于所述细胞上或细胞内的第一细胞部分；和
(b)将所述细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合到存在于所述细胞上或细胞内的第二细胞部分，
其中所述第一细胞部分和第二细胞部分不同或相同。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分不同。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分相同。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一笼多肽和所述第一钥匙多肽的共定位提高效应物对包含所述第一细胞部分和所述第二细胞部分的细胞的选择性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述接触(a)和接触(b)同时或顺序执行。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分彼此非常接近；任选地，其中：
(a)所述第一细胞部分和所述第二细胞部分由于直接或间接形成复合物而共定位；和/或
(b)所述第一细胞部分和所述第二细胞部分由于在同一亚细胞室中以足够数量表达而共定位。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一细胞部分和/或所述第二细胞部分以每个细胞至少约100个拷贝、每个细胞至少约200个拷贝、每个细胞至少约500个拷贝、每个细胞至少约1000个拷贝、每个细胞至少约1500个拷贝、每个细胞至少约2000个拷贝、每个细胞至少约2500个拷贝、每个细胞至少约3000个拷贝、每个细胞至少约3500个拷贝、每个细胞至少约4000个拷贝、每个细胞至少约4500个拷贝、每个细胞至少约5000个拷贝、每个细胞至少约5500个拷贝、每个细胞至少约6000个拷贝、每个细胞至少约6500个拷贝、或每个细胞至少约7000个拷贝存在。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其还包括允许所述第一笼多肽和所述第一钥匙多肽共定位，从而形成复合物并激活所述一种或多种生物活性肽。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分存在于所述细胞的表面上。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分存在于所述细胞的细胞质内。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分存在于所述细胞的细胞核内。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其还包括使该细胞与融合到第三结合域的第二钥匙多肽接触，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第二钥匙多肽能够结合至所述笼结构区以激活所述一或多个生物活性肽，其中，所述第三结合域能够结合到还包含第一细胞部分的细胞上或细胞内存在的第三细胞部分，其中所述第三细胞部分不同于所述第一细胞部分或所述第二细胞部分；以及任选地，所述方法还包括第三钥匙多肽、第四钥匙多肽、第五钥匙多肽、第六钥匙多肽或第七钥匙多肽，其中所述第三、第四、第五、第六或第七钥匙多肽中的一种或多种融合到结合域，其中，所述结合域能够结合到包含第一细胞部分的所述细胞上或细胞内存在的细胞部分。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中
(i)所述第一钥匙多肽包括第三结合域，其中所述第二结合域和/或第三结合域结合到(i)同一细胞表面上与第一结合域不同的部分，或(ii)在相接触的两个细胞之间的突触上与第一结合域不同的部分，其中，在与所述第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第三结合域能够结合到还包含所述第一细胞部分的所述细胞上或细胞内的第三细胞部分，其中，所述第三细胞部分不同于所述第一细胞部分或所述第二细胞部分；和/或
(ii)还包括使细胞与至少第二笼多肽接触，所述第二笼多肽包括(A)第二结构区，(B)进一步包含一种或多种生物活性肽的第二闩区，以及(C)第六结合域，其中，所述第二结构区与所述第二闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，其中所述第一钥匙和/或所述第二钥匙多肽能够结合到所述第二结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，第六结合域和/或第一结合域结合到(I)同一细胞表面上与第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(II)与在相接触的两个细胞之间的突触上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分；其中，在与第一笼或第二笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到第一笼或第二笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其还包括将融合到第三结合域的第二钥匙多肽与包括第二细胞的细胞接触，所述第二细胞还包括第一细胞部分，其中在与第一笼多肽共定位后，所述第二钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第三结合域能够结合到存在于第二细胞上或内的第三细胞部分。
15.根据权利要求1至11或14中任一项所述的方法，其还包括将所述细胞与融合到第四结合域的第三钥匙多肽接触，其中在与第一笼多肽共定位后，所述第三钥匙多肽能够结合至笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第三结合域能够结合到还包含第一细胞部分的所述细胞上或细胞内的第三细胞部分，其中所述第三细胞部分不同于所述第一细胞部分或所述第二细胞部分。
16.根据权利要求15所述的方法，其还包括将所述细胞与第四钥匙多肽、第五钥匙多肽、第六钥匙多肽或第七钥匙多肽接触，其中所述第四、第五、第六或第七钥匙多肽中的一种或多种融合到结合域，其中所述结合域能够结合到存在于所述细胞上或细胞内的细胞部分。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其还包括将所述细胞与融合到一个或多个结合域的一种或多种诱饵笼多肽(“诱饵结合域”)接触，其中每个诱饵笼多肽包括诱饵结构区，所述诱饵结构区在与所述第一钥匙多肽和所述第一笼多肽共定位后，能够优先结合到所述第一钥匙多肽，其中每个诱饵结合域能够结合到细胞中包括第一细胞部分和/或第二细胞部分的细胞部分(“诱饵细胞部分”)。
18.根据权利要求17所述的方法，其中每个诱饵细胞部分仅存在于健康细胞上。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中在与所述第一钥匙多肽共定位后，所述诱饵笼多肽结合到所述第一钥匙多肽，并且其中所述第一笼多肽中的一种或多种生物活性肽未被激活。
20.一种提高体外、离体或体内相互作用的细胞选择性的方法，包括：
(a)将两个或多个细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中，所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在没有与钥匙多肽共定位的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于所述两个或多个细胞之间的突触中的第一细胞部分；和
(b)将所述两个或多个细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合到存在于所述两个或多个细胞之间的突触中的第二细胞部分，
其中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分相同或不同。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分彼此非常接近。
22.根据权利要求20或21所述的方法，还包括允许所述第一笼多肽和所述第一钥匙多肽共定位，从而形成复合物并激活所述一种或多种生物活性肽。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分不同或相同。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述接触(a)和接触(b)同时或顺序执行。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其还包括将融合到第三结合域的第二钥匙多肽与还包括第一细胞部分的两个或多个细胞的突触接触，其中在与第一笼多肽共定位后，所述第二钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中第三结合域能够结合到存在于两个或多个细胞的突触中的第三细胞部分。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其还包括将两个或多个具有融合到一个或多个诱饵结合域的一种或多种诱饵笼多肽的细胞与所述两个或多个细胞接触，其中每个诱饵笼多肽包括诱饵结构区，在与第一钥匙多肽和第一笼多肽共定位后，能够优先结合到第一钥匙多肽，并且其中每个诱饵结合域能够结合到存在于两个或更多细胞的突触中的诱饵细胞部分。
27.一种体外、离体或体内靶向异质细胞(两种以上不同细胞类型)的方法，其中所述第一细胞部分和第二细胞部分存在于第一细胞上，第一细胞部分和第三细胞部分存在于第二细胞上，包括：
(a)将两个或多个细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，并且其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在没有与钥匙多肽共定位的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于所述两个或多个细胞上或内的第一细胞部分；
(b)将所述两个或多个细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在共定位时，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第二结合域能够结合到存在于还包含所述第一细胞部分的细胞上的第二细胞部分，以及
(c)将所述两个或多个细胞与融合到第三结合域的第二钥匙多肽接触，其中在共定位时，第二钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第三结合域能够结合到存在于包括第一细胞部分的所述细胞上的第三细胞部分，
其中，所述第一细胞部分、第二细胞部分和第三细胞部分不同，并且包括第二细胞部分的细胞和包括第三细胞部分的细胞不同。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一钥匙多肽和所述第二钥匙多肽相同。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述第一钥匙多肽和所述第二钥匙多肽不相同。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其还包括将所述两个或多个细胞与融合到一个或多个诱饵结合域的一种或多种诱饵笼多肽接触，其中每一诱饵笼多肽包括诱饵结构区，所述诱饵结构区在与所述第一钥匙多肽、第二钥匙多肽、和/或第一笼多肽共定位后，能够优先结合到第一钥匙多肽或第二钥匙多肽，其中每个诱饵结合域能够结合到包括第一细胞部分和第二细胞部分的细胞中的诱饵细胞部分。
31.一种在体外、离体或体内降低脱靶活性的方法，包括：
(a)将两个或多个细胞与融合到第一结合域的第一笼多肽接触，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，并且其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止在不与钥匙多肽共定位的情况下所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于细胞上的第一细胞部分；
(b)将所述两个或多个细胞与融合到第二结合域的第一钥匙多肽接触，其中在共定位时，所述第一钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第二结合域能够结合到存在于还包含第一细胞部分的所述细胞上的第二细胞部分，以及
(c)将所述两个或多个细胞与融合到第三结合域的诱饵笼多肽接触，其中所述诱饵笼多肽包括诱饵结构区，所述诱饵结构区在与所述钥匙多肽和所述第一笼多肽共定位后，能够优先结合到第一钥匙多肽，其中所述第三结合域能够结合到存在于包括第一细胞部分和第二细胞部分的所述细胞上的第三细胞部分。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第三细胞部分仅存在于健康细胞上。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述第一笼多肽包括不多于7个α螺旋、不多于6个α螺旋、不多于5个α螺旋、不多于4个α螺旋、不多于3个α螺旋或不多于2个α螺旋，其中，所述结构区包括至少一个α螺旋，所述闩区包括至少一个α螺旋。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述第一笼多肽的结构区包括一个α螺旋、两个α螺旋、三个α螺旋、四个α螺旋、五个α螺旋或六个α螺旋，且所述第一钥匙多肽的闩区包括不多于一个α螺旋。
35.根据权利要求17至19及26至34所述的方法，其中每一诱饵笼多肽包括至少一个α螺旋、至少两个α螺旋、至少三个α螺旋、至少四个α螺旋、至少五个α螺旋、至少六个α螺旋或至少七个α螺旋。
36.根据权利要求17至19和26至35中任一项所述的方法，其中所述诱饵笼多肽与钥匙多肽的结合亲和力(例如KD)比所述第一笼多肽与钥匙多肽的结合亲和力强(例如KD)(例如，低)至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍，至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍或至少约1000倍。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中，当在细胞上或细胞内共定位时，溶液中第一笼多肽和第一钥匙多肽的结合效率低于第一笼多肽和第一钥匙多肽的结合效率。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中，所述第一笼多肽和第一钥匙多肽的共定位提高第一笼多肽和第一钥匙多肽的局部浓度，并改变结合平衡，有利于所述第一笼多肽和第一钥匙多肽之间形成复合物。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述接触包括引入编码多肽(例如，所述第一笼多肽、所述第一钥匙多肽、所述第二钥匙多肽和所述诱饵笼多肽)的多核苷酸。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述第一笼多肽、所述第一钥匙多肽、所述第二钥匙多肽和/或所述诱饵多肽进一步修饰以改变(i)疏水性，(ii)氢键网络，(iii)与每种多肽的结合亲和力，和/或(iv)其任何组合。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述第一笼多肽的闩区和结构区之间的界面包括与极性氨基酸残基的比率在1∶1至10∶1之间，例如，1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1的疏水性氨基酸。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述闩区经突变以降低疏水性。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述闩区中1、2、3或更多个诸如异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸的大疏水残基突变为丝氨酸、苏氨酸或诸如缬氨酸或丙氨酸的小疏水氨基酸残基。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述第一笼多肽包括位于第一笼多肽的闩区和结构区之间的界面处的掩藏氨基酸残基，其中，所述界面处掩藏的氨基酸残基具有包括构成氢键的氮原子或氧原子的侧链。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中有所述第一细胞部分和/或所述第二细胞部分存在于其上或其内的细胞包括肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、白细胞、淋巴细胞、T细胞、调节T细胞、效应T细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、记忆T细胞、自身反应性T细胞，耗竭性T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、心肌细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、中枢神经系统细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、细菌细胞、酵母细胞，或它们的任何组合。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和/或诱饵结合域中的一个或多个包括其抗体或抗原结合部分、Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG、重组单链Fv片段(scFv)、VH单结构域、二价或双特异性分子、双价抗体、三价抗体和四价抗体、设计的锚定蛋白重复蛋白、纳米抗体、亲和抗体、NS1抗体类似物、adnectin、α抗体、白蛋白结合域、Adhiron、Affilin、Affimer、Affitin/Nanofitin、抗运载蛋白、Armadillo重复蛋白、Atrimer/Tetranectin、Avimer/Maxibody、Centyrin、Fynomer、人组织因子途径抑制物、Obody/OB-fold、Pronectin、Repebody、计算设计蛋白，或它们的任何组合。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和/或诱饵结合域中的一个或多个结合到包括Her2、EGFR、EpCAM、B7-H3、ROR1、GD2、GPC2、αvβ6、Her3、L1CAM、BCMA、GPCR5d、EGFRvIII、CD20、CD22、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD27、CD28、CD30、CD33、CD48、IL3RA、血小板组织因子、CLEC12A、CD82、TNFRSF1B、ADGRE2、ITGB5、CD96、CCR1、PTPRJ、CD70、LILRB2、LTB4R、TLR2、LILRA2、ITGAX、CR1、EMC10、EMB、DAGLB、P2RY13、LILRB3、LILRB4、SLC30A1、LILRA6、SLC6A6、SEMA4、TAG72、FRα、PMSA、间皮素、LIV-1、CEA、MUC1、PD1、BLIMP1、CTLAA4、LAG3、TIM3、TIGIT、CD39、结合素-4(Nectin-4)、肿瘤标志物、健康组织标志物、心脏标志物，或它们的任何组合。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述一种或多种笼多肽和钥匙多肽还包括连接所述笼多肽或钥匙多肽和所述一个或多个结合域的接头。
49.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其还包括向所述细胞施用效应物。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述细胞存在于体内。
51.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述细胞系在体外或离体存在。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述效应物结合到所述一种或多种生物活性肽。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述效应物包括其抗体或抗原结合片段、T细胞受体、DARPin、双特异性或二价分子、纳米抗体、亲和抗体、NS1抗体类似物、adnectin、α抗体、白蛋白结合域、Adhiron、Affilin、Affimer、Affitin/Nanofitin、抗运载蛋白、Armadillo重复蛋白、Atrimer/Tetranectin、Avimer/Maxibody、Centyrin、Fynomer、人组织因子途径抑制物、Obody/OB-fold、Pronectin、Repebody、计算设计蛋白、蛋白酶、泛素连接酶、激酶、磷酸酶和/或其中效应物诱导蛋白水解。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述其抗原结合部分包括Fab′，F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG、重组单链Fv片段(scFv)和/或VH单结构域。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述效应物为治疗性细胞。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述治疗性细胞包括免疫细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗性细胞包括T细胞、干细胞、NK细胞、B细胞，或它们的任何组合。
58.根据权利要求49至57中任一项所述的方法，其中
(a)所述施用杀死包括第一结合部分和第二结合部分的细胞；
(b)所述施用造成包括第一结合部分和第二结合部分的所述细胞中的受体信号(例如，细胞因子)；
(c)所述施用造成在包括第一结合部分和第二结合部分的所述细胞附近产生信号分子(例如，细胞因子、趋化因子)；或
(d)所述施用导致包括第一结合部分和第二结合部分的细胞分化。
59.由方法1至58中任一方法形成的蛋白复合物。
60.一种编码如权利要求59的蛋白复合物的多核苷酸。
61.一种蛋白复合物，其包括(i)融合到第一结合域的第一笼多肽和(ii)融合到第二结合域的第一钥匙多肽，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中所述第一钥匙多肽结合到所述笼结构区，其中所述一种或多种生物活性肽被激活，其中，所述第一结合域结合存在于细胞上或细胞内或两个相互作用细胞的突触上的第一细胞部分，所述第二结合域结合存在于细胞上或细胞内或两个相互作用细胞的突触上的第二细胞部分，其中所述第一细胞部分和第二细胞部分不同或相同。
62.一种蛋白复合物，包括(i)融合到第一结合域的第一钥匙多肽和(ii)融合到第二结合域的诱饵笼多肽，其中所述第一钥匙多肽结合到诱饵笼多肽，其中，所述第一结合域结合存在于细胞上或细胞内或两个相互作用细胞的突触上的第一细胞部分，所述第二结合域结合存在于细胞上或细胞内或两个相互作用细胞的突触上的第二细胞部分，其中所述第一细胞部分和第二细胞部分不同或相同。
63.一种组合物，包括：
(a)融合到第一结合域或编码该第一结合域的多核苷酸的第一笼多肽，其中所述第一笼多肽包括(i)结构区和(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，其中，所述结构区与所述闩区相互作用，以在不与钥匙多肽共定位的情况下阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，并且其中所述第一结合域能够结合到存在于细胞上或细胞内的第一细胞部分；和
(b)融合到第二结合域或编码该结合域的多核苷酸的第一钥匙多肽，其中在与第一笼多肽共定位后，所述第一钥匙多肽能够结合到笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第二结合域能够结合存在于所述细胞上或细胞内的第二细胞部分，
其中所述第一细胞部分和第二细胞部分不同或相同。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述第一细胞部分及第二细胞部分不同。
65.根据权利要求63所述的组合物，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分相同。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述第一笼多肽和所述第一钥匙多肽的共定位提高效应物对包含所述第一细胞部分和所述第二细胞部分的细胞的选择性。
67.根据权利要求63至66中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多核苷酸和所述第一钥匙多核苷酸编码在相同或不同的核酸序列上。
68.根据权利要求63至67中任一项所述的组合物，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分彼此非常接近；任选地，其中：
(a)所述第一细胞部分和第二细胞部分由于直接或间接形成复合物而共定位；或
(b)所述第一细胞部分和第二细胞部分由于在同一亚细胞室中以足够数量存在而共定位。
69.根据权利要求63至68中任一项所述的组合物，其中所述第一细胞部分和/或所述第二细胞部分以每个细胞至少约100个拷贝、每个细胞至少约200个拷贝、每个细胞至少约500个拷贝、每个细胞至少约1000个拷贝、每个细胞至少约1500个拷贝、每个细胞至少约2000个拷贝、每个细胞至少约2500个拷贝、每个细胞至少约3000个拷贝、每个细胞至少约3500个拷贝、每个细胞至少约4000个拷贝、每个细胞至少约4500个拷贝、每个细胞至少约5000个拷贝、每个细胞至少约5500个拷贝、每个细胞至少约6000个拷贝、每个细胞至少约6500个拷贝、或每个细胞至少约7000个拷贝存在。
70.根据权利要求63至69中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽和所述第一钥匙多肽共定位，从而形成复合物并激活所述一种或多种生物活性肽。
71.根据权利要求63至70中任一项所述的组合物，其中所述第一细胞部分和所述第二细胞部分存在于所述细胞的表面上。
72.根据权利要求63至70中任一项所述的组合物，其中所述第一细胞部分及该第二细胞部分存在于所述细胞的细胞质内。
73.根据权利要求63至70中任一项所述的组合物，其中所述第一细胞部分及该第二细胞部分存在于该细胞的细胞核内。
74.根据权利要求63至73中任一项所述的组合物，其还包括融合到第三结合域的第二钥匙多肽或编码该第二钥匙多肽的多核苷酸，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第二钥匙多肽能够结合至所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中，所述第三结合域能够结合到还包含第一细胞部分的所述细胞上或细胞内的第三细胞部分，其中所述第三细胞部分不同于所述第一细胞部分或第二细胞部分。
75.根据权利要求74所述的组合物，其还包括第三钥匙多肽、第四钥匙多肽、第五钥匙多肽、第六钥匙多肽或第七钥匙多肽，或编码这些钥匙多肽的多核苷酸，其中一种或多种所述第三、第四、第五、第六或第七钥匙多肽融合到结合域，并且其中所述结合域能够结合到存在于包含第一细胞部分的所述细胞上或细胞内的细胞部分。
76.根据权利要求63至73中任一项所述的组合物，其还包括融合到第三结合域的第二钥匙多肽或编码所述第二钥匙多肽的多核苷酸，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第二钥匙多肽能够结合至该笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，并且其中所述第三结合域能够结合到存在于还包括第一细胞部分的第二细胞上或内的第三细胞部分。
77.根据权利要求63至73或76中任一项所述的组合物，其还包括融合到第四结合域的第三钥匙多肽或编码该第三钥匙多肽的多核苷酸，其中在与所述第一笼多肽共定位后，所述第三钥匙多肽能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述第三结合域能够结合到还包含第一细胞部分的所述细胞上或细胞内的第三细胞部分，其中，所述第三细胞部分不同于所述第一细胞部分或第二细胞部分。
78.根据权利要求77所述的组合物，其还包括第四钥匙多肽、第五钥匙多肽、第六钥匙多肽或第七钥匙多肽，或编码这些钥匙多肽的多核苷酸，其中一种或多种所述第四、第五、第六或第七钥匙多肽融合到结合域，其中所述结合域能够结合到存在于所述细胞上或细胞内的细胞部分。
79.根据权利要求63至78中任一项所述的组合物，其还包括一种或多种融合到一个或多个结合域(“诱饵结合域”)的诱饵笼多肽或编码该诱饵笼多肽的多核苷酸，其中每一诱饵笼多肽包括诱饵结构区，在与第一钥匙多肽和第一笼多肽共定位后，能够优先结合到第一钥匙多肽，其中每个诱饵结合域能够结合到包括第一细胞部分和/或第二细胞部分的所述细胞中的细胞部分(“诱饵细胞部分”)。
80.根据权利要求79所述的组合物，其中每一诱饵细胞部分仅存在于健康细胞上。
81.根据权利要求79或80所述的组合物，其中在与所述第一钥匙多肽共定位后，所述诱饵笼多肽结合到所述第一钥匙多肽，并且其中所述第一钥匙多肽中的一种或多种生物活性肽未被激活。
82.根据权利要求63至81中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽包括不多于7个α螺旋、不多于6个α螺旋、不多于5个α螺旋、不多于4个α螺旋、不多于3个α螺旋或不多于2个α螺旋，其中，所述结构区包括至少一个α螺旋，所述闩区包括至少一个α螺旋。
83.根据权利要求63至82中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽的结构区包括一个α螺旋、两个α螺旋、三个α螺旋、四个α螺旋、五个α螺旋或六个α螺旋，且该第一钥匙多肽的闩区包括不多于一个α螺旋。
84.根据权利要求79至83所述的组合物，其中所述诱饵笼多肽包括至少一个α螺旋、至少两个α螺旋、至少三个α螺旋、至少四个α螺旋或至少五个α螺旋。
85.根据权利要求79至84中任一项所述的组合物，其中所述诱饵笼多肽与钥匙多肽的结合亲和力(例如KD)比所述第一笼多肽与钥匙多肽的结合亲和力强(例如KD)(例如，低)至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍，至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍，至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍或至少约1000倍。
86.根据权利要求63至85中任一项所述的组合物，其中当在细胞上或细胞内共定位时，溶液中第一笼多肽和第一钥匙多肽的结合效率低于第一笼多肽和第一钥匙多肽的结合效率。
87.根据权利要求63至86中任一项的组成，其中，所述第一笼多肽和第一钥匙多肽的共定位提高了第一笼多肽和第一钥匙多肽的局部浓度，并改变了结合平衡，有利于所述第一笼多肽和第一钥匙多肽之间形成复合物。
88.根据权利要求63至87中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽、第一钥匙多肽、第二钥匙多肽和/或诱饵状多肽经进一步修饰以改变(i)疏水性、(ii)氢键网络、(iii)对每一种的结合亲和力和/或(iv)其任何组合。
89.根据权利要求63至88中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽的闩区与结构区之间的界面包括与极性氨基酸残基比率为1∶1至10∶1，例如，1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1的疏水性氨基酸。
90.根据权利要求63至89中任一项所述的组合物，其中所述闩区经突变以降低疏水性。
91.根据权利要求90所述的组合物，其中所述闩区中1、2、3或更多大疏水残基(例如异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸)突变为丝氨酸、苏氨酸或更小疏水氨基酸残基或丝氨酸。
92.根据权利要求63至91中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽包括位于所述第一笼多肽的闩区和结构区之间的界面处的掩藏氨基酸残基，其中，所述界面处掩藏的氨基酸残基具有包括参与氢键的氮原子或氧原子的侧链。
93.根据权利要求63至92中任一项所述的组合物，其中有所述第一细胞部分和/或该第二细胞部分存在于其上或其内的细胞包括肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、白细胞、淋巴细胞、T细胞、调整性T细胞、效应T细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、记忆T细胞，自身反应性T细胞、衰竭性T细胞、自然杀伤性T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、心肌细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、中枢神经系统细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、细菌细胞、酵母细胞，或它们的任何组合。
94.根据权利要求63至93中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和/或诱饵结合域中的一个或多个包括其抗体或抗原结合部分、Fab′，F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG、重组单链Fv片段(scFv)、VH单结构域、二价或双特异性分子、双价抗体、三价抗体和四价抗体、设计的锚定蛋白重复蛋白、纳米抗体、亲和抗体、NS1抗体类似物、adnectin、α抗体、白蛋白结合域、Adhiron、Affilin、Affimer、Affitin/Nanofitin、抗运载蛋白、Armadillo重复蛋白、Atrimer/Tetranectin、Avimer/Maxibody、Centyrin、Fynomer、人组织因子途径抑制物、Obody/OB-fold、Pronectin、Repebody、计算设计蛋白，或它们的任何组合。
95.根据权利要求63至94中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和/或诱饵结合域中的一个或多个结合到包括Her2、EGFR、EpCAM、B7-H3、ROR1、GD2、GPC2、αvβ6、Her3、L1CAM、BCMA、GPCR5d、EGFRvIII、CD20、CD22、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD27、CD28、CD30、CD33、CD48、IL3RA、血小板组织因子、CLEC12A、CD82、TNFRSF1B、ADGR2、ITGB5、CD96、CCR1、PTPRJ、CD70、LILRB2、LTB4R、TLR2、LILRA2、ITGAX、CR1、EMC10、EMB、DAGLB、P2RY13、LILRB3、LILRB4、SLC30A1、LILRA6、SLC6A6、SEMA4A、TAG72、FRα、PMSA、间皮素、LIV-1、CEA、MUC1、PD1、BLIMP1、CTLA4、LAG3、TIGIT、TIGIT-4、CD39、肿瘤标志物、健康组织标志物、心脏标志物，或它们的任何组合。
96.根据权利要求63至95中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种笼多肽和钥匙多肽还包括连接所述笼多肽或钥匙多肽和所述一个或多个结合域的接头。
97.根据权利要求63至96中任一项所述的组合物，还包括效应物。
98.一种细胞，包括如权利要求63至96中任一项所述的组合物。
99.根据权利要求98的细胞，还包括效应物。
100.一种为有需要的受试者做准备的方法，包括向受试者施用权利要求63至96中任一项的组合物。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述受试者的一种或多种细胞表现出激活的一种或多种生物活性肽。
102.一种治疗有需要的受试者的疾病或状况的方法，包括向受试者施用效应剂，其中还向受试者施用如权利要求63及96中任一项所述的组合物。
103.根据权利要求99或102中任一项所述的方法，其中所述效应物结合到所述一种或多种生物活性肽。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述效应物包括其抗体或抗原结合片段、T细胞受体、DARPin、纳米抗体、亲和抗体(affibody)、NS1抗体类似物(monobody)、adnectin、α抗体(alphabody)、白蛋白结合域、Adhiron、Affilin、Affimer、Affitin/Nanofitin；抗运载蛋白；Armadillo重复蛋白；Atrimer/Tetranectin；Avimer/Maxibody；Centyrin；Fynomer；人组织因子途径抑制物；Obody/OB-fold；Pronectin；Repebody；计算设计蛋白、蛋白酶、泛素连接酶、激酶、磷酸酶、诱导蛋白水解的效应物，或它们的任何组合。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述其抗原结合部分包括Fab′，F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG、重组单链Fv片段(scFv)和/或VH单结构域。
106.根据权利要求99、102及103中任一项所述的方法，其中所述效应物为治疗性细胞。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述治疗性细胞包括免疫细胞。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述治疗性细胞包括T细胞、干细胞、NK细胞、B细胞，或它们的任何组合。
109.根据权利要求102至108中任一项所述的方法，其中
(a)所述施用杀死包括第一结合部分和第二结合部分的细胞；
(b)所述施用造成包括所述第一结合部分和第二结合部分的所述细胞中的受体信号(例如，细胞因子)；
(c)所述施用导致在包括第一结合部分和第二结合部分的所述细胞附近产生信号分子(例如，细胞因子、趋化因子)；或
(d)所述施用导致包括第一结合部分和第二结合部分的细胞分化。
110.一种组合物，包括：
(a)第一笼多肽，包括(i)结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，以及(iii)第一结合域，其中所述结构区与闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性；
(b)第一钥匙多肽，其能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，其中所述钥匙多肽包括第二结合域，
其中，所述第一结合域和第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，(ii)相同细胞表面上的相同部分，(iii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触上的相同部分；和
(c)任选地，当所述一种或多种生物活性肽被激活时，结合到所述一种或多种生物活性肽的一种或多种效应物。
111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽包括第三结合域，其中所述第二结合域和/或所述第三结合域结合到(i)与所述同一细胞表面上的第一结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第一个结合域不同的部分。
112.根据权利要求111所述的组合物，其中所述第二结合域和所述第三结合域结合到不同细胞表面上的不同部分。
113.根据权利要求110至112中任一项所述的组合物，还包括：
(d)至少一种能够结合到第一笼结构区的第二钥匙多肽，其中所述钥匙多肽包括第四结合域，
其中，所述第二结合域和/或第四结合域结合到(i)同一细胞表面上与第一结合域不同的部分，或(ii)在相接触的两个细胞之间的突触上与第一结合域不同的部分。
114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述第二结合域和所述第四结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分；或者其中第二结合域和第四结合域结合到不同细胞表面上的不同部分。
115.根据权利要求110至114中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽还包括第五结合域，其中所述第五结合域和/或所述第一结合域结合到(i)与所述同一细胞表面上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分。
116.根据权利要求115所述的组合物，其中所述第五结合域和所述第一结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。
117.根据权利要求110至116中任一项所述的组合物，还包括：
(e)至少一种第二笼多肽，其包括(i)第二结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的第二闩区，以及(iii)第六结合域，其中所述第二结构区与所述第二闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，
其中，所述第一钥匙和/或所述第二钥匙多肽能够结合到所述第二结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，以及
其中，所述第六结合域和/或第一结合域结合到(i)同一细胞表面上与第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(ii)与第二结合域不同的部分，相接触的两个细胞之间的突触上的第三结合域和/或第四结合域。
118.根据权利要求117所述的组合物，其中所述第六结合域和所述第一结合域结合到(i)不同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。
119.根据权利要求110至118中任一项所述的组合物，还包括：
(f)一种或多种诱饵笼多肽，每个包括(i)诱饵结构区，(ii)诱饵闩区，任选地进一步包含一种或多种生物活性肽，以及(iii)第七结合域，其中所述诱饵结构区与所述第一钥匙多肽和/或所述第二钥匙多肽相互作用以阻止它们结合到所述第一和/或所述第二笼多肽，并且其中所述第七结合域结合到与所述第二结合域、第三结合域相同的细胞表面上的部分，和/或第四结合域。
120.根据权利要求119所述的组合物，其中所述第七结合域和所述第一结合域和/或所述第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。
121.根据权利要求119或120所述的组合物，其中所述第七结合域以与所述第二结合域、第三结合域和/或该第四结合域所结合的部分相等或更高水平结合于该细胞上的部分。
122.根据权利要求110至121中任一项所述的组合物，其中所述第一结合域、第二结合域、第三结合域(当存在时)、第四结合域(当存在时)、第五结合域(当存在时)、第六结合域(当存在时)和/或第七结合域(当存在时)包括能够结合存在于细胞表面的部分的多肽，所述存在于细胞表面的部分包括蛋白、糖和脂质；或包括细胞表面蛋白结合多肽。
123.一种组合物，包括：
(a)一种或多种表达载体，其编码和/或细胞表达：
(i)第一笼多肽，包括(i)结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，以及(iii)第一结合域，其中所述结构区与闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性；和
(ii)能够结合到所述笼结构区以激活所述一种或多种生物活性肽的第一钥匙多肽，其中所述钥匙多肽包括第二结合域，
其中，所述第一结合域和第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，(ii)相同细胞表面上的相同部分，(iii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触上的相同部分；和
(b)任选地，当所述一种或多种生物活性肽被激活时结合到所述一种或多种生物活性肽的一种或多种效应物，和/或编码所述一种或多种效应物的一个或多个核酸。
124.根据权利要求123所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽包括第三结合域，其中所述第二结合域和/或所述第三结合域结合到(i)同一细胞表面上与所述第一结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第一个结合域不同的部分。
125.根据权利要求124所述的组合物，其中所述第二结合域和所述第三结合域结合到不同靶细胞表面上的不同部分。
126.根据权利要求123至125中任一项所述的组合物，还包括：
(c)编码和/或表达至少能够结合到第一笼结构区的第二钥匙多肽的表达载体和/或细胞，其中所述钥匙多肽包括第四结合域，
其中，所述第二结合域和/或第四结合域结合到(i)同一细胞表面上与第一结合域不同的部分，或(ii)在相接触的两个细胞之间的突触上与第一结合域不同的部分。
127.根据权利要求126所述的组合物，其中所述第二结合域和所述第四结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分；或者其中所述第二结合域和第四结合域结合到不同细胞表面上的不同部分。
128.根据权利要求123至127中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽还包括第五结合域，其中所述第五结合域和/或所述第一结合域结合到(i)与所述同一细胞表面上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(ii)与相接触的两个细胞之间的突触上的第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分。
129.根据权利要求128所述的组合物，其中所述第五结合域和所述第一结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。
130.根据权利要求123至129中任一项所述的组合物，还包括：
(d)编码和/或表达至少第二笼多肽的细胞的表达载体，所述第二笼多肽包括(i)第二结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的第二闩区，以及(iii)第六结合域，其中，所述第二结构区与所述第二闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性，
其中，所述第一钥匙和/或所述第二钥匙多肽能够结合到所述第二结构区以激活所述一种或多种生物活性肽，以及
其中，所述第六结合域和/或第一结合域结合到(i)同一细胞表面上与第二结合域、第三结合域和/或第四结合域不同的部分，或(ii)与第二结合域、第三结合域不同的部分，和/或相接触的两个细胞之间的突触上的第四个结合域。
131.根据权利要求130所述的组合物，其中所述第六结合域和所述第一结合域结合到(i)不同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。
132.根据权利要求123至131中任一项所述的组合物，还包括：
(e)编码和/或表达诱饵笼多肽的表达载体和/或细胞，其包括(i)诱饵结构区，(ii)诱饵闩区(任选地进一步包含一种或多种生物活性肽)和(iii)第七结合域，其中所述诱饵结构区与所述第一钥匙多肽和/或所述第二钥匙多肽相互作用以阻止它们结合到所述第一和/或所述第二笼多肽，并且其中所述第七结合域结合到与所述第二结合域、第三结合域、和/或第四结合域相同的细胞表面上的部分。
133.根据权利要求132所述的组合物，其中所述第七结合域和所述第一结合域和/或所述第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，或(ii)相接触的两个细胞之间的突触上的不同部分。
134.根据权利要求132或133所述的组合物，其中所述第七结合域以与所述第二结合域、第三结合域和/或第四结合域所结合的部分相等或更高水平结合于该细胞上的部分。
135.根据权利要求123至134中任一项所述的组合物，其中所述第一结合域、第二结合域、第三结合域(当存在时)、第四结合域(当存在时)、第五结合域(当存在时)、第六结合域(当存在时)和/或第七结合域(当存在时)包括能够结合存在于细胞表面的部分的多肽，所述存在于细胞表面的部分包括蛋白、糖和脂质；或包括细胞表面蛋白结合多肽。
136.根据权利要求110至134中任一项所述的组合物，其中存在效应物。
137.根据权利要求136所述的组合物，其中所述效应物非限制性选自Bcl2、GFP1-10、小分子、抗体、抗体-药物缀合物、免疫原性肽、蛋白酶、T细胞受体、细胞毒剂、荧光团、荧光蛋白、细胞粘附分子、内吞受体，吞噬细胞受体、磁珠和凝胶过滤树脂，以及选自与SEQ ID NO：27460-27469的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
138.根据权利要求110至137中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽、该第二笼多肽和/或该诱饵笼多肽包括：
(a)与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27359-27392、1-49、51-52、54-59、61、65、67-14317、27094-27117、27120-27125和27278-27321，表7、表8或表9中列出的笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，不包括任选氨基酸残基；其中多肽的N端和/或C端60个氨基酸是任选的；和
(b)一个或多个第一、第五、第六或第七结合域。
139.根据权利要求110至138中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括：
(a)与选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，不包括任选氨基酸残基；和
(b)一个或多个第一、第五、第六或第七结合域。
140.根据权利要求110至138中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括：
(a)与选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同氨基酸序列，包括任选氨基酸残基；和
(b)一个或多个第一、第五、第六或第七结合域。
141.根据权利要求110至140中任一项所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽和/或所述第二钥匙多肽包括：
(a)包括选自SEQ ID NO：14318-26601、26602-27015、27016-27050、27322-27358的氨基酸序列和选自表7、表8和/或表9中列出的钥匙多肽的氨基酸序列以及选自SEQ ID NO：27393-27398的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽；和
(b)一个或多个第二、第三或第四结合域。
142.根据权利要求110至140中任一项所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽和/或第二钥匙多肽包括：
(a)包括与选自SEQ ID NO：27393-27398的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，不包括任选残基；和
(b)一个或多个第二、第三或第四结合域。
143.根据权利要求110至140中任一项所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽和/或所述第二钥匙多肽包括：
(a)包括与选自SEQ ID NO：27393-27398的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，包括任选残基；和
(b)一个或多个第二、第三或第四结合域。
144.根据权利要求110至140中任一项所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽和/或该第二钥匙多肽包括：
(a)包括与选自SEQ ID NO：27394-27395的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽；和
(b)一个或多个第二、第三或第四结合域。
145.根据权利要求110至144中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种生物活性肽包含一种或多种选自SEQ ID NO：60、62-64、66、27052、27053和27059-27093的生物活性肽。
146.根据权利要求110至145中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七结合域非限制性选自靶向待结合的细胞表面部分的抗原结合多肽，包括但不限于Fab′，F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG，重组单链Fv片段(scFv)、VH单结构域、VH单结构域、二价或双特异性分子、双价抗体、三价抗体和四价抗体；DARPins；纳米抗体；亲和抗体；NS1抗体类似物；adnectin；α抗体(alphabody)；白蛋白结合域；Adhiron；Affilin；Affimer；Affitin/Nanofitin；抗运载蛋白；Armadillo重复蛋白；Atrimer/Tetranectin；Avimer/Maxibody；Centyrin；Fynomer；人组织因子途径抑制物；Obody/OB-fold；Pronectin；Repebody；和计算设计的蛋白。
147.根据权利要求110至146中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七结合域结合到非限制性选自肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、白细胞、淋巴细胞、T细胞、调整性T细胞、效应T细胞，CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、记忆T细胞、自反应T细胞、耗竭性T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、心肌细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、CNS细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、细菌细胞和酵母细胞的细胞上的细胞表面蛋白。
148.根据权利要求110至147中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七结合域系结合至非限制性选自Her2、EGFR、EpCAM、B7-H3、ROR1、GD2、GPC2、αvβ6、Her3、L1CAM、BCMA、GPCR5d、EGFRvIII、CD20、CD22、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD27，CD28、CD30、CD33、CD48、IL3RA、血小板组织因子、CLEC12A、CD82、TNFRSF1B、ADGRE2、ITGB5、CD96、CCR1、PTPRJ、CD70、LILRB2、LTB4R、TLR2、LILRA2、ITGAX、CR1、EMC10、EMB、DAGLB、P2RY13、LILRB4、SLC30A1、LILRA6、SLC6A6、SEMA4A、TAG72、FRα、PMSA、间皮素、LIV-1、CEA、MUC1、PD1、BLIMP1、CTLAA4、TIGIT、TIGN-39、癌症标志物、健康组织标志物和心脏标志物的细胞表面蛋白。
149.根据权利要求110至148中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六和/或第七结合域包括与从SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％相同的氨基酸序列。
150.根据权利要求110至149中任一项所述的组合物，其中(i)所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽；和(ii)第一和/或第二钥匙多肽，包括至少一个笼多肽和至少一个钥匙多肽，其包括分别与表7、8或9的同一行中的笼多肽和钥匙多肽的氨基酸序列(即：表第2行第1列中的每个笼多肽可与表第2行第1列中的每个钥匙多肽一起使用，依此类推)至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，条件是每个笼多肽和每个钥匙多肽包括一个结合域。
151.根据权利要求110至149中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括：
(a)与非限制性选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，以及
(b)包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的结合域。
152.根据权利要求151所述的组合物，其中所述第一笼多肽、第二笼多肽和/或诱饵笼多肽包括：
(a)与非限制性选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选氨基酸残基；和
(b)包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的结合域。
153.根据权利要求110至152中任一项所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽和/或该第二钥匙多肽包括：
(a)与选自SEQ ID NO：27393-27398的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和
(b)包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的结合域。
154.根据权利要求153所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽和/或该第二钥匙多肽包括：
(a)与选自SEQ ID NO：27393-27398的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选氨基酸残基；和
(b)包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的结合域。
155.根据权利要求153所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽和/或该第二钥匙多肽包括：
(a)与选自SEQ ID NO：27394-27395的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和
(b)包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的结合域。
156.根据权利要求110至155中任一项所述的组合物，其中所述第一笼多肽、所述第二笼多肽和/或所述诱饵笼多肽包括与选自SEQ ID NO：27404-27446的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
157.根据权利要求110至156中任一项所述的组合物，其中所述第一钥匙多肽和/或该第二钥匙多肽包括与选自SEQ ID NO：27448-27459的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
158.一种将效应物靶向细胞的方法，包括将含有细胞的生物样品与权利要求110至157任一项所述的组合物接触。
159.根据权利要求158所述的方法，其还包括使所述细胞与所述效应物接触。
160.一种用于细胞靶向的方法，包括：
(a)使含有细胞的生物样品接触：
(i)笼多肽，其包括(i)结构区，(ii)进一步包含一种或多种生物活性肽的闩区，以及(iii)靶向相关细胞的第一结合域，其中所述结构区与所述闩区相互作用以阻止所述一种或多种生物活性肽的活性；和
(ii)钥匙多肽，其包括靶向所述关注细胞的第二结合域，其中所述第一结合域和所述第二结合域结合到(i)相同细胞表面上的不同部分，(ii)相同细胞表面上的相同部分，(iii)相接触的两个细胞之间的突触的不同部分，或(iv)相接触的两个细胞之间的突触的相同部分；
其中，所述接触发生一段时间并在促进笼多肽和钥匙多肽与相关细胞结合，以及促进钥匙多肽与笼结构区的结合的条件下发生，以仅当笼多肽和钥匙多肽共定位于目标细胞时置换所述闩区并激活所述一种或多种生物活性肽；
(b)在促进所述一种或多种效应物与所述一种或多种活化生物活性肽结合以产生效应物-生物活性肽复合物的条件下，将所述生物样品与一种或多种效应物接触；和
(c)任选地检测效应物生物活性肽复合物，其中所述效应物-生物活性肽复合物提供生物样品中目标细胞的测量值。
161.根据权利要求160所述的方法，其中执行检测步骤。
162.根据权利要求160或161所述的方法，其中所述方法包括使用如权利要求110至157中任一项所述的组合物。
163.根据权利要求158至162中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用本发明公开的任何实施方案或实施方案组合使用与逻辑、或逻辑和/或非逻辑。
164.根据权利要求158至163中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用与逻辑。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述方法包括使用权利要求110至112或123至125或其从属权利要求中任何一项的组合物。
166.根据权利要求158至165中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用或逻辑。
167.根据权利要求166所述的方法，其中所述方法包括使用权利要求113至118或126至131或其从属权利要求中任一项的组合物。
168.根据权利要求158至167中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用非逻辑。
169.根据权利要求168所述的方法，其中所述方法包括使用权利要求119至121和132至144或其从属权利要求中任一项的组合物。
170.一种非天然存在的多肽，包括：
(a)螺旋束，包括2到7个α螺旋；和
(b)一个或多个结合域；
其中所述螺旋束和所述一个或多个结合域不均存在于天然存在的多肽中。
171.根据权利要求170所述的多肽，其还包括：
(c)连接相邻α螺旋的氨基酸接头。
172.根据权利要求170或171所述的多肽，其中所述一个或多个结合域包括细胞表面蛋白结合多肽。
173.根据权利要求170至172中任一项所述的多肽，其中每个螺旋在长度上独立地为18-60、18-55、18-50、18-45、22-60、22-55、22-50、22-45、25-60、25-55、25-50、25-45、28-60、28-55、28-50、28-45、32-60、32-55、32-50、32-45、35-60、35-55、35-50、35-45、38-60、38-55、38-50、38-45、40-60、40-58、40-55、40-50或40-45个氨基酸。
174.根据权利要求170-173中任一项所述的多肽，其中每个氨基酸接头的长度独立地为3-10、4-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10、2-9、3-9、4-9、5-9、6-9、7-9、8-9、2-8、3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、2-7、3-7、4-7、5-7、6-7、2-6、3-6、4-6、5-6、2-5、3-5、4-5、2-4、3-4、2-3，或2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸，不包括可能融合到接头的任何其他功能序列。
175.根据权利要求170至174中任一项所述的多肽，其中所述螺旋束通过接头连接到所述一个或多个结合域。
176.根据权利要求175的多肽，其中所述接头包括多肽接头或非多肽接头。
177.一种非天然存在的多肽，包括：
(a)包括与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列，或选自27359-27392、1-49、51-52、54-59、61、65、67-14317、27094-27117、27120-27125、27278-27321不包括任选氨基酸残基的氨基酸序列，或表7、表8或表9中所列的笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的N端和/或C端60个氨基酸是任选的；和
(b)一个或多个结合域。
178.一种非天然存在的多肽，包括：
(a)一种，包括与本发明公开的笼多肽的氨基酸序列，或选自SEQ ID NO：27359-27392、SEQ ID NO：1-49、51-52、54-59、61、65、67-14317、27094-27117、27120-27125、27278-27321的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽，不包括闩区中的氨基酸残基；和
(b)一个或多个结合域。
179.根据权利要求177或178所述的多肽，其中所述多肽具有与本发明所公开的笼多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27359-27392、1-49、51-52、54-59、61、65、67-14317、27094-27117、27120-27125、27278-27321的氨基酸序列或表7、表8或表9中列出的笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任何任选氨基酸残基。
180.根据权利要求110至119中任一项所述的非天然多肽，包括：
(a)沿其长度与所公开的选自SEQ ID NO：27359-27392笼多肽的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，不包括任选氨基酸残基，以及
(b)一个或多个结合域。
181.根据权利要求180所述的多肽，其中所述多肽沿其长度具有与所公开的选自SEQID NO：27359-27392的笼多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，包括任选残基。
182.根据权利要求170至181中任一项所述的多肽，其中所述多肽的闩区和结构区之间的界面包括与极性氨基酸残基的比率在1∶1至10∶1之间的疏水性氨基酸。
183.根据权利要求170至182中任一项所述的多肽，其中所述闩区中的1、2、3或更多个包括但不限于异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸的大的疏水残基突变为丝氨酸、苏氨酸或更小的疏水氨基酸残基。
184.根据权利要求170至183中任一项所述的多肽，其中所述结构区中的1、2、3或更多个包括但不限于异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸的大的疏水残基突变为丝氨酸、苏氨酸或更小的疏水氨基酸残基。
185.根据权利要求170至184中任一项所述的多肽，其包括界面处掩藏的、具有侧链的氨基酸残基，所述侧链包括参与氢键的氮原子或氧原子。
186.一种非天然存在的多肽，其包括与选自SEQ ID NO：27359-27392的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选氨基酸残基。
187.根据权利要求186所述的非天然多肽，其还包括一个或多个结合域。
188.根据权利要求187所述的多肽，其还包括连接所述多肽和所述一个或多个结合域的氨基酸接头。
189.根据权利要求186至188中任一项所述的多肽，其中所述多肽的闩区和结构区之间的界面包括与极性氨基酸残基的比率在1∶1至10∶1之间的疏水性氨基酸。
190.根据权利要求186至189中任一项所述的多肽，其中所述闩区中的1、2、3或更多个包括但不限于异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸的大的疏水残基突变为丝氨酸、苏氨酸或更小的疏水氨基酸残基。
191.根据权利要求186至190中任一项所述的多肽，其中所述结构区中有1、2、3或更多个包括但不限于异亮氨酸、缬氨酸、或亮氨酸的大的疏水残基突变为丝氨酸、苏氨酸或更小的疏水性氨基酸残基。
192.根据权利要求186至191中任一项所述的多肽，其包括界面处掩藏的、具有侧链的氨基酸残基，所述侧链接包括参与氢键的氮原子或氧原子。
193.根据权利要求170至192中任一项所述的多肽，其中所述一个或多个结合域包括细胞表面蛋白结合多肽。
194.根据权利要求193所述的多肽，其中所述细胞表面蛋白结合多肽位于肿瘤细胞上。
195.根据权利要求194所述的多肽，其中所述细胞表面蛋白结合多肽为癌蛋白。
196.根据权利要求170至195中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括至少一个α螺旋中的一种或多种生物活性肽，其中所述一种或多种生物活性肽能够选择性地结合到定义的靶标。
197.根据权利要求196所述的多肽，其中所述一种或多种生物活性肽可包括一种或多种选自SEQ ID NO：60、62-64、66、27052、27053和27059-27093的生物活性肽。
198.一种非天然存在的钥匙多肽，其包括一个钥匙结构域和一个或多个结合结构域，其中所述钥匙多肽能够特异性结合到权利要求179至197中任一项所述的多肽。
199.根据权利要求198所述的多肽，其中所述钥匙特异性结合至所述笼多肽并激活一种或多种生物活性肽。
200.根据权利要求198或199所述的多肽，其中
(a)所述钥匙多肽包括与本发明公开的钥匙多肽的氨基酸序列或选自SEQ ID NO：27393-27398、14318-26601、26602-27015、27016-27050、27322-27358的氨基酸序列，以及表7、表8和/或表9中列出的钥匙多肽的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，不包括任选氨基酸残基；和
(b)一个或多个结合域。
201.根据权利要求198至200中任一项所述的多肽，其中，
(a)所述钥匙多肽包括与选自SEQ ID NO：27393-27398至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和
(b)一个或多个结合域。
202.根据权利要求198至200中任一项所述的多肽，其中，
(a)所述钥匙多肽包括与选自SEQ ID NO：27394-27395的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；和
(b)一个或多个结合域。
203.根据权利要求198至202中任一项所述的多肽，其中所述多肽的N端和/或C端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸残基被删除。
204.一种非天然存在的多肽，其包括与选自SEQ ID NO：27393-27398的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选氨基酸残基。
205.根据权利要求204所述的非天然存在的多肽，其包括与选自SEQ ID NO：27394-27395的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
206.根据权利要求204或205所述的非天然存在的多肽，其还包括一个或多个结合域。
207.根据权利要求206所述的多肽，其还包括连接所述多肽和所述一个或多个结合域的氨基酸接头。
208.根据权利要求205至207中任一项所述的多肽，其中所述多肽的N-末端和/或C-末端处的1、2、3或更多个残基被删除。
209.根据权利要求170至208所述的多肽，其中所述一个或多个结合域包括细胞表面蛋白结合多肽。
210.根据权利要求170至209中任一项所述的多肽，其中所述一个或多个结合域非限制性选自靶向待结合细胞表面部分的抗原结合多肽，包括但不限于Fab′，F(ab′)2、Fab、Fv、rIgG、重组单链Fv片段(scFv)、VH单结构域、二价或双特异性分子、双价抗体、三价抗体和四价抗体；DARPins；纳米抗体；亲和抗体；NS1抗体类似物；adnectin；α抗体；白蛋白结合域；Adhiron；Affilin；Affimer；Affitin/Nanofitin；抗运载蛋白；Armadillo重复蛋白；Atrimer/Tetranectin；Avimer/Maxibody；Centyrin；Fynomer；人组织因子途径抑制物；Obody/OB-fold；Pronectin；Repebody；和计算设计蛋白。
211.根据权利要求170至210中任一项所述的多肽，其中所述细胞表面蛋白结合域结合到非限制性选自肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞、白细胞、淋巴细胞、T细胞、调整性T细胞、效应T细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞，记忆T细胞、自身反应性T细胞、衰竭性T细胞、自然杀伤性T细胞(NKT细胞)、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、心肌细胞、肺细胞、肌肉细胞、上皮细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、中枢神经系统细胞、神经元、肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、细菌细胞、和酵母细胞的细胞上的细胞表面蛋白。
212.根据权利要求170至211中任一项所述的多肽，其中所述细胞表面蛋白结合域结合到非限制性选自Her2、EGFR、EpCAM、B7-H3、ROR1、GD2、GPC2、αvβ6、Her3、L1CAM、BCMA、GPCR5d、EGFRvIII、CD20、CD22、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD27、CD28、CD30、CD33、CD48、IL3RA，血小板组织因子、CLEC12A、CD82、TNFRSF1B、ADGRE2、ITGB5、CD96、CCR1、PTPRJ、CD70、LILRB2、LTB4R、TLR2、LILRA2、ITGAX、CR1、EMC10、EMB、DAGLB、P2RY13、LILRB3、LILRB4、SLC30A1、LILRA6、SEMA4A、TAG72、FRα、PMSA、间皮素、LIV-1、CEA、MUC1、PD1、BLIMP1、CTLA4、LAG3、TIGIT、CD39、Nectin-4、癌症标志物，健康组织标志物和心脏标志物的细胞表面蛋白。
213.根据权利要求170至212中任一项所述的多肽，其中所述一个或多个结合域包括与选自SEQ ID NO：27399-27403的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
214.根据权利要求170至197及209至213中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括与非限制性选自SEQ ID NO：27404-27446的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
215.根据权利要求170至197及209至212中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括与非限制性选自SEQ ID NO：27404-27446的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选残基。
216.根据权利要求198至208中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括包括与非限制性选自SEQ ID NO：27448-27459的氨基酸序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
217.根据权利要求198-208中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO：27448-27459至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，包括任选残基。
218.一种编码权利要求170至217中任一项所述多肽的核酸。
219.一种载体，包括但不限于表达载体，其包括与启动子操作性连接的如权利要求218所述的核酸。
220.根据权利要求219所述的载体，其中所述载体系病毒载体。
221.根据权利要求220所述的载体，其中所述病毒载体包括腺病毒载体、痘苗病毒载体、AAV载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、α病毒载体或其任何组合。
222.一种细胞，其包括根据权利要求170至217中任一项所述的多肽、如权利要求218所述的核酸和/或权利要求219至221所述的载体，任选地，其中所述核酸和/或所述表达载体整合至细胞染色体，或任选地，其中所述核酸和/或表达载体为游离体。
223.根据权利要求110至222中任一项所述的多肽、核酸、表达载体、细胞和/或组合物用于任何适当目的的用途，包括但不限于本发明所公开的用途。
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