KR20140091040A - Trop-2에 특이적인 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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막달레나 그라지나 도리왈스카
아빈드 라즈팔
데이비드 루이스 쉘튼
토마스-토안 트란
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리나트 뉴로사이언스 코프.
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Abstract

본 발명은 영양막 세포-표면 항원-2 (Trop-2)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 이러한 항체를 포함하는 항체 접합체, 항체 코딩 핵산, 및 이러한 항체를 수득하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 Trop-2 발현과 연관된 상태 (예를 들어, 암), 예컨대 결장, 식도, 위, 두경부, 폐, 난소 또는 췌장 암의 치료를 위해 이들 항체 및 Trop-2 항체 접합체를 사용하는 치료 방법에 관한 것이다.
[대표도]
도 9a

Description

Trop-2에 특이적인 항체 및 그의 용도{ANTIBODIES SPECIFIC FOR TROP-2 AND THEIR USES}
관련 출원
본원은 2011년 11월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 61/559,015, 2012년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 61/640,641, 및 2012년 10월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 61/717,288을 우선권 주장하며, 이들은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 발명은 영양막 세포-표면 항원 (Trop-2)에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, 전장 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 Trop-2 항체를 포함하는 항체 접합체 (예를 들어, 항체-약물-접합체), Trop-2 항체를 포함하는 조성물, 및 Trop-2 발현과 연관된 상태 (예를 들어, 암)를 치료하기 위해 Trop-2 항체 및 그의 접합체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
M1S1, GA733-1 (위 항원 733-1), EGP-1 (상피 당단백질-1) 또는 TACSTD2 (종양-연관 칼슘 신호 전달자)로도 지칭되는 영양막 세포-표면 항원 (Trop-2)은 인간 태반 영양막에서 처음으로 확인되고, 이후에 대부분의 인간 암종에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌으나 정상 성인 조직에서는 단지 한정되거나 제한된 발현을 나타내는 세포 표면 당단백질이다. 예를 들어, 문헌 [Varughese et al., Gynecologic Oncology, 122:171-177, 2011]을 참조한다. Trop-2는 종 사이에서 고도로 보존된다. 예를 들어, 인간 Trop-2 단백질은 뮤린 Trop-2 단백질과 79% 동일성을 공유한다. 문헌 [Cubas et al., Molecular Cancer, 9:253, 2010]을 참조한다. Trop-2의 생물학적 역할이 아직 명확하지는 않지만, 다양한 연구가 Trop-2의 과다발현이 다양한 인간 암종, 예컨대 결장암, 난소암 및 췌장암에서 증가된 종양 공격성, 전이 및 불량한 예후와 상관된다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 문헌 [Fang et al., Int. J. 결장직장 Dis, 24:875-884, 2009; Bignotti et al., Eur. J. Cancer, 46:944-953, 2010; 및 Fong et al., Br J Cancer, 99:1290-1295, 2008]을 참조한다. 연구는 또한 Trop-2가 암 세포 증식, 이동, 침습 및 생존에서 중요한 의미를 갖는 ERK1/2 MAPK 경로를 활성화시킴으로써 적어도 부분적으로 종양 발병기전에 기여한다는 것을 보여주었다. 문헌 [Cubas et al., 2010, 상기 문헌]을 참조한다.
상피 종양 세포에 의한 Trop-2의 과다발현 및 그의 막횡단 위치는 Trop-2가 암 면역요법을 위한 매력적인 표적이 되도록 한다. 따라서, Trop-2, 특히 인간 Trop-2에 대한 고친화도 항체는 인간 환자에서 암 치료를 위한 우수한 치료제를 만들 것이다. 다양한 Trop-2 항체가 개시되어 있으나 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,420,041 (항체 AR47A6.4.2), 미국 특허 번호 5,850,854 (항체 BR110), 미국 특허 번호 6,653,104 (항체 RS7), 미국 특허 번호 7,517,964 (항체 RS7), US2012/0237518 참조), 높은 친화도, 높은 특이성, 및 강력한 세포독성 또는 종양 사멸/억제/퇴행 활성을 갖는 모노클로날 항체를 확인하는 것은 매우 어려웠다. 개선된 효능 및 안전성 프로파일을 가지며 인간 환자에 사용하기 적합한 Trop-2에 대해 지시된 항체 및 다른 면역요법제 (예컨대, 항체-약물 접합체)가 계속 요구된다.
본원에 개시된 본 발명은 Trop-2에 결합하는 항체 및 항체 접합체 (예를 들어, 항체-약물 접합체)에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 약 6.5 nM 이하의 1가 항체 결합 친화도 (KD)로 인간 Trop-2 (서열 27)의 도메인 3 (예를 들어, 아미노산 잔기 152-206) 및 도메인 4 (예를 들어, 아미노산 잔기 209-274)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Trop-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 a) (i) 서열 SYGVH (서열 30), GGSISSY (서열 36) 또는 GGSISSYGVH (서열 37)를 포함하는 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열 VIWTX1GX2TDYNSALMX3 (여기서, X1은 G 또는 S이고; X2는 S 또는 V이고; X3은 S 또는 G임) (서열 49) 또는 WTX1GX2 (여기서, X1은 G 또는 S이고, X2는 S 또는 V임) (서열 50)를 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열 DGDYDRYTMDY (서열 35); DYDRYTX1DY (여기서, X1은 E 또는 M임) (서열 82); 또는 DYDRYTX1DY (여기서, X1은 임의의 자연 발생 아미노산, 예를 들어 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V임) (서열 83)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 상보성 결정 영역 및/또는 b) (i) 서열 RASKSVSTSX1YSYMH (여기서, X1은 G, L 또는 N임) (서열 63)를 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열 LASNLES (서열 55)를 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 VLQHSRELPYT (서열 56)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역 상보성 결정 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열
Figure pct00001
의 중쇄 가변 영역 및 서열
Figure pct00002
의 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Trop-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 서열 5, 84 또는 85에 나타낸 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열 3 또는 6에 나타낸 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 영역은 (i) 서열 SYGVH (서열 30), GGSISSY (서열 36) 또는 GGSISSYGVH (서열 37)를 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열 VIWTSGVTDYNSALMG (서열 38) 또는 WTSGV (서열 39)를 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열 DGDYDRYTMDY (서열 35) 또는 DYDRYTX1DY (여기서, X1은 E 또는 M임) (서열 82)를 포함하는 VH CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL 영역은 (i) 서열 RASKSVSTSGYSYMH (서열 54) 또는 RASKSVSTSLYSYMH (서열 57)를 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열 LASNLES (서열 55)를 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 QHSRELPYT (서열 56)를 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) (i) 서열 SYGVH (서열 30), GGSISSY (서열 36) 또는 GGSISSYGVH (서열 37)를 포함하는 CDR1; (ii) 서열 VIWTSGVTDYNSALMG (서열 38) 또는 WTSGV (서열 39)를 포함하는 CDR2; 및 (iii) 서열 DGDYDRYTMDY (서열 35), DYDRYTMDY (서열 99) 또는 DYDRYTEDY (서열 100)를 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 CDR; 및 b) (i) 서열 RASKSVSTSGYSYMH (서열 54) 또는 RASKSVSTSLYSYMH (서열 57)를 포함하는 CDR1; (ii) 서열 LASNLES (서열 55)를 포함하는 CDR2; 및 (iii) 서열 QHSRELPYT (서열 56)를 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 영역은 서열 5, 84 또는 85에 나타낸 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고/거나 VL 영역은 서열 3, 6에 나타낸 아미노산 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 66에 나타낸 서열을 포함하는 경쇄 및/또는 서열 65에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ATCC 등록 번호 PTA-12872를 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 VH 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ATCC 등록 번호 PTA-12871을 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 VL 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 약 35 nM 이하의 결합 친화도 (KD)로 인간 Trop-2 (서열 27)의 도메인 1 (예를 들어, 아미노산 잔기 31-71)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Trop-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 a) (i) 서열 SYWIN (서열 40), GYTFTSY (서열 41) 또는 GYTFTSYWIN (서열 42)을 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열 NIX1PSDSYSNYNX2KFKD (여기서, X1은 Y 또는 F이고; X2는 Q 또는 K임) (서열 51) 또는 X1PSDSY (여기서, X1은 Y 또는 F임) (서열 52)를 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열 GSX1FDY (여기서, X1은 S 또는 G임) (서열 53)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 상보성 결정 영역; 및/또는 b) (i) 서열 RASQTIGTSIH (서열 59)를 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열 YASESIS (서열 60)를 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 X1QSX2SWPFT (여기서, X1은 Q 또는 S이고; X2는 N 또는 F임) (서열 64)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역 상보성 결정 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Trop-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 서열 13에 나타낸 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열 12에 나타낸 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 영역은 (i) 서열 SYWIN (서열 40), GYTFTSY (서열 41) 또는 GYTFTSYWIN (서열 42)을 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열 NIFPSDSYSNYNKKFKD (서열 46) 또는 FPSDSY (서열 47)를 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열 GSGFDY (서열 48)를 포함하는 VH CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL 영역은 (i) 서열 RASQTIGTSIH (서열 59)를 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열 YASESIS (서열 60)를 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 SQSFSWPFT (서열 62)를 포함하는 VL CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) (i) 서열 SYWIN (서열 40), GYTFTSY (서열 41) 또는 GYTFTSYWIN (서열 42)을 포함하는 CDR1; (ii) 서열 NIFPSDSYSNYNKKFKD (서열 46) 또는 FPSDSY (서열 47)를 포함하는 CDR2; 및 (iii) 서열 GSGFDY (서열 48)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 CDR; 및 b) (i) 서열 RASQTIGTSIH (서열 59)를 포함하는 CDR1; (ii) 서열 YASESIS (서열 60)를 포함하는 CDR2; 및 (iii) 서열 SQSFSWPFT (서열 62)를 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 영역은 서열 13에 나타낸 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고/거나 VL 영역은 서열 12에 나타낸 아미노산 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 68에 나타낸 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 67에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG2Δa, IgG3 또는 IgG4 하위부류의 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 글리코실화 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 인간 Fc 감마 수용체(들)에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 불변 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Trop-2에 특이적으로 결합하며 본원에 기재된 항체 (예를 들어, m7E6, h7E6_SVG, h7E6_SVG4, h7E6_SVG19, h7E6_SVG6, h7E6_SVG20, h7E6_SVG22, h7E6_SVG28, h7E6_SVG30, h7E6_SVGL, h7E6_SVGL1, h7E6_SVGL2, h7E6_SVGL3, h7E6_SVGL4, h7E6_SVGL5, h7E6_SVGN, m6G11, h6G11 또는 h6G11_FKG_SF)와 경쟁하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 h7E6_SVG와 경쟁하고, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 약 6.5 nM 이하의 1가 항체 결합 친화도 (KD)를 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 접합체를 제공하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 작용제에 접합되고, 작용제는 세포독성제, 면역조절제, 영상화제, 치료 단백질, 생체중합체 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작용제는 세포독성제 (예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 D (MMAD) 또는 다른 아우리스타틴)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체의 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 태그는 아미노산 글루타민 (Q) 또는 아미노산 서열 GGLLQGG (서열 78), LLQGA (서열 79), GGLLQGA (서열 81), LLQ 또는 LLQX1X2X3X4X5를 포함하며, 여기서 X1은 G 또는 P이고, X2는 A, G, P이거나 또는 부재하고, X3은 A, G, K, P이거나 또는 부재하고, X4는 G, K이거나 또는 부재하고, X5는 K이거나 또는 부재하다 (서열 88). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그, 예컨대 G, GGLLQGG (서열 78), LLQGA (서열 79), GGLLQGA (서열 81), LLQ 또는 LLQX1X2X3X4X5를 포함하며, 여기서 X1은 G 또는 P이고, X2는 A, G, P이거나 또는 부재하고, X3은 A, G, K, P이거나 또는 부재하고, X4는 G, K이거나 또는 부재하고, X5는 K이거나 또는 부재하다 (서열 88).
한 변형에서, 본 발명은 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222, 340 또는 370 (카바트 넘버링 방식)에서의 아미노산 변형을 포함하는 단리된 항체를 제공하며, 여기서 변형은 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 Trop-2 항체의 특정 부위 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 카르복실 말단 또는 또 다른 부위)에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예를 들어, Q, GGLLQGG (서열 78), LLQGA (서열 79), GGLLQGA (서열 81), LLQ 또는 LLQX1X2X3X4X5, 여기서 X1은 G 또는 P이고, X2는 A, G, P이거나 또는 부재하고, X3은 A, G, K, P이거나 또는 부재하고, X4는 G, K이거나 또는 부재하고, X5는 K이거나 또는 부재함 (서열 88)) 및 항체의 위치 222, 340 또는 370 (카바트 넘버링 방식)에서의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변형은 리신으로부터 아르기닌으로의 치환이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 접합체를 제공하며, 여기서 접합체는 식: 항체-(아실 공여자 글루타민-함유 태그)-(링커)-(세포독성제)를 포함하고, 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 항체 또는 항원 결합 단편의 특정 부위 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 카르복실 말단 또는 또 다른 부위)에서 조작되고, 태그는 링커 (예를 들어, 하나 이상의 반응성 아민 (예를 들어, 1급 아민 NH2)을 함유하는 링커)에 접합되고, 링커는 세포독성제 (예를 들어, MMAD 또는 다른 아우리스타틴)에 접합된다.
일부 실시양태에서, 접합체는 1) 항체-LLQGA-(아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐)-0101 (여기서, 아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐은 AcLys-VC-PABC이고, 0101은 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드임); 2) 항체-LLQGA-AcLys-VC-PABC-MMAD; 3) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-AcLys-VC-PABC-0101; 4) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-AcLys-VC-PABC-MMAD; 5) 항체-GGLLQGG (서열 78)-AcLys-VC-PABC-0101; 및 6) 항체-GGLLQGG (서열 78)-AcLys-VC-PABC-MMAD로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 접합체는 위치 222에서 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합체는 항체 중쇄의 C-말단에서 아미노산 리신 (K) 결실을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 접합체를 제공하며, 상기 접합체는 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환, 아미노-PEG6-프로피오닐을 포함하는 링커 및 세포독성제 (예를 들어, MMAD 또는 다른 아우리스타틴)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 Trop-2 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 Trop-2 항체를 재조합적으로 생산하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Trop-2 발현과 연관된 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Trop-2 발현과 연관된 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상태는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광, 유방, 자궁경부, 융모막암종, 결장, 식도, 위, 교모세포종, 두경부, 신장, 폐, 경구, 난소, 췌장, 전립선 암, 및 피부 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Trop-2 발현 암 세포의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Trop-2 발현 암 세포의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 접합체는 개체에서 비경구로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 서열
Figure pct00003
의 중쇄 가변 영역 및 서열
Figure pct00004
의 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는다.
도 1은 표적-발현 Colo205 이종이식편 모델에서 다양한 Trop-2 마우스 항체 (7E6, 15E2 및 18B1)의 생체내 효능 연구를 도시한다.
도 2a는 표적-발현 A431 이종이식편 모델에서 다양한 Trop-2 마우스 항체 (7E6, 15E2 및 18B1)의 생체내 효능 연구를 도시한다.
도 2b는 용량-반응 연구에서 Trop-2 항체 7E6에 의한 A431 이종이식편 종양 성장의 억제를 도시한다.
도 2c는 A431 이종이식편 모델에서 Trop-2 항체 6G11, 7E6 및 18B1에 의한 A431 이종이식편 종양 성장의 억제를 도시한다.
도 3은 A431 세포에서 키메라 및 인간화 Trop-2 7E6 항체의 ADCC 활성을 도시한다. 7E6은 키메라 Trop-2 7E6 항체 (예를 들어, 서열 2 및 3을 포함하는 항체)에 해당하고, h7E6-WT는 서열 4 및 3을 포함하는 항체에 해당하고, h7E6-SVG는 서열 5 및 3을 포함하는 항체에 해당하고, h7E6-L은 서열 4 및 6을 포함하는 항체에 해당하고, h7E6-SVGL은 서열 5 및 6을 포함하는 항체에 해당하고, 항-EGFR (표피 성장 인자 수용체)은 양성 대조군 항체에 해당한다.
도 4는 인간 Trop-1 (서열 29) 및 인간 Trop-2 (서열 27) 사이, 및 컨센서스 서열 (서열 69)의 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 5는 인간 Trop-2 (서열 27) 및 마우스 Trop-2 (서열 28) 사이, 및 컨센서스 서열 (서열 70)의 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 6a는 Trop-2 항체 h7E6 (서열 4), h7E6_SVG (서열 5) 및 m7E6 (서열 2)의 중쇄 가변 영역, 및 그의 컨센서스 서열 (서열 71)의 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 6b는 Trop-2 항체 h7E6_VL (서열 3), h7E6_VL_L (서열 6), h7E6_VL_N (서열 7) 및 m7E6_VL (서열 1)의 경쇄 가변 영역, 및 그의 컨센서스 서열 (서열 72)의 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 7a는 Trop-2 항체 h6G11 (서열 11), h6G11_FKG_SF (서열 13) 및 m6G11 (서열 9)의 중쇄 가변 영역, 및 그의 컨센서스 서열 (서열 73)의 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 7b는 Trop-2 항체 h6G11 (서열 10), h6G11_FKG_SF (서열 12) 및 m6G11 (서열 8)의 경쇄 가변 영역, 및 그의 컨센서스 서열 (서열 74)의 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 8은 AcLys-vc-PABC-MMAD에 접합된 키메라 (7E6) Trop-2 항체가 BxPC3 이종이식편 모델에서 장기간 종양 퇴행을 유도한다는 것을 도시한다. AcLys-vc-PABC-MMAD는 아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐-모노메틸 아우리스타틴 D에 해당한다. LCQ03 및 TG6는 각각 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열 78 및 79에 해당한다. NNC-TG1-vcMMAD는 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 (서열 75) 및 vcMMAD에 접합된 대조군 항체를 나타낸다.
도 9a는 vc0101에 접합된 인간화 (h7E6SVG) Trop-2 항체가 췌장 종양 BxPC3 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도한다는 것을 도시한다. Vc0101은 AcLys-vc-PABC-0101 (아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐-(2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)에 해당한다. TG6은 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열 79에 해당한다.
도 9b는 위치 297 및 222에서 아미노산 치환을 가지며 PEG6-MMAD에 접합된 인간화 (h7E6SVG) Trop-2 항체가 췌장 종양 BxPC3 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도한다는 것을 도시한다. PEG6-MMAD는 (프로필렌 글리콜)6-프로피오닐-MMAD에 해당한다.
도 9c는 위치 222에서 아미노산 치환을 가지며 vc0101에 접합된 인간화 (h7E6SVG) Trop-2 항체가 췌장 종양 BxPC3 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도한다는 것을 도시한다. LCQ04는 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열 79에 해당한다. vc0101은 AcLys-vc-PABC-0101에 해당한다.
도 10은 vc0101에 접합된 인간화 (h7E6SVG) Trop-2 항체가 결장직장 종양 Colo205 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도한다는 것을 도시한다. TG6 및 LCQ03은 각각 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열 79 및 78에 해당한다.
도 11은 vc0101에 접합된 인간화 (h7E6SVG) Trop-2 항체가 난소 PDX Ova196756 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도한다는 것을 도시한다. TG6은 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열 79에 해당한다.
도 12a는 vc0101에 접합된 인간화 (h7E6SVG) Trop-2 항체가 Pan0146 췌장 PDX 모델에서 종양 퇴행을 유도하는데 있어 겜시타빈보다 우수한 효능을 갖는다는 것을 보여준다. TG6은 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 서열 79에 해당한다 (도 12b에서와 동일함).
도 12b는 vc0101에 접합된 인간화 (h7E6SVG) Trop-2 항체의 연속 투여가 췌장 PDX Pan0146 이종이식편 모델에서 지속적인 종양 퇴행을 발생시킨다는 것을 보여준다.
도 13은 PEG6-MMAD와 접합된 인간화 항-Trop2 항체의 단일 용량이 췌장 Pan144607 PDX 모델에서 종양 퇴행을 유도한다는 것을 보여준다.
도 14는 PEG6-MMAD와 접합된 인간화 항-Trop2 항체의 단일 용량이 췌장 Pan0135 PDX 모델에서 종양 퇴행을 유도한다는 것을 보여준다.
본 발명은 Trop-2 (예를 들어, 인간 Trop-2)에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 접합체 (예를 들어, 항체-약물 접합체)를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 항체를 포함하는 조성물, 및 이러한 항체를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에서 Trop-2 발현과 연관된 상태, 예컨대 암 (예를 들어, 결장, 위, 두경부, 폐, 난소, 및 췌장 암)을 치료하는 방법을 제공한다.
일반적 기술
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 당업계 기술 내의 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 하기와 같은 문헌에 자세하게 설명되어 있다: 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)].
정의
"항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 그의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일쇄 (ScFv) 및 도메인 항체 (예를 들어, 상어 및 낙타류 항체를 포함), 및 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 그의 하위부류)을 포함하며, 항체가 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 항체의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 부분"은 주어진 항원 (예를 들어, Trop-2)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 단편" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 Fab; Fab'; F(ab')2; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (문헌 [Ward et al., Nature 341:544-546, 1989]), 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
표적 (예를 들어, Trop-2 단백질)에 "우선적으로 결합" 또는 "특이적으로 결합" (본원에서 교환가능하게 사용됨)하는 항체, 항체 접합체 또는 폴리펩티드는 당업계에서 잘 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 측정하는 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 대안적 세포 또는 물질보다 특정한 세포 또는 물질과 보다 빈번하게, 보다 급속하게, 보다 큰 지속력으로, 및/또는 보다 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 경우에, 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체는, 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게, 및/또는 보다 큰 지속력으로 결합하는 경우에, 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, Trop-2 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 이 에피토프에 이것이 다른 Trop-2 에피토프 또는 비-Trop-2 에피토프에 결합하는 것보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게 및/또는 보다 큰 지속력으로 결합하는 항체이다. 또한, 이러한 정의를 읽음으로써, 예를 들어 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합할 수 없다고 이해된다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.
항체의 "가변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄 가변 영역 또는 항체 중쇄 가변 영역을 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역이라고도 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어져 있다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR에 의해 함께 매우 가까이 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 2가지 이상의 기술이 있다: (1) 종-교차 서열 가변성을 기초로 하는 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)]), 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기초로 하는 접근법 (문헌 [Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948]). 본원에 사용된 CDR은 상기 접근법 중 하나 또는 둘 다의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.
가변 도메인의 "CDR"은 카바트, 코티아의 정의, 카바트와 코티아 양자의 복합, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태적 정의, 또는 당업계에 널리 공지된 임의의 CDR 결정 방법에 따라 확인되는 가변 영역 내 아미노산 잔기이다. 항체 CDR은 카바트 등에 의해 최초로 정의된 초가변 영역으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.]을 참조한다. CDR의 위치는 또한 코티아 및 기타에 의해 최초로 기재된 구조적 루프 구조로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989]을 참조한다. CDR을 확인하는 다른 접근법으로는 카바트와 코티아의 절충안으로서, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (현재 엑셀리스(Accelrys)®)를 이용하여 유도된 "AbM 정의", 또는 문헌 [MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996]에 설명되어 있는, 관찰된 항원 접촉에 기초한 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. 본원에서 CDR의 "입체형태 정의"로서 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 엔탈피에 의해 항원 결합에 기여하는 잔기로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008]을 참조한다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있고, 그럼에도 불구하고, 이들이 특정 잔기 또는 잔기의 기 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 더 짧아지거나 더 길어질 수 있을지라도, 적어도 카바트 CDR의 일부와 중첩될 것이다. 본원에 사용된 CDR은 접근법의 조합을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용되는 방법은 이들 접근법 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 것에 대한 임의의 주어진 실시양태의 경우에, CDR은 카바트, 코티아, 확장, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종의 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 이루는 개별 항체들이 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되며 고도로 특이적이다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생산이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조될 수 있거나, 또는 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법으로 제조될 수도 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.
본원에 사용된 "인간화" 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄, 또는 그의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)인, 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 가리킨다. 바람직하게는, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있지만, 이것은 항체 성능이 추가로 정교해지고 최적화되도록 포함된 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로는 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 바람직한 것은 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 갖는 항체이다. 다른 형태의 인간화 항체는 본래 항체에 대해 변형된 1개 이상의 CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 또는 CDR H3) (이들은 또한 본래 항체로부터의 1개 이상의 CDR"로부터 유래된" 1개 이상의 CDR로 지칭됨)을 갖는다.
본원에 사용된 "인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/거나 당업자에게 공지되거나 본원에 개시된 인간 항체의 제조를 위한 임의의 기술을 이용하여 제조된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체의 이러한 정의는 적어도 하나의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 적어도 하나의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 하나의 이러한 예는 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되며, 여기서 상기 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다 (문헌 [Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991]). 인간 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 좌위가 내인성 좌위 대신에 트랜스제닉 도입된 동물, 예를 들어 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스의 면역화에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기재되어 있다. 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 인간 B 림프구의 불멸화에 의해 제조될 수 있다 (이러한 B 림프구는 개체로부터 또는 cDNA의 단일 세포 클로닝으로부터 회수할 수 있거나 시험관내에서 면역화될 수 있음). 예를 들어, 문헌 [Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991; 및 미국 특허 번호 5,750,373을 참조한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종에서 유래되고 불변 영역 서열은 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 바람직하게는 비교적 짧은 (예를 들어, 10-100개 아미노산) 임의의 길이의 아미노산 쇄를 지칭하기 위해 본원에서 교환가능하게 사용된다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/거나, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개재에 의해 변형된 아미노산 쇄를 포괄한다 (예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합). 또한 이러한 정의에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드가 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
"1가 항체"는 분자당 하나 항원 결합 부위를 포함한다 (예를 들어, IgG 또는 Fab). 일부 경우에서, 1가 항체는 하나 초과의 항원 결합 부위를 가질 수 있으나, 결합 부위는 상이한 항원으로부터의 것이다.
"2가 항체"은 분자당 2개의 항원 결합 부위를 포함한다 (예를 들어, IgG). 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 항원 특이성이 동일하다. 그러나, 2가 항체가 이중특이적일 수 있다.
"이중특이적", "이중-특이적" 또는 "이관능성" 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체의 2개의 항원 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적 상에 존재할 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합한다.
본 발명의 항체는 당업계에 널리 공지된 기술, 예를 들어 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술의 조합 또는 당업계에 용이하게 공지된 다른 기술을 이용하여 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999 및 Fellouse, F.A., et al., J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007] 참조).
당업계에 공지된 바와 같이, 본원에서 교환가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 쇄를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 쇄 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우에, 이러한 변형은 쇄의 어셈블리 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해, 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡", 1개 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 모이어티, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 또한, 당에 본래 존재하는 임의의 히드록실 기는 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 인산화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 포함하여, 일반적으로 당업계에 공지된 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결이 대안적인 연결 기로 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 대체된 실시양태를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결을 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
당업계에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한 (즉, 오염물 없음), 보다 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 도입을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 상기 자손은 천연적, 우연적 또는 계획적인 돌연변이로 인해 반드시 본래 모 세포에 완전하게 동일 (형태적으로 또는 게놈 DNA 보체에서)할 필요는 없을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지의 범위로 경계지어진다. Fc 영역 내 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스의 넘버링이다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 영역인 CH2 및 CH3을 포함한다.
당업계에 사용된 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, 대립유전자 변이체 및 이러한 수용체의 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995]에서 검토된다. "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; 및 Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994]).
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (또는 부분)이 제2 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하여, 상기 제1 항체와 그의 동족 에피토프의 결합이 제2 항체 부재 하의 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 것을 의미한다. 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 상황도 가능하지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 즉, 제2 항체는 제1 항체가 그의 각각의 에피토프에 결합하는 것을 억제하지 않으면서 제1 항체는 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 동일한 정도, 보다 큰 정도, 또는 보다 적은 정도의 여부와 상관없이 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출가능하게 억제하는 경우에, 이러한 항체들은 이들의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체가 둘 다 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 일어나는 메카니즘 (예를 들어, 입체 장애, 입체형태 변화 또는 공통적인 에피토프 또는 그의 일부에 대한 결합)과는 상관없이, 당업자는 본원에 제공되는 교시를 기초로 하여 본원에 개시된 방법에 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포괄되며 유용할 수 있음을 알 것이다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향-조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능에는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되고, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위해 당업계에 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인하여 천연 서열 Fc 영역의 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하나, 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능이 유지된다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교시 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 이와 적어도 약 90%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 이와 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가질 것이다.
용어 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에서 기인한 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), Fc 수용체 결합, 보체 의존성 세포독성 (CDC), 식세포작용, C1q 결합, 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056을 참조한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되고, 이것은 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 당업계에 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가할 수 있다. 이펙터 기능의 예시적 측정은 Fcγ3 및/또는 C1q 결합을 통해 이루어진다.
본원에 사용되 "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다. 관심 분자의 ADCC 활성을 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 것을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예컨대 문헌 [Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수도 있다.
"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적의 용해를 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어, 항체)에 보체계의 제1 성분 (C1q)이 결합하는 것에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
본원에 사용된 "치료"는 유익하거나 원하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 신생물성 또는 암성 세포의 증식의 감소 (또는 파괴), 신생물성 세포의 전이의 억제, Trop-2 발현 종양의 크기의 수축 또는 감소, Trop-2 연관 질환 (예를 들어, 암)의 완화, Trop-2 연관 질환 (예를 들어, 암)으로부터 발생한 증상의 감소, Trop-2 연관 질환 (예를 들어, 암)을 앓고 있는 자의 삶의 질 증가, Trop-2 연관 질환 (예를 들어, 암)을 치료하기 위해 요구되는 다른 의약의 용량의 감소, Trop-2 연관 질환 (예를 들어, 암)의 진행 지연, Trop-2 연관 질환 (예를 들어, 암)의 치유, 및/또는 Trop-2 연관 질환 (예를 들어, 암)을 갖는 환자의 생존 연장.
"개선"은 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 투여하지 않는 경우와 비교하여 하나 이상의 증상이 감소되거나 개선된 것을 의미한다. "개선"은 또한 증상의 지속기간의 단축 또는 감소를 포함한다.
본원에 사용된 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 임의의 하나 이상의 유익하거나 원하는 결과를 발생시키기에 충분한 양이다. 예방적 사용의 경우에, 유익하거나 원하는 결과는 위험의 제거 또는 감소, 중증도의 감소, 또는 질환 (질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 질환의 발생 동안 나타나는 그의 합병증 및 중간 병적 표현형 포함)의 발생 지연을 포함한다. 치료 용도를 위해, 유익하거나 원하는 결과는 임상 결과, 예컨대 다양한 Trop-2 연관 질환 또는 상태 (예컨대, 위, 두경부, 폐, 난소 및 췌장 암)의 하나 이상의 증상의 발생 감소 또는 개선, 질환을 치료하기 위해 요구되는 다른 의약의 용량의 감소, 또 다른 의약의 효과의 증진 및/또는 환자의 Trop-2 연관 질환의 진행 지연을 포함한다. 유효 투여량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 예방적 또는 치유적 치료를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기에 충분한 양이다. 임상적 문맥에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성되거나 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 하나 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 작용제는 하나 이상의 다른 작용제와 관련하여 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면 유효량으로 주어진 것으로 간주될 수 있다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 또한 가축, 경주용 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "벡터"는 숙주 세포 내에 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우에 상기 성분이 생물학적 활성을 보유하고 대상체의 면역계와 비-반응성이도록 하는 임의의 물질을 포함한다. 그 예는 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 수중유 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 중 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 통상의 (0.9%) 염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상의 방법에 의해 제제화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005] 참조).
본원에 사용된 용어 "아실 공여자 글루타민-함유 태그" 또는 "글루타민 태그"는 트랜스글루타미나제 아민 수용자로서 작용하는 1개 이상의 Gln 잔기(들)를 함유하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, WO2012059882를 참조한다.
본원에 사용된 용어 "kon"은 항원에 대한 항체의 회합에 대한 속도 상수를 지칭한다. 구체적으로, 속도 상수 (kon 및 koff) 및 평형 해리 상수는 Fab 항체 단편 (즉, 1가) 및 Trop-2 단백질 (예를 들어, Trop-2-Fc 융합 단백질)을 사용하여 측정된다.
본원에 사용된 용어 "koff"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 속도 상수를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함(하고 이를 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 수치 범위는 그 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.
실시양태가 표현 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 발명의 측면 또는 실시양태를 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 분류의 방법으로 기재한 경우에, 본 발명은 전체로서 열거한 전체 군 뿐만 아니라, 군의 각 구성원을 개별적으로, 및 주요 군의 모든 가능한 하위군 뿐만 아니라 하나 이상의 군 구성원이 없는 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한 본 발명의 특허청구범위에서 하나 이상의 임의의 군 구성원이 명시적으로 배제된 것도 고려한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속하는 업계의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우에, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우선될 것이다. 본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급한 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군은 배제시키지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다.
예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
Trop-2 항체 및 그의 제조 방법
본 발명은 Trop-2에 결합하는 항체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 6.5 nM 이하의 1가 항체 결합 친화도 (KD)로 인간 Trop-2 (예를 들어, 서열 27)의 도메인 3 (예를 들어, 아미노산 잔기 153-206) 및 도메인 4 (예를 들어, 아미노산 잔기 209-273)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 약 35 nM 이하의 결합 친화도 (KD)로 인간 Trop-2 (예를 들어, 서열 27)의 도메인 1 (예를 들어, 아미노산 잔기 27-70)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 항체 및 항체 접합체는 하기 특성 중 어느 하나 이상에 의해 특성화된다: (a) Trop-2에 결합함; (b) Trop-2의 단백질 발현을 감소시키거나 하향조절함; (c) 대상체에서 Trop-2 발현과 연관된 상태 (예를 들어, 암, 예컨대 위, 두경부, 폐, 난소 또는 췌장 암)의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 개선함; (d) 대상체 (Trop-2 발현 종양을 가짐)에서 종양 성장 또는 진행을 억제함; (e) 대상체 (하나 이상의 Trop-2 발현 암 세포를 가짐)에서 Trop-2 발현 암 세포의 전이를 억제함; (f) Trop-2 발현 종양의 퇴행 (예를 들어, 장기간 퇴행)을 유도함; (g) Trop-2 발현 세포에서 세포독성 활성을 발휘함; (h) ERK1/2 MAPK 경로를 비활성화시키거나 하향조절함; 및 (i) 아직 확인되어야 할 다른 인자로 Trop-2 상호작용을 차단함.
본 발명에서 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 (예로서, 도메인 항체), 인간화된 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유결합으로 변형된 항체를 비롯한 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 또 다른 변형된 형상의 이뮤노글로불린 분자를 포함할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원일 수 있다 (키메라 또는 인간화 항체 포함).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체는 모노클로날 항체이다. 예를 들어, Trop-2 항체는 인간화 모노클로날 항체 또는 키메라 모노클로날 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 면역 반응을 유발하는 증가된 잠재성을 갖는 불변 영역 (이에 제한되지 않음)을 포함한다. 예를 들어, 불변 영역은 Fc 감마 수용체, 예컨대 예를 들어 FcγRI, FcγRIIA 또는 FcγIII에 대한 증가된 친화도를 갖도록 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 면역학적으로 불활성인, 즉 면역 반응 유발을 위한 잠재력이 감소된 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 영국 특허 출원 번호 98099518에 기재된 바와 같이 변형된다. Fc는 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4일 수 있다. Fc는 돌연변이 A330P331 → S330S331을 함유하는 인간 IgG2 (IgG2Δa)일 수 있다 (여기서, 아미노산 잔기는 야생형 IgG2 서열에 대해 넘버링됨). 문헌 [Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999]. 일부 실시양태에서, 항체는 하기 돌연변이를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함한다 (문헌 [Armour et al., Molecular Immunology 40 585-593, 2003]): E233F234L235 → P233V234A235 (IgG4Δc) (여기서, 넘버링은 야생형 IgG4에 대한 것임). 또 다른 실시양태에서, Fc는 결실 G236을 갖는 인간 IgG4 E233F234L235 → P233V234A235 (IgG4Δb)이다. 또 다른 실시양태에서, Fc는 힌지 안정화 돌연변이 S228 → P228을 함유하는 임의의 인간 IgG4 Fc (IgG4, IgG4Δb 또는 IgG4Δc)이다 (문헌 [Aalberse et al., Immunology 105, 9-19, 2002]). 또 다른 실시양태에서, Fc는 비-글리코실화 Fc일 수 있다.
일부 실시양태에서, 불변 영역은 올리고사카라이드 부착 잔기 (예컨대, Asn297) 및/또는 불변 영역 내 글리코실화 인식 서열의 일부인 플랭킹 잔기를 돌연변이시켜서 비-글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결 글리코실화에 대하여 효소적으로 비-글리코실화된다. 불변 영역은 N-연결 글리코실화에 대하여 효소적으로 또는 글리코실화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 비-글리코실화될 수 있다.
Trop-2에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는 방법 중 하나는 항체의 일관능성 Fab 단편의 결합 친화도를 측정하는 것이다. 일관능성 Fab 단편을 수득하기 위해서, 항체 (예를 들어, IgG)를 파파인으로 절단시키거나 재조합 방식으로 발현시킬 수 있다. 항체의 Trop-2 Fab 단편의 친화도는 HBS-EP 러닝 완충제 (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20)를 사용하여 미리-고정화된 스트렙타비딘 센서 칩 (SA) 또는 항-마우스 Fc 또는 항-인간 Fc가 장착된 표면 플라즈몬 공명 (비아코어™3000™(Biacore™3000™) 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템, 비아코어™, 인크, 뉴저지주 피스카타웨이)으로 측정할 수 있다. 비오티닐화 또는 Fc 융합 인간 Trop-2를 HBS-EP 완충제에 0.5 μg/mL 미만의 농도로 희석시키고, 다양한 접촉 시간을 사용하여 개별 칩 채널을 통해 주입함으로써 2가지 범위의 항원 밀도, 상세한 동역학 연구의 경우에 50-200 반응 단위 (RU) 또는 스크리닝 검정의 경우에 800-1,000 RU를 달성할 수 있다. 재생 연구는 25% v/v 에탄올 중 25 mM NaOH가 200회가 넘는 주사 동안 칩 상의 Trop-2의 활성을 유지시키면서 결합된 Fab를 효과적으로 제거하였음을 보여주었다. 전형적으로, 정제된 Fab 샘플의 연속 희석물 (0.1-10x 추정 KD의 농도 범위)을 1분 동안 100 μL/분으로 주사하고, 최대 2시간의 해리 시간을 허용한다. Fab 단백질의 농도를 공지된 농도 (아미노산 분석에 의해 결정됨)의 Fab를 표준물로 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 결정한다. 동역학적 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 비아이밸류에이션 (BIAevaluation) 프로그램을 사용하여 1:1 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델에 전체적으로 데이터를 피팅하여 동시에 수득된다 (문헌 [Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110]). 평형 해리 상수 (KD) 값은 koff/kon으로 계산된다. 이 프로토콜은 인간 Trop-2, 또 다른 포유동물의 Trop-2 (예컨대 마우스 Trop-2, 래트 Trop-2 또는 영장류 Trop-2) 뿐만 아니라 상이한 형태의 Trop-2 (예를 들어, 글리코실화 Trop-2)를 비롯한 임의의 Trop-2에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는데 사용하기에 적합한다. 항체의 결합 친화도는 일반적으로 25℃에서 측정하나, 또한 37℃에서 측정할 수도 있다.
본원에 기재된 Trop-2 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 하이브리도마 세포주의 생산을 위해, 숙주 동물의 면역화 경로 및 스케쥴은 일반적으로 본원에 추가로 기재한 바와 같이 항체 자극 및 생산을 위한 확립된 기술 및 통상의 기술로 유지된다. 인간 및 마우스 항체의 생성을 위한 일반적 기술은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다.
인간을 비롯한 임의의 포유동물 대상체 또는 이들로부터의 항체 생산 세포는 인간을 비롯한 포유동물의 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기초로 작용하도록 조작될 수 있다고 여겨진다. 전형적으로, 본원에 기재된 것을 포함하여, 소정량의 면역원이 숙주 동물에게 복강내로, 근육내로, 경구로, 피하로, 족저내로 및/또는 피내로 접종된다.
문헌 [Kohler, B. and Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975]의 일반적인 체세포 혼성화 기술을 이용하여, 또는 문헌 [Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982]에 의하여 변형된 바와 같은 방법에 의해, 하이브리도마는 림프구 및 불멸화 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트의 셀 디스트리부션 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center)의 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이용가능한 골수종 세포주를 혼성화에 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합원을 사용하거나 당업자에게 널리 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포 및 림프성 세포를 융합시키는 것을 수반하였다. 융합 후에, 세포를 융합 배지로부터 분리하고, 선별 성장 배지, 예컨대 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지에서 성장시켜서 혼성화되지 않은 모 세포를 제거하였다. 혈청이 보충되거나 혈청이 보충되지 않은, 본원에 기재된 임의의 배지가 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는데 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, EBV 불멸화 B 세포를 본 발명의 Trop-2 모노클로날 항체 생산에 사용할 수 있다. 원하는 경우에, 하이브리도마를 증식시켜 서브클로닝하고, 상청액을 통상의 면역검정 절차 (예를 들어, 방사선면역검정, 효소 면역검정 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 대하여 검정한다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 Trop-2에 대해 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 부분을 생산하는 모 하이브리도마의 자손 세포인 모든 유도체를 포함한다.
이러한 항체를 생성하는 하이브리도마는 공지된 절차를 이용하여 시험관내 또는 생체내 성장시킬 수 있다. 원한다면, 통상의 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과에 의해 모노클로날 항체를 배양 배지 또는 체액으로부터 단리할 수 있다. 바람직하지 않은 활성이 존재하는 경우에, 이것은 예를 들어 고체 상에 부착된 면역원으로 이루어진 흡착제상에 제제를 운행시키고, 원하는 항체를 면역원으로부터 용출 또는 방출시킴으로써 제거할 수 있다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한 접합), 글리타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 인간 Trop-2, 또는 면역화시킬 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편으로 숙주 동물을 면역화함으로써, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 집단이 생성될 수 있다.
원하는 경우에, 관심 Trop-2 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)를 서열분석할 수 있고, 이어서 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 또는 증식을 위해 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내의 벡터 내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포를 추후의 사용을 위해 증식 및 동결시킬 수 있다. 세포 배양물 중 재조합 모노클로날 항체의 생산은 당업계에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터의 항체 유전자를 클로닝하여 수행될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008]; 미국 특허 번호 7,314,622를 참조한다.
대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"시키거나 항체의 친화도 또는 기타 특성을 개선시키기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체가 인간에서의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우에 면역 반응을 피하기 위해서 불변 영역을 인간 불변 영역과 더 유사하도록 조작할 수 있다. Trop-2에 대한 더 높은 친화도 및 Trop-2 억제에 있어서의 더 높은 효능을 얻기 위해 항체 서열을 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다.
모노클로날 항체를 인간화하는 4가지 일반적 단계가 있다. 이들은 다음과 같다: (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예상 아미노산 서열 결정 (2) 인간화 항체 설계, 즉 인간화 과정 동안 사용하기 위한 항체 프레임워크 영역 결정 (3) 실제 인간화 방법론/기술 및 (4) 인간화 항체의 형질감염 및 발현. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; 및 6,180,370을 참조한다.
설치류 또는 변형된 설치류 V 영역 및 인간 불변 영역에 융합된 그의 연관 CDR을 갖는 키메라 항체를 비롯하여, 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 항원 결합 부위를 포함하는 다수의 "인간화" 항체 분자가 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Winter et al. Nature 349:293-299, 1991, Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224, 1989, Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538, 1987, 및 Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583, 1987]을 참조한다. 다른 참고문헌은 적절한 인간 항체 불변 영역과의 융합 전 인간 지지 프레임워크 영역 (FR)으로 그라프팅된 설치류 CDR을 기재한다. 예를 들어, 문헌 [Riechmann et al. Nature 332:323-327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536, 1988, 및 Jones et al. Nature 321:522-525, 1986]을 참조한다. 또 다른 문헌은 재조합 방식으로 조작된 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지되는 설치류 CDR을 기재한다. 예를 들어, 유럽 특허 공개 번호 0519596을 참조한다. 이러한 "인간화" 분자는 설치류 항-인간 항체 분자에 대한 원치않는 면역학적 반응을 최소화하도록 설계되고, 이때 상기 반응은 인간 수용자에서 이러한 모이어티를 치료학적으로 적용하는 것에 관한 기간 및 유효성을 제한한다. 예를 들어, 항체 불변 영역은 면역학적으로 불활성이도록 (예를 들어, 보체 용해를 촉발하지 않도록) 조작될 수 있다. 예를 들어 PCT 공개 번호 PCT/GB99/01441; 영국 특허 출원 번호 9809951.8을 참조한다. 또한 이용될 수 있는 인간화 항체의 다른 방법은 문헌 [Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, 1991], 및 미국 특허 번호 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671; 및 6,350,861; 및 PCT 공개 번호 WO 01/27160에 개시되어 있다.
상기 논의된 인간화 항체에 관한 일반적 원리는 또한 예를 들어 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서 사용하기 위한 항체를 맞추는데 적용가능하다. 또한, 본원에 기재된 항체를 인간화하는 하나 이상의 측면은 조합된, 예를 들어 CDR 그라프팅, 프레임워크 돌연변이 및 CDR 돌연변이일 수 있다.
한 변화에서, 특정 인간 이뮤노글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수가능한 마우스를 사용하여 완전 인간 항체를 수득할 수 있다. 보다 바람직한 (예를 들어, 완전 인간 항체) 또는 보다 강한 면역 반응을 생성하도록 설계된 트랜스제닉 동물은 또한 인간화 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.) (캘리포니아주 프레몬트)의 제노마우스(Xenomouse)™ 및 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.) (뉴저지 프린스턴)의 HuMAb-마우스® 및 TC 마우스™이다.
대안에서, 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 항체를 재조합 방식으로 제조하고 발현시킬 수 있다. 또 다른 대안에서, 파지 디스플레이 기술에 의해 항체를 재조합 방식으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 문헌 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994]를 참조한다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990])은 비면역화된 공여자로부터 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 단백질 유전자로 인-프레임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기반으로 한 선택에 의해 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선택된다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고; 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993]을 참조한다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합의 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리시킨다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 항원 (자기-항원을 포함함)의 다양한 배열에 대한 항체는 문헌 [Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993]에 의해 기재된 기술에 따라 본질적으로 단리될 수 있다. 천연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다 (체세포 과다돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 더 높은 친화도를 부여할 것이고, 고친화도 표면 이뮤노글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 후속 항원 접종 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. "쇄 셔플링"으로 공지된 기술을 이용함으로써 이러한 천연 공정이 모방될 수 있다. (문헌 [Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992]). 이러한 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화도는, 비면역화된 공여자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체 (레퍼토리)의 레퍼토리로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 순차적으로 대체함으로써 향상시킬 수 있다. 이러한 기술은 친화도가 pM-nM 범위인 항체 및 항체 단편이 생성되도록 한다. 초대형 파지 항체 레퍼토리 ("모든 라이브러리의 모체"로 또한 공지됨)를 제조하기 위한 전략이 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993]에 기재되어 있다. 유전자 셔플링은 또한 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수도 있고, 이때 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅"으로도 지칭되는 이러한 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기법에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 설치류-인간 키메라가 생성된다. 항원을 기초로 선택한 결과로서, 기능적 항원-결합 부위가 복원될 수 있는 인간 가변 영역이 단리되고, 즉 에피토프가 파트너의 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 남아있는 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 방법이 반복되는 경우에, 인간 항체가 수득된다 (PCT 공개 번호 WO 93/06213 참조). CDR 그라프팅에 의한 설치류 항체의 종래의 인간화와는 달리, 이러한 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.
먼저 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생성 세포를 단리하여 유전자 서열을 수득하고 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 항체를 재조합적으로 발현시킴으로써 항체를 재조합 방식으로 제조할 수 있다. 이용될 수 있는 또 다른 방법은 식물 (예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 유액에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 유액에서 항체를 재조합적으로 발현시키는 방법이 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001; Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; 및 Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999]을 참조한다. 항체의 유도체, 예를 들어 인간화 항체, 단일 쇄 항체 등의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
또한, 면역검정 및 유동 세포측정법 분류 기술, 예컨대 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 이용하여 Trop-2에 특이적인 항체를 단리할 수 있다.
본원에 기재된 항체는 다수의 상이한 담체에 결합될 수 있다. 담체는 활성 및/또는 불활성일 수 있다. 널리-공지된 담체의 예는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철광을 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자는 항체를 결합시키기 위한 다른 적합한 담체를 알고 있거나, 또는 일상적인 실험을 통해 이를 확인할 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 담체는 심근을 표적으로 하는 모이어티를 포함한다.
통상의 절차를 이용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로 제공된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터) 내에 배치할 수 있고, 이어서 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포로 형질감염시켜서 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 87/04462를 참조한다. DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 코딩 서열을 대체하거나 (문헌 [Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984]) 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 대해 공유 연결하여 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에서의 Trop-2 모노클로날 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
본원에 기재된 Trop-2 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 확인 또는 특성화될 수 있으며, 이에 의해 Trop-2 발현 수준의 감소가 검출되고/거나 측정된다. 일부 실시양태에서, Trop-2 항체는 Trop-2와 후보 작용제를 인큐베이션하고, 결합 및/또는 Trop-2 발현 수준의 감소 여부를 모니터링함으로써 확인된다. 결합 검정은 정제된 Trop-2 폴리펩티드(들)를 사용하거나 Trop-2 폴리펩티드(들)를 자연적으로 발현하거나 이를 발현하도록 형질감염된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 검정은 Trop-2 결합에 대해 공지된 Trop-2 항체와 경쟁하는 후보 항체의 능력을 평가하는 경쟁적 결합 검정이다. 검정은 ELISA 포맷을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
초기 확인에 이어, 후보 Trop-2 항체의 활성은 표적화된 생물학적 활성을 시험하는 것으로 공지된 생물검정에 의해 추가로 확인되고 정밀화될 수 있다. 대안적으로, 생물검정을 이용하여 후보물질을 직접 스크리닝할 수 있다. Trop-2 항체를 확인하고 특성화하는 방법의 일부가 실시예에 상세하게 기재되어 있다.
Trop-2 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 이것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]의 챕터 11에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조의 해결, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기재 검정을 비롯하여 단백질 상에서 에피토프의 위치를 맵핑하고 특성화하는 당업계에 공지된 다수의 방법이 존재한다. 추가의 예에서, 에피토프 맵핑을 이용하여 Trop-2 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들어 펩스캔 시스템즈(Pepscan Systems) (네덜란드 8219 피에이치 렐리스타드 에델헤르트벡 15)로부터 상업적으로 입수가능하다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 스트레치 내에 함유된 것일 수도 있거나, 또는 반드시 단일 스트레치 내에 함유된 것은 아닐 수도 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형태적 에피토프일 수도 있다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 적어도 4-6개 아미노산 길이)가 단리 또는 합성되어 (예를 들어, 재조합적으로), Trop-2 항체를 사용한 결합 검정에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, Trop-2 항체가 결합하는 에피토프를 Trop-2 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하여 Trop-2 항체에 의한 결합을 결정하는 전반적 스크리닝에서 결정할 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, Trop-2를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특정 유전자 구축에 의해 단편화시키고, Trop-2의 발현된 단편과 시험될 항체의 반응성을 결정한다. 유전자 단편은, 예를 들어 방사성 아미노산의 존재 하에 PCR에 의해 생성된 후 시험관내 전사되고 단백질로 번역될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 Trop-2 단편에 대한 항체의 결합을 면역침전 및 젤 전기영동에 의해 결정한다. 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리 (파지 라이브러리)를 사용하여 특정 에피토프를 확인할 수도 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 한정된 라이브러리를 시험 항체와의 결합에 대해 간단한 결합 검정으로 시험할 수 있다. 추가의 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 교체 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 에피토프 결합에 요구되고/되거나 충분하고/하거나 필요한 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, Trop-2 단백질의 다양한 단편이 또 다른 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 Trop-2 또는 밀접하게 관련되지만 항원적으로 구별되는 단백질 (예를 들어, Trop-1)로부터의 서열로 대체 (교체)된 돌연변이체 Trop-2를 사용하여 도메인 교체 실험을 수행할 수 있다. 돌연변이체 Trop-2에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정한 Trop-2 단편의 중요성을 평가할 수 있다.
Trop-2 항체를 특성화하는데 이용될 수 있는 또 다른 방법은 동일한 항원, 즉 Trop-2 상의 다양한 단편에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체와의 경쟁 검정을 이용하여, Trop-2 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하는 것이다. 경쟁 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
발현 벡터를 사용하여 Trop-2 항체의 발현을 지시할 수 있다. 당업자는 생체내 외인성 단백질의 발현을 달성하기 위한 발현 벡터의 투여를 알고 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471을 참조한다. 발현 벡터의 투여는 국부 또는 전신 투여, 예를 들어 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여, 및 국소 투여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감신경 줄기 또는 신경절에, 또는 관상 동맥, 심방, 심실 또는 심막 내로 직접 투여된다.
발현 벡터 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화 전달이 이용될 수도 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은, 예를 들어 문헌 [Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 263:621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem., 269:542, 1994; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655, 1990; 및 Wu et al., J. Biol. Chem., 266:338, 1991]에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국부 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA의 범위로 투여된다. 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg의 DNA의 농도 범위가 유전자 요법 프로토콜 동안 또한 사용될 수 있다. 치료 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Jolly, Cancer Gene Therapy,1:51, 1994; Kimura, Human Gene Therapy, 5:845, 1994; Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185; 및 Kaplitt, Nature Genetics, 6:148, 1994]을 참조). 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 이용하여 이러한 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적일 수도 있고, 또는 조절될 수도 있다.
원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기재 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-기재 비히클은 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 번호 5, 219,740 및 4,777,127; 독일 특허 번호 2,200,651; 및 유럽 특허 번호 0 345 242 참조), 알파바이러스-기재 벡터 (예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147]에 기재된 바와 같은, 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
또한, 단독으로 사멸된 아데노바이러스에 연결되거나 연결되지 않은 다가양이온성 축합 DNA (예를 들어, 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992] 참조); 리간드-연결된 DNA (예를 들어, 문헌 [Wu, J. Biol. Chem., 264:16985, 1989] 참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,814,482; PCT 공개 번호 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함하나 이에 제합되지는 않는 비-바이러스성 전달 비히클 및 방법이 이용될 수 있다. 네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법이 PCT 공개 번호 WO 90/11092 및 미국 특허 번호 5,580,859에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜이 미국 특허 번호 5,422,120; PCT 공개 번호 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0524968에 기재되어 있다. 추가의 접근법이 문헌 [Philip, Mol. Cell Biol., 14:2411, 1994 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:1581, 1994]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재되거나 본원에 기재된 방법에 의해 제조되고, 본원에 기재된 특징을 갖는 항체를 포함하는, 제약 조성물을 비롯한 조성물을 포함한다. 본원에 사용된 조성물은 Trop-2에 결합하는 하나 이상의 항체, 및/또는 하나 이상의 이들 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 조성물은 당업계에 공지된 적합한 부형제, 예컨대 제약상 허용되는 부형제, 예를 들어 완충제를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 중 어느 것, 또는 하기 중 어느 것을 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다:
(a)
Figure pct00005
Figure pct00006
의 부분 경쇄 서열을 갖는 항체 및/또는
(b)
Figure pct00007
Figure pct00008
의 부분 중쇄 서열을 갖는 항체.
[표 1]
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
표 1에서, 밑줄친 서열은 카바트에 따른 CDR 서열이고, 볼드체는 코티아에 따른다.
본 발명은 또한 Trop-2에 대한 항체의 CDR 부분을 제공한다 (코티아, 카바트 CDR, 및 CDR 접촉 영역 포함). CDR 영역을 결정하는 것은 당업계의 기술에 속한다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 및 코티아 CDR의 조합 (또한, "조합형 CR" 또는 "확장된 CDR"이라고도 불림)일 수 있다는 것이 이해된다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 즉, 1개 초과의 CDR을 사용하는 실시양태에서, CDR은 카바트, 코티아 및/또는 조합 CDR 또는 이들의 조합 중 임의의 것일 수 있다. 표 2는 본원에 제공된 CDR 서열의 예를 제공한다.
[표 2]
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
일부 실시양태에서, 본 발명은 Trop-2에 결합하고, 본원에 기재된 항체, 예컨대 m7E6, h7E6, h7E6_SVG, h7E6_SVG1, h7E6_SVG2, h7E6_SVG3, h7E6_SVG4, h7E6_SVG5, h7E6_SVG6, h7E6_SVG7, h7E6_SVG8, h7E6_SVG9, h7E6_SVG10, h7E6_SVG11, h7E6_SVG12, h7E6_SVG13, h7E6_SVG14, h7E6_SVG15, h7E6_SVG16, h7E6_SVG17, h7E6_SVG18, h7E6_SVG19, h7E6_SVG20, h7E6_SVG21, h7E6_SVG22, h7E6_SVG23, h7E6_SVG24, h7E6_SVG25, h7E6_SVG26, h7E6_SVG27, h7E6_SVG28, h7E6_SVG29, h7E6_SVG30, h7E6_SVG31, h7E6_SVG32, h7E6_SVGL, h7E6_SVGL1, h7E6_SVGL2, h7E6_SVGL3, h7E6_SVGL4, h7E6_SVGL5, h7E6_SVGN, m6G11, h6G11 또는 h6G11_FKG_SF와 경쟁하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Trop-2의 결합을 항체 h7E6_SVG, h7E6_SVG4, h7E6_SVG19, h7E6_SVG20, h7E6_SVG22, h7E6_SVG28, h7E6_SVG30, h7E6_SVGL, h7E6_SVGL1, h7E6_SVGL2, h7E6_SVGL3, h7E6_SVGL4, h7E6_SVGL5, h7E6_SVGN 또는 h6G11_FKG_SF와 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Trop-2의 결합을 항체 h7E6_SVG와 경쟁하고, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 약 6.5 nM, 6.0 nM, 5.5 nM, 5.0 nM, 4.5 nM, 4.0 nM, 3.5 nM, 3.0 nM, 2.5 nM, 2.0 nM, 1.5 nM, 1.0 nM, 0.5 nM 또는 0.25 nM 정도 또는 그 미만의 1가 항체 결합 친화도 (KD)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 Trop-2의 결합을 항체 h7E6과 경쟁하고, 약 30 nM, 25 nM, 22 nM, 20 nM, 15 nM 또는 10 nM 정도 또는 그 미만의 1가 항체 결합 친화도 (KD)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 경쟁 항체는 서열
Figure pct00025
의 중쇄 가변 영역 및 서열
Figure pct00026
의 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 경쟁 항체는 항체 AR47A6.4.2, AR52A301.5, AR36A36.11.1, BR110 또는 RS7이 아니다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 Trop-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 서열 5, 84 또는 85에 나타낸 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열 3에 나타낸 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열
Figure pct00027
를 포함하는 경쇄
및 서열
Figure pct00028
를 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 66의 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 101 또는 102의 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 Trop-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 서열 13에 나타낸 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열 12에 나타낸 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열
Figure pct00029
를 포함하는 경쇄 및 서열
Figure pct00030
를 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 CDR 접촉 영역에 기초하여 Trop-2 항체에게 항체의 CDR 부분을 제공한다. CDR 접촉 영역은 항원에 대한 항체에 특이성을 주입시키는 항체의 영역이다. 일반적으로, CDR 접촉 영역은 CDR 및 버니어(Vernier) 구역 중 잔기 위치를 포함하며, 이들은 특정 항원에 결합하는 항체에 대해서 적합한 루프 구조를 유지하기 위하여 제약된다. 예를 들어, 문헌 [Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007]을 참조한다. CDR 접촉 영역의 결정은 당업계의 기술 내에 잘 포함된다.
Trop-2 (예컨대, 인간 Trop-2)에 대한 본원에 기재된 Trop-2 항체의 결합 친화도 (KD)는 약 0.002 내지 약 200 nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 45 nM, 약 40 nM, 약 35 nM, 약 30 nM, 약 25 nM, 약 20 nM, 약 15 nM, 약 10 nM, 약 8 nM, 약 7.5 nM, 약 7 nM, 약 6.5 nM, 약 6 nM, 약 5.5 nM, 약 5 nM, 약 4 nM, 약 3 nM, 약 2 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 30 nM, 약 20 nM, 약 10 nM, 약 7.5 nM, 약 7 nM, 약 6.5 nM, 약 6 nM, 약 5 nM, 약 4.5 nM, 약 4 nM, 약 3.5 nM, 약 3 nM, 약 2.5 nM, 약 2 nM, 약 1.5 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 5 pM 또는 약 2 pM 미만이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 결합 친화도 (예를 들어, 1가 항체 결합)는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 약 35 nM 이하이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 결합 친화도 (예를 들어, 1가 항체 결합)는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 약 6.5 nM 이하이다.
본 발명은 또한 임의의 이들 항체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 절차로 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질분해 또는 기타 분해, 상기 기재된 바와 같은 재조합 방법에 의해 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 최대 약 50개 아미노산의 더 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 항체는 고체 상 방법을 이용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기로 생성될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415를 참조한다.
또 다른 대안에서, 항체는 당업계에 놀리 공지된 절차를 이용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 m7E6, h7E6, h7E6_SVG, h7E6_SVG1, h7E6_SVG2, h7E6_SVG3, h7E6_SVG4, h7E6_SVG5, h7E6_SVG6, h7E6_SVG7, h7E6_SVG8, h7E6_SVG9, h7E6_SVG10, h7E6_SVG11, h7E6_SVG12, h7E6_SVG13, h7E6_SVG14, h7E6_SVG15, h7E6_SVG16, h7E6_SVG17, h7E6_SVG18, h7E6_SVG19, h7E6_SVG20, h7E6_SVG21, h7E6_SVG22, h7E6_SVG23, h7E6_SVG24, h7E6_SVG25, h7E6_SVG26, h7E6_SVG27, h7E6_SVG28, h7E6_SVG29, h7E6_SVG30, h7E6_SVG31, h7E6_SVG32, h7E6_SVGL, h7E6_SVGL1, h7E6_SVGL2, h7E6_SVGL3, h7E6_SVGL4, h7E6_SVGL5, h7E6_SVGN, m6G11, h6G11 또는 h6G11_FKG_SF의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포에서 벡터에서 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 이후의 사용을 위해 확장 및 동결된다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 본원에 추가로 기재된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 scFv를 포함한다. 단일 쇄 가변 영역 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결시켜 제조된다 (문헌 [Bird et al., Science 242:423-426, 1988]). 연결 펩티드의 예는 (GGGGS)3 (서열 80)이고, 이것은 한쪽 가변 영역의 카르복시 말단 및 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 대략 약 3.5 nm을 가교시킨다. 다른 서열의 링커가 설계되고 사용된다 (문헌 [Bird et al., 1988, 상기 문헌] 참조). 링커는 가요성의 짧은 폴리펩티드이어야 하고 바람직하게는 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 이루어져야 한다. 이후, 링커는 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에 대한 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합 방식으로 또는 합성 방식으로 생성될 수 있다. scFv의 합성적 생산의 경우에, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산의 경우에, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 또는 이. 콜라이와 같은 원핵생물의 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 관심 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 라이게이션과 같은 통상적인 조작에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv를 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술로 단리할 수 있다.
다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디 또는 미니바디가 또한 포괄된다. 디아바디는 2가의, 이중특이적 항체이고, 여기서 중쇄 가변 (VH) 및 경쇄 가변 (VL) 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만, 너무 짧아서 동일 쇄 상에서 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 허용할 수 없는 링커를 사용하여 도메인이 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하도록 촉진하고, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448, 1993; Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994] 참조). 미니바디는 이뮤노글로불린 분자의 힌지 영역 및 CH3 도메인에 융합된 천연 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 예를 들어, US5,837,821을 참조한다.
예를 들어, 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체인 이중특이적 항체는 본원에 개시된 항체를 이용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986] 참조). 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2종의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현을 기초로 하였고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539, 1983]).
이중특이적 항체를 제조하는 한가지 접근법에 따라, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)은 이뮤노글로불린 불변 영역 서열에 융합된다. 융합은, 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 1개 이상의 융합물 내에 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 개별 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동 형질감염된다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비를 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우에, 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
한 접근법에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 있는 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물을 분리하는 것을 용이하게 한다. 이러하 접근법은 PCT 공개 번호 WO 94/04690에 기재되어 있다.
또 다른 접근법에서, 이중특이적 항체는 한 아암의 제1 힌지 영역에서의 아미노산 변형으로 구성되고, 제1 힌지 영역의 치환/대체된 아미노산은 또 다른 아암에서의 제2 힌지 영역의 상응하는 아미노산에 대해 반대 전하를 갖는다. 이러한 접근법은 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/036419 (WO2011/143545)에 기재되어 있다.
또 다른 접근법에서, 이중특이적 항체는 한 아암에서 에피토프 (예를 들어, Trop-2)에 대해 지시된 항체에 대해 조작된 글루타민-함유 펩티드 태그 및 트랜스글루타미나제의 존재 하에 또 다른 아암에서 제2 에피토프에 대해 지시된 제2 항체에 대해 조작된 또 다른 펩티드 태그 (예를 들어, Lys-함유 펩티드 태그 또는 반응성 내인성 Lys)를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근법은 국제 특허 출원 번호 PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882)에 기재되어 있다.
2개의 공유 연결된 항체를 포함하는 이종접합 항체가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 항체는 원치않는 세포에 대해 면역계 세포를 표적화하고 (미국 특허 번호 4,676,980), HIV 감염을 치료하는데 (PCT 공개 번호 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089) 사용되어 왔다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제 및 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 기재되어 있다.
가교제를 사용하는 방법을 포함하여, 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 이용하여 키메라 또는 하이브리드 항체가 또한 시험관내 제조될 수도 있다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 면역독소를 구축할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
재조합 인간화 항체에서, Fcγ 수용체 및 보체계 및 면역계와의 상호작용을 피하기 위해 Fcγ 부분을 변형시킬 수 있다. 이러한 항체를 제조하는 기술은 WO 99/58572에 기재되어 있다. 예를 들어, 항체가 인간에서의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우에는 면역 반응을 피하기 위해서 불변 영역이 인간 불변 영역과 더 유사하도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,997,867 및 5,866,692를 참조한다.
본 발명은 특성에 유의하게 영향을 미치지 않는 기능적 등가 항체 및 활성 및/또는 친화도가 증진되거나 감소된 변이체를 포함하는, 표 1에 나타낸 본 발명의 변이체의 항체 및 폴리펩티드에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열은 Trop-2에 대해 목적하는 결합 친화도를 갖는 항체를 수득하기 위해 돌연변이될 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 당업계에서 일반적 실시이고, 본원에 상세하게 기재할 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기가 보존적 치환되거나, 기능적 활성에 유의하게 해로운 변화를 야기하지 않는 아미노산이 1개 이상 결실 또는 부가되거나, 또는 리간드에 대한 폴리펩티드의 친화도가 성숙 (증진)되거나, 또는 화학적 유사체가 사용된 폴리펩티드를 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입물의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체는 혈액 순환 중 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항체 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
치환 변이체에서는, 항체 분자 내 적어도 1개의 아미노산 잔기가 제거하고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이유발에 가장 관심 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변경 또한 고려된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 3에 제시된다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하면, 표 3에서 "예시적인 치환"으로 명명되거나, 아미노산 부류에 대해 하기 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝할 수 있다.
[표 3]
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항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 아미노산 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 하기 군으로 분류된다:
(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 전하 없는 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성 (음으로 하전됨): Asp, Glu;
(4) 염기성 (양으로 하전됨): Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하여 이루어진다.
또한, 항체의 적절한 입체형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 이것의 안정성을 개선시킬 수 있고, 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에 그러하다.
아미노산 변형은 1개 이상의 아미노산을 변화 또는 변형시키는 것에서 가변 영역과 같은 영역을 완전히 다시 설계하는 것까지의 범위일 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 1 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인에서 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, CDR 도메인은 CDR H3 및/또는 CDR L3이다.
변형은 또한 글리코실화 및 비-글리코실화 폴리펩티드 및 또한 다른 번역후 변형, 예컨대 여러 당으로의 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다 (문헌 [Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997; Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32, 1997]). 이뮤노글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능 (문헌 [Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996; Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180, 1990]), 및 당단백질의 부분 사이의 분자내 상호작용에 영향을 미치고, 이것은 당단백질의 입체형태 및 제시된 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있다 (문헌 [Jefferis and Lund, 상기 문헌; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996]). 올리고사카라이드는 또한 특정 인식 구조를 기초로 하여 주어진 당단백질을 특정 분자로 표적화하는 기능을 할 수도 있다. 항체의 글리코실화는 또한 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라시클린-조절된 발현을 보이는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다 (문헌 [Umana et al., Mature Biotech. 17:176-180, 1999]).
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 나타낸다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 잔기의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용될 수도 있다.
항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 1개 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 원래의 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 또한 달성될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체의 글리코실화 패턴은 근본적인 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수도 있다. 글리코실화는 항체의 발현에 사용된 숙주 세포에 주로 의존적이다. 잠재적 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현에 사용되는 세포 유형은 천연 세포가 드물기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴의 유의한 변형을 예상할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997] 참조).
숙주 세포의 선택 뿐만 아니라, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 방식, 배지 제제, 배양 밀도, 산소 공급, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고사카라이드 생산과 관련된 특정 효소의 도입 또는 과다발현을 비롯하여 특정한 숙주 유기체에서 달성된 글리코실화 패턴을 변경하기 위해 다양한 방법이 제안되어 왔다 (미국 특허 번호 5,047,335; 5,510,261 및 5,278,299). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화는 예를 들어 엔도글리코시다제 H (엔도 H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 이용하여 당단백질로부터 효소에 의해 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 폴리사카라이드의 가공시에 결함이 있도록 유전자 조작될 수 있다. 이러한 기술 및 유사 기술은 당업계에 공지되어 있다.
다른 변형 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 커플링 기술을 이용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들어 면역검정을 위한 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 당업계의 확립된 절차를 사용하여 변형된 폴리펩티드가 제조되고, 당업계에 공지된 표준 검정을 이용하여 스크리닝될 수 있으며, 그의 일부가 아래 및 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 인간 Fc 감마 수용체에 대해 친화도가 증가된 불변 영역을 포함하고, 면역적으로 불활성 또는 부분적으로 불활성이며, 예를 들어 보체 매개 용해을 촉발시키지 않거나, 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않거나, 또는 소교세포를 활성화하지 않거나; 또는 보체 매개 용해 촉발, 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 자극, 또는 소교세포 활성화 중 어느 하나 이상에서 (변형되지 않은 항체에 비해) 활성을 감소시킨다. 불변 영역의 상이한 변형을 사용하여 최적 수준 및/또는 이펙터 기능의 조합을 달성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995; Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996; Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000; Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; 및 Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 영국 특허 출원 번호 9809951.8에 기재된 바와 같이 변형된다. 다른 실시양태에서, 항체는 A330P331 → S330S331 (아미노산 넘버링은 야생형 IgG2 서열에 대한 것임)의 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2 불변 영역을 포함한다. 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]. 또 다른 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결 글리코실화에 대하여 글리코실화되지 않는다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 글리코실화된 아미노산 잔기 또는 불변 영역 내 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 플랭킹 잔기를 돌연변이시켜서 N-연결 글리코실화에 대하여 글리코실화되지 않는다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은 A, Q, K 또는 H로 돌연변이될 수 있다. 문헌 [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; 및 Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결 글리코실화에 대하여 글리코실화되지 않는다. 불변 영역은 효소적으로 (예컨대, 효소 PNGase에 의해 탄수화물을 제거함), 또는 글리코실화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결 글리코실화에 대하여 글리코실화되지 않을 수 있다.
다른 항체 변형은 PCT 공개 번호 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자에서 지시된 결합 도메인 외에, 인간 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역 전부 또는 일부에 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이러한 항체는 유의한 보체 의존성 용해, 또는 표적의 세포-매개 파괴를 촉발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 이뮤노글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기초로 한다. 이러한 방식으로 변형된 항체는 종래의 항체 요법에 대한 염증성 반응 및 기타 유해 작용을 피하기 위해 장기간의 항체 요법에서 사용하는데 특히 적합하다.
본 발명은 친화도 성숙 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, 1992; Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al., Gene, 169:147-155, 1995; Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9, 1995, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896, 1992]; 및 PCT 공개 번호 WO2004/058184).
하기 방법이 항체의 친화도를 조정하고 CDR을 특성화는데 이용될 수 있다. 항체의 CDR을 특성화하고/거나 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화도를 변경 (예컨대, 개선)시키는 한가지 방식은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"이라 불리는 것이다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 다음과 같이 수행한다. CDR 내의 1개 이상의 아미노산 위치가 당업계에 인지된 방법을 이용하여 2개 이상 (예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 아미노산으로 대체된다. 이것으로 클론의 소형 라이브러리가 생성되는데 (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나씩), 각각은 2개 이상의 구성원의 복합도를 갖는다 (2개 이상의 아미노산이 모든 위치마다 치환되는 경우). 일반적으로, 라이브러리는 또한 천연 (치환되지 않은) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각 라이브러리로부터 적은 수의 클론, 예를 들어 약 20-80개의 클론 (라이브러리의 복합도에 따라 달라짐)을 표적 폴리펩티드 (또는 다른 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝하고, 결합이 증가되었거나 동일하거나 감소되었거나 또는 결합되지 않은 후보물을 확인한다. 결합 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 약 2배 이상의 결합 친화도의 차이를 검출하는 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 분석을 이용하여 결합 친화도를 결정할 수 있다. 비아코어™는 출발 항체가 이미 비교적 높은 친화도, 예를 들어 약 10 nM 이하의 KD로 결합하는 경우에 특히 유용하다. 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명을 이용한 스크리닝이 본원의 실시예에 기재되어 있다.
결합 친화도는 키넥사 바이오센서(Kinexa Biocensor), 섬광 근접 검정, ELISA, 오리겐(ORIGEN) 면역검정 (이겐(IGEN)), 형광 켄칭, 형광 전달 및/또는 효모 디스플레이를 이용하여 결정될 수 있다. 결합 친화도는 적합한 생물검정을 이용하여 스크리닝될 수도 있다.
일부 실시양태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치가 당업계에 인지된 돌연변이유발 방법 (일부는 본원에 기재됨)을 이용하여 모든 20종의 천연 아미노산으로 대체된다 (일부 실시양태에서, 한번에 하나씩). 이것으로 클론의 소형 라이브러리가 생성되는데 (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나씩), 각각은 20개 구성원의 복합도를 갖는다 (모든 20종의 아미노산이 모든 위치마다 치환되는 경우).
일부 실시양태에서, 스크리닝될 라이브러리는 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함하고, 이는 동일한 CDR 내에 또는 2개 이상의 CDR 내에 존재할 수 있다. 따라서, 라이브러리는 하나의 CDR 중 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR에서 발견되는 3, 4, 5개 또는 그 초과의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 치환은 낮은 중복도의 코돈을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Balint et al., Gene 137(1):109-18, 1993]의 표 2를 참조한다.
CDR은 CDRH3 및/또는 CDRL3일 수 있다. CDR은 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3 중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 또는 확장된 CDR일 수 있다.
결합이 개선된 후보를 서열분석함으로써, 친화도가 개선된 (치환이 "개선된" 것이라 불리기도 함) CDR 치환 돌연변이체를 확인할 수 있다. 결합하는 후보는 또한 서열분석함으로써 결합이 유지되는 CDR 치환을 확인할 수 있다.
다중 라운드에 걸친 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 개선된 결합을 갖는 후보 (각각 1개 이상의 CDR의 1개 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함함)은 각각의 개선된 CDR 위치 (즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타내는 CDR 내의 아미노산 위치)에서 적어도 원래 아미노산 및 치환된 아미노산을 함유하는 제2 라이브러리를 설계하는데에도 유용하다. 이 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선택은 하기에 추가로 논의된다.
또한, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은, 결합이 개선되거나 동일하거나 감소되거나 또는 결합되지 않은 클론의 빈도가 또한 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각각의 아미노산 위치의 중요성과 관련이 있는 정보를 제공하는 한은 CDR을 특징규명하는 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 한 위치가 모든 20종의 아미노산으로 변화된 경우에도 결합을 유지한다면, 상기 위치는 항원 결합에 있어서 필요할 것 같지 않은 위치로서 확인된다. 반대로, CDR의 한 위치가 적은 백분율의 치환에서만 결합을 유지한다면, 상기 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로서 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 방법은, 다수의 상이한 아미노산 (예를 들어, 모든 20종의 아미노산)으로 변화될 수 있는 CDR 내의 위치, 및 변화될 수 없거나 단지 몇개의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 생성한다.
개선된 친화도를 갖는 후보는 그 위치에서 개선된 아미노산, 본래 아미노산을 포함하는 제2 라이브러리 중 조합될 수 있고, 목적하는 스크리닝 또는 선택 방법을 사용하여 목적하는, 또는 허용되는 라이브러리의 복합성에 따라 그 위치에서 추가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 원하는 경우에, 인접한 아미노산 위치는 적어도 2개 이상의 아미노산에 대해 랜덤화될 수 있다. 인접한 아미노산의 랜덤화는 돌연변이체 CDR 중 추가 형태 가요성을 허용할 수 있고, 이는 대규모의 돌연변이의 개선의 도입을 차례로 허용하거나 또는 용이하게 할 수 있다. 라이브러리는 제1 라운드의 스크리닝에서 개선된 친화도를 나타내지 않는 위치에서의 치환을 포함할 수도 있다.
비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 분석을 이용한 스크리닝, 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 선택 방법을 이용한 선택을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여, 결합 친화도가 개선되고/되거나 변경된 라이브러리 구성원에 대해 제2 라이브러리를 스크리닝 또는 선택한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열 1, 3, 6, 7, 8, 10 및 12에 나타낸 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 인접한 아미노산 및/또는 서열 2, 4, 5, 9, 11 및 13에 나타낸 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열 1 및 2, 3 및 4, 3 및 5, 6 및 5, 7 및 5, 8 및 9, 10 및 11, 및 12 및 13으로부터 선택된 임의의 서열 쌍에서 나타난 바와 같은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 1개 이상의 CDR(들)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 CDR H3 (VH CDR3) 및/또는 CDR L3 (VL CDR3)을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 융합 단백질은 하나 이상의 항체, 및 천연 분자에서는 부착되지 않는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어 이종 서열 또는 또 다른 영역으로부터의 상동성 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열은 "태그", 예컨대 플래그 태그 또는 6His 태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 태그는 당업계에 공지되어 있다.
융합 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 합성 방식으로 또는 재조합적으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기재된 재조합 방법을 이용하여 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 제조될 수 있지만, 당업계에 공지된 기타 수단, 예를 들어 화학적 합성에 의해 제조될 수도 있다.
본 발명은 또한 고체 지지체 (예컨대 비오틴 또는 아비딘)에 대한 커플링을 용이하게 하는 작용제에 접합된 (예를 들어, 연결된) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 간략하게 하기 위해, 일반적으로 항체를 언급할 것이고, 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 Trop-2 항체 실시양태에 적용된다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 접합은 본원에 기재된 바와 같은 성분들을 연결시키는 것을 지칭한다. 연결 (일반적으로, 적어도 투여를 위해 이러한 성분들을 근접한 관계로 고정시킴)은 임의의 수의 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 작용제 및 항체가 각각 서로 반응할 수 있는 치환기를 보유하는 경우에, 이러한 작용제와 항체 사이의 직접 반응이 가능하다. 예를 들어, 한쪽의 친핵성 기, 예컨대 아미노 또는 술프히드릴 기는, 다른쪽의 카르보닐-함유 기, 예컨대 무수물 또는 산 할라이드, 또는 양호한 이탈기 (예를 들어, 할라이드)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 (또는 조성물, 제약 조성물 포함)를 제공한다: m7E6, h7E6, h7E6_SVG, h7E6_SVG1, h7E6_SVG2, h7E6_SVG3, h7E6_SVG4, h7E6_SVG5, h7E6_SVG6, h7E6_SVG7, h7E6_SVG8, h7E6_SVG9, h7E6_SVG10, h7E6_SVG11, h7E6_SVG12, h7E6_SVG13, h7E6_SVG14, h7E6_SVG15, h7E6_SVG16, h7E6_SVG17, h7E6_SVG18, h7E6_SVG19, h7E6_SVG20, h7E6_SVG21, h7E6_SVG22, h7E6_SVG23, h7E6_SVG24, h7E6_SVG25, h7E6_SVG26, h7E6_SVG27, h7E6_SVG28, h7E6_SVG29, h7E6_SVG30, h7E6_SVG31, h7E6_SVG32, h7E6_SVGL, h7E6_SVGL1, h7E6_SVGL2, h7E6_SVGL3, h7E6_SVGL4, h7E6_SVGL5, h7E6_SVGN, m6G11, h6G11, h6G11_FKG_SF, 또는 Trop-2에 결합하는 능력을 갖는 그의 임의의 단편 또는 부분.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체 (항체 단편 포함) 및 폴리펩티드, 예컨대 이펙터 기능이 손상된 항체 및 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 절차에 따라 제조 및 발현될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 (예컨대, 제약 조성물)을 제공한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 임의의 본원에 기재된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 15 및 서열 14에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다.
m7E6 중쇄 가변 영역
Figure pct00032
m7E6 경쇄 가변 영역
Figure pct00033
다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 17 및 서열 16에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다.
h7E6 중쇄 가변 영역
Figure pct00034
h7E6 경쇄 가변 영역
Figure pct00035
또 다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 18 및 서열 16에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다.
h7E6_SVG 중쇄 가변 영역
Figure pct00036
h7E6_SVG 경쇄 가변 영역
Figure pct00037
다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 18 및 서열 19에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다.
h7E6_SVGL 중쇄 가변 영역
Figure pct00038
h7E6_SVGL 경쇄 가변 영역
Figure pct00039
또 다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 18 및 서열 20에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다.
h7E6_SVGN 중쇄 가변 영역
Figure pct00040
h7E6_SVGN 경쇄 가변 영역
Figure pct00041
다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 25 및 서열 20에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다.
h6G11_FKG_SF 중쇄 가변 영역
Figure pct00042
h6G11_FKG_SF 경쇄 가변 영역
Figure pct00043
다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 22 및 서열 21에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다.
m6G11 중쇄 가변 영역
Figure pct00044
m6G11 경쇄 가변 영역
Figure pct00045
다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 24 및 서열 23에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다를 포함한다.
h6G11 중쇄 가변 영역
Figure pct00046
h6G11 경쇄 가변 영역
Figure pct00047
발현 벡터, 및 폴리뉴클레오티드 조성물의 투여는 본원에서 추가로 기재된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 1:1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 그의 부분을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수도 있고, 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩되는 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩되는 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 하여 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 적어도 약 70%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 80%의 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90%의 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 이들 2개의 서열 내 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 하기하는 바와 같이 최대한 상응하게 정렬된 경우 동일하다면 "동일"하다고 한다. 전형적으로, 2개의 서열 사이의 비교는 비교 윈도우에서 서열들을 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비교 윈도우"는 약 20개 이상의 인접 위치, 일반적으로는 30 내지 약 75개, 또는 40 내지 약 50개 인접 위치의 절편을 지칭하고, 여기서 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후에 서열을 인접 위치의 수가 동일한 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 디폴트 파라미터를 사용하여 바이오인포매틱스 소프트웨어 (디엔에이스타, 인크.(DNASTAR, Inc.), 위스콘신주 매디슨)의 레이저진(Lasergene) 스위트 내의 메갈린(Megalign) 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로그램은 하기 참고문헌에 기재된 여러 정렬 기법을을 구현한다: 문헌 [Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].
바람직하게는, "서열 동일성 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에서 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교하여 결정되고, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 일반적으로는 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 참조 서열 내의 위치의 총 수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 또한 또는 대안적으로, 천연 유전자, 또는 그의 일부 또는 상보체에 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항체를 코딩하는 자연 발생 DNA 서열 (또는 상보적 서열)에 중간 정도의 엄격한 조건 하에 혼성화될 수 있다.
적절한 " 중간 정도의 엄격한 조건"은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액에서 예비세정하고; 50℃-65℃, 5 X SSC에서 밤새 혼성화시킨 후; 0.1 % SDS를 함유하는 각각의 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 65℃에서 20분 동안 2회 세정하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고엄격도 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 사용하거나, (2) 혼성화 동안에 42℃에서 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 함유하는 50% (v/v) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하거나, 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용하고 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 중에 및 55℃에서 50% 포름아미드 중에 세척한 후에, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC로 이루어진 고엄격도 세척을 수행한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 알 것이다.
유전자 코드의 축중성으로 인해 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 여럿 존재한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 구체적으로 고려된다. 추가로, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범위 내에 속한다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 구조 또는 기능이 변경될 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술 (예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 확인될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR로 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 상세하게 기술될 필요가 없다. 당업자는 본원에서 제공되는 서열 및 시판되는 DNA 합성기를 사용하여 원하는 DNA 서열을 생성할 수 있다.
재조합 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우에, 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 원하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내에 삽입할 수 있고, 이어서 상기 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-접합 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입하여 세포를 형질전환시킨다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 일단 도입되면 세포 내에서 비-통합 벡터 (예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수도 있고, 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수도 있다. 이와 같이 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다.
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생산을 허용한다. PCR 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202, 뿐만 아니라 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 적합한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하여 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989, 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 RNA를 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구축될 수도 있고, 또는 당업계에서 이용가능한 수많은 클로닝 벡터로부터 선택될 수도 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제 능력을 갖고/갖거나 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선별하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript) (예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이러한 클로닝 벡터 및 다수의 기타 클로닝 벡터는 바이오라드(BioRad), 스트라테진(Strategene) 및 인비트로젠(Invitrogen)과 같은 판매업체로부터 입수가능하다.
일반적으로, 발현 벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 이것은, 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하여야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 포함), 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 1개 이상의 마커 유전자, 적합한 전사 제어 요소 (예컨대, 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)에는 일반적으로 1개 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈도 필요하다.
관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 기타 물질을 사용한 형질감염, 마이크로프로젝타일(microprojectile) 충격, 리포펙션, 및 감염 (예를 들어, 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 임의의 수많은 적절한 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 달라진다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과다발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하는 목적에 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비-제한적인 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. PCT 공개 번호 WO 87/04462를 또한 참조한다. 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵생물 (예컨대, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스(B. subtillis)) 및 효모 (예컨대, 에스. 세레비지아에(S. cerevisae) 및 에스. 폼베(S. pombe) 또는 케이. 락티스(K. lactis))를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내에 상응하는 관심 내인성 항체 또는 단백질이 존재한다면, 이들보다 약 5배 더 높은 수준, 보다 바람직하게는 10배 더 높은 수준, 보다 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. Trop-2 또는 Trop-2 도메인 (예를 들어, 도메인 1-4)에 대한 특이적 결합을 위한 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역검정 또는 FACS에 의해 수행된다. 관심 항체 또는 단백질을 과다발현하는 세포가 확인될 수 있다.
Trop-2 항체 접합체
본 발명은 또한 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 접합체 (또는 면역접합체)를 제공하며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 표적화된 면역요법 (예를 들어, 항체-약물 접합체)을 위한 작용제 (예를 들어, 세포독성제)에 접합된다. 예를 들어, 세포독성제는 종양 (예를 들어, Trop-2 발현 종양)에 대한 세포독성제 모이어티의 표적화된 국부 전달을 위해 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 연결되거나 이에 접합될 수 있다.
세포독성제 또는 다른 치료제를 항체에 접합시키는 방법은 다양한 공개문에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 변형이 접합 반응이 일어나도록 하기 위핸 쇄간 디술피드 결합을 환원시킴으로써 활성화된 리신 측쇄 아민 또는 시스테인 술프히드릴 기를 통해 항체에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, 2005, 및 Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004]을 참조한다. 한정된 화학량론을 갖는 특정 약물 접합을 위해 항체의 특정 부위에서 조작된 반응성 시스테인 잔기가 또한 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008]을 참조한다. 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 내인성 글루타민을 사용하는 접합은 트랜스글루타미나제의 존재 하의 폴리펩티드 조작에 의해 반응성 (즉, 아실 공여자로서 공유 결합을 형성하는 능력)으로 되고, 아민 (예를 들어, 반응성 아민을 포함하거나 이에 부착된 세포독성제)이 또한 국제 특허 출원 일련 번호 PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 항체의 특정 부위 (예를 들어, 카르복실 말단, 아미노 말단, 또는 Trop-2 항체 내의 또 다른 부위)에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 태그는 아미노산 글루타민 (Q) 또는 아미노산 서열 GGLLQGG (서열 78), LLQGA (서열 79), GGLLQGA (서열 81), LLQ, LLQGPGK (서열 90), LLQGPG (서열 91), LLQGPA (서열 92), LLQGP (서열 93), LLQP (서열 94), LLQPGK (서열 95), LLQGAPGK (서열 96), LLQGAPG (서열 97), LLQGAP (서열 98), LLQX1X2X3X4X5 (여기서, X1은 G 또는 P이고, X2는 A, G, P이거나 또는 부재하고, X3은 A, G, K, P이거나 또는 부재하고, X4는 K, G이거나 또는 부재하고, X5는 K이거나 또는 부재함) (서열 88) 또는 LLQX1X2X3X4X5 (여기서, X1은 임의의 자연 발생 아미노산이고, X2, X3, X4 및 X5는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재함) (서열 89)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 항체의 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하고, 여기서 태그는 Trop-2 항체의 경쇄 카르복실 말단에서 조작된 아미노산 서열 GGLLQGG (서열 78)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 항체의 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하고, 여기서 태그는 Trop-2 항체의 경쇄 카르복실 말단에서 조작된 아미노산 서열 GGLLQGA (서열 81)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 항체의 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하고, 여기서 태그는 Trop-2 항체의 중쇄 카르복실 말단에서 조작된 아미노산 서열 LLQGA (서열 79)를 포함하고, 중쇄 카르복실 말단에서의 리신 잔기가 결실된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 항체의 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하며, 여기서 태그는 Trop-2 항체의 중쇄 카르복실 말단에서 조작된 아미노산 서열 LLQ를 포함하고, 중쇄 카르복실 말단에서의 리신 잔기는 결실된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 Trop-2 항체의 위치 297에서 아스파라긴 (N)으로부터 글루타민 (Q)으로의 아미노산 치환을 포함한다.
또한 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222, 340 또는 370 (카바트 넘버링 방식)에서의 아미노산 변형을 포함하는 단리된 항체가 제공되며, 여기서 변형은 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이, 또는 그의 임의의 조합이다. 따라서, 일부 실시양태에서, Trop-2 항체의 특정 부위 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 카르복실 말단 또는 또 다른 부위)에 접합된 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예를 들어, Q, GGLLQGG (서열 78), LLQGA (서열 79), GGLLQGA (서열 81), LLQ, LLQGPGK (서열 90), LLQGPG (서열 91), LLQGPA (서열 92), LLQGP (서열 93), LLQP (서열 94), LLQPGK (서열 95), LLQGAPGK (서열 96), LLQGAPG (서열 97), LLQGAP (서열 98), LLQX1X2X3X4X5 (여기서, X1은 G 또는 P이고, X2는 A, G, P이거나 또는 부재하고, X3은 A, G, K, P이거나 또는 부재하고, X4는 K, G이거나 또는 부재하고, X5는 K이거나 또는 부재함) (서열 88), 또는 LLQX1X2X3X4X5 (여기서, X1은 임의의 자연 발생 아미노산이고, X2, X3, X4 및 X5는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 부재함) (서열 89)) 및 항체의 위치 222, 340, 또는 370 (카바트 넘버링 방식)에서의 아미노산 변형을 포함하는 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변형은 리신으로부터 아르기닌으로의 치환이다 (예를 들어, K222R, K340R, 또는 K370R). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 Trop-2 항체 경쇄의 C-말단에서 조작된 서열 GGLLQGG (서열 78)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222 (카바트 넘버링 방식)에서의 아미노산 리신으로부터 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 Trop-2 항체 경쇄의 C-말단에서 조작된 서열 GGLLQGA (서열 81)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222 (카바트 넘버링 방식)에서의 아미노산 리신으로부터 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 Trop-2 항체 중쇄의 C-말단에서 조작된 서열 LLQGA (서열 79)를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222 (카바트 넘버링 방식)에서의 아미노산 리신으로부터 아르기닌으로의 치환을 포함하며, 여기서 중쇄 카르복실 말단에서의 리신 잔기가 결실된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 Trop-2 항체 중쇄의 C-말단에서 조작된 서열 LLQ를 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222 (카바트 넘버링 방식)에서의 아미노산 리신으로부터 아르기닌으로의 치환을 포함하며, 여기서 중쇄 카르복실 말단에서의 리신 잔기가 결실된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 접합체는 Trop-2 항체의 위치 297에서 조작된 글루타민을 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그 및 항체의 위치 222 (카바트 넘버링 방식)에서의 아미노산 리신으로부터 아르기닌으로의 치환을 포함한다.
본 발명의 Trop-2 항체 또는 항원 결합 단편에 접합될 수 있는 작용제는 세포독성제, 면역 조절제, 영상화제, 치료 단백질, 생체중합체 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
세포독성제의 예는 안트라시클린, 아우리스타틴, 돌라스타틴, CC-1065, 두오카르마이신, 에네디인, 겔다나마이신, 메이탄신, 퓨로마이신, 탁산, 빈카 알칼로이드, SN-38, 튜부리신, 헤미아스텔린, 및 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
안트라시클린은 박테리아 스트렙토미세스(Strepomyces)로부터 유래되고, 광범위한 암, 예컨대 백혈병, 림프종, 유방, 자궁, 난소 및 폐 암을 치료하는데 사용되었다. 예시적인 안트라시클린은 다우노루비신, 독소루비신 (즉, 아드리아마이신), 에피루비신, 이다루비신, 발루비신 및 미톡산트론을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
돌라스타틴 및 그의 펩티드성 유사체 및 유도체, 아우리스타틴은 항암 및 항진균 활성을 갖는 것으로 밝혀진 고도로 강력한 항유사분열제이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,663,149 및 문헌 [Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, 1998]을 참조한다. 예시적인 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 돌라스타틴 10, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 EB (AEB), 아우리스타틴 EFP (AEFP), MMAD (모노메틸 아우리스타틴 D 또는 모노메틸 돌라스타틴 10), MMAF (모노메틸 아우리스타틴 F 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-페닐알라닌), MMAE (모노메틸 아우리스타틴 E 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-노르에페드린), 5-벤조일발레산-AE 에스테르 (AEVB), 및 다른 신규 아우리스타틴 (예컨대, 미국 출원 번호 61/561,255 및 61/676,423에 기재된 것)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 아우리스타틴은 하기 구조를 갖는 0101 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure pct00048
두오카르마이신 및 CC-1065는 세포독성 효력을 갖는 DNA 알킬화제이다. 문헌 [Boger and Johnson, PNAS 92:3642-3649, 1955]을 참조한다. 예시적인 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 (+)-두오카르마이신 A 및 (+)-두오카르마이신 SA 및 (+)-CC-1065 를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
에네디인은 9- 및 10-원 고리 또는 접합된 삼중-이중-삼중 결합의 시클릭 시스템의 존재를 특징으로 하는 일종의 항종양 박테리아 생성물이다. 예시적인 에네디인은 칼리케아미신, 에스페라미신 및 디네미신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
겔다나마이신은 Hsp90 (열 쇼크 단백질 90)에 결합하는 벤조퀴논 안사마이신 항생제이고, 항종양 약물로 사용되었다. 예시적인 겔다나마이신은 17-AAG (17-N-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신) 및 17-DMAG (17-디메틸아미노에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
메이탄신 또는 그의 유도체 메이탄시노이드는 유사분열 동안 튜불린의 중합의 억제를 통하여 미세관 형성을 억제함으로써 세포 증식을 억제한다. 문헌 [Remillard et al., Science 189:1002-1005, 1975]을 참조한다. 예시적인 메이탄신 및 메이탄시노이드는 메르탄신 (DM1) 및 그의 유도체 뿐만 아니라 안사미토신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
탁산은 항-튜불린 작용제 또는 유사분열 억제제로서 작용하는 디테르펜이다. 예시적인 탁산은 파클리탁셀 (예를 들어, 탁솔(TAXOL)®) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
빈카 알킬로이드는 또한 항-튜불린 작용제이다. 예시적인 빈카 알킬로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제는 면역조절제이다. 면역조절제의 예는 강시클로비에르, 에타네르셉트, 타크롤리무스, 시롤리무스, 보클로스포린, 시클로스포린, 라파마이신, 시클로포스파미드, 아자티오프린, 미코페놀게이트 모페틸, 메토트렉트레이트, 글루코코르티코이드 및 그의 유사체, 시토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 종양 괴사 인자 (TNF), 조혈 인자, 인터류킨 (예를 들어, 인터류킨-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 및 IL-21), 콜로니 자극 인자 (예를 들어, 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF)), 인터페론 (예를 들어, 인터페론-α, -β 및 -γ), 줄기 세포 성장 인자 ("S 1 인자"로 지정됨), 에리트로포이에틴 및 트롬보포이에틴 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제는 영상화제 (예를 들어, 형광단 또는 PET (양전자 방출 단층촬영) 표지, SPECT (단일-광자 방사 컴퓨터 단층촬영) 표지) 또는 MRI (자기 공명 영상화) 표지이다.
형광단의 예는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) (예를 들어, 5-FITC), 플루오레세인 아미다이트 (FAM) (예를 들어, 5-FAM), 에오신, 카르복시플루오레세인, 에리트로신, 알렉사 플루오르® (예를 들어, 알렉사 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700, 또는 750), 카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA) (예를 들어, 5,-TAMRA), 테트라메틸로다민 (TMR) 및 술포로다민 (SR) (예를 들어, SR101)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 치료 또는 진단 방사성동위원소 또는 다른 표지 (예를 들어, PET 또는 SPECT 표지)는 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 접합을 위한 작용제에 혼입될 수 있다. 방사성동위원소 또는 다른 표지의 예는 3H, 11C, 13N, 14C, 15N, 15O, 35S, 18F, 32P, 33P, 47Sc, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 75Se, 76Br, 77Br, 86Y, 89Zr, 90Y, 94Tc, 95Ru, 97Ru, 99Tc, 103Ru, 105Rh, 105Ru, 107Hg, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 121Te, 122Te, 123I, 124I, 125I, 125Te, 126I, 131I, 131In, 133I, 142Pr, 143Pr, 153Pb, 153Sm, 161Tb, 165Tm, 166Dy, 166H, 167Tm, 168Tm, 169Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 197Pt, 198Au, 199Au, 201Tl, 203Hg, 211At, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra, 224Ac 및 225Ac를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제는 독소, 호르몬, 효소 및 성장 인자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 치료 단백질이다.
독소 단백질 (또는 폴리펩티드)의 예는 디프테리아 (예를 들어, 디프테리아 A 쇄), 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 및 내독소, 리신 (예를 들어, 리신 A 쇄), 아브린 (예를 들어, 아브린 A 쇄), 모데신 (예를 들어, 모데신 A 쇄), 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 리보뉴클레아제 (RNase), DNase I, 스타필로코쿠스 장독소-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테린 독소, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 트리코테센, 억제제 시스틴 노트 (ICK) 펩티드 (예를 들어, 세라토톡신), 및 코노톡신 (예를 들어, KIIIA 또는 SmIIIa)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제는 생체적합성 중합체이다. 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 항원 결합 단편은 혈청 반감기 및 생물활성을 증가시키고/또는 생체내 절반-생존을 확장하기 위해 생체적합성 중합체에 접합될 수 있다. 생체적합성 중합체의 예는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 그의 유도체 및 쯔비터이온-함유 생체적합성 중합체 (예를 들어, 포스포릴콜린 함유 중합체)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 작용제는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 접합체를 제공하며, 여기서 접합체는 식: 항체-(아실 공여자 글루타민-함유 태그)-(링커)-(세포독성제)를 포함하고, 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 항체 또는 항원 결합 단편의 특정 부위 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 카르복실 말단 또는 또 다른 부위)에서 조작되고, 태그는 링커 (예를 들어, 1개 이상의 반응성 아민 (예를 들어, 1급 아민 NH2)을 함유하는 링커)에 접합되고, 링커는 세포독성제 (예를 들어, MMAD 또는 다른 아우리스타틴, 예컨대 0101)에 접합된다.
1개 이상의 반응성 아민을 함유하는 링커의 예는 아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (AcLys-VC-PABC) 또는 아미노 PEG6-프로피오닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 WO2012/059882를 참조한다.
일부 실시양태에서, 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 GGLLQGG (서열 78), LLQGA (서열 79), GGLLQGA (서열 81), LLQ, LLQGPGK (서열 90), LLQGPG (서열 91), LLQGPA (서열 92), LLQGP (서열 93), LLQP (서열 94), LLQPGK (서열 95), LLQGAPGK (서열 96), LLQGAPG (서열 97), LLQGAP (서열 98), LLQX1X2X3X4X5 (여기서, X1은 G 또는 P이고, X2는 A, G, P이거나 또는 부재하고, X3은 A, G, K, P이거나 또는 부재하고, X4는 K, G이거나 또는 부재하고, X5는 K이거나 또는 부재함) (서열 88), 또는 LLQX1X2X3X4X5 (여기서, X1은 임의의 자연 발생 아미노산이고, X2, X3, X4 및 X5는 임의의 자연 발생 아미노산이거나 또는 부재함) (서열 89)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 접합체는 1) 항체-LLQGA (서열 79)-AcLys-VC-PABC-0101; 2) 항체-LLQGA (서열 79)-AcLys-VC-PABC-MMAD; 3) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-AcLys-VC-PABC-0101; 4) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-AcLys-VC-PABC-MMAD; 5) 항체-GGLLQGG (서열 78)-AcLys-VC-PABC-0101; 및 6) 항체-GGLLQGG (서열 78)-AcLys-VC-PABC-MMAD이다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 LLQ, 서열 79, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 또는 98을 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 항체 중쇄의 C-말단에서 조작되고, C-말단에서의 리신 잔기는 결실된다. 다른 실시양태에서, 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예를 들어, GGLLQGG (서열 78))는 항체의 경쇄의 C-말단에서 조작된다. 항체의 예는 h7E6_SVG, h7E6_SVG1, h7E6_SVG2, h7E6_SVG3, 및 h7E6_SVG4, h7E6_SVG5, h7E6_SVG6, h7E6_SVG7, h7E6_SVG8, h7E6_SVG9, h7E6_SVG10, h7E6_SVG11, h7E6_SVG12, h7E6_SVG13, h7E6_SVG14, h7E6_SVG15, h7E6_SVG16, h7E6_SVG17, h7E6_SVG18, h7E6_SVG19, h7E6_SVG20, h7E6_SVG21, h7E6_SVG22, h7E6_SVG23, h7E6_SVG24, h7E6_SVG25, h7E6_SVG26, h7E6_SVG27, h7E6_SVG28, h7E6_SVG29, h7E6_SVG30, h7E6_SVG31, h7E6_SVG32, h7E6_SVGL, h7E6_SVGL1, h7E6_SVGL2, h7E6_SVGL3, h7E6_SVGL4, h7E6_SVGL5, h7E6SVGN, h6G11, 또는 h6G11_FKG_SF를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 변형에서, 접합체는 위치 222에서 아미노산 리신으로부터 아르기닌으로의 치환을 추가로 포함한다. 따라서, 예를 들어, 접합체는 1) 항체-GGLLQGG (서열 78)-AcLys-VC-PABC-MMAD이며 K222R를 포함하고; 2) 항체-GGLLQGG (서열 78)-AcLys-VC-PABC-0101이며 K222R을 포함하고; 3) 항체-LLQGA (서열 79)-AcLys-VC-PABC-0101이며 K222R을 포함하고; 4) 항체-LLQGA (서열 79)-AcLys-VC-PABC-MMAD이며 K222R을 포함하고; 5) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-AcLys-VC-PABC-MMAD이며 K222R을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, LLQ, 서열 79, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 또는 98을 포함하는 아실 공여자 글루타민-함유 태그는 항체 중쇄의 C-말단에서 조작되고, 여기서 C-말단에서의 리신 잔기가 결실된다. 다른 실시양태에서, 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예를 들어, GGLLQGG (서열 78))는 항체의 경쇄의 C-말단에서 조작된다. 항체의 예는 h7E6_SVG, h7E6_SVG1, h7E6_SVG2, h7E6_SVG3, 및 h7E6_SVG4, h7E6_SVG5, h7E6_SVG6, h7E6_SVG7, h7E6_SVG8, h7E6_SVG9, h7E6_SVG10, h7E6_SVG11, h7E6_SVG12, h7E6_SVG13, h7E6_SVG14, h7E6_SVG15, h7E6_SVG16, h7E6_SVG17, h7E6_SVG18, h7E6_SVG19, h7E6_SVG20, h7E6_SVG21, h7E6_SVG22, h7E6_SVG23, h7E6_SVG24, h7E6_SVG25, h7E6_SVG26, h7E6_SVG27, h7E6_SVG28, h7E6_SVG29, h7E6_SVG30, h7E6_SVG31, h7E6_SVG32, h7E6_SVGL, h7E6_SVGL1, h7E6_SVGL2, h7E6_SVGL3, h7E6_SVGL4, h7E6_SVGL5, h6G11, 또는 h6G11_FKG_SF를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 접합체를 제공하며, 여기서 접합체는 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환, 아미노-PEG6-프로피오닐을 포함하는 링커 및 세포독성제 (예를 들어, MMAD 또는 다른 아우리스타틴)를 포함한다. 예를 들어, 접합체는 아미노-PEG6-프로피오닐 및 MMAD에 접합하는 h7E6_SVG, h7E6_SVG1, h7E6_SVG2, h7E6_SVG3, h7E6_SVG4, h7E6_SVG5, h7E6_SVG6, h7E6_SVG7, h7E6_SVG8, h7E6_SVG9, h7E6_SVG10, h7E6_SVG11, h7E6_SVG12, h7E6_SVG13, h7E6_SVG14, h7E6_SVG15, h7E6_SVG16, h7E6_SVG17, h7E6_SVG18, h7E6_SVG19, h7E6_SVG20, h7E6_SVG21, h7E6_SVG22, h7E6_SVG23, h7E6_SVG24, h7E6_SVG25, h7E6_SVG26, h7E6_SVG27, h7E6_SVG28, h7E6_SVG29, h7E6_SVG30, h7E6_SVG31, h7E6_SVG32, h7E6_SVGL, h7E6_SVGL1, h7E6_SVGL2, h7E6_SVGL3, h7E6_SVGL4, h7E6_SVGL5, h6G11 또는 h6G11_FKG_SF, 또는 아미노-PEG6-프로피오닐 및 0101에 접합하는 h7E6_SVG, h7E6_SVG1, h7E6_SVG2, h7E6_SVG3, h7E6_SVG4, h7E6_SVG5, h7E6_SVG6, h7E6_SVG7, h7E6_SVG8, h7E6_SVG9, h7E6_SVG10, h7E6_SVG11, h7E6_SVG12, h7E6_SVG13, h7E6_SVG14, h7E6_SVG15, h7E6_SVG16, h7E6_SVG17, h7E6_SVG18, h7E6_SVG19, h7E6_SVG20, h7E6_SVG21, h7E6_SVG22, h7E6_SVG23, h7E6_SVG24, h7E6_SVG25, h7E6_SVG26, h7E6_SVG27, h7E6_SVG28, h7E6_SVG29, h7E6_SVG30, h7E6_SVG31, h7E6_SVG32, h7E6_SVGL, h7E6_SVGL1, h7E6_SVGL2, h7E6_SVGL3, h7E6_SVGL4, h7E6_SVGL5, h6G11 또는 h6G11_FKG_SF이다.
Trop-2 항체 및 그의 항체 접합체를 사용하는 방법
본 발명의 항체 및 항체 접합체는 치유적 치료 방법 및 진단적 치료 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 적용에 유용하다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 Trop-2 발현과 연관된 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 Trop-2 발현과 연관된 상태를 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. Trop-2 발현과 연관된 상태는 비정상적 Trop-2 발현, 변경된 또는 이상 Trop-2 발현, Trop-2 과다발현, 및 증식성 장애 (예를 들어, 암)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 일부 실시양태에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 사용된 암은 방광, 유방, 자궁경부, 융모막암종, 결장, 식도, 위, 교모세포종, 두경부, 신장, 폐, 경구, 난소, 췌장, 전립선 및 피부 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, Trop-2 발현 암 세포의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Trop-2 발현 암 세포의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, Trop-2 발현 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Trop-2 발현 종양 퇴행을 유도하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, Trop-2 발현과 연관된 상태를 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법에 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 Trop-2 항체는 검출가능한 모이어티, 예컨대 영상화제 및 효소-기질 표지로 표지될 수 있다. 본원에 기재된 항체는 또한 생체내 진단 검정, 예컨대 생체내 영상화 (예를 들어, PET 또는 SPECT), 또는 염색 시약에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체를 추가의 형태의 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 형태의 요법은 화학요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법 및/또는 추가의 면역요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 항암 요법이다.
일부 실시양태에서, 추가의 형태의 요법은 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체에 더하여 하나 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 치료제는 제2 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체, 항-CD25 항체 및/또는 항-CD20 항체), 혈관신생 억제제, 세포독성제, 항염증제 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 독소루비신, 프레드니손, 미토마이신, 프로게스테론, 타목시펜 또는 플루오로우라실)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체는 임의의 적합한 경로를 통해 개체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 예는 이용가능한 기술을 제한하려는 것이 아니라 예시하기 위한 것임이 당업자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체는 공지된 방법에 따라, 예컨대 예를 들어 볼루스로서의 정맥내 투여 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 두개내, 경피, 피하, 관절내, 설하, 활막내, 취입을 통해, 척수강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 개체에게 투여된다. 투여는 전신성, 예를 들어 정맥내 투여일 수도 있고, 또는 국소화될 수도 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 비롯하여 액체 제제를 위한 상업적으로 입수가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 분무될 수 있고, 동결건조 분말이 재구성 후에 분무될 수 있다. 대안적으로, Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체는 플루오로카본 제제 및 계량 용량 흡입기를 이용하여 에어로졸화될 수도 있고, 또는 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수도 있다.
한 실시양태에서, Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체는 부위-특이적 또는 표적화된 국부 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적화된 국부 전달 기술의 예는 Trop 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 다양한 이식가능한 데포 공급원 또는 국부 전달 카테터, 예컨대 주입 카테터, 유치 카테터, 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외피 랩, 션트 및 스텐트 또는 다른 이식가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사, 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 5,981,568을 참조한다.
Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 다양한 제제가 투여에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체는 그 자체로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, Trop-2 항체 (또는 Trop-2 항체 접합체) 및 제약상 허용되는 부형제가 다양한 제제에 있을 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 약리학상 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 상대적으로 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 점조도를 제공할 수도 있고, 또는 희석제로서 작용할 수도 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 오스몰농도를 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충제 및 피부 침투 증진제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비경구 및 경구 약물 전달을 위한 부형제 뿐만 아니라 제제가 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 이들 작용제는 주사에 의한 (예를 들어, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등의) 투여를 위해 제제화된다. 따라서, 이러한 제제들은 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특정힌 투여 요법, 즉 용량, 시기 및 반복 횟수는 특정한 개체 및 그 개체의 병력에 따라 달라질 것이다.
본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체는 주사 (예를 들어, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등)을 포함하는 임의의 적합한 방법을 이용하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체는 또한 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 투여를 위한 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 전형적인 일일 용량은 상기 언급한 요인에 따라 약 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg, 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg 및 약 25 mg/kg의 투여량이 사용될 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 증상의 원하는 억제가 나타날 때까지 또는 예를 들어 종양 성장/진행 또는 암 세포의 전이를 억제 또는 지연시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투여 요법은 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 초기 용량 약 2 mg/kg으로 투여한 후에 매주 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하거나 2주마다 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하는 것을 포함한다. 다른 예시적인 투여 요법은 증가하는 용량 (예를 들어, 1 mg/kg의 초기 용량 및 매주 또는 보다 긴 기간마다 하나 이상의 보다 높은 용량으로의 점진적 증가)을 포함한다. 진료의가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 또한 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 1주에 1 내지 4회 투여하는 것이 고려된다. 다른 실시양태에서, 1개월에 1회 또는 2개월마다 또는 3개월마다 1회 투여하는 것이 고려된다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법 (사용된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체 포함)은 시간 경과에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 적절한 투여량은 사용된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체 (또는 그의 조성물), 치료될 증상의 유형 및 중증도, 작용제가 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 작용제에 대한 반응, 투여된 작용제에 대한 환자의 제거율, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 투여할 것이다. 용량 및/또는 빈도는 치료 과정에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 반감기와 같은 실험적인 고려사항이 투여량을 결정하는데 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 사용하여, 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있고, 일반적으로 증상의 치료 및/또는 저해 및/또는 개선 및/또는 지연, 예를 들어 종양 성장 억제 또는 지연에 기초하지만 반드시 그렇지는 않다. 대안적으로, Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 지속적인 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 위한 투여량은 Trop-2 항체 또는 그의 Trop-2 항체 접합체의 하나 이상의 투여(들)를 받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체는 Trop-2 항체 또는 Trop-2 길항제의 증진된 투여량을 제공받는다. 효능을 평가하기 위해, 질환의 지표를 따르게 될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료 또는 예방인지의 여부, 및 당업자에게 공지된 기타 인자들에 따라, 연속적 또는 간헐적일 수 있다. Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 간격을 둔 일련의 투여로 수행될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 하나 초과의 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체가 존재할 수 있다. 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종의 상이한 또는 그 초과의 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이들 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 하기 Trop-2 항체 중 하나 이상이 사용될 수 있다: Trop-2 상의 하나의 에피토프에 대해 지시된 제1 Trop-2 항체 및 Trop-2 상의 상이한 에피토프에 대해 지시된 제2 Trop-2 항체.
본 발명에 따라 사용된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 치료 제제는 동결건조 제제 또는 수용액 형태로 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체와 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합하여 저장을 위해 제조된다 (문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005]). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 함유하는 리포솜은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030, 1980]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 방법에 의해서 제조된다. 순환 시간이 증진된 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜을 규정된 기공 크기의 필터를 통해 추출하여 원하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 '폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 놓는다.
본 발명에 따른 조성물은 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제로, 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입을 통해 투여될 수 있다.
고체 조성물, 예컨대 정제를 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 제약 담체, 예를 들어 전형적인 타정 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 제약 희석제, 예를 들어 물과 혼합하여 본 발명의 화합물의 동종 혼합물 또는 그의 무독성 제약상 허용되는 염을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성한다. 이러한 예비제제 조성물이 균질한 것으로서 지칭되는 경우에, 이는 활성 성분이 조성물에 고르게 분포되어 있어서 상기 조성물이 정제, 환제 및 캡슐제와 같은 동일한 유효 단위 투여 형태로 용이하게 세분될 수 있음을 의미한다. 이 고체 예비제제 조성물은 그 후, 본 발명의 활성 성분 0.1 내지 약 500 mg을 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 신규 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나, 그렇지 않으면 배합되어 지속 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있고, 외부 투여 성분은 내부 투여 성분 상의 외피의 형태일 수 있다. 2개의 성분은 위에서의 붕해에 저항하는데 도움을 주고, 내부 성분이 십이지장으로 손상 없이 통과하게 허용하거나 또는 방출이 지연되게 하는 장용 층에 의해서 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 이러한 물질은 다수의 중합체성 산, 및 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질과 중합체성 산과의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성제는 특히, 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어 스판(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5% 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요한 경우에, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)™, 리포신(Liposyn)™, 인포누트롤(Infonutrol)™, 리포푼딘(Lipofundin)™ 및 리피피산(Lipiphysan)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리-혼합된 에멀젼 조성물 중 용해될 수 있거나, 또는 대안적으로 오일 (예를 들어, 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 및 인지질 (예를 들어 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합하여 형성된 에멀젼 중에서 용해될 수 있다. 에멀젼의 등장성을 조정하기 위해, 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스를 첨가할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20%의 오일, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 μm, 특히 0.1 및 0.5 μm의 지방 소적을 포함하고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
에멀젼 조성물은 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합하여 제조될 수 있다.
흡입 또는 취입을 위한 조성물은 제약상 허용되는 수성 또는 유기 용매 또는 그의 혼합물 중 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 기재된 바와 같은 적합한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 구강 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는 멸균 제약상 허용되는 용매 중의 조성물은 기체를 이용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접 호흡될 수도 있고, 또는 분무 장치가 페이스 마스크, 텐트 또는 간헐성 양압 호흡 기계에 부착될 수도 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 제제를 적절한 방식으로 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구로 또는 비내로 투여될 수 있다.
조성물
본 발명의 방법에 사용된 조성물은 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 유효량을 포함한다. 이러한 조성물의 예 뿐만 아니라 제제화방법은 또한 이전 섹션 및 하기에 기재된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 포함한다. 예를 들어, Trop-2 항체는 인간 Trop-2를 인식한다. 일부 실시양태에서, Trop-2 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, Trop-2 항체는 원하는 면역 반응, 예컨대 항체-매개 용해 또는 ADCC를 촉발할 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, Trop-2 항체는 원치않은 또는 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 항체-매개 용해 또는 ADCC를 촉발하지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, Trop-2 항체는 항체의 1개 이상의 CDR(들) (예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 일부 실시양태에서는 모든 6개의 CDR)을 포함한다.
조성물은 하나 초과의 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체 (예를 들어, Trop-2의 상이한 에피토프를 인식하는 Trop-2 항체의 혼합물)를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 하나 초과의 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체, 또는 Trop-2 (예를 들어, 인간 Trop-2)의 다양한 에피토프에 결합하는 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 상이한 종을 포함한다.
본 발명에 사용되는 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다 (문헌 [Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 본원에 추가로 기재되어 있다.
키트
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 포함하는 하나 이상의 용기, 및 본원에 기재된 본 발명의 방법 중 임의의 것에 따른 사용 지침서를 포함한다. 일반적으로, 이러한 지침서는 상기 기재된 치유적 치료를 위해 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체를 투여하는 것에 관한 설명을 포함한다.
본원에 기재된 Trop-2 항체 또는 Trop-2 항체 접합체의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로와 같은 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 대형 포장물 (예를 들어, 다중-용량 포장물) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공되는 지침서는 전형적으로 라벨 또는 포장 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함되어 있는 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기계-판독식 지침서 (예컨대, 자기 또는 광학 저장 디스크상의 지침서) 또한 허용가능하다.
본 발명의 키트는 적합한 포장물로 존재한다. 적합한 포장물은 바이알, 병, 단지, 가요성 포장물 (예를 들어, 밀봉 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 미립화기) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 함께 사용하기 위한 포장물도 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기도 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 하나 이상의 활성제는 Trop-2 항체이다. 용기는 제2의 제약상 활성인 작용제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 설명 정보를 임의로 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다.
돌연변이 및 변형
본 발명의 Trop-2 항체를 발현시키기 위해, 상기 기재된 임의의 방법을 이용하여 VH 및 VL 영역을 코딩하는 DNA 단편을 우선 수득할 수 있다. 또한, 다양한 변형, 예를 들어 돌연변이, 결실 및/또는 부가가 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 DNA 서열에 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발은 표준 방법, 예컨대 PCR-매개 돌연변이유발을 이용하여 수행될 수 있고, 여기서 돌연변이된 뉴클레오티드는 PCR 프라이머 내로 혼입되어 PCR 생성물이 원하는 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이를 함유하게 한다.
예를 들어, 이루어질 수 있는 치환 중 한 유형은 화학적으로 반응성일 수 있는 항체 내 1개 이상의 시스테인을 또 다른 잔기, 예컨대 비제한적으로 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 예를 들어, 비-정규 시스테인의 치환이 있을 수 있다. 치환은 항체의 CDR 또는 가변 도메인의 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 정규 시스테인이다.
항체는 또한 예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 예를 들어, 항체의 결합 특성을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 CDR 영역 중 하나 이상에서 Trop-2에 대한 항체의 KD가 증가 또는 감소하도록, koff가 증가 또는 감소하도록, 또는 항체의 결합 특이성이 변경되도록 만들어질 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발의 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. 및 Ausubel et al., 상기 문헌]을 참조한다.
변형 또는 돌연변이는 또한 Trop-2 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/09560을 참조한다. 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한 항체의 면역원성을 변경시키거나, 또 다른 분자에의 공유 결합 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하거나, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성과 같은 특성을 변경시키기 위해 만들어 질 수 있다. 본 발명에 따르면, 단일 항체는 CDR 또는 가변 도메인의 프레임워크 영역 또는 불변 영역 중 어느 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수 있다.
"배선화"로 공지된 과정에서, VH 및 VL 서열 내의 특정 아미노산이 배선 VH 및 VL 서열에서 천연에서 발견되는 것들과 매치하도록 돌연변이될 수 있다. 특히, VH 및 VL 서열 내의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 항체 투여시 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 배선 서열과 매치되도록 돌연변이될 수 있다. 인간 VH 및 VL 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, "브이베이스(Vbase)" 인간 배선 서열 데이터베이스를 참조함; 또한 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227:776-798, 1992; 및 Cox et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836, 1994] 참조).
이루어질 수 있는 또 다른 유형의 아미노산 치환은 항체 내의 잠재적인 단백질분해 부위를 제거하는 것이다. 상기 부위는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 또는 항체의 불변 영역에서 발생할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질분해 부위의 제거는 항체 생성물 내 불균일성의 위험을 감소시킬 수 있고, 따라서 그의 균일성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 유형의 아미노산 치환은 하나 또는 잔기 둘다를 변경함으로써 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 또 다른 예에서, 본 발명의 Trop-2 항체에서는 중쇄의 C-말단 리신이 절단될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, Trop-2 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의로 신호 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편이 일단 수득되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이와 관련하여 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록 이들 2개의 DNA 단편을 연결하는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 불변 영역이다. IgG 불변 영역 서열은 여러 개체 간에 발생하는 것으로 공지된 임의의 다양한 대립유전자 및 동종이형, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3) 및 Gm(17)일 수 있다. 이러한 동종이형은 IgG1 불변 영역에서의 자연 발생 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우에, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변 영역은 임의의 중쇄 유전자로부터 유래될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자 (및 또한 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 여러 개체 간에 발생하는 것으로 공지된 임의의 다양한 대립유전자, 예컨대 Inv(1), Inv(2) 및 Inv(3)일 수 있다. 람다 불변 영역은 임의의 3개의 람다 유전자로부터 유래될 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩하는 DNA 단편은 가요성 링커, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)3, (서열 80)을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결되어 VH 및 VL 서열이 인접 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554] 참조). 단일 쇄 항체는 단일 VH 및 VL만이 사용되는 경우에는 1가, 2개의 VH 및 VL이 사용되는 경우에는 2가, 또는 2개 초과의 VH 및 VL이 사용되는 경우에는 다가일 수 있다. Trop-2 및 또 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 또 다른 폴리펩티드에 연결된 본 발명의 Trop-2 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 이뮤노어드헤신을 제조할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Trop-2 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, Trop-2 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 연결되고 Trop-2 항체의 VL 도메인은 제2 폴리펩티드에 연결되며, 상기 제2 폴리펩티드 및 제1 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 방식으로 결합된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 VH 도메인이 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다. 이어서, VH-링커-VL 항체가 관심 폴리펩티드에 연결된다. 또한, 2개 (또는 그 초과의) 단일-쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 쇄 상의 2가 또는 다가 항체를 생성하기를 원하거나 또는 이중특이적 항체를 생성하기를 원하는 경우에 유용하다.
다른 실시양태에서, 다른 변형된 항체는 핵산 분자를 코딩하는 Trop-2 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, "카파 바디" (문헌 [Ill et al., Protein Eng. 10:949-57, 1997]), "미니바디" (문헌 [Martin et al., EMBO J., 13:5303-9, 1994]), "디아바디" (문헌 [Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993]), 또는 "자누신" (문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991 및 Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52, 1992])이 명세서의 교시에 따라 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편이 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321, 1990, Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992]을 참조한다. 또한, "디아바디" 또는 "자누신"으로서 이중특이적 항체가 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 Trop-2의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 변형된 항체는 본원에 제공된 Trop-2 항체로부터의 가변 도메인 또는 CDR 영역 중 하나 이상을 사용하여 제조된다.
본 발명의 대표적인 물질을 2012년 4월 26일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC))에 기탁하였다. ATCC 등록 번호 PTA-12872를 갖는 벡터는 인간화 Trop-2 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, ATCC 등록 번호 PTA-12871을 갖는 벡터는 인간화 Trop-2 항체 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 (부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아있는 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC로부터 이용가능할 것이고, 이는 화이자, 인크.(Pfizer, Inc.)와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 상기 협정은 관련 미국 특허의 허여시에 또는 임의의 미국 또는 타국 특허 출원의 공개시에 (이 중 빠른 시점에) 기탁 배양물의 자손에 대한 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 그에 대한 미국 특허청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정한 언급을 갖는 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 따라 특허청장에 의해 자격이 인정된 것에 대한 자손의 이용가능성을 보장한다.
본원의 양수인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양시에 사멸하거나 또는 손실 또는 파괴되는 경우에, 그 물질을 통지하에 또 다른 동일한 것으로 신속하게 대체할 것에 동의하였다. 기탁 물질의 유용성은 그의 특허법에 따른 임의의 정부의 권한 하에 보장된 권리에 반하여 본 발명을 실시하는데에 대한 허가로 간주되지 않는다.
하기 실시예는 단지 예시적 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 기재로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 첨부된 특허청구범위 내에 속할 것이다.
실시예
실시예 1: 재조합 항-Trop-2 마우스 항체에 대한 항체 결합 친화도 결정
하이브리도마로부터 생성된 항-Trop-2 마우스 항체의 친화도를 조사-등급 CM5 센서 칩 (비아코어™ AB, 스웨덴 웁살라 - 현재 지이 헬스케어(GE Healthcare))이 장착된 표면 플라즈몬 공명 비아코어™ 2000 또는 3000 바이오센서 상에서 측정하였다. 항-마우스 IgG를 먼저 CM5 센서 표면에 아민 커플링시켰다. 이어서, 다양한 항-Trop-2 마우스 IgG를 항-마우스 IgG에 의해 포획하였다. 이어서, Trop-2-Fc 융합 단백질의 파파인 소화로부터 제조된 단량체 Trop-2 세포외 도메인을 3배 희석 연속물에서 분석물로서 주사하였다. 항-Trop-2 마우스 항체의 친화도는 7.5 내지 31.8 nM 범위이다. 표 4.
[표 4]
Figure pct00049
실시예 2: 재조합 항-트롭-2 마우스 항체의 도메인 맵핑
도메인 맵핑은 Trop-2 세포외 도메인을 Trop-1 (EpCAM) 또는 마우스 Trop-2 동등 영역으로 교체하여 수행하였다. 도 4-5를 참조한다. 항-Trop-2 항체 3E9, 6G11, 7E6 및 18B1 (재조합 마우스 IgG2a로 발현됨)은 인간 Trop-1 또는 마우스 Trop-2에 결합하지 않는 한편 15E2는 마우스 Trop-2에 결합하지만 인간 Trop-1에는 결합하지 않는다. 이러한 하이브리드 단백질을 293F 세포에서 인간 Fc 융합 단백질로 발현시켰다. 이러한 도메인 하이브리드에 대한 항-Trop-2 항체의 결합을 비아코어에 의해 결정하였다. 특정 인간 Trop-2 도메인의 항-Trop-2 항체에 의한 인식은 도메인 교체가 결합의 상실 또는 감소를 발생시키는 경우에 정의된다. 항-Trop-2 항체 클론 3E9, 7E6 및 15E2는 도메인 3 및 4에 결합하는 한편 클론 6G11 및 18B1은 도메인 1에 결합한다. 표 5. 상이한 도메인의 Trop-2에 의한 정의는, 예를 들어 문헌 [Chong et al., J. Biol. Chem. 276(8):5804-13, 2001]에서 찾아볼 수 있다.
[표 5]
Figure pct00050
실시예 3: Colo205 이종이식편 모델을 사용한 생체내 효능 연구
항-Trop-2 마우스 IgG의 생체내 효능 연구를 표적-발현 colo205 이종이식편 모델을 사용하여 수행하였다. 1백만개의 colo205 결장 암 세포를 5-8주령 nu/nu 마우스에 피하로 이식하였다 (제0일). 다음날 (제1일) 동물을 체중에 의해 상이한 처리 코호트 (대조군 IgG, 7E6, 15E2 또는 18B1 군; n=10/군)로 무작위로 분류하였다. 상이한 처리 코호트로부터의 20mg/kg의 항-Trop-2 항체 및 대조군 mIgG를 총 12회 용량에 대해 1주에 3회 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 모든 실험 동물을 매일 체중 변화에 대해 모니터링하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 1주에 2회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2로 계산하였다. 연구를 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전에 종결하였다. TGI (% 종양 성장 억제)를 [1-종양 크기 (처리군)/종양 크기 (대조군)] x 100으로 결정하였다. 표 6 및 도 1은 항-Trop-2 항체 7E6, 15E2 및 18B1이 Colo205 이종이식편 종양 성장을 생체내에서 억제한다는 것을 보여준다.
[표 6]
Figure pct00051
실시예 4: A431 이종이식편 모델을 사용한 생체내 효능 연구
a) 항-Trop-2 항체 7E6, 15E2, 및 18B1에 의한 A431 이종이식편 종양 성장의 억제
항-Trop-2 마우스 IgG의 생체내 효능 연구를 표적-발현 A431 이종이식편 모델을 사용하여 수행하였다. 2백만개의 A431 표피양암 세포를 종양 크기가 대략 100 mm3에 도달할 때까지 5-8 주령 nu/nu 마우스에 피하로 이식하였다. 동물을 종양 크기에 의해 무작위로 분류하고, 투여를 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 수행하였다. 항-Trop-2 항체를 293F 일시적 발현으로부터 재조합 마우스 IgG2a 항체로 발현시켰다. 20mg/kg의 항-Trop-2 항체 (18B1, 15E2 및 7E6 재조합 mIgG2a) 또는 대조군 IgG를 총 6회 용량에 대해 1주에 2회 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 1주에 2회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2로 계산하였다. 연구를 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전에 종결하였다. TGI (% 종양 성장 억제)를 [1-종양 크기 (처리군)/종양 크기 (대조군)] x 100으로 결정하였다. 표 7A 및 도 2a는 항-Trop 2 항체 7E6, 15E2 및 18B1이 A431 이종이식편 종양 성장을 생체내에서 억제한다는 것을 보여준다.
[표 7A]
Figure pct00052
b) 용량-반응 연구에서 항-Trop-2 항체 7E6에 의한 A431 이종이식편 종양 성장의 억제
상기 실시예 4a에 기재된 바와 동일한 이종이식편 모델을 사용하여, 다양한 용량의 항-Trop-2 7E6 항체 (5, 10 및 20 mg/kg) 또는 20 mg/kg 대조군 IgG를 총 6회 용량에 대해 1주 2회 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 표 7B 및 도 2b는 다양한 용량의 7E6에 의한 A431 이종이식편 종양 성장의 생체내 억제를 보여준다.
[표 7B]
Figure pct00053
c) 항-Trop-2 항체 6G11, 7E6 및 18B1에 의한 A431 이종이식편 종양 성장의 억제
유사하게, 모두 mIgG2로 재조합적으로 발현된 20 mg/kg의 항-Trop-2 항체 (6G11, 7E6 및 18B1 및 대조군 IgG)를 실시예 4a)에 기재된 바와 같이 A431 이종이식편 모델에서 총 3회 투여에 대해 1주 1회 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 표 7C 및 도 2c는 항-Trop 2 항체 6G11, 7E6 및 18B1이 A431 이종이식편 종양 성장을 생체내에서 억제한다는 것을 보여준다.
[표 7C]
Figure pct00054
실시예 5: 인간화 항-Trop-2 항체 - 7E6에 대한 항체 결합 친화도 결정
키메라 및 인간화 항-Trop-2 7E6 항체의 친화도를 조사-등급 CM4 센서 칩 (비아코어™ AB, 스웨덴 웁살라 - 현재 지이 헬스케어)이 장착된 표면 플라즈몬 공명 비아코어™ T200 바이오센서 상에서 측정하였다. 인간 Trop-2-hFc 또는 시노몰구스 원숭이 Trop-2-hFc 단백질을 항-인간 Fc와 커플링된 CM5 EDA 칩 37 센서 표면 상에 포획하였다. 키메라 및 인간화 7E6 재조합 Fab 단편을 3배 희석 연속물로 주사하였다. 표 8A 및 8B는 각각 인간 Trop-2 단백질 및 시노몰구스 원숭이에 대한 인간화 항-Trop-2 7E6 항체의 친화도 측정을 보여준다.
[표 8A]
Figure pct00055
[표 8B]
Figure pct00056
실시예 6: 인간화 항-Trop-2 항체 - 6G11에 대한 항체 결합 친화도 결정
인간화 6G11 항체의 친화도를 조사-등급 CM5 센서 칩 (비아코어™ AB, 스웨덴 웁살라 - 현재 지이 헬스케어)이 장착된 표면 플라즈몬 공명 비아코어™ 2000 바이오센서 상에서 측정하였다. 인간 Trop-2-mFc 단백질을 항-마우스 Fc와 커플링된 CM5 칩 상에 포획하였다. 인간 6G11_WT 또는 인간 6G11_FKG_SF 키메라 Fab 단편을 3배 희석 연속물로 주사하였다. 표 9는 인간 Trop-2 단백질에 대한 인간화 항-Trop-2 6G11 항체의 친화도 측정을 보여준다.
[표 9]
Figure pct00057
실시예 7: Trop-2 양성 및 음성 종양 세포에 대한 마우스 및 인간화 항-Trop-2 항체의 유동 세포측정법
a) 7E6
마우스 키메라 및 인간화 항-Trop-2 7E6 항체 (인간 IgG1 하위유형에서 발현됨)의 결합을 Trop-2 발현 (A431 및 Colo205) 및 비-발현 (SW620) 세포 상에서 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. A431 세포 염색을 위해, 200,000개의 세포를 100uL 결합 완충제 (PBS (포스페이트 완충 염수) + 0.5% BSA (소 혈청 알부민)) 중 0.5 ug 항체와 인큐베이션한 후에, 잭슨 이뮤노리서치 래보러토이즈(Jackson immunoresearch Laboratories) (펜실베니아주 웨스트 그로브)로부터의 다이라이트488(Dylight488)-접합된 염소 항-인간 (Fab')2-특이적 이차 항체와 인큐베이션하였다. Colo205 및 SW620 세포의 경우에, 300,000개의 세포를 1 ug의 일차 항체에 이어 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈 (펜실베니아주 웨스트 그로브)로부터의 알렉사플루오르(AlexaFluor) 647 항-인간 (Fab')2-특이적 이차 항체와 함께 사용하였다. 표 10은 마우스 7E6 및 인간화 7E6 항체에 의한 Trop-2 양성 종양 세포 상의 적어도 약 93%의 결합을 보여준다.
[표 10]
Figure pct00058
b) 6G11
실시예 7a)와 유사하게, 키메라 마우스 및 인간화 항-Trop-2 6G11 항체 (인간 IgG1 하위유형에서 발현됨)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 Trop-2 발현 (A431 및 Colo205) 및 비-발현 (SW620) 세포 상에서 평가하였다. 300,000개의 세포를 1 ug의 일차 항체에 이어 알렉사플루오르 647 항-인간 (Fab')2-특이적 이차 항체와 함께 사용하였다. 표 11은 마우스 6G11 및 인간화 6G11 항체에 의한 Trop-2 양성 종양 세포 상의 적어도 약 99%의 결합을 보여준다.
[표 11]
Figure pct00059
실시예 8: A431 세포 상의 키메라 및 인간화 항-Trop-2 7E6 hIgG1 항체의 ADCC 활성
키메라 마우스 (h7E6-WT) 및 인간화 항-Trop-2 7E6 인간 IgG1 항체 (h7E6_SVG (VH 영역), h7E6_L (VL 영역) 및 h7E6-SVGL (VH 및 VL 영역 둘 다))의 ADCC (항체-의존성 세포독성) 활성을 시토톡스(cytoTox) 96 비-방사성 세포독성 검정 키트 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)로 결정하였다. 표적 발현 A431 세포를 검정 전날에 10,000개 세포/웰로 시딩하였다. 공여자 PBMC (저온보존된 말초 혈액 단핵 세포)를 피콜 구배를 통해 단리하고, X-VIVO 배지 (론자(Lonza), 미주리주 워커스빌) 중에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 항체를 다음날 웰에 도 3에 지시된 농도로 첨가한 후에, RPMI+5% FBS (태아 소 혈정) 중 500,000개 PBMC 세포 (E:T=50:1)를 첨가하였다. 항-EGFR (표피 성장 인자 수용체) 항체 (에르비툭스(ERBITUX)®, 임클론(Imclone), 뉴저지주 브리지워터)를 검정에서 양성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 3.5시간 시점에, 20 uL의 용해 용액을 표적 세포 단독 웰에 첨가하였다. 플레이트를 8000 rpm에서 3분 동안 회전시킨 후에, 50uL의 상청액을 또 다른 플레이트로 전달하였다. 이어서, 50ul의 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 암실에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응을 각각의 웰에 프로메가 (위스콘신주 매디슨)로부터의 50 uL의 정지 용액을 첨가하여 정지시켰다. 이어서, 플레이트를 분광광도계 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)로 490 nm에서 판독하였다. 비용해의 백분율 (%)을 하기 식으로 계산하였다:
% 비용해 = (처리 LDH (락테이트 데히드로게나제) 방출 - 표적 세포 자발적 LDH 방출 - 이펙터 세포 자발적 LDH 방출) / (표적 세포 최대 LDH 방출 - 표적 세포 자발적 LDH 방출) x 100
도 3은 키메라 마우스 및 인간화 항-Trop-2 7E6 IgG1 항체가 둘 다 A431 세포에서 ADCC 사멸을 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 9: Trop-2 양성 세포에서 항-Trop-2-ADC의 세포독성
키메라 마우스 (6G11 및 7E6) 및 인간화 항-Trop-2 (h7E6-SVG, h7E6-SVGL 및 h7E6-SVGN) 항체를 표 12에 지시된 바와 같이 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 ("Q") 태그 (예를 들어, TG1, LCQ03 및 TG6은 각각 서열 75, (LLQGG); 78 (GGLLQGA) 및 79 (LLQGA)에 상응함)로 조작되고 AcLys-vcMMAD (아세틸-리신-발린-시트룰린-MMAD), 아미노카프로일-vc-PABC-MMAD (아미노카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐-MMAD), 또는 AcLys-vc-PABC-MMAD (아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐-MMAD)와 접합된 인간 IgG1 하위유형으로 발현시켰다. 한 경우에, 트랜스글루타미나제 태그는 항체의 경쇄 또는 중쇄 C-말단에서 조작될 수 있고; 다른 경우에 트랜스글루타미나제 태그 (예를 들어, Q)는 항체의 또 다른 부위, 예컨대 인간 IgG의 위치 297 (카바트 넘버링 방식)에서 조작될 수 있다. 예를 들어, 야생형 아미노산 아스파라긴 (N)은 Trop-2 항체의 위치 297에서 글루타민으로 치환된다 (N297Q). 이어서, MMAD에 대한 항-Trop-2 항체 접합은 특정 부위 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄, 위치 297의 카르복실 말단 또는 아미노 말단, 또는 항체의 또 다른 부위)에 글루타민-함유 태그를 보유하는 항-Trop-2 항체 및 페이로드의 아민-함유 유도체 (예를 들어, MMAD) 사이의 미생물 트랜스글루타미나제-촉매된 아미드교환 반응을 통해 달성되었다. 일부 경우에, 카르복실 말단 (카바트 넘버링 방식에 따라 위치 447)에서의 야생형 아미노산 리신을 결실시키고, Q-태그로 대체하였다. 다른 경우에, 위치 222, 340 또는 370 (카바트 넘버링 방식에 따름)에서의 야생형 아미노산 리신을 아미노산 아르기닌으로 대체하였다 ("K222R", "K340R" 또는 "K370R"). 예를 들어, K222R 치환은 보다 균질한 항체 및 페이로드 접합체, 항체 및 페이로드 사이의 보다 우수한 분자간 가교, 및/또는 항체 경쇄의 C 말단 상의 글루타민 태그와의 쇄간 가교의 유의한 감소를 발생시키는 놀라운 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 아미드교환 반응에서, 항체 상의 글루타민은 아실 공여자로서 작용하고, 아민-함유 화합물은 아실 수용자 (아민 공여자)로서 작용하였다. 1.67 - 4.04 μM의 농도의 정제된 항-Trop-2 항체를 150 - 900 mM NaCl, 및 25 mM MES, HEPES [4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산] 또는 트리스 HCl 완충제 (pH 범위 6.2 - 8.8) 중 0.225 - 0.545% (w/v) 스트렙토베르티실리움 모바라엔스(Streptoverticillium mobaraense) 트랜스글루타미나제 (액티바(ACTIVA)™, 일본 아지노모토)의 존재 하에 167 - 404 μM 범위의 20 - 100 M 과량의 아실 수용자와 인큐베이션하였다. 반응 조건을 개별 아실 수용자 유도체에 대해 조정하고, 최적의 효율 및 특이성은 전형적으로 150 mM NaCl, 25 mM 트리스 HCl, pH 8.8 중 2.87 μM 항체, 287 μM 유도체, 및 0.378% (w/v) 트랜스글루타미나제에서 관찰되었다. 실온에서 2.5시간 동안 인큐베이션 후에, 항체를 당업자에게 공지된 표준 친화도 크로마토그래피 방법, 예컨대 지이 헬스케어로부터의 상업적 친화도 크로마토그래피를 이용하여 맵셀렉트(MabSelect) 수지 (지이 헬스케어, 위스콘신주 와우케샤) 상에서 정제하였다.
표적 발현 (A431, BxPC3, CAPAN-2 및 Colo205) 또는 비-발현 (SW620) 세포를 처리 전에 백색 벽 투명 바닥 플레이트 상에 24시간 동안 2000개 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 세포 생존율을 처리 96시간 후에 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광 세포 생존율 검정 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 상대 세포 생존율을 비처리 대조군의 백분율로 결정하였다. IC50을 프리즘 소프트웨어에 의해 계산하였다. 표 12는 트랜스글루타미나제 태그를 통해 MMAD에 접합된 키메라 마우스 및 인간화 항-Trop-2 7E6 항체가 Trop-2 발현 세포에서 강력한 세포 사멸 활성을 발휘한다는 것을 보여준다.
[표 12]
Figure pct00060
Figure pct00061
실시예 10: 항-Trop-2 7E6 아우리스타틴 접합체는 BxPC3 이종이식편 모델에서 장기간 종양 퇴행을 유도하였다
트랜스글루타미나제를 통해 1) LCQ03-AcLys-vc-PABC-MMAD K222R 변이체 또는 2) TG6-AcLys-vc-PABC-MMAD와 접합된 대조군 항체 hIgG1-TG1-vcMMAD ("NNCTG1-vcMMAD") 및 키메라 항-Trop-2 항체 7E6의 생체내 효능 연구를 표적-발현 BxPC3 이종이식편 모델을 사용하여 수행하였다. h7E6-K222R-LCQ03-AcLys-vc-PABC-MMAD 변이체 접합체의 경우에, 항-Trop-2 항체에서 야생형 아미노산 리신을 카바트 넘버링 방식에 따라 위치 222에서 아미노산 아르기닌으로 치환하였다 (즉, K222R). LCQ03은 서열 78 (GGLLQGG)에 해당하고, TG6은 서열 79 (LLQGA)에 해당한다. 트랜스글루타미나제 태그 LCQ03 및 TG6을 사용하여 Trop-2 항체를 접합시키는 일반적 방법은 실시예 9에 기재된다. 2백만개의 BxPC3 암 세포를 종양 크기가 대략 250 mm3에 도달할 때까지 5-8 주령 CB17 SCID 마우스에 피하로 이식하였다. 동물을 종양 크기에 의해 무작위로 분류하고, 투여는 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 수행하였다. 3 mg/kg의 대조군 hIgG1, 키메라 h7E6-K222R-LCQ03-AcLys-vc-PABC-MMAD 변이체, 또는 키메라 7E6-TG6-AcLys-vc-PABC-MMAD를 총 1회 용량에 대해 1회 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 1주 1회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2로 계산하였다. 연구를 그의 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전에 종결시켰다. AcLys-vc-PABC-MMAD와 접합된 키메라 항-Trop-2 항체 7E6의 단일 용량은 장기간 종양 퇴행을 발생시켰다. 도 8을 참조한다.
실시예 11: Trop-2 양성 세포에서 항-Trop-2-ADC의 세포독성
음성 대조군 (NNC) 및 인간화 항-Trop-2 (h7E6SVG) 항체를 지시된 바와 같이 중쇄 (TG6 (서열 79)), 경쇄 (LCQ03 (서열 78) 및 LCQ04 (서열 79))의 C-말단에서의 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그로 또는 중쇄의 CH2/힌지 도메인 내의 N297Q/K222R 돌연변이로 조작되고, AcLys-vc-PABC-0101 ("vc0101" 또는 아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐-(2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)) 또는 아미노카프로일-PEG6 (프로필렌 글리콜)6-프로피오닐)-MMAD와 접합된 인간 IgG1 하위유형으로 발현시켰다. 2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드는 미국 출원 번호 61/561,255 및 61/676,423에 기재된 바와 같은 신규 아우리스타틴이다. 트랜스글루타미나제 태그를 사용하여 Trop-2 항체를 접합시키는 방법이 실시예 9에 기재되어 있다. 표적 발현 또는 비-발현 (SW620) 세포를 백색 벽 투명 바닥 플레이트 상에 웰당 2000개 (A431, BxPC3, NCI-H292, NCI-H1650, MDA-MB-468 및 SW620), 2500개 (Calu-3) 또는 3000개 (OVCAR3 및 SKBR3)의 세포로 24시간 동안 시딩한 후에 처리하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 세포 생존율을 처리 96시간 후에 셀타이터-글로® 발광 세포 생존율 검정 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 상대 세포 생존율을 비처리 대조군의 백분율로 결정하였다. IC50을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 소프트웨어에 의해 계산하고, 총 Ab의 농도 (nM)로 표현하였다. 표 13은 트랜스글루타미나제 태그를 통해 vc0101 또는 PEG6-MMAD에 접합된 인간화 항-Trop-2 7E6 항체가 Trop-2 발현 세포에서 강력한 세포 사멸 활성을 발휘한다는 것을 보여준다.
[표 13]
Figure pct00062
실시예 12: 항-Trop-2 7E6 아우리스타틴 접합체는 췌장 종양 BxPC3 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도한다
Trop-2 ADC의 생체내 효능 연구를 표적-발현 BxPC3 이종이식편 모델을 사용하여 수행하였다. 2백만개의 BxPC3 췌장 암세포를 종양 크기가 300-400 mm3에 도달할 때까지 5-8 주령 CB17/SCID 마우스에 피하로 이식하였다. 동물을 종양 크기에 의해 무작위로 분류하고, 1) TG6-AcLys-vc-PABC-0101 (도 9a에 도시된 TG6-AcLys-vc-0101와 동등함); 2) N297Q/K222R-PEG6-MMAD ((프로필렌 글리콜)6-프로피오닐-MMAD); 및 3) LCQ04-K222R-vc-PABC0101 (도 9c에 도시된 LCQ04/K222R-vc0101과 동등함); LCQ04는 서열 79 (LLQGA)에 해당함)과 접합된 인간화 항-Trop2 항체 및 대조군 접합체의 단일 용량을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 1주 1회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2로 계산하였다. 연구를 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전에 종결시켰다. 도 9a-9c는 1) TG6-AcLys-vc-PABC-0101; 2) N297Q/K222R-PEG6-MMAD; 및 3) LCQ04-K222R-vc-PABC0101과 접합된 인간화 항-Trop2 항체의 단일 용량이 췌장 종양 BxPC3 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 발생시킨다는 것을 보여준다.
실시예 13: 항-Trop-2 7E6 아우리스타틴 접합체는 결장직장 종양 Colo205 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도한다
Trop-2 ADC의 생체내 효능 연구를 표적-발현 colo205 이종이식편 모델을 사용하여 수행하였다. 3백만개의 colo205 결장암 세포를 종양 크기가 ~300 mm3에 도달할 때까지 5-8 주령 nu/nu 마우스에 피하로 이식하였다. 동물을 종양 크기에 의해 무작위로 분류하고, 1) TG6-AcLys-vc-PABC-0101 (도 10에 도시된 TG6-vc-0101과 동등함); 및 2) 중쇄의 힌지/CH2 도메인에 K222R 치환을 갖는 LCQ03-vc-PABC-0101 (도 10에 도시된 LCQ03/K222R-vc0101과 동등함; LCQ03은 서열 78 (GGLLQGG)에 해당함)과 접합된 6mg/kg 인간화 항-Trop2 항체; 및 대조군 접합체 (IgG-vc-PABC-0101)의 단일 용량을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 1주 1회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2로 계산하였다. 연구를 그의 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전에 종결시켰다. 도 10은 1) TG6-AcLys-vc-PABC-0101; 및 2) 중쇄의 힌지/CH2 도메인에서 K222R 치환을 갖는 LCQ03-vc-PABC-0101과 접합된 인간화 항-Trop2 항체의 단일 용량이 결장직장 종양 Colo205 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 발생시킨다는 것을 보여준다.
실시예 14: 항-Trop-2 7E6 아우리스타틴 접합체는 난소 PDX Ova196756 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 유도한다
TG6-vc-0101과 접합된 인간화 항-Trop2 항체 (h7E6SVG)를 사용하는 Trop-2 ADC의 생체내 효능 연구를 표적-발현 난소암 환자 유래된 이종이식편 모델 (PDX Ova196756)을 사용하여 수행하였다. 이러한 종양 샘플은 수술 시편으로부터 유래하였고, NSG 마우스에서 증식시켰다 (잭슨 래보러토리즈, 메인주 바 하버). 효능 연구를 위해, 대략 1-2 mm3의 종양 단편을 CB17/SCID 마우스의 측면 옆구리에 피하로 이식하였다. 동물을 종양 크기가 ~400 mm3에 도달하면 이들에 의해 무작위로 분류하고, h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101 (0.75 mg/kg 및 1.5 mg/kg; 도 11에 도시된 TG6-vc0101과 동등함) 및 대조군 접합체(1.5 mg/kg; 도 11에 도시된 IgG-vc-PABC-0101 또는 IgG-vc0101)의 단일 용량을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 1주 1회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2로 계산하였다. 연구를 그의 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전에 종결시켰다. 도 11은 TG6-AcLys-vc-PABC-0101과 접합된 인간화 항-Trop2 항체의 단일 투여가 난소 PDX Ova196756 이종이식편 모델에서 종양 퇴행을 발생시킨다는 것을 보여준다.
실시예 15: 항-Trop-2 7E6 아우리스타틴 접합체는 Pan0146 췌장 PDX 모델에서 종양 퇴행을 유도하는데 있어 겜시타빈보다 우수한 효능을 보여준다
TG6-vc0101과 접합된 인간화 항-Trop-2 항체 (h7E6SVG)를 사용하는 Trop-2 ADC의 생체내 효능 연구를 잭슨 래보러토리즈 (메인주 바 하버)로부터의 표적-발현 췌장암 환자 유래된 이종이식편 모델 (PDX Pan0146)을 사용하여 수행하였다. 효능 연구를 위해, 1-2 mm3의 종양 단편을 동물의 측면 옆구리에 피하로 이식하였다. 동물을 종양 크기가 ~300 mm3에 도달하면 이들에 의해 무작위로 분류하고, h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101 및 대조군 접합체를 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 도 12a: h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101 (도면에서 h7E6SVG-TG6-vc0101로 나타냄) 및 대조군 접합체의 단일 투여는 지시된 용량으로 주어진다. 겜시타빈은 총 6회 용량에 대해 1주에 2회 75 mg/kg으로 주어진다. 도 12b: h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101은 4회 용량에 대해 매주 0.75 mg/kg으로, 2회 용량에 대해 격주 1.5 mg/kg으로 또는 3.0 mg/kg 단일 용량으로 주어진다. 겜시타빈은 4회 용량에 대해 75 mg/kg으로 1주 1회 주어진다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 1주 1회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2로 계산하였다. 연구를 그의 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전에 종결시켰다. 데이터는 TG6-AcLys-vc-PABC-0101에 접합된 인간화 항-Trop2 항체가 Pan0146 췌장 PDX 모델에서 종양 퇴행을 유도하는데 있어 겜시타빈보다 우수한 효능을 가지며, h7E6SVG-TG6-AcLys-vc-PABC-0101의 연속 투여가 췌장 PDX Pan0146 이종이식편 모델에서 지속적인 종양 퇴행을 발생시킨다는 것을 보여준다.
실시예 16: 항-Trop-2 7E6 아우리스타틴 접합체는 췌장 Pan144607 PDX 모델에서 종양 퇴행을 유도한다
vc0101 또는 PEG6MMAD와 접합된 인간화 항-Trop-2 항체 (h7E6SVG)를 사용하는 Trop-2 ADC의 생체내 효능 연구를 표적-발현 췌장암 환자 유래된 이종이식편 모델 (PDX Pan144607)을 사용하여 수행하였다. 이러한 종양 샘플은 수술 시편으로부터 유래되었고, NSG 마우스에서 증식시켰다 (잭슨 래보러토리즈, 메인주 바 하버). 효능 연구를 위해, 대략 1-2 mm3의 종양 단편을 CB17/SCID 마우스의 측면 옆구리에 피하로 이식하였다. 동물을 종양 크기가 ~300 mm3에 도달하여 이들에 의해 무작위로 분류하고, 1.5, 3.0 및 6.0 mg/kg h7E6SVG-N297Q/K222R-PEG6MMAD 및 대조군 접합체의 단일 용량을 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 1주 1회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2로 계산하였다. 연구를 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전에 종결시켰다. 도 13은 PEG6-MMAD와 접합된 인간화 항-Trop2 항체의 단일 용량이 췌장 Pan144607 PDX 모델에서 종양 퇴행을 발생시킨다는 것을 보여준다.
실시예 17: 항-Trop-2 7E6 아우리스타틴 접합체는 췌장 Pan0135 PDX 모델에서 종양 퇴행을 유도한다
PEG6MMAD와 접합된 인간화 항-Trop-2 항체 (h7E6SVG)를 사용하는 Trop-2 ADC의 생체내 효능 연구를 잭슨 래보러토리즈로부터 표적-발현 췌장암 환자 유래된 이종이식편 모델 (PDX Pan0135)을 사용하여 수행하였다. 효능 연구를 위해, 대략 1-2 mm3의 종양 단편을 동물의 측면 옆구리에 피하로 이식하였다. 동물을 종양 크기가 ~300 mm3에 도달하면 이들에 의해 무작위로 분류하고, 6mg/kg의 h7E6SVG-N297Q/K222R-PEG6MMAD 및 대조군 접합체를 단일 용량의 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 1주 1회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 폭2) / 2로 계산하였다. 연구를 그의 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기 전에 종결하였다. 도 14는 PEG6-MMAD와 접합된 인간화 항-Trop2 항체의 단일 용량이 췌장 Pan0135 PDX 모델에서 종양 퇴행을 발생시킨다는 것을 보여준다.
실시예 18: 인간화 항-Trop-2 항체에 대한 항체 결합 친화도 결정
Fab/인간 Trop2-ECD (세포외 도메인) 상호작용의 분석을 GLC 센서 칩이 장착된 바이오-라드 프로테온(Bio-Rad Proteon) XPR36 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서 (바이오-라드, 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 수행하였다. 검정 온도는 25℃였고, 검정 완충제는 10 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20, pH 7.4였다. 아민-커플링된 Fab의 어레이를 문헌 [Abdiche et al. (Anal. Biochem., 411: 139-151 (2011))]에 기재된 방법론을 이용하여 제조하였다. 각각의 분석 사이클에서, 1가 인간 Trop2-ECD 항원을 3분 동안 고정화된 Fab 상에서 30 μL/분으로 유동시킨 후에 15분 동안 완충제로 세척하여 Fab/Trop2 복합체의 해리를 모니터링하였다. 센서 표면을 피어스(Pierce) IgG 용리 완충제:4 M NaCl (피어스, 일리노이주 록포드)의 2:1 혼합물 (부피에 의함)의 3회 18-초 주사를 이용하여 분석 사이클 사이에 재생시켰다. 결합 및 재생 사이클을 6, 30 및 150 nM의 인간 Trop2-ECD 농도에서 반복하였다. 생성된 데이터를 프로테온 평가 소프트웨어를 이용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델에 핏팅하였다. 결과는 하기 표에 나타난다.
[표 14]
Figure pct00063
개시된 교시내용이 다양한 용도, 방법, 키트 및 조성물과 관련하여 기술되었지만, 본원의 교시내용 및 하기의 청구된 발명을 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기 예는 개시된 교시를 보다 잘 설명하기 위해 제공되고, 본원에 제시된 교시의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 교시가 이러한 예시적 실시양태들의 관점에서 기재되어 있지만, 이러한 예시적 실시양태의 수많은 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다는 것을 당업자는 용이하게 이해할 것이다. 모든 이러한 변경 및 변형이 현재의 교시의 범위 내에 속한다.
특허, 특허 출원, 논문, 교재 등을 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌 및 이에 인용된 참고문헌은 이들이 이미 포함되어 있지는 않은 정도로, 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기술 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 다르거나 모순되는 경우에, 본 출원이 우선한다.
상기 기재 및 실시예는 본 발명의 특정의 구체적 실시양태를 상세히 기재하고, 본 발명자들에 의해 고려된 최적 방식을 기재한다. 그러나, 상기의 것을 문서에서 아무리 상세히 기재할 수 있을지라도, 본 발명이 다수의 방식으로 실시될 수 있고, 첨부된 특허청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 본 발명이 해석되어야 하는 것으로 이해될 것이다.
ATCC PTA-12871 20120426 ATCC PTA-12872 20120426
SEQUENCE LISTING <110> Rinat Neuroscienc Corp. Liu, Shu-Hui Ho, Wei-Hsien Strop, Pavel Dorywalska, Magdalena G Rajpal, Arvind Shelton, David Tran, Thomas-Toan <120> ANTIBODIES SPECIFIC FOR TROP-2 AND THIER USES <130> PC71866A <150> US 61/559,015 <151> 2011-11-11 <150> US 61/640,641 <151> 2012-04-30 <150> US 61/717,288 <151> 2012-10-23 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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acatgcaccg tgagcggtgg tagtattagc tcttacggcg tccattggat ccgtcaaccg 120 cctggtaaag gtctggaatg gattggcgtg atctggaccg gtggtagcac cgactataac 180 agcgcactga tgagccgcgt gaccatctcg gtagacacgt cgaaaaacca gttcagcctg 240 aaactgagca gcgtgaccgc cgcggatacc gctgtttatt actgcgcacg cgacggggat 300 tatgatcgct acaccatgga ttattggggc cagggtaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 16 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 16 gatatcgtaa tgacccaatc tccggattcg ctggcggtat cactgggcga acgtgccacg 60 attaactgcc gtgcaagcaa atcagtgtcg acctccggct acagctatat gcactggtat 120 caacagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgatctatc tggctagcaa cctggagagc 180 ggtgtgcctg atcgctttag tggctccggt agcggtaccg atttcacgct gaccatcagc 240 tccctgcagg cagaagacgt ggccgtgtat tattgtcagc acagccgtga gctgccgtat 300 acttttggcc aggggacaaa actggaaatc aaa 333 <210> 17 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 17 caggtccaac tgcaggaatc aggtccaggc ctggtgaaac cgtctgaaac cctgagcctg 60 acatgcaccg tgagcggtgg tagtattagc tcttacggcg tccattggat ccgtcaaccg 120 cctggtaaag gtctggaatg gattggcgtg atctggaccg gtggtagcac cgactataac 180 agcgcactga tgagccgcgt gaccatctcg gtagacacgt cgaaaaacca gttcagcctg 240 aaactgagca gcgtgaccgc cgcggatacc gctgtttatt actgcgcacg cgacggggat 300 tatgatcgct acaccatgga ttattggggc cagggtaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 18 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 18 caggtccaac tgcaggaatc aggtccaggc ctggtgaaac cgtctgaaac cctgagcctg 60 acatgcaccg tgagcggtgg tagtattagc tcttacggcg tccattggat ccgtcaaccg 120 cctggtaaag gtctggaatg gattggcgtg atctggacca gtggtgtgac cgactataac 180 agcgcactga tgggccgcgt gaccatctcg gtagacacgt cgaaaaacca gttcagcctg 240 aaactgagca gcgtgaccgc cgcggatacc gctgtttatt actgcgcacg cgacggggat 300 tatgatcgct acaccatgga ttattggggc cagggtaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 19 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 19 gatatcgtaa tgacccaatc tccggattcg ctggcggtat cactgggcga acgtgccacg 60 attaactgcc gtgcaagcaa atcagtgtcg acctccttgt acagctatat gcactggtat 120 caacagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgatctatc tggctagcaa cctggagagc 180 ggtgtgcctg atcgctttag tggctccggt agcggtaccg atttcacgct gaccatcagc 240 tccctgcagg cagaagacgt ggccgtgtat tattgtcagc acagccgtga gctgccgtat 300 acttttggcc aggggacaaa actggaaatc aaa 333 <210> 20 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 20 gatatcgtaa tgacccaatc tccggattcg ctggcggtat cactgggcga acgtgccacg 60 attaactgcc gtgcaagcaa atcagtgtcg acctccaatt acagctatat gcactggtat 120 caacagaaac cgggccagcc gccgaaactg ctgatctatc tggctagcaa cctggagagc 180 ggtgtgcctg atcgctttag tggctccggt agcggtaccg atttcacgct gaccatcagc 240 tccctgcagg cagaagacgt ggccgtgtat tattgtcagc acagccgtga gctgccgtat 300 acttttggcc aggggacaaa actggaaatc aaa 333 <210> 21 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 21 gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60 ttctcctgca gggccagtca gaccattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120 aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180 aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240 gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa agtaatagct ggccattcac gttcggctcg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 22 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 22 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga taaactgggt gaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gatcggaaat atttatcctt ctgatagtta ttctaactac 180 aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaggtca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac gtacggtagt 300 agctttgact actggggcca aggcaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 23 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 23 gagatcgtgc tgacccaaag tccagccacc ctttccctgt ctccaggcga acgcgcaacc 60 ctgagctgcc gcgcttctca 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<223> Xaa can be V or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be A or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be F or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be G or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be A or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be T or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa can be A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa can be T or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa can be F or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa can be A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be E or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa can be V or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa can be E or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa can be N or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa can be Y or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa can be A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa can be N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa can be C or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa can be F or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa can be V or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa can be N or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa can be N or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa can be N or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa can be R or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa can be Q or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa can be T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa can be Q or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa can be N or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa can be T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa can be I or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa can be K or T 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G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (157)..(157) <223> Xaa can be P or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (159)..(159) <223> Xaa can be D or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (160)..(160) <223> Xaa can be S or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (161)..(161) <223> Xaa can be K or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (162)..(162) <223> Xaa can be S or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (164)..(164) <223> Xaa can be R or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (165)..(165) <223> Xaa can be T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (166)..(166) <223> Xaa can be A or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (168)..(168) <223> Xaa can be Q or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (170)..(170) <223> Xaa can be E or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (171)..(171) <223> Xaa can be I or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (172)..(172) <223> Xaa can be T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (173)..(173) <223> Xaa can be T or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (176)..(176) <223> Xaa can be Q or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (178)..(178) <223> Xaa can be D or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (183)..(183) <223> Xaa can be T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (186)..(186) <223> Xaa can be L or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (190)..(190) <223> Xaa can be N or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (191)..(191) <223> Xaa can be V or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (193)..(193) <223> Xaa can be T or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (197)..(197) <223> Xaa can be V or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (204)..(204) <223> Xaa can be T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (205)..(205) <223> Xaa can be Q or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (206)..(206) <223> Xaa can be N or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (213)..(213) <223> Xaa can be V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (228)..(228) <223> Xaa can be H or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (229)..(229) <223> Xaa can be S or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (231)..(231) <223> Xaa can be K or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (232)..(232) <223> Xaa can be G <220> <221> MISC_FEATURE 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MISC_FEATURE <222> (286)..(267) <223> Xaa can be K or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (286)..(286) <223> Xaa can be V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (292)..(292) <223> Xaa can be R or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (296)..(296) <223> Xaa can be M or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (300)..(300) <223> Xaa can be E or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (302)..(302) <223> Xaa can be A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (311)..(311) <223> Xaa can be H or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (314)..(314) <223> Xaa can be L or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (315)..(315) <223> Xaa can be N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (316)..(316) <223> Xaa can be A or L <400> 69 Pro Pro Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Leu Leu Xaa Ala Ala Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Ala Ala Gln Asp Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Lys Leu 20 25 30 Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gln Cys Xaa Ala 35 40 45 Leu Gly Ala Xaa Xaa Xaa Val Xaa Cys Ser Xaa Leu Xaa Ala Lys Cys 50 55 60 Leu Leu Leu Lys Ala Xaa Met Xaa Ala Xaa Lys Xaa Ala Arg Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Pro Xaa Glu Xaa Ala Leu Xaa Xaa Asn Asp Gly Leu Tyr Asp 85 90 95 Pro Asp Cys Asp Xaa Xaa Gly Xaa Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Xaa 100 105 110 Thr Ser Xaa Cys Trp Cys Val Asn Ser Xaa Gly Val Arg Arg Thr Asp 115 120 125 Lys Xaa Asp Xaa Xaa Ile Xaa Cys Xaa Glu Xaa Val Arg Thr His Xaa 130 135 140 Ile Ile Ile Asp Leu Lys His Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Tyr Xaa 165 170 175 Leu Xaa Pro Lys Phe Ile Xaa Ala Ile Xaa Tyr Glu Asn Xaa Xaa Ile 180 185 190 Xaa Ile Asp Leu Xaa Gln Asn Ser Ser Gln Lys Xaa Xaa Xaa Asp Val 195 200 205 Asp Ile Ala Asp Xaa Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Ile Lys Gly Glu 210 215 220 Ser Leu Phe Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Leu Asp Leu Xaa Val Xaa Gly Glu 225 230 235 240 Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu 245 250 255 Xaa Xaa Pro Xaa Phe Ser Met Xaa Xaa Leu Xaa Ala Gly Leu Ile Ala 260 265 270 Val Ile Val Val Val Val Ile Ala Leu Val Ala Gly Ile Xaa Val Leu 275 280 285 Val Ile Ser Xaa Lys Lys Lys Xaa Ala Lys Tyr Xaa Lys Xaa Glu Ile 290 295 300 Lys Glu Leu Gly Glu Leu Xaa Lys Glu Xaa Xaa Xaa 305 310 315 <210> 70 <211> 323 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be P or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be G or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa can be R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa can be P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa can be A or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa can be V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa can be G or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa can be H or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa can be T or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa can be A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa can be D or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa can be S or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa can be P or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa can be D or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa can be R or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa can be G or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa can be A or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83) <223> Xaa can be P or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85)..(85) <223> Xaa can be N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa can be R or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> Xaa can be P or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(111) <223> Xaa can be E or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (141)..(141) <223> Xaa can be L or Q <220> <221> 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K or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (282)..(282) <223> Xaa can be V or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (285)..(285) <223> Xaa can be V or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (293)..(293) <223> Xaa can be A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (299)..(299) <223> Xaa can be N or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (319)..(319) <223> Xaa can be K or S <400> 70 Met Ala Arg Gly Xaa Xaa Leu Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Ala Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Gln Xaa 20 25 30 Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Xaa Xaa Xaa Gly 35 40 45 Pro Gly Gly Xaa Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Xaa Met Xaa Val 50 55 60 Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met 65 70 75 80 Ser Ala Xaa Lys Xaa Ala Arg Ser Leu Val Xaa Pro Ser Glu His Ala 85 90 95 Ile Leu Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Xaa Xaa Gly 100 105 110 Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val 115 120 125 Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp 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can be L or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be T or S <400> 77 Gly Xaa Ser Xaa Xaa Ser Tyr Gly Val His 1 5 10 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 78 Gly Gly Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 79 Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 81 Gly Gly Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa can be M or E <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> Xaa can be E or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be M or E <400> 82 Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Xaa Asp Tyr 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 83 Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Xaa Asp Tyr 1 5 <210> 84 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 84 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Ser Gly Val Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 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Xaa Xaa Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 86 Xaa Xaa Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Xaa Asp Tyr 1 5 10 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be E or M <400> 87 Xaa Xaa Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Xaa Asp Tyr 1 5 10 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be G or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be A, G, P, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be A, G, K, P, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be G, K, or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be K or absent <400> 88 Leu Leu Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or absent <400> 89 Leu Leu Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 90 Leu Leu Gln Gly Pro Gly Lys 1 5 <210> 91 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 91 Leu Leu Gln Gly Pro Gly 1 5 <210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 92 Leu Leu Gln Gly Pro Ala 1 5 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 93 Leu Leu Gln Gly Pro 1 5 <210> 94 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 94 Leu Leu Gln Pro 1 <210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 95 Leu Leu Gln Pro Gly Lys 1 5 <210> 96 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 96 Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly Lys 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 97 Leu Leu 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250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 102 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa can be E or M <400> 102 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Ser Gly Val Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Gly Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Xaa Xaa Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 103 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 103 Leu Gly Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 104 Tyr Gly Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 105 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 105 Phe Gly Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 106 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 106 His Gly Asp Tyr Asp Arg Tyr Thr Met Asp 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Claims (41)

  1. (a) (i) 서열 SYGVH (서열 30), GGSISSY (서열 36) 또는 GGSISSYGVH (서열 37)를 포함하는 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열 VIWTX1GX2TDYNSALMX3 (여기서, X1은 G 또는 S이고; X2는 S 또는 V이고; X3은 S 또는 G임) (서열 49) 또는 WTX1GX2 (여기서, X1은 G 또는 S이고, X2는 S 또는 V임) (서열 50)를 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열 DYDRYTX1DY (여기서, X1은 E 또는 M임) (서열 82)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 상보성 결정 영역; 및/또는
    (b) (i) 서열 RASKSVSTSX1YSYMH (여기서, X1은 G, L 또는 N임) (서열 63)를 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열 LASNLES (서열 55)를 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 QHSRELPYT (서열 56)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역 상보성 결정 영역
    을 포함하며 영양막 세포-표면 항원-2 (Trop-2)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 서열 5 또는 85에 나타낸 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는
    서열 3 또는 6에 나타낸 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역
    을 포함하며 Trop-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, VH 영역이 (i) 서열 SYGVH (서열 30), GGSISSY (서열 36) 또는 GGSISSYGVH (서열 37)를 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열 VIWTSGVTDYNSALMG (서열 38) 또는 WTSGV (서열 39)를 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열 DGDYDRYTMDY (서열 35), DYDRYTMDY (서열 99) 또는 DYDRYTEDY (서열 100)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 제3항에 있어서, VL 영역이 (i) 서열 RASKSVSTSGYSYMH (서열 54) 또는 RASKSVSTSLYSYMH (서열 57)를 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열 LASNLES (서열 55)를 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 QHSRELPYT (서열 56)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, VH 영역이 서열 5, 85에 나타낸 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고/거나 VL 영역이 서열 3, 6에 나타낸 아미노산 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 항체가 서열 66에 나타낸 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 65 또는 102에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제3항에 있어서, 항체가 ATCC 등록 번호 PTA-12872를 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 VH 영역을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. 제4항에 있어서, 항체가 ATCC 등록 번호 PTA-12871을 갖는 발현 벡터에 의해 생산된 VL 영역을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  9. 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 약 6.5 nM 이하의 1가 항체 결합 친화도 (KD)로 인간 Trop-2 (서열 27)의 도메인 3 및 도메인 4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. (a) (i) 서열 SYWIN (서열 40), GYTFTSY (서열 41) 또는 GYTFTSYWIN (서열 42)을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1); (ii) 서열 NIX1PSDSYSNYNX2KFKD (여기서, X1은 Y 또는 F이고; X2는 Q 또는 K임) 또는 X1PSDSY (여기서, X1은 Y 또는 F임) (서열 52)를 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열 GSX1FDY (여기서, X1은 S 또는 G임) (서열 53)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 상보성 결정 영역; 및/또는
    (b) (i) 서열 RASQTIGTSIH (서열 59)를 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열 YASESIS (서열 60)를 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 X1QSX2SWPFT (여기서, X1은 Q 또는 S이고; X2는 N 또는 F임) (서열 64)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역 상보성 결정 영역
    을 포함하며 Trop-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 서열 13에 나타낸 VH 서열의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH 영역; 및/또는
    서열 12에 나타낸 VL 서열의 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL 영역
    을 포함하며 Trop-2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, VH 영역이 (i) 서열 SYWIN (서열 40), GYTFTSY (서열 41) 또는 GYTFTSYWIN (서열 42)을 포함하는 VH CDR1; (ii) 서열 NIFPSDSYSNYNKKFKD (서열 46) 또는 FPSDSY (서열 47)를 포함하는 VH CDR2; 및 (iii) 서열 GSGFDY (서열 48)를 포함하는 VH CDR3을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, VL 영역이 (i) 서열 RASQTIGTSIH (서열 59)를 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열 YASESIS (서열 60)를 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열 SQSFSWPFT (서열 62)를 포함하는 VL CDR3을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, VH 영역이 서열 13에 나타낸 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함하고/거나 VL 영역이 서열 12에 나타낸 아미노산 서열 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 항체가 서열 68에 나타낸 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 67에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  16. Trop-2에 특이적으로 결합하여 제2항 또는 제4항의 항체와 경쟁하는 단리된 항체.
  17. 제16항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에 약 6.5 nM 이하의 1가 항체 결합 친화도 (KD)를 갖는 항체.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 부위에서 조작된 아실 공여자 글루타민-함유 태그를 포함하는 항체.
  19. 제18항에 있어서, 태그가 아미노산 서열 GGLLQGG (서열 78), LLQGA (서열 79) 또는 LLQ를 포함하는 것인 항체.
  20. 제19항에 있어서, 위치 222, 340 또는 370에서 아미노산 변형을 추가로 포함하는 항체.
  21. 제20항에 있어서, 아미노산 변형이 리신으로부터 아르기닌으로의 치환인 항체.
  22. 제1항 내지 제15항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편이 세포독성제, 면역조절제, 영상화제, 치료 단백질, 생체중합체 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제에 접합된, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 접합체.
  23. 제22항에 있어서, 작용제가 세포독성제인 접합체.
  24. 제23항에 있어서, 세포독성제가 MMAD (모노메틸 아우리스타틴 D) 또는 0101 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)인 접합체.
  25. 제24항에 있어서, 식: 항체-(아실 공여자 글루타민-함유 태그)-(링커)-(세포독성제)를 포함하는 접합체.
  26. 제25항에 있어서, 아실 공여자 글루타민-함유 태그가 아미노산 서열 GGLLQGG (서열 78), LLQGA (서열 79), LLQ 또는 LLQX1X2X3X4X5 (여기서, X1은 G 또는 P이고, X2는 A, G, P이거나 또는 부재하고, X3은 A, G, K, P이거나 또는 부재하고, X4는 G, K이거나 또는 부재하고, X5는 K이거나 또는 부재함) (서열 88)를 포함하고, 링커가 아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 또는 아미노-PEG6-프로피오닐을 포함하는 것인 접합체.
  27. 제26항에 있어서, 1) 항체-LLQGA (서열 79)-(아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (AcLys-VC-PABC))-0101; 2) 항체-LLQGA (서열 79)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD; 3) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-(AcLys-VC-PABC)-0101; 4) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD; 5) 항체-GGLLQGG (서열 78)-(AcLys-VC-PABC)-0101; 및 6) 항체-GGLLQGG (서열 78)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD로 이루어진 군으로부터 선택된 접합체.
  28. 제27항에 있어서, 접합체 1) 항체-GGLLQGG (서열 78)-(AcLys-VC-PABC)-0101; 2) 항체-GGLLQGG (서열 78)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD; 3) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-(AcLys-VC-PABC)-0101; 4) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD; 5) 항체-LLQGA (서열 79)-(AcLys-VC-PABC)-0101; 또는 6) 항체-LLQGA (서열 79)-AcLys-VC-PABC-MMAD가 위치 222에서의 리신으로부터 아르기닌으로의 아미노산 치환을 포함하는 것인 접합체.
  29. 제27항에 있어서, 접합체 1) 항체-LLQGA (서열 79)-(AcLys-VC-PABC)-0101; 2) 항체-LLQGA (서열 79)-AcLys-VC-PABC-MMAD; 3) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-(AcLys-VC-PABC)-0101; 또는 4) 항체-LLQX1X2X3X4X5 (서열 88)-(AcLys-VC-PABC)-MMAD가 항체 중쇄의 C-말단에서의 아미노산 리신의 결실을 포함하는 것인 접합체.
  30. 제24항에 있어서, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환, 아미노-PEG6-프로피오닐을 포함하는 링커 및 MMAD를 포함하는 세포독성제를 포함하는 접합체.
  31. 치료 유효량의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항의 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  32. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  33. 제32항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  34. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체를 재조합적으로 생산하는 단리된 숙주 세포.
  35. 제34항의 숙주 세포를 항체를 생산하는 조건 하에 배양하는 것, 및 숙주 세포 또는 배양물로부터 항체를 단리하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  36. Trop-2 발현과 연관된 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제31항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Trop-2 발현과 연관된 상태를 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상태가 암인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 암이 방광, 유방, 자궁경부, 융모막암종, 결장, 식도, 위, 교모세포종, 두경부, 신장, 폐, 경구, 난소, 췌장, 전립선 및 피부 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  39. 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에게 유효량의 제31항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법.
  40. Trop-2 발현 암 세포의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제31항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Trop-2 발현 암 세포의 전이를 억제하는 방법.
  41. 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에게 유효량의 제31항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, Trop-2 발현 종양을 갖는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법.
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