ES2751378T3

ES2751378T3 - Vectores fagos de presentación y procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2751378T3
Application number: ES16809601T
Authority: ES
Inventors: Sepideh Afshar
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2036-11-18
Also published as: WO2017091467A1; US20180327480A1; EP3380606A1; CA3003911A1; US11066460B2; EP3380606B1; CN108350436B; CN108350436A; CA3003911C; JP6530863B2; JP2018531038A

Abstract

Un vector bacteriófago M13 tipo 33 que comprende una primera secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores fagos de presentación y procedimientos de uso

La presente invención está en el campo de las tecnologías de los fagos de presentación. Más particularmente, la presente invención se refiere a vectores adecuados para su uso en la presentación de proteínas de fusión que comprenden la proteína de superficie P.III sobre la superficie de partículas del bacteriófago M13, así como a procedimientos para su uso y composiciones que comprenden los mismos.

Las técnicas de presentación en fagos actuales permiten la generación y presentación de bibliotecas peptídicas heterogéneas sobre la superficie de partículas de bacteriófago. El principio de la presentación en fagos se basa en la presentación de un péptido de interés como parte de una proteína de fusión con una proteína de revestimiento de la superficie del bacteriófago. En resumen, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de interés se clona en fase abierta con un gen que codifica una proteína de revestimiento de la superficie del fago para generar un producto de fusión que se expresa o 'presenta' como parte de la superficie de revestimiento al ensamblarse el fago. La biblioteca peptídica que se expresa se puede entonces explorar contra una diana o antígeno para identificar potenciales ligandos peptídicos para una optimización o maduración de la afinidad posterior.

El bacteriófago M13 es un ejemplo de un fago utilizado comúnmente para la expresión de péptidos heterogéneos y fragmentos de anticuerpo mediante la presentación en fago. El ensamblaje del bacteriófago M13 filamentosos se produce en la membrana bacteriana interna. Las proteínas de revestimiento del fago se sintetizan en el citoplasma utilizando la maquinaria bacteriana sintética de proteínas y se dirigen entonces al periplasma mediante diferentes péptidos de señal. Las partículas funcionales del fago M13 comprenden cinco tipos de proteínas de revestimiento de superficie denominados P.III, P.VI, P.VII, P.VIII, y P.IX. Aunque todas estas cinco proteínas se han utilizado para presentar péptidos exógenos en la superficie de partículas M13, la proteína de revestimiento menor P.III es la que se utiliza más comúnmente para anclar péptidos de interés en la superficie de revestimiento del fago. (Methods in Molecular Biology, Vol. 178, Antibody Phage Display: Methods and Protocols, editado por O'Brien y Aitken). La P.III existe en cinco copias en el extremo proximal del fago M13 y tiene importantes papeles en la infectividad, ensamblaje y estabilidad del fago. La P.III se expresa como un polipéptido de 406 aminoácidos y está comprendida por tres regiones distintas: Los dominios N1, N2 y del extremo C (CT) (Russel y col., Introduction to Phage Biology and Display, Phage Display: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Lab. Press). El dominio N1 participa en la translocalización del ADN vírico en el huésped bacteriano (E. coli) durante la infección, aunque el dominio N2 transmite el reconocimiento de la célula huésped uniéndose al pelo F bacteriano. El dominio CT participa en el anclaje de la proteína P.III al revestimiento del fago durante el ensamblaje. (Omidfar y col., Advances in Phage Display Technology for Drug Discovery, Expert Opin. Drug Discov, (2015)).

Los sistemas de presentación en fagos se pueden clasificar de acuerdo con el tipo de vector utilizado para la infección de la célula huésped bacteriana. Para la presentación de productos de fusión con P.III, se utilizan comúnmente vectores del tipo 3 y tipo 33. (Omidfar y col. (2015)). El vector tipo 3 comprende una copia del gen que codifica la proteína P.III (el gen g.III), al que se puede clonar en fase un gen que codifique un péptido exógeno de interés. Como resultado, cada péptido se presenta en el fago en cinco copias, cada una en fusión con una proteína P.III que se expresa. Aunque el uso de vectores de tipo 3 es una manera eficaz para presentar péptidos cortos, por ejemplo, de 12 aminoácidos o menos, la presentación de péptidos más largos reduce sustancialmente la infectividad del fago y, por lo tanto, su aplicación (título), evitando de esta manera la construcción de bibliotecas peptídicas altamente diversas. El vector tipo 33 comprende dos copias del gen g.III - la copia de tipo silvestre y la copia recombinante. Los genes g.III de tipo silvestre y recombinantes codifican una proteína P.III que tiene la misma secuencia de aminoácidos; sin embargo, se diferencian en la secuencia de nucleótidos y se expresan utilizando diferentes secuencias de péptidos de señal. Por ejemplo, la proteína P.III codificada por el g.III de tipo silvestre se puede expresar con la secuencia de señal endógena de 18 aminoácidos, mientras que la P.III codificada por el g.III recombinante puede expresarse con una secuencia de señal periplásmica.

Utilizando el sistema de tipo-33, el gen que codifica la proteína o péptido exógenos se puede clonar en fase con una copia del gen g.III (es decir, el gen de tipo silvestre o recombinante), permitiendo la presentación del péptido de interés con una reducción de los impedimentos estéricos sobre la superficie de revestimiento del fago. Por lo tanto, el vector de tipo-33 es tolerante para la presentación de péptidos exógenos más grandes, sin embargo, con un número de copias menor. El número de copias menor, sin embargo, crea una limitación para el aislamiento satisfactorio de péptidos específicos de diana debido a que los péptidos, antes de la maduración de afinidad, sufren una disminución de la afinidad por sus dianas. La menor afinidad, combinada con niveles de presentación menores, dificultan la detección de péptidos específicos de diana a partir de un gran agrupamiento de variantes peptídicas. De acuerdo con la presente invención, se ha identificado un sistema mejorado de vectores fagos de tipo-33 y procedimientos de uso de manera que se pueden presentar satisfactoriamente péptidos, por ejemplo, péptidos de hasta 35 aminoácidos de longitud sobre la superficie del fago M13 en múltiples copias. En este sistema, la presentación mejorada del péptido de interés se consigue introduciendo mutaciones definidas en el gen g.III de tipos silvestre. Estas mutaciones reducen la incorporación del polipéptido codificado por el gen g.III de tipo silvestre mutado sobre la superficie del fago. Como consecuencia, se presentan sobre el fago más copias de la proteína P.III codificada por el gen g.III recombinante. Esto da como resultado un nivel más alto de presentación de un péptido exógeno de interés cuando se fusiona o clona en fase con el producto del gen g.III recombinante. Además, los vectores y procedimientos de la presente invención permiten la generación de partículas del bacteriófago M13 que mantienen la infectividad del fago a niveles comparables con el bacteriófago M13 tipo silvestre cuando se presentan péptidos de hasta 35 aminoácidos de longitud sobre la superficie de revestimiento del fago.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un vector bacteriófago M13 tipo 33 que comprende una primera secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 2. Como una realización particular del vector bacteriófago M13 mencionado anteriormente, dicha primera secuencia de polinucleótido se da en la SEQ ID NO: 3 y dicha segunda secuencia de polinucleótido se da en la SEQ ID NO: 4. Como otra realización particular de los vectores mencionados anteriormente, dicho vector comprende adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia marcadora de detección adecuada clonada en fase con y corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1. Como una realización particular adicional del vector mencionado anteriormente, dicha primera secuencia de polinucleótido se da en la SEQ ID NO: 15. Como una realización particular más adicional a cualquiera de los vectores mencionados anteriormente, dicho vector es una molécula de polinucleótido de cadena doble.

Como otra realización, la presente invención proporciona cualquiera de los vectores de bacteriófago M13 tipo 33 como se ha descrito anteriormente, que comprenda adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifique un polipéptido exógeno, y particularmente un polipéptido exógeno de hasta 35 aminoácidos de longitud, se clonan en fase con y corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídico que se da como la SEQ ID NO: 1, o corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora de detección adecuada. Más particularmente, la secuencia de polinucleótido que codifica el péptido exógeno se clona en fase con la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, o con la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora de detección adecuada, mediante una secuencia de polinucleótido que codifica un engarce peptídico corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, o la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora de detección adecuada. Más particularmente, el polipéptido exógeno tiene entre 7 y 35 aminoácidos de longitud.

En otra realización más, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de una partícula de bacteriófago M13 que comprende: (a) transfectar una célula huésped bacteriana con un vector bacteriófago M13 tipo 33 de cadena doble que comprende una primera secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 2, (b) la incubación de dicha células huésped bacteriana en condiciones adecuadas para la expresión de dichas primera y segunda secuencias de polinucleótido y el ensamblaje de las partículas del bacteriófago M13 en dicha célula huésped bacteriana, y (c) la recuperación a partir de dicha células huésped bacteriana de una partícula de bacteriófago M13 que comprende las secuencias polipeptídicas que se dan en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 presentadas independientemente sobre la superficie de revestimiento del bacteriófago M13. Más particular respecto a esta realización, dicha secuencia de polinucleótido se da en la SEQ ID NO: 3 y dicha segunda secuencia de polinucleótido se da en la SEQ ID NO: 4. Como otra realización particular, la presente invención proporciona cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente en los que el vector bacteriófago M13 de doble cadena comprende adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia marcadora de detección adecuada clonada en fase con y corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1. Como otra realización particular más, el vector bacteriófago M13 de doble cadena comprende la secuencia de polinucleótido que se da en la SEQ ID NO: 15. Incluso más particularmente, la presente invención proporciona cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, en los que el vector M13 de cadena doble comprende adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido exógeno, y particularmente un polipéptido exógeno de hasta 35 aminoácidos de longitud, se clonan en fase con y corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da como la SEQ ID NO: 1, o corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora de detección adecuada. Como otra realización particular, la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido exógeno se clona en fase con la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, o con la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora de detección adecuada, mediante una secuencia de polinucleótido que codifica un engarce peptídico corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, o la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora de detección adecuada. Más particularmente, el polipéptido exógeno tiene entre 7 y 35 aminoácidos de longitud. Como otra realización particular respecto a los procedimientos mencionados anteriormente, la célula huésped bacteriana es una cepa bacteriana F+ tal como una célula de XL-1 blue de E. coli o una célula XLO de E. coli.

En otra realización más, la presente invención proporciona una partícula de bacteriófago M13 en el que dicha partícula comprende las secuencias de polipéptido que se dan en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 presentadas independientemente en la superficie de revestimiento de la partícula de fago. Más particularmente, la presente invención proporciona la partícula de bacteriófago M13 mencionada anteriormente en la que dicha partícula comprende adicionalmente una secuencia marcadora de detección adecuada fusionada al extremo N de la secuencia polipeptídica que se da por la secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Más particularmente aún, la presente invención proporciona cualquiera de las partículas de bacteriófago M13 mencionadas anteriormente en la que dicha partícula comprende adicionalmente un polipéptido exógeno, y particularmente un polipéptido un polipéptido exógeno de hasta 35 aminoácidos de SEQ ID NO: de longitud, fusionado al extremo N de la secuencia polipeptídica que se da por la secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o al extremo N de la secuencia marcadora de detección adecuada. En otra realización particular, el polipéptido exógeno se fusiona a la secuencia polipeptídica que se da en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o la secuencia marcadora de detección adecuada, mediante un engarce peptídico fusionado al extremo N de la secuencia polipeptídica dada por la SEQ ID NO: 1, o al extremo N de la secuencia marcadora de detección adecuada, y al extremo C del polipéptido exógeno. Más particularmente, el polipéptido exógeno fusionado a la secuencia polipeptídica deseada por la SEQ ID NO: 1, o la secuencia marcadora de detección, tiene entre 7 y 35 aminoácidos de longitud.

En otra realización más, la presente invención proporciona un procedimiento para la infección de una célula huésped bacteriana que comprende poner en contacto dicha célula huésped bacteriana con una partícula de bacteriófago M13 que comprende las secuencias de polipéptido que se dan en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 presentadas independientemente sobre la superficie de revestimiento de la partícula de bacteriófago M13. Más particularmente, la presente invención proporciona el procedimiento mencionado anteriormente en el que dicha partícula de bacteriófago M13 comprende adicionalmente una secuencia marcadora de detección adecuada fusionada al extremo N de la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1. Más particularmente aún, la presente invención proporciona cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente en los que dicha partícula del bacteriófago M13 comprende adicionalmente un polipéptido exógeno, y particularmente un polipéptido exógeno de hasta 35 aminoácidos de longitud, fusionado al extremo N de la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, o al extremo N de la secuencia marcadora de detección adecuada. Más particularmente, el polipéptido exógeno se fusiona a la secuencia polipeptídico que se da en la SEQ ID NO: 1, o la secuencia marcadora de detección adecuada, mediante un engarce peptídico fusionado al extremo N de la secuencia polipeptídica dada por la SEQ ID NO: 1, o al extremo N de la secuencia marcadora de detección adecuada, y al extremo C del polipéptido exógeno. Más particularmente, el polipéptido exógeno fusionado a la secuencia polipeptídica deseada por la SEQ ID NO: 1, o la secuencia marcadora de detección, tiene entre 7 y 35 aminoácidos de longitud. Como otra realización particular respecto a los procedimientos mencionados anteriormente, la célula huésped bacteriana es una cepa bacteriana F+ tal como una célula de XL-1 blue de E. coli o una célula XLO de E. coli.

Cuando se utiliza un vector bacteriófago M13tipo-33 para la expresión y presentación de los productos de fusión con la proteína P.III, las proteínas P.III codificadas por los genes g.III de tipo silvestre y recombinante compiten por el ensamblaje en las partículas de fago. Los trabajos previos en el campo demostraban que la modificación del sitio de escisión en la región c y algunos restos de la región h de las secuencias de señal Sec podían dar como resultado un aumento de la expresión de fragmentos de anticuerpos presentados sobre las partículas de fago utilizando un sistema de vector 3 3. (Lee y col., Biochemical and Biophysical Research Communications, 411 (2011); 348-353). Al contrario que en la técnica anterior, el objetivo de la presente invención es influenciar en la relación de los productos genéticos codificados por los genes g.III de tipo silvestre y recombinantes expresados en el periplasma en favor de la proteína P.III codificada por el gen g.III recombinante. Como consecuencia de la presente invención, se consigue un aumento de la expresión relativa y presentación de proteína P.III codificada por el gen g.III recombinante que, a su vez, da como resultado un aumento de la presentación de péptidos exógenos cuando las secuencias de nucleótido que codifican dichos péptidos exógenos se clonan en fase con el gen g.III recombinante.

Definiciones

"Vector", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra secuencia de ácido nucleico (o múltiples secuencias de ácido nucleico) a la que se ha ligado en la célula huésped o genoma. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN circular, normalmente de cadena doble, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en la célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tiene un origen de replicación bacteriano). Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes (por ejemplo, genes que codifican un péptido o proteína exógenos de interés) al que están unidos operativamente cuando se combinan con secuencias de control apropiadas tales como secuencias promotoras y operadoras y sitios de inicio de replicación. Se hace referencia comúnmente a dichos vectores como "vectores de expresión" y también pueden incluir un sitio de clonación múltiple para la inserción del gen que codifica la proteína de interés. De manera alternativa, el gen que codifica el péptido o proteína de interés puede introducirse mediante mutagénesis dirigida al sitio tal como la mutagénesis de Kunkel. (Handa y col., Rapid and Reliable Site-Directed Mutagenesis Using Kunkel's Approach, Methods in Molecular Biology, vol. 182: In Vitro Mutagenesis Protocols, 2a Ed.).

"Vector bacteriófago M13 tipo 33", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un "Vector" capaz de transportar secuencias de ácido nucleico del genoma del bacteriófago M13 en las células o genomas huésped y comprende regiones codificantes para dos copias de la proteína de superficie P.III (es decir, un gen g.III de tipo silvestre y recombinante) además de las regiones codificantes de cada una de las proteínas restantes (P.I, P.II, P.IV - P.XI) codificadas por el genoma del bacteriófago M13. Los vectores de bacteriófago M13 tipo 33 de la presente invención contienen mutaciones en la copia de tipo silvestre del gen g.III que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos diferentes de la proteína de superficie P.III codificada por los genes g.III de tipo silvestre (no mutado) y g.III recombinante.

Un péptido, polipéptido o proteína "exógenos" o "ajenos" se refiere a un péptido, polipéptido o proteína codificados por una secuencia de ácido nucleico que no está presente normalmente en la célula o genoma huésped a partir del cual se va a expresar el ácido nucleico. "Marcador de detección adecuado" o "secuencia marcadora de detección adecuada", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia peptídica que puede injertarse o fusionarse con otra proteína o péptido de interés mediante técnicas recombinantes. El injerto de la secuencia marcadora en la proteína de interés permite la detección de la proteína, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos dirigidos contra la secuencia peptídica marcadora. La determinación de las secuencias marcadoras de detección adecuadas está bien en el conocimiento de los expertos en la técnica. Las secuencias de detección típicas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, marcador c-myc, marcador HA, marcador His, marcador Flag, y marcador S.

"Clonado en fase", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la inserción de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido particular de interés) en la misma fase de lectura abierta que un ácido nucleico de referencia o gen (por ejemplo, ungen que codifica una proteína separada a la que el polipéptido de interés se va a fusionar). Como apreciará un experto en la técnica, la inserción de ácido nucleico se puede insertar contigua al gen de referencia o se puede insertar en un sitio separado espacialmente mediante el uso de una secuencia que codifique un engarce que también se clona en fase. Además, la inserción de ácido nucleico se puede insertar o bien corriente arriba o corriente debajo de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Como se utiliza en el presente documento, "corriente arriba" se refiere a la situación o localización de una secuencia de ácido nucleico de interés con respecta a un ácido nucleico o gen de referencia de manera que la secuencia de interés se traduce antes que el ácido nucleico o gen de referencia durante la traducción. De igual manera, "corriente abajo" se refiere a la situación o localización de una secuencia de ácido nucleico de interés con respecta a un ácido nucleico o gen de referencia de manera que la secuencia de interés se traduce después del ácido nucleico o gen de referencia durante la traducción.

"Engarce peptídico" como se utiliza en el presente documento se refiere a una secuencia polipeptídica que se fusiona o une un primer péptido o proteína con un segundo péptido o proteína. El extremo N de la secuencia polipeptídica del engarce se une covalentemente al extremo C del primer péptido o proteína mediante un enlace amida mientras que el extremo C de la secuencia polipeptídica del engarce se une covalentemente al extremo N del segundo péptido o proteína, también mediante un enlace amida. Los engarces peptídicos típicos para su uso en la presente invención incluyen péptidos que contienen serina tales como las secuencias peptídicas -(GaSG)ny -(G⁴S)n-, y engarces en a-hélice tales como -AEAAAKEAAAKEAAAKA- (SEQ ID NO: 34), -AE-AAAKEAAAKEAAAKAGGGGS-(SEQ ID NO: 35), y -AEAAAKEAAAKEAAAKAGPPGP-(SEQ ID NO: 36).

Las cadenas polipeptídicas que se desvelan en el presente documento se representan por su secuencia de aminoácidos a partir del extremo N hasta el extremo C, cuando se lee de izquierda a derecha, con cada aminoácido representado por su abreviatura de aminoácido de una única letra o de tres letras. El "extremo N" (o extremo amino) de un aminoácido, o una cadena polipeptídica, se refiere al grupo amina libre del aminoácido, o el grupo amina libre del primer resto de aminoácido de la cadena polipeptídica. De la misma manera, "extremo C" (o extremo carboxilo) de un aminoácido, o una cadena polipeptídica, se refiere al grupo carboxilo libre del aminoácido, o el grupo carboxilo libre del resto de aminoácido final de la cadena polipeptídica.

Modificación del vector

Utilizando la mutagénesis de Kunkel (Handa y col., Rapid and Reliable Site-Directed Mutagenesis Using Kunkel's Approach, Methods in Molecular Biology, vol. 182: In Vitro Mutagenesis Protocols, 2a Ed.), los primeros sesenta y siete aminoácidos de la región N1 de la proteína P.III codificada por el gen g.III de tipo silvestre se aleatorizan respecto a diferentes aminoácidos mientras que se monitoriza el nivel de presentación de una secuencia marcadora de detección, por ejemplo, proteína c-myc (EQKLISEEKL: SEQ ID NO: 7), fusionada a la proteína P.III codificada por el gen g.III recombinante. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia marcadora de detección, por ejemplo, la secuencia codificante de c-myc (gagcaaaagctcattagtgaagaggatctt: SEQ ID NO: 8) se clona en fase con el gen g.III recombinante. Se utiliza la cepa RZ1032 de Escherichia coli (ATCC 39737) que carece de dUTPasa y uracil glicosilasa funcionales, para preparar un ADN de cadena sencilla que contiene uracilo del vector de bacteriófago M13 tipo 33 parental (SEQ ID NO: 6). Los sesenta y siete cebadores mutagénicos se dividen en cuatro reacciones de Kunkel diferentes, cubriendo tres reacciones diecisiete mutaciones y una reacción que cubre diecisiete mutaciones. Cada cebador en un grupo de reacción contiene un codón NNK que se corresponde con el aminoácido que se va a aleatorizar completamente y se diseñan para compartir la misma secuencia flanqueante con el vector parental para asegurar que todos los cebadores se hibridarán con la matriz con una eficacia comparable.

A continuación de la mutación del vector parental, se utilizan los vectores modificados como matrices para preparar un ADN de doble cadena que se transfectan entonces en células huésped bacterianas (por ejemplo, células XL1-Blue de E. coli) mediante electroporación para la expresión de las partículas del bacteriófago M13. Antes de la exploración de las bibliotecas de fagos M13, los fagos aleatorios de cada biblioteca se secuencian para asegurar que cada posición está completamente aleatorizada respecto a los 20 aminoácidos sin ninguna tendencia por un aminoácido en particular.

Recolección de fagos y determinación del título

Después de una amplificación durante una noche, el fago se puede recolectar de la siguiente manera: Las células huésped bacterianas infectadas (por ejemplo, células XL-1 Blue) se centrifugan a 3.000 rpm durante aproximadamente 20 minutos. Se transfieren entonces 40 ml de sobrenadante a un matraz nuevo y se precipitan los fagos por adición de 10 ml de una solución de PEG (un 20 % de PEG que incluye NH⁴OAc 3,5 M) y se incuba a 4 °C durante aproximadamente 90 minutos. La mezcla se centrifuga entonces a 13.000 rpm durante aproximadamente 45 min. El aglomerado se resuspende entonces en 1 ml de PBS (solución salina tampón de fosfato, pH 7,4) y se centrifuga durante 5 minutos a 13.000 rpm para retirar los desechos celulares residuales. El sobrenadante se transfiere entonces a un tubo nuevo, se añaden 200 |jl de la solución de PEG, y la mezcla se incuba sobre hielo durante aproximadamente 30 min. La mezcla se precipita por centrifugación a 13.000 rpm durante aproximadamente 45 min a 4 °C. El aglomerado resultante se resuspendió en 200-500 j l de PBS y se centrifugó a 13.000 rpm durante aproximadamente 5 min para retirar los desechos celulares residuales. El sobrenadante se transfiere entonces a un tubo nuevo y se repite el procedimiento de centrifugación hasta que no hay presente restos celulares bacterianos. El sobrenadante se puede transferir entonces a un tubo nuevo para la determinación del título de la siguiente manera: Se preparan diluciones en serie del sobrenadante que contiene los fagos y se añaden entonces 100 j l de cada dilución a un nuevo tubo seguido por la adición de 300 j l de células bacterianas (por ejemplo, células XL1-Blue) que se han dejado en cultivo durante una noche. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos y luego se añaden 3 ml de agar blando a cada tubo. (El agar blando se puede preparar de la siguiente manera: Se llena una botella de 250 ml con 50 ml de caldo lisogénico (LB), se añade Bacto agar 2.08 en polvo (Fisher DF0140-01-1), luego se remueve para mezclarlo. La mezcla se lleva a 250 ml con LB adicional, se lleva al autoclave durante 45 min, y se almacena a 55 °C. La mezcla se remueve brevemente y entonces se añade a las placas LB y se incuba durante una noche a 37 °C. Las placas resultantes se cuentan entonces y se determina el título como unidades formadoras de placas (ufp).

Infección y amplificación del fago

Para la amplificación de clones de fago particulares, se pueden emplear los siguientes procedimientos: Se cultiva una única colonia de células huésped bacterianas (por ejemplo, células XL1-Blue (Stratagene)) en 50 ml de medio 2YT suplementado con tetraciclina a 37 °C mientras se agita hasta una densidad de DO⁶⁰⁰0,4-0,6. Se añadieron aproximadamente 108 ufp (unidades formadoras de placas) de fagos al cultivo bacteriano y la mezcla se incubó entonces a 37 °C durante aproximadamente 30 minutos mientras se deja en reposo para permitir la infección del fago. El cultivo celular infectado se incuba entonces a 37 °C durante 12-15 horas mientras se agita para permitir la amplificación del fago.

Exploración de bacteriófagos M13

Ensayo de captura por elevación de filtro:

Para identificar las mutaciones que dan como resultado una presentación mayor de c-myc fusionado a la proteína P.III codificada por el gen g.III recombinante, se puede utilizar un ensayo de elevación de filtro (Wu, Simultaneous Humanization and Affinity Optimization of Monoclonal Antibodies, Methods in Molecular biology, Vol. 2017. Recombinant Antibodies for Cancer Therapy: Methods and Protocols, editado por Weischof y Krauss). En resumen, se revisten filtros de nitrocelulosa con 2 jg/ml de un anticuerpo anti-bacteriófago M13 (GE Biosciences 27-9420-01) y entonces se bloquea con caseína antes de elevar la placa. El nivel de presentación de c-myc se detecta mediante un anticuerpo c-myc conjugado con fosfatasa alcalina (SIGMA A5963) con placas que presentan un nivel de presentación más alto de proteína c-myc que aparecen con un color más oscuro. Las placas con niveles de presentación más alto del marcador c-myc se aíslan entonces para la secuenciación. El fago M13 secuenciado que tiene las mutaciones que dan como resultado una señal de c-myc más fuerte se pueden amplificar para la exploración adicional, incluyendo un ELISA dependiente de título de fago y punto único, como se describe adicionalmente posteriormente.

ELISA dependiente del título de fago y punto único:

Para el ELISA de punto único, se amplificó un bacteriófago M13 individual con un aumento de nivel de presentación de c-myc (identificado, por ejemplo, por un ensayo de elevación en filtro) durante una noche utilizando 2 ml de cultivo bacteriano de XL1-Blue. A continuación de la amplificación, el cultivo se precipita por centrifugación y el sobrenadante (que contiene el fago) se utiliza en el ensayo. En resumen, las placas de ELISA se revistieron durante una noche con un anticuerpo anti-bacteriófago M13 (GE Biosciences 27-9420-01) y se bloqueó con caseína. El sobrenadante que contiene el fago M13 se añade y se detecta la presentación de c-myc mediante un anticuerpo anti-c-myc conjugado con fosfatasa alcalina (SIGMA A5963). Los niveles de expresión de c-myc se determinaron por espectrofotometría midiendo la DO a la longitud de onda apropiada, utilizando un sustrato apropiado. El fago que demuestra los niveles de presentación del péptido c-myc pueden confirmarse adicionalmente en un ELISA dependiente del título del fago, donde el nivel de presentación de c-myc para los clones individuales se determina sobre un intervalo de títulos y se comparan con el nivel de presentación de c-myc de los clones obtenidos por transfección con el vector parental (es decir, el vector que contiene el gen g.III de tipo silvestre (sin mutaciones), y la proteína c-myc clonada en fase con el gen g.III recombinante).

Ejemplo 1

Presentación de la fusión marcador c-myc-P.MI sobre la superficie del bacteriófago M13

Utilizando un vector parental de bacteriófago M13 tipo-33 que comprendía el gen g.III tanto de tipo silvestre (SEQ ID NO: 5) y un gen g.III recombinante (SEQ ID NO: 3) bajo el control de un promotor IacZ, codificando cada gen una copia de la proteína de superficie P.III y utilizando las secuencias de nucleótido que codifican la P.III endógena y los péptidos de señal peIB, respectivamente (SEQ ID NO: 17 y 19), los aminoácidos únicos de la región N1 del g.III de tipo silvestre se aleatorizan esencialmente como se ha descrito anteriormente. Se construyen los vectores modificados que comprendían las mutaciones que codifican las sustituciones L8P o S11P en el producto del gen g.III de tipo silvestre maduro y se transfectan en células XL1-Blue de E. coli para que expresen la secuencia que codifica el marcador c-myc (SEQ ID NO: 8) se clona en fase con y corriente arriba del gen g.III recombinante. La proteína de fusión P.III-c-myc resultante se presenta sobre la superficie de las partículas M13 recolectadas y se detectaron los niveles de presentación de c-myc mediante un ELISA dependiente del título de fago, esencialmente como se ha descrito anteriormente.

La Tabla 1 posterior, proporciona las secuencias de ácido nucleico de los genes g.III de tipo silvestre parental y mutado, el gen g.III recombinante, la secuencia que codifica el marcador c-myc, las secuencias que codifican el péptido de señal y las secuencias de aminoácidos resultantes de esta manera. La Tabla 2 proporciona los resultados del ELISA dependiente del título del fago.

Tabla 1

Tabla 2

La Tabla 2 proporciona los valores de la DO⁵⁶⁰de un ELISA dependiente de título como se describe en general anteriormente utilizando un sustrato PMP/AMP y demuestra que cuando se utiliza un vector fago M13 tipo 33 que contiene las mutaciones que codifican las sustituciones L8P o S11P en el producto del gen g.III de tipo silvestre maduro, se obtiene un aumento de la expresión de la proteína c-myc fusionada a la proteína de superficie P.III codificada por el gen g.III recombinante.

Ejemplo 2

Presentación de fusiones del péptido de ensayo-P.III sobre la superficie del fago M13 (cuando se combina con las mutaciones 8P 11P en el gen g.III TS)

Se construyeron los vectores del bacteriófago M13 tipo-33 modificado adicionalmente que comprende las mutaciones que codifican las sustituciones L8P y S11P en el producto del gen g.III de tipo silvestre maduro (SEQ ID NO: 2). Una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica dicho producto genético se da en la SEQ ID NO: 4. En los mismos vectores se clonan en fase por separado, las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido de ensayo (como se da en la SEQ ID NO: 10, 12 y 14, posteriores), mediante secuencias que codifican un engarce peptídico, con una secuencia que codifica un marcador c-myc (SEQ ID NO: 8) que, a su vez, se clona en fase con y corriente arriba de la secuencia del gen g.III recombinante (SEQ ID NO: 3) en el vector. Las mismas secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido de ensayo se clonaron también cada una por separado (de la misma manera y formato que se ha descrito anteriormente) en el bacteriófago M13 tipo-33 parental que no comprende las mutaciones de ácido nucleico que codifican L8P- o S11P en el gen g.III de tipo silvestre (SEQ ID NO: 5 proporciona la secuencia de ácido nucleico del gen g.III de tipo silvestre parental sin las mutaciones que codifican L8P- o S11P). La Tabla 3 proporciona las secuencias de ácido nucleico del gen g.III de tipo silvestre parental y mutado, el gen g.III recombinante, la secuencia que codifica el marcador c-myc, las secuencias que codifican el engarce peptídico y las secuencias que codifican el péptido de ensayo de los clones de vector ejemplares preparados.

Los vectores resultantes se utilizaron para presentar las proteínas de fusión del péptido de ensayo-P.III sobre la superficie de las partículas de bacteriófago M13 recolectadas de las células bacterianas de XL-1 Blue. Los péptidos de ensayo empleados para unirse a la proteína diana IL-6 humana como se describe adicionalmente con posterioridad. La Tabla 4 proporciona las secuencias de aminoácidos correspondientes de los componentes de los productos de proteína de fusión presentados en las partículas de fago M13 recolectadas.

Tabla 3

Tabla 4

El fago recolectado que presenta las proteínas de fusión péptido de ensayo-P.III se amplificaron y se llevó a cabo la determinación del título como se ha descrito en general anteriormente. Los niveles de presentación del péptido de ensayo se determinaron por ELISA dependiente de título de fago esencialmente como se describe posteriormente: Las placas de ELISA (Greiner-bio-one, número de Cat.: 650061) se revistieron con 50 pl/pocillo con NeutrAvidin (Thermo Scientific, número de Cat.: 31050) a 2 pg/ml en PBS y se dejó en reposo durante una noche a 4 °C. El exceso de sitios se bloqueó añadiendo 100 pl/pocillo de Caseína (Thermo Scientific, número de Cat.: 37528) durante una hora a temperatura ambiente. Entonces se añadieron 50 pl/pocillo de IL6 humana biotinilada (R&D Systems, número de Cat. 206-IL-010/CF) en PBS a cada pocillo y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras se balancea. Se añadieron entonces 50 pl/pocillo de fago a diferentes títulos y el fago diluido a una concentración final de un 1 % de BSA en PBS. Las placas se incubaron entonces durante 60 minutos a temperatura ambiente mientras se balancea. Se añadieron entonces 50 pl/pocillo de anti-M13-HRP (G.E., número de Cat.: 27 9421-01), diluido 1:5.000 en un 0,1 % de tween en PBS seguido por la incubación de las placas durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron entonces 50 pl/pocillo de sustrato de Ultra tetrametilbencidina (sustrato Ultra TMB, Thermo Scientific, número de Cat.: 34029) y se determinó la DO a 650 nm.

La Tabla 5 posterior proporciona los valores de la DO⁶⁵⁰obtenidos en un intervalo de títulos de fago para los clones de fago 18-24, 18-22 y 18-4 preparados cada uno por separado con el vector de bacteriófago M13 tipo-33 que codifica las mutaciones que codifican L8P- y S11P en el gen g.III de tipo silvestre y el vector de bacteriófago M13 tipo-33 parental (sin las mutaciones que codifican L8P- y S11P en el gen g.III de tipo silvestre).

Tabla 5

Los valores de la DO⁶⁵⁰de la Tabla 5 demuestran que cuando se utiliza un vector de bacteriófago M13 tipo 33 que contiene mutaciones que codifican las sustituciones L8P y S11P en el producto del gen g.III tipo silvestre maduro, se obtiene un aumento de la expresión de cada péptido de ensayo fusionado (mediante un engarce peptídico) a una proteína de superficie P.III codificada por el gen g.III recombinante.

Ejemplo 3

Presentación de fusiones Fab-P.III sobre la superficie del fago M13

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de Fab de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) se dan en la SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, respectivamente, se clonan en un vector de bacteriófago M13 tipo-33 que comprende las mutaciones que codifican las sustituciones L8P y S11P en el producto del gen g.III de tipo silvestre maduro. La secuencia de ácido nucleico que codifica el Fab de HC (SEQ ID NO: 27), que utiliza la secuencia que codifica el péptido de señal PhoA1 (SEQ ID NO: 30), se clona en fase y corriente arriba, mediante una secuencia que codifica un espaciador, a una secuencia codificante que codifica el marcador HA (SEQ ID NO: 32) y una secuencia de que codifica un marcador c-myc (SEQ ID NO: 8) que, a su vez, se clona en fase y corriente arriba de la secuencia del gen g.III recombinante (SEQ ID NO: 3) en el vector. La secuencia de ácido nucleico que codifica el Fab de LC (SEQ ID NO: 28) se clona por separado en el vector utilizando la secuencia codificante del péptido de señal peIB (SEQ ID NO: 19). La transcripción de los componentes que codifican el Fab tanto de HC como de LC está bajo el control del promotor IacZ.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector bacteriófago M13 tipo 33 que comprende una primera secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 2.

2. El vector bacteriófago M13 tipo 33 de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha primera secuencia de polinucleótido se da en la SEQ ID NO: 3 y dicha segunda secuencia de polinucleótido se da en la SEQ ID NO: 4.

3. El vector bacteriófago M13 tipo 33 de acuerdo con la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, que comprende adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia marcadora de detección adecuada clonada en fase con, y corriente arriba de, la primera secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1.

4. El vector bacteriófago M13 tipo 33 de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia marcadora de detección adecuada clonada en fase con, y corriente arriba de, la secuencia de la primera secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora codifica un marcador c-myc, un marcador HA, un marcador His, un marcador Flag, o un marcador S.

5. El vector bacteriófago M13 tipo 33 de acuerdo con la Reivindicación 3 o la Reivindicación 4, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora codifica un marcador c-myc.

6. El vector bacteriófago M13 tipo 33 de acuerdo con la Reivindicación 5, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica el marcador c-myc se da en la SEQ ID NO: 8.

7. El vector bacteriófago M13 tipo 33 de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho vector comprende la secuencia de polinucleótido que se da en la SEQ ID NO: 15.

8. El vector bacteriófago M13 tipo 33 de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 7, que comprende adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido exógeno clonada en fase con, y corriente arriba de, la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, o corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora de detección adecuada.

9. El vector bacteriófago M13 tipo 33 de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho vector es una molécula de ADN de cadena doble.

10. El vector bacteriófago M13 tipo 33 de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho vector es un ADN plasmídico de cadena doble.

11. Un procedimiento para la producción de una partícula de bacteriófago M13 que comprende:

(a) la transfección de una célula huésped bacteriana con un vector bacteriófago M13 tipo 33 de cadena doble que comprende una primera secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 2,

(b) la incubación de dicha célula huésped bacteriana en condiciones adecuadas para la expresión de dichas primera y segunda secuencias de polinucleótido y el ensamblaje de las partículas de bacteriófago M13 en dicha célula huésped bacteriana, y

(c) la recuperación a partir de dicha célula huésped bacteriana de una partícula de bacteriófago M13 que comprende secuencias polipeptídicas que se dan en las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 presentadas independientemente sobre la superficie de revestimiento del bacteriófago M13.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicha primera secuencia de polinucleótido se da en la SEQ ID NO: 3 y dicha segunda secuencia de polinucleótido se da en la SEQ ID NO: 4.

13. El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 11 o la Reivindicación 12, en el que el vector bacteriófago M13 de doble cadena comprende adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia marcadora de detección adecuada clonada en fase con, y corriente arriba, de la primera secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la s Eq ID NO: 1.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora codifica un marcador c-myc, un marcador HA, un marcador His, un marcador Flag, o un marcador S.

15. El procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 13 o la Reivindicación 14, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora codifica un marcador c-myc.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la secuencia de polinucleótido que codifica el marcador c-myc se da en la SEQ ID NO: 8.

17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 16, en el que dicho vector M13 de cadena doble comprende la secuencia de polinucleótido que se da en la SEQ ID NO: 15.

18. El procedimiento de acuerdo con las Reivindicaciones 13 a 17, en el que el vector M13 de doble cadena comprende adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido exógeno clonada en fase con, y corriente arriba de, la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, o corriente arriba de la secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia marcadora de detección adecuada.

19. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 18 en el que la célula huésped bacteriana es una cepa bacteriana F+.

20. Una partícula de bacteriófago M13 en la que dicha partícula comprende los polipéptidos que se dan en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 presentadas independientemente sobre la superficie de revestimiento de la partícula del fago.

21. La partícula de bacteriófago M13 de acuerdo con la Reivindicación 20 en la que dicha partícula comprende adicionalmente una secuencia marcadora de detección adecuada fusionada al extremo N de la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1.

22. La partícula de bacteriófago M13 de acuerdo con la Reivindicación 21, en la que la secuencia marcadora de detección adecuada se da en la SEQ ID NO: 7.

23. La partícula de bacteriófago M13 de acuerdo con la Reivindicación 21 o la Reivindicación 22, en la que dicha partícula comprende adicionalmente un polipéptido exógeno fusionado al extremo N de la secuencia polipeptídica que se da en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o al extremo N de la secuencia marcadora de detección adecuada.

24. La partícula de bacteriófago M13 de acuerdo con la Reivindicación 23, en la que el polipéptido exógeno se fusiona a la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, o a la secuencia marcadora de detección adecuada, mediante un engarce peptídico fusionado al extremo N de la secuencia polipeptídica que se da en la SEQ ID NO: 1, o al extremo N de la secuencia marcadora de detección adecuada, y al extremo C del polipéptido exógeno.