CN115362169A - 色谱树脂以及其用途 - Google Patents

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Abstract

亲和色谱树脂包含附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段以及其使用方法。

Description

色谱树脂以及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月26日提交的美国临时专利申请序列号62/982,002和2020年2月11日提交的美国临时专利申请序列号62/975,141的优先权，两者均以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本公开涉及生物技术领域，更具体地说，涉及抗原结合分子。
背景技术
组织因子(TF)是263个氨基酸的整体膜糖蛋白，分子量约为46kDa，是外在凝血路径的触发蛋白，是体内凝血的主要引发剂。通常不与循环血液接触的组织因子在暴露于循环凝血丝氨酸蛋白酶因子后引发凝血级联反应。血管损伤暴露了表达组织因子的内皮下细胞，从而引起与预先存在的血浆因子VIIa(FVIIa)形成钙依赖性高亲和力复合物。丝氨酸蛋白酶FVIIa结合到组织因子促进了FX快速裂解为FXa和FIX快速裂解为FIXa。所得FXa和活性膜表面的蛋白水解活性于是无法有效地将少量凝血酶原转化为凝血酶。Fxa产生的凝血酶引发血小板活化，并且将微量的原辅因子：因子V(FV)和因子VIII(FVIII)活化成为活性辅因子：因子Va(FVa)和因子VIIIa(FVIIIa)。FIXa与FVIIIa在血小板表面上复合，形成内在液化酶(tenase)复合物，从而引起FXa快速产生。FXa与FVa复合，在活化的血小板表面上形成凝血酶原酶复合物，其引起凝血酶原快速裂解为凝血酶。
除了组织因子-FVIIa复合物外，最近的研究表明，组织因子-FVIIa-FXa复合物也能够活化FVIII，从而在初始阶段提供额外水平的FVIIIa。外在路径首要之处在于通过有限量的凝血酶的活化来引发凝血，而内在路径通过显著扩增初始信号来维持凝血。
细胞表面表达的许多组织因子被“加密”，为了完全参与凝血，必须被“解密”。目前，细胞表面组织因子“解密”的机制尚不清楚，但是，阴离子磷脂的暴露在此过程中起着重要作用。健康细胞会主动将阴离子磷脂(例如磷脂酰丝氨酸(PS))隔离到质膜的内部小叶上。在细胞损伤、活化或胞质Ca2+水平增加之后，这种双层不对称性消失，导致外部小叶上PS暴露增加，从而增加了细胞表面组织因子-FVIIa复合物的比活性。已知PS暴露会降低组织因子-FVIIa复合物活化FIX和FX的表观Km，但其它机制可能包括组织因子或组织因子-FVIIa的构象重排以及随后的底物结合位点暴露。
发明内容
本文提供包括附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段的亲和色谱树脂以及其使用方法。
本文提供亲和色谱树脂，其包括附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段，所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO:1、2或9和3的CDR的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:4、5和6的CDR的轻链可变结构域。
在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，重链可变结构域包含与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列，并且轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，重链可变结构域包含SEQID NO:7，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8。
在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，基础树脂为琼脂糖凝胶。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，基础树脂为任何载体材料。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，载体材料为琼脂糖或capto树脂。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段非共价附接到基础树脂。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段共价附接到基础树脂。
在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在抗组织因子抗体或其抗原结合片段中的半胱氨酸和基础树脂上的化学基团之间形成二硫键而共价附接到基础树脂。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在抗组织因子抗体或抗原结合结构域的游离胺和基础树脂上的化学基团之间形成共价键而共价附接到基础树脂。
在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，基础树脂为CNBr活化的或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的固体载体材料。在本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的一些实施例中，共价键由下式I表示：
Figure BDA0003872947890000021
其中R表示抗组织因子抗体或其抗原结合片段。
本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的试剂盒。
本文还提供纯化含有组织因子的蛋白质的方法，其包括使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种。本文描述的方法中的任一种的一些实施例另外包括：用包含含有组织因子的蛋白质的液体装载亲和色谱树脂；使用一种或多种洗涤缓冲液洗涤亲和色谱树脂；和使用洗脱缓冲液洗脱含有组织因子的蛋白质。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，包含含有组织因子的蛋白质的液体为澄清的液体培养基。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，包含含有组织因子的蛋白质的液体包含细胞裂解物。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一种或多种洗涤缓冲液为：(i)包含磷酸盐缓冲盐水的第一洗涤缓冲液；和(ii)包含约0.01M至约0.2M柠檬酸盐并且pH为约4.5至约5.5的第二洗涤缓冲液。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，(i)第一洗涤缓冲液为磷酸盐缓冲盐水；和(ii)第二洗涤缓冲液为pH为5.0的0.1M柠檬酸盐。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，洗脱缓冲液包含0.01M至约0.2M乙酸盐并且pH为约2.5至约3.5。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，洗脱缓冲液包含0.1M乙酸盐并且pH为约2.9。
本文还提供制造含有组织因子的蛋白质的方法，其包括：(i)使用包括使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的本文描述的方法中的任一种纯化含有组织因子的蛋白质；和(ii)对从步骤(i)获得的洗脱液执行一个或多个另外的单元操作。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一个或多个另外的单元操作按顺序包含：执行低pH病毒灭活；执行深层过滤；执行精制色谱；执行纳滤；和执行超滤和渗滤(UF/DF)。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，含有组织因子的蛋白质为单链嵌合多肽。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽包含：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；和(iii)第二靶标结合结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽另外包含介于第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽另外包含介于可溶性组织因子结构域与第二靶标结合结构域之间的接头序列。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包含相同的氨基酸序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为抗原结合结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个结合到选自以下的组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体和CD28的受体。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白选自以下的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、FLT3L、MICA、MICB和ULP16结合蛋白。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体为可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155或可溶性CD28。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域为可溶性人组织因子结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:10至少80％相同的序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域不包含以下中的任一个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域包含以下中的一个或多个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽另外包含在其N和/或C端的一个或多个另外的靶标结合结构域。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，含有组织因子的蛋白质为多链嵌合多肽。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，多链嵌合多肽包含：(a)第一嵌合多肽，其包含：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；和(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；(b)第二嵌合多肽，其包含：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；和(ii)第二靶标结合结构域，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽通过一对亲和结构域中的第一结构域和第二结构域的结合而缔合。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽另外包含介于第一嵌合多肽中的第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域和一对亲和结构域中的第一结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽另外包含介于第一嵌合多肽中的可溶性组织因子结构域与一对亲和结构域中的第一结构域之间的接头序列。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一对亲和结构域中的第二结构域和第二靶标结合结构域在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽另外包含介于第二嵌合多肽中的一对亲和结构域中的第二结构域与第二靶标结合结构域之间的接头序列。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为抗原结合结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个特异性结合到选自以下的组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体和CD28的受体。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素或细胞因子蛋白。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素、细胞因子或配体蛋白选自以下的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素或细胞因子受体。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性受体为可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155或可溶性CD28。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽另外包含一个或多个另外的靶标结合结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽另外包含一个或多个另外的靶标结合结构域。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域为可溶性人组织因子结构域。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性人组织因子结构域包含与SEQ ID NO:10至少80％相同的序列。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域不包含以下中的任一个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域包含以下中的一个或多个：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一对亲和结构域是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的寿司结构域和可溶性IL-15。在本文描述的方法中的任一种的一些实施例中，一对亲和结构域选自由以下组成的组：芽胞杆菌核糖核酸酶和芽胞杆菌核糖核酸酶抑制子、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块以及基于蛋白质突触蛋白、突触结合蛋白、突触泡蛋白和SNAP25的相互作用的SNARE模块。
还提供通过本文描述的方法中的任一种制造的含有组织因子的蛋白质。本文还提供包括本文描述的制造的含有组织因子的蛋白质中的任一种的药物组合物。
如本文所用，术语“嵌合”是指多肽包括最初来源于两个不同来源(例如两种天然存在的不同蛋白质，例如来自相同或不同物种)的氨基酸序列(例如结构域)。例如，嵌合多肽可包括来自至少两种不同的天然存在的人蛋白质的结构域。在一些实例中，嵌合多肽可包括作为合成序列的结构域(例如，scFv)和衍生自天然存在的蛋白质(例如，天然存在的人蛋白质)的结构域。在一些实施例中，嵌合多肽可包括至少两个不同的结构域，其为合成序列(例如，两个不同的scFv)。
“抗原结合结构域”是能够特异性结合到一种或多种不同抗原的一个或多个蛋白质结构域(例如，由来自单个多肽的氨基酸形成或由来自两个或多于两个多肽(例如，相同或不同的多肽)的氨基酸形成)。在一些实例中，抗原结合结构域可能以与天然存在的抗体相似的特异性和亲和力结合到抗原或表位。在一些实施例中，抗原结合结构域可以是抗体或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域可以包括替代支架。本文描述抗原结合结构域的非限制性实例。抗原结合结构域的另外的实例是本领域已知的。
“可溶性组织因子结构域”是指与缺少跨膜结构域和细胞内结构域的野生型哺乳动物组织因子蛋白(例如，野生型人组织因子蛋白)的段具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％相同)的多肽。本文描述可溶性组织因子结构域的非限制性实例。
术语“可溶性白介素蛋白”在本文中用于指成熟并且分泌的白介素蛋白或其生物活性片段。在一些实例中，可溶性白介素蛋白可以包括与野生型成熟并且分泌的哺乳动物白介素蛋白(例如，野生型人白介素蛋白)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列，并且保留其生物活性。本文描述可溶性白介素蛋白的非限制性实例。
术语“可溶性细胞因子蛋白”在本文中用于指成熟并且分泌的细胞因子蛋白或其生物活性片段。在一些实例中，可溶性细胞因子蛋白可以包括与野生型成熟并且分泌的哺乳动物白介素蛋白(例如，野生型人白介素蛋白)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列，并且保留其生物活性。本文描述可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例。
术语“可溶性白介素受体”在本文中以最广泛的意义用于指一种多肽，其缺少能够结合一个或多个其天然配体(例如，在生理条件下，例如在室温下、在磷酸盐缓冲盐水中)的跨膜结构域(和任选的细胞内结构域)。例如，可溶性白介素受体可以包括与野生型白介素受体的细胞外结构域至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列，并且保留其特异性结合到一个或多个其天然配体的能力，但缺少其跨膜结构域(并且任选地，还缺少其细胞内结构域)。本文描述可溶性白介素受体的非限制性实例。
术语“可溶性细胞因子受体”在本文中以最广泛的意义用于指一种多肽，其缺少能够结合一个或多个其天然配体(例如，在生理条件下，例如在室温下、在磷酸盐缓冲盐水中)的跨膜结构域(和任选的细胞内结构域)。例如，可溶性细胞因子受体可以包括与野生型细胞因子受体的细胞外结构域至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列，并且保留其特异性结合到一个或多个其天然配体的能力，但缺少其跨膜结构域(并且任选地，还缺少其细胞内结构域)。本文描述了可溶性细胞因子受体的非限制性实例。
术语“抗体”在本文中以其最广泛的意义使用，并且包括某些类型的免疫球蛋白分子，其包括一个或多个特异性结合到抗原或表位的抗原结合结构域。抗体具体包括例如完整抗体(例如，完整免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。抗原结合结构域的一个实例是由VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。本文描述抗体的另外的实例。抗体的另外的实例是本领域已知的。
“亲和力”是指抗原结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文所用，“亲和力”是指固有结合亲和力，其反映抗原结合结构域与抗原或表位的成员之间的1:1相互作用。分子X与其配偶体Y的亲和力可以通过解离平衡常数(KD)表示。在下文中更详细地描述贡献于解离平衡常数的动力学组分。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包括本文描述的方法。亲和力可以例如使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如，
Figure BDA0003872947890000091
)或生物层干涉测量术(例如，
Figure BDA0003872947890000092
)来确定。确定对抗原结合结构域和其对应抗原或表位的亲和力的另外方法是本领域已知的。
如本文所用，“多链多肽”是指包含两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)蛋白链(例如，至少第一嵌合多肽和第二多肽)的多肽，其中两个或更多个蛋白链通过非共价键缔合形成四级结构。
如本文所用的“单链多肽”是指单蛋白质链。
术语“一对亲和结构域”是以小于小于1×10-7M(例如，小于1×10-8M、小于1×10- 9M、小于1×10-10M或小于1×10-11M)的KD彼此特异性结合的两个不同的蛋白质结构域。在一些实例中，一对亲和结构域可以是一对天然存在的蛋白质。在一些实施例中，一对亲和结构域可以是一对合成蛋白质。本文描述亲和结构域对的非限制性实例。
术语“表位”是指特异性结合到抗原结合结构域的抗原的一部分。表位可以例如由表面可接近的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合而非与后者的结合可能会丢失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基。鉴别与抗原结合结构域结合的表位的方法是本领域已知的。
术语“治疗”是指改善病症的至少一种症状。在一些实例中，所治疗的病症是癌症，并且改善癌症的至少一种症状包括减少异常增殖、基因表达、信号传导、翻译和/或因子的分泌。一般来说，治疗方法包括将治疗有效量的组合物给予需要或已确定为需要这种治疗的受试者，所述组合物减少病症的至少一种症状。
术语“纯化”意指为将蛋白质(例如，本文描述的示例性单链或多链嵌合多肽中的任一种)与含有蛋白质(例如，液体培养基蛋白质或存在于哺乳动物细胞中或从哺乳动物细胞分泌的一种或多种其它组分(例如，DNA、RNA、其它蛋白质、内毒素、病毒等))的流体中存在的一种或多种其它杂质(例如大量杂质)或组分分离而执行的步骤。可使用树脂、膜或结合蛋白质或污染物的任何其它固体载体执行纯化(例如，通过使用亲和色谱、疏水相互作用色谱、阴离子或阳离子交换色谱或分子筛色谱)。可使用至少一个色谱柱(例如，包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的本文描述的色谱柱中的任一个)从含有蛋白质的流体中纯化蛋白质。
术语“精制”为本领域术语并且意指从含有接近最终期望纯度的蛋白质(例如，本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种)的流体中去除剩余痕量或少量污染物或杂质而执行的步骤。举例来说，可通过使含有蛋白质的流体通过选择性结合蛋白质或存在于含有蛋白质的流体中的少量污染物或杂质的一个或多个色谱柱或一个或多个膜吸收器来执行精制。在这类实例中，一个或多个色谱柱或一个或多个膜吸收器的洗脱液/滤液含有蛋白质。
除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可以使用其他在本领域已知的合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过全文引用的方式并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包括定义)为准。
本发明的其它特征和优点将通过以下详细描述和附图以及通过权利要求书变得显而易见。
附图说明
图1为示出用于制造含有组织因子的蛋白质的示例性工作流的工作流示意图，其包括提供收获的细胞培养物(例如，基本上无细胞(例如，至少99％无细胞)的液体培养基)、使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种纯化含有组织因子的蛋白质、执行低pH病毒灭活、执行深层过滤、执行精制色谱、执行纳滤，和执行超滤/渗滤(在示意图中示出为“TFF/最终配制物”)。
图2为来自本文提供的示例性亲和色谱树脂(αTF抗体CNBr-琼脂糖凝胶亲和柱)的18t15-12s蛋白质的洗脱曲线，所述树脂用磷酸盐缓冲盐水平衡、装载、用磷酸盐缓冲盐水洗涤并且使用pH为2.9的0.1M乙酸洗脱。
图3为不同亲和色谱树脂制剂的配体密度对结合能力的曲线图，其示出抗组织因子抗体偶联密度与树脂对含有组织因子的蛋白质如18t15-12s蛋白质的结合能力之间的关系。
图4为示出使用本文提供的示例性亲和色谱树脂(抗组织因子CNBr-琼脂糖凝胶亲和柱)对18t15-12s纯化的洗涤条件进行优化的曲线图。每个实验都使用用磷酸盐缓冲盐水平衡、装载、用磷酸盐缓冲盐水洗涤并且使用pH为2.9的0.1M乙酸洗脱的柱执行。蓝色示出的数据不包括使用pH为5.0的0.1M柠檬酸钠的另外的5CV洗涤，而橙色的数据包括使用pH为5.0的0.1M柠檬酸钠的另外的5CV洗涤。
图5示出本文提供的新生成的示例性亲和色谱树脂(抗组织因子CNBr柱)的第一次运行的洗脱曲线，所述树脂通过用磷酸盐缓冲盐水平衡树脂、装载树脂、使用磷酸盐缓冲盐水洗涤树脂并且使用pH为2.9的0.1M乙酸洗脱树脂来纯化。
图6示出使用图5中使用的同一柱进行的第51次纯化运行的洗脱曲线。第51次纯化运行通过用磷酸盐缓冲盐水平衡柱、装载柱、用磷酸盐缓冲盐水洗涤柱并且使用pH为2.9的0.1M乙酸洗脱柱来执行。
图7示出承载活化间隔臂的NHS活化的琼脂糖凝胶高性能树脂的部分结构。
图8示出含有伯氨基(R-NH2)的蛋白质配体与NHS活化的琼脂糖凝胶树脂的偶联。
图9示出来自本文提供的示例性亲和色谱树脂(抗组织因子CNBr柱)的TGFRt15-TGFRs洗脱曲线的色谱图。深灰色线为在280nm处的吸光度，并且浅灰色线表示使用洗脱缓冲液(pH为2.9的0.1M乙酸)。
图10示出来自本文提供的示例性亲和色谱树脂(抗组织因子CNBr柱)的2t2洗脱曲线的色谱图。深灰色线为在280nm处的吸光度，并且浅灰色线表示使用洗脱缓冲液(pH为2.9的0.1M乙酸)。
具体实施方式
本文提供一种亲和色谱树脂，其包含附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段，所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO:1、2或9和3的CDR的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:4、5和6的CDR的轻链可变结构域。
本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的试剂盒。本文还提供纯化含有组织因子的蛋白质的方法，其包含使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种。本文还提供制造含有组织因子的蛋白质的方法，其包含：(i)使用本文描述的纯化含有组织因子的蛋白质的方法中的任一种纯化含有组织因子的蛋白质；和(ii)对从步骤(i)获得的洗脱液执行一个或多个另外的单元操作。本文还提供通过本文描述的方法中的任一种制造的含有组织因子的蛋白质。本文还提供包含本文描述的制造的含有组织因子的蛋白质中的任一种的药物组合物。
在一些实施例中，如本文描述的亲和色谱树脂对含有组织因子的蛋白质的结合能力可为约0.5mg/mL至约6.0mg/mL(例如，约0.5mg/mL至约5.5mg/mL、约0.5mg/mL至约5.0mg/mL、约0.5mg/mL至约4.5mg/mL、约0.5mg/mL至约4.0mg/mL、约0.5mg/mL至约3.5mg/mL、约0.5mg/mL至约3.0mg/mL、约0.5mg/mL至约2.5mg/mL、约0.5mg/mL至约2.0mg/mL、约0.5mg/mL至约1.5mg/mL、约0.5mg/mL至约1.0mg/mL、约1.0mg/mL至约6.0mg/mL、约1.0mg/mL至约5.5mg/mL、约1.0mg/mL至约5.0mg/mL、约1.0mg/mL至约4.5mg/mL、约1.0mg/mL至约4.0mg/mL、约1.0mg/mL至约3.5mg/mL、约1.0mg/mL至约3.0mg/mL、约1.0mg/mL至约2.5mg/mL、约1.0mg/mL至约2.0mg/mL、约1.0mg/mL至约1.5mg/mL、约1.5mg/mL至约6.0mg/mL、约1.5mg/mL至约5.5mg/mL、约1.5mg/mL至约5.0mg/mL、约1.5mg/mL至约4.5mg/mL、约1.5mg/mL至约4.0mg/mL、约1.5mg/mL至约3.5mg/mL、约1.5mg/mL至约3.0mg/mL、约1.5mg/mL至约2.5mg/mL、约1.5mg/mL至约2.0mg/mL、约2.0mg/mL至约6.0mg/mL、约2.0mg/mL至约5.5mg/mL、约2.0mg/mL至约5.0mg/mL、约2.0mg/mL至约4.5mg/mL、约2.0mg/mL至约4.0mg/mL、约2.0mg/mL至约3.5mg/mL、约2.0mg/mL至约3.0mg/mL、约2.0mg/mL至约2.5mg/mL、约2.5mg/mL至约6.0mg/mL、约2.5mg/mL至约5.5mg/mL、约2.5mg/mL至约5.0mg/mL、约2.5mg/mL至约4.5mg/mL、约2.5mg/mL至约4.0mg/mL、约2.5mg/mL至约3.5mg/mL、约2.5mg/mL至约3.0mg/mL、约3.0mg/mL至约6.0mg/mL、约3.0mg/mL至约5.5mg/mL、约3.0mg/mL至约5.0mg/mL、约3.0mg/mL至约4.5mg/mL、约3.0mg/mL至约4.0mg/mL、约3.0mg/mL至约3.5mg/mL、约3.5mg/mL至约6.0mg/mL、约3.5mg/mL至约5.5mg/mL、约3.5mg/mL至约5.0mg/mL、约3.5mg/mL至约4.5mg/mL、约3.5mg/mL至约4.0mg/mL、约4.0mg/mL至约6.0mg/mL、约4.0mg/mL至约5.5mg/mL、约4.0mg/mL至约5.0mg/mL、约4.0mg/mL至约4.5mg/mL、约4.5mg/mL至约6.0mg/mL、约4.5mg/mL至约5.5mg/mL、约4.5mg/mL至约5.0mg/mL、约5.0mg/mL至约6.0mg/mL、约5.0mg/mL至约5.5mg/mL或约5.5mg/mL至约6.0mg/mL)。
如本文所用，“亲和色谱”是指基于抗原和抗体、酶和底物、受体和配体、或蛋白质和核酸之间的高度特异性相互作用来分离溶液或混合物的方法。亲和色谱(例如，蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或金属螯合物亲和色谱)为特异性纯化靶蛋白质的有效方法，其具有高产量回收和低水平的污染蛋白质和起始混合物中的其它组分如细胞培养物上清液、血清和血浆。一旦获得包含靶蛋白质的澄清液体或混合物，亲和色谱就可与一种或多种不同纯化技术(例如，离子交换分离、疏水相互作用分离)的组合一起用于纯化靶蛋白质。
基于抗体(例如，单克隆或多克隆)的免疫亲和色谱已广泛用作研究、开发和制造领域中纯化特异性抗原或含有抗原的蛋白质(例如，含有人组织因子的蛋白质)的方法/过程。对于免疫亲和方法，将抗体(例如，单克隆)或抗体混合物(例如，多克隆)共价固定(例如，偶联)到固体载体材料如CNBr活化的琼脂糖凝胶、NHS-琼脂糖凝胶和适用于蛋白质偶联或固定的其它相关珠/树脂上。固体载体材料为共价附接到生物特异性配体的任何材料，其中在亲和色谱中使用的材料的实例包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、乳胶和受控微孔玻璃。有用的载体材料可具有如高表面积与体积比、易于为配体的共价附接而修饰的化学基团、最小的非特异性结合特性、良好的流动特征以及机械和化学稳定性的特性。
组织因子
人组织因子是263个氨基酸的跨膜蛋白，其含有三个结构域：(1)219个氨基酸的N端胞外结构域(残基1-219)；(2)22个氨基酸的跨膜结构域(残基220-242)；和(3)21个氨基酸的胞质C端尾(残基242-263)((UniProtKB标识符编号：P13726)。胞质尾在Ser253和Ser258处含有两个磷酸化位点，在Cys245处含有一个S-棕榈酰化位点。没有发现胞质结构域的缺失或突变影响组织因子凝血活性。组织因子在蛋白质胞内结构域中Cys245处具有一个S-棕榈酰化位点。Cys245位于胞内结构域的氨基酸端，并且靠近膜表面。组织因子跨膜结构域由单跨度的α-螺旋构成。
由两个纤连蛋白III型结构域构成的组织因子的细胞外结构域通过六氨基酸接头与跨膜结构域连接。这一接头提供构象灵活性，以使组织因子细胞外结构域与其跨膜结构域和胞质结构域解偶联。每个组织因子纤连蛋白III型模块均由两个重叠的β折叠构成，其中顶层折叠结构域含有三个反平行的β链，而底层折叠含有四个β链。β链通过β环在链βA和βB、βC和βD以及βE和βF之间连接，其在两个模块中均构象保守。有三个短的α螺旋段连接β链。组织因子的独特特征是链β10与链β11之间的17个氨基酸的β-发夹，这不是纤连蛋白超家族的常见成分。N端结构域还在β6F与β7G之间含有一个12个氨基酸的环，所述环不存在于C端结构域，并且是组织因子特有的。这种纤连蛋白III型结构域结构是免疫球蛋白样家族蛋白质折叠的特征，并且在广泛多种细胞外蛋白中是保守的。
一旦酶原FVII与组织结合形成活性组织因子-FVIIa复合物，就可通过有限的蛋白水解将其迅速转化成FVIIa。FVIIa以大约0.1nM(血浆FVII的1％)的浓度作为酶循环，也可以直接结合到组织因子。组织因子与FVIIa在组织因子-FVIIa复合物上的变构相互作用极大地增加了FVIIa的酶促活性：小的发色肽基底物的水解速率增加约20到100倍，并且天然大分子底物FIX和FX的激活速率增加接近一百万倍。与结合到组织因子时FVIIa活性位点的变构激活相一致，磷脂双层上组织因子-FVIIa复合物的形成(即，当磷脂酰基-L-丝氨酸暴露在膜表面时)以Ca2+依赖性方式将FIX或FX激活速率再增加1,000倍。相对于游离FVIIa，组织因子-FVIIa-磷脂复合物对FX激活的大约百万倍总体增加是凝血级联反应的关键调节点。
FVII是约50kDa的单链多肽，由406个氨基酸残基组成，具有N端富含γ-羧基谷氨酸(GLA)的结构域、两个表皮生长因子样结构域(EGF1和EFG2)和C端丝氨酸蛋白酶结构域。FVII通过在EGF2与蛋白酶结构域之间的短接头区中Ile-154-Arg152键的特异性蛋白水解裂解而被激活为FVIIa。这种裂解引起轻链和重链通过Cys135和Cys262的单个二硫键固定在一起。FVIIa通过其N端GLA结构域以Ca2+依赖性方式结合磷脂膜。GLA结构域的C端紧邻芳香族堆叠和两个EGF结构域。芳香族堆叠将GLA连接到结合单个Ca2+离子的EGF1结构域。占用这一Ca2+结合位点会增加FVIIa酰胺分解活性和组织因子缔合。催化三联体由His193、Asp242和Ser344组成，并且FVIIa蛋白酶结构域内单个Ca2+离子的结合对其催化活性至关重要。FVII对FVIIa的蛋白水解激活释放了Ile153处新形成的氨基端，使其向后折叠并且插入激活袋中，与Asp343的羧酸盐形成盐桥，以生成氧阴离子孔。这一盐桥的形成对于FVIIa活性至关重要。但是，在蛋白水解激活后，游离的FVIIa中不会发生氧阴离子孔的形成。结果，FVIIa以酶原样状态循环，血浆蛋白酶抑制剂不能很好识别所述状态，使其以大约90分钟的半衰期循环。
FVIIa活性位点在膜表面上方的组织因子介导的定位对于FVIIa朝向同源底物很重要。游离FVIIa在结合到膜上时采用稳定扩展结构，其活性位点定位在膜表面上方约
Figure BDA0003872947890000151
FVIIa与组织因子结合后，FVa活性位点将重新定位为更靠近膜约
Figure BDA0003872947890000152
这种调节可帮助FVIIa催化三联体与靶标底物裂解位点适当对齐。使用无GLA结构域的FVIIa，已显示活性位点仍位于膜上方相似的距离，证明即使在没有FVIIa-膜相互作用的情况下，组织因子也能够完全支持FVIIa活性位点定位。另外的数据显示，只要组织因子细胞外结构域以某种方式系栓到膜表面，组织因子就支持完全FVIIa蛋白水解活性。但是，将FVIIa的活性位点提高到膜表面上方大于
Figure BDA0003872947890000153
会大大降低组织因子-FVIIa复合物激活FX的能力，但不会降低组织因子-FVIIa的酰胺分解活性。
丙氨酸扫描诱变已用于评定组织因子细胞外结构域中特定氨基酸侧链对与FVIIa相互作用的作用(Gibbs等人,《生物化学(Biochemistry)》33(47):14003-14010,1994；Schullek等人,《生物化学杂志(J Biol Chem)》269(30):19399-19403,1994)。丙氨酸取代鉴别出有限数量的残基位置，在这些位置处，丙氨酸置换引起对FVIIa结合的亲和力降低5到10倍。发现这些残基侧链中的大多数在晶体结构中充分暴露于溶剂，与大分子配体相互作用一致。FVIIa配体结合位点位于两个模块之间边界处的宽广区上。在C模块中，位于突出的B-C环上的残基Arg135和Phe140提供与FVIIa的独立接触。Leu133位于手指状结构的基底部，并且挤入两个模块之间的裂缝中。这提供由Lys20、Thr60、Asp58和Ile22组成的重要结合残基的主要簇的连续性。Thr60仅部分暴露于溶剂，并且可能起局部结构作用，而不是与配体显著接触。结合位点延伸到模块间角的凹面，其涉及Glu24和Gln110，并且可能涉及更远的残基Val207。结合区从Asp58延伸到由Lys48、Lys46、Gln37、Asp44和Trp45形成的凸表面区。Trp45和Asp44不会独立地与FVIIa相互作用，表明Trp45位置处的突变效应可能反映这一侧链对邻近Asp44和Gln37侧链的局部堆积的结构重要性。相互作用区还包括两个表面暴露的芳香族残基Phe76和Tyr78，其在N模块中形成疏水簇的一部分。
组织因子-FVIIa的已知生理底物是FVII、FIX和FX以及某些蛋白酶激活受体。突变分析已鉴别出许多残基，当突变时，所述残基支持对小肽基底物的完全FVIIa酰胺分解活性，但缺少支持大分子底物(即，FVII、FIX和FX)激活的能力(Ruf等人,《生物化学杂志》267(31):22206-22210,1992；Ruf等人,《生物化学杂志》267(9):6375-6381,1992；Huang等人,《生物化学杂志》271(36):21752-21757,1996；Kirchhofer等人,《生物化学》39(25):7380-7387,2000)。已显示在残基159-165处的组织因子环区和在这一柔性环中或附近的残基对于组织因子-FVIIa复合物的蛋白水解活性至关重要。这定义了提出的组织因子的底物结合位点外区，所述区与FVIIa活性位点相距甚远。甘氨酸残基被稍大的残基丙氨酸取代会大大损害组织因子-FVIIa的蛋白水解活性。这表明甘氨酸提供的柔性对于用于组织因子大分子底物识别的残基159-165的环至关重要。
还证明了残基Lys165和Lys166对于底物识别和结合很重要。这些残基中的任何一个突变为丙氨酸均会引起组织因子辅助因子功能的显著降低。在大多数组织因子-FVIIa结构中，Lys165和Lys166彼此背对，Lys165指向FVIIa，而Lys166指向晶体结构中的底物结合位点外区。FVIIa的Lys165和Gla35之间的推定盐桥形成将支持组织因子与FVIIa的GLA结构域相互作用调节底物识别的观点。这些结果表明，组织因子胞外结构域的C端部分直接与FIX和FX的GLA结构域、可能的邻近EGF1结构域相互作用，并且FVIIa GLA结构域的存在可以直接或间接调节这些相互作用。
抗组织因子抗体和抗原结合抗体片段
在一些实例中，抗组织因子抗体为人源化或完全人抗组织因子抗体(参见例如美国专利号7,968,094和美国专利号8,007,795中描述的抗组织因子抗体)。
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链可变结构域，其包括以下一组CDR序列：包括DYNVY(SEQ ID NO:1)的CDR1；包括YIDPYNGITIYDQNFKG(SEQ ID NO:2)的CDR2；以及包括DVTTALDF(SEQ ID NO:3)的CDR3。
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链可变结构域，其包括以下一组CDR序列：包括DYNVY(SEQ ID NO:1)的CDR1；包括YIDPYNGITIYDQNLKG(SEQ ID NO:9)的CDR2；以及包括DVTTALDF(SEQ ID NO:3)的CDR3。
示例性重链可变结构域(SEQ ID NO:7)QIQLVQSGGEVKKPGASVRVSCKASGYSFTDYNVYWVRQSPGKGLEWIGYIDPYNGITIYDQNFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARDVTTALDFWGQGTTVTVSS
示例性重链(SEQ ID NO:127)QIQLVQSGGEVKKPGASVRVSCKASGYSFTDYNVYWVRQSPGKGLEWIGYIDPYNGITIYDQNFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARDVTTALDFWGQGTTVTVSSEFASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
编码示例性重链的cDNA(SEQ ID NO:128)CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAGGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGACTACAACGTGTACTGGGTGAGGCAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCCTACAACGGCATCACCATCTACGACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGGGACGTGACCACCGCCCTGGACTTCTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGCGAGTTCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAGTGA
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链可变结构域，其包括与SEQ ID NO:7至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链可变结构域，其包括与SEQ ID NO:127至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括轻链可变结构域，其包括以下一组CDR序列：包括LASQTIDTWLA(SEQ ID NO:4)的CDR1；包括AATNLAD(SEQ ID NO:5)的CDR2；以及包括QQVYSSPFT(SEQ ID NO:6)的CDR3。
示例性轻链可变结构域(SEQIDNO:8)DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCLASQTIDTWLAWYLQKPGKSPQLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLQPEDFATYYCQQVYSSPFTFGQGTKLEIK
示例性轻链(SEQIDNO:129)DIQMTQSPASLSASVGRVTITCLASQTIDTWLAWLQKPGKSPQLLIYAATNLDGVPSRFSGSGSGTDFSFISSLQPEDFATYYCQQVYSSPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
编码示例性轻链的cDNA(SEQIDNO:130)GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCCTGGCCAGCCAGACCATCGACACCTGGCTGGCCTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCAAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACGCCGCCACCAACCTGGCCGACGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCAGCTTCAACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTGTACTAGCAGCCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGCTGA
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括轻链可变结构域，其包括与SEQ ID NO:8至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括轻链可变结构域，其包括与SEQ ID NO:129至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
抗组织因子抗体的非限制性实例可包括：重链可变结构域，其包括与SEQ ID NO:7至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列，以及轻链可变结构域，其包括与SEQ ID NO:8至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
抗组织因子抗体的非限制性实例可包括：重链可变结构域，其包括与SEQ ID NO:127至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列，以及轻链可变结构域，其包括与SEQ ID NO:129至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
在本文描述的抗组织因子抗体中的任一种的一些实施例中，抗组织因子抗体以以下结合常数(KD)结合到组织因子：约0.1nM至约1μM(例如，约0.1nM至约800nM、约0.1nM至约750nM、约0.1nM至约700nM、约0.1nM至约650nM、约0.1nM至约600nM、约0.1nM至约550nM、约0.1nM至约500nM、约0.1nM至约450nM、约0.1nM至约400nM、约0.1nM至约350nM、约0.1nM至约300、约0.1nM至约250nM、约0.1nM至约200nM、约0.1nM至约150nM、约0.1nM至约100nM、约0.1nM至约80nM、约0.1nM至约60nM、约0.1nM至约50nM、约0.1nM至约40nM、约0.1nM至约25nm、约0.1nM至约20nM、约0.1nM至约15nM、约0.1nM至约10nM、约0.1nM至约8nM、约0.1nM至约6nM、约0.1nM至约5nM、约0.1nM至约4nM、约0.1nM至约3nM、约0.1nM至约2nM、约0.1nM至约1nM、约0.1nM至约0.8nM、约0.1nM至约0.6nM、约0.1nM至约0.4nM、约0.1nM至约0.2nM；约0.2nM至约1μM、约0.2nM至约800nM、约0.2nM至约750nM、约0.2nM至约700nM、约0.2nM至约650nM、约0.2nM至约600nM、约0.2nM至约550nM、约0.2nM至约500nM、约0.2nM至约450nM、约0.2nM至约400nM、约0.2nM至约350nM、约0.2nM至约300、约0.2nM至约250nM、约0.2nM至约200nM、约0.2nM至约150nM、约0.2nM至约100nM、约0.2nM至约80nM、约0.2nM至约60nM、约0.2nM至约50nM、约0.2nM至约40nM、约0.2nM至约25nm、约0.2nM至约20nM、约0.2nM至约15nM、约0.2nM至约10nM、约0.2nM至约8nM、约0.2nM至约6nM、约0.2nM至约5nM、约0.2nM至约4nM、约0.2nM至约3nM、约0.2nM至约2nM、约0.2nM至约1nM、约0.2nM至约0.8nM、约0.2nM至约0.6nM、约0.2nM至约0.4nM、约0.2nM至约0.2nM、约0.4nM至约1μM、约0.4nM至约800nM、约0.4nM至约750nM、约0.4nM至约700nM、约0.4nM至约650nM、约0.4nM至约600nM、约0.4nM至约550nM、约0.4nM至约500nM、约0.4nM至约450nM、约0.4nM至约400nM、约0.4nM至约350nM、约0.4nM至约300、约0.4nM至约250nM、约0.4nM至约200nM、约0.4nM至约150nM、约0.4nM至约100nM、约0.4nM至约80nM、约0.4nM至约60nM、约0.4nM至约50nM、约0.4nM至约40nM、约0.4nM至约25nm、约0.4nM至约20nM、约0.4nM至约15nM、约0.4nM至约10nM、约0.4nM至约8nM、约0.4nM至约6nM、约0.4nM至约5nM、约0.4nM至约4nM、约0.4nM至约3nM、约0.4nM至约2nM、约0.4nM至约1nM、约0.4nM至约0.8nM、约0.4nM至约0.6nM、约0.5nM至约1μM、约0.5nM至约800nM、约0.5nM至约750nM、约0.5nM至约700nM、约0.5nM至约650nM、约0.5nM至约600nM、约0.5nM至约550nM、约0.5nM至约500nM、约0.5nM至约450nM、约0.5nM至约400nM、约0.5nM至约350nM、约0.5nM至约300、约0.5nM至约250nM、约0.5nM至约200nM、约0.5nM至约150nM、约0.5nM至约100nM、约0.5nM至约80nM、约0.5nM至约60nM、约0.5nM至约50nM、约0.5nM至约40nM、约0.5nM至约25nm、约0.5nM至约20nM、约0.5nM至约15nM、约0.5nM至约10nM、约0.5nM至约8nM、约0.5nM至约6nM、约0.5nM至约5nM、约0.5nM至约4nM、约0.5nM至约3nM、约0.5nM至约2nM、约0.5nM至约1nM、约0.5nM至约0.8nM、约0.5nM至约0.6nM、约0.6nM至约1μM、约0.6nM至约800nM、约0.6nM至约750nM、约0.6nM至约700nM、约0.6nM至约650nM、约0.6nM至约600nM、约0.6nM至约550nM、约0.6nM至约500nM、约0.6nM至约450nM、约0.6nM至约400nM、约0.6nM至约350nM、约0.6nM至约300、约0.6nM至约250nM、约0.6nM至约200nM、约0.6nM至约150nM、约0.6nM至约100nM、约0.6nM至约80nM、约0.6nM至约60nM、约0.6nM至约50nM、约0.6nM至约40nM、约0.6nM至约25nm、约0.6nM至约20nM、约0.6nM至约15nM、约0.6nM至约10nM、约0.6nM至约8nM、约0.6nM至约6nM、约0.6nM至约5nM、约0.6nM至约4nM、约0.6nM至约3nM、约0.6nM至约2nM、约0.6nM至约1nM、约0.6nM至约0.8nM、约1nM至约1μM、约1nM至约800nM、约1nM至约750nM、约1nM至约700nM、约1nM至约650nM、约1nM至约600nM、约1nM至约550nM、约1nM至约500nM、约1nM至约450nM、约1nM至约400nM、约1nM至约350nM、约1nM至约300、约1nM至约250nM、约1nM至约200nM、约1nM至约150nM、约1nM至约100nM、约1nM至约80nM、约1nM至约60nM、约1nM至约50nM、约1nM至约40nM、约1nM至约25nm、约1nM至约20nM、约1nM至约15nM、约1nM至约10nM、约1nM至约8nM、约1nM至约6nM、约1nM至约5nM、约1nM至约4nM、约1nM至约3nM、约1nM至约2nM、约2nM至约1μM、约2nM至约800nM、约2nM至约750nM、约2nM至约700nM、约2nM至约650nM、约2nM至约600nM、约2nM至约550nM、约2nM至约500nM、约2nM至约450nM、约2nM至约400nM、约2nM至约350nM、约2nM至约300、约2nM至约250nM、约2nM至约200nM、约2nM至约150nM、约2nM至约100nM、约2nM至约80nM、约2nM至约60nM、约2nM至约50nM、约2nM至约40nM、约2nM至约25nm、约2nM至约20nM、约2nM至约15nM、约2nM至约10nM、约2nM至约8nM、约2nM至约6nM、约2nM至约5nM、约2nM至约4nM、约2nM至约3nM、约5nM至约1μM、约5nM至约800nM、约5nM至约750nM、约5nM至约700nM、约5nM至约650nM、约5nM至约600nM、约5nM至约550nM、约5nM至约500nM、约5nM至约450nM、约5nM至约400nM、约5nM至约350nM、约5nM至约300、约5nM至约250nM、约5nM至约200nM、约5nM至约150nM、约5nM至约100nM、约5nM至约80nM、约5nM至约60nM、约5nM至约50nM、约5nM至约40nM、约5nM至约25nm、约5nM至约20nM、约5nM至约15nM、约5nM至约10nM、约5nM至约8nM、约5nM至约6nM、约10nM至约1μM、约10nM至约800nM、约10nM至约750nM、约10nM至约700nM、约10nM至约650nM、约10nM至约600nM、约10nM至约550nM、约10nM至约500nM、约10nM至约450nM、约10nM至约400nM、约10nM至约350nM、约10nM至约300、约10nM至约250nM、约10nM至约200nM、约10nM至约150nM、约10nM至约100nM、约10nM至约80nM、约10nM至约60nM、约10nM至约50nM、约10nM至约40nM、约10nM至约25nm、约10nM至约20nM、约10nM至约15nM、约20nM至约1μM、约20nM至约800nM、约20nM至约750nM、约20nM至约700nM、约20nM至约650nM、约20nM至约600nM、约20nM至约550nM、约20nM至约500nM、约20nM至约450nM、约20nM至约400nM、约20nM至约350nM、约20nM至约300、约20nM至约250nM、约20nM至约200nM、约20nM至约150nM、约20nM至约100nM、约20nM至约80nM、约20nM至约60nM、约20nM至约50nM、约20nM至约40nM、约50nM至约1μM、约50nM至约800nM、约50nM至约750nM、约50nM至约700nM、约50nM至约650nM、约50nM至约600nM、约50nM至约550nM、约50nM至约500nM、约50nM至约450nM、约50nM至约400nM、约50nM至约350nM、约50nM至约300、约50nM至约250nM、约50nM至约200nM、约50nM至约150nM、约50nM至约100nM、约50nM至约80nM、约100nM至约1μM、约100nM至约800nM、约100nM至约750nM、约100nM至约700nM、约100nM至约650nM、约100nM至约600nM、约100nM至约550nM、约100nM至约500nM、约100nM至约450nM、约100nM至约400nM、约100nM至约350nM、约100nM至约300、约100nM至约250nM、约100nM至约200nM、约100nM至约150nM、约250nM至约1μM、约250nM至约800nM、约250nM至约750nM、约250nM至约700nM、约250nM至约650nM、约250nM至约600nM、约250nM至约550nM、约250nM至约500nM、约250nM至约450nM、约250nM至约400nM、约250nM至约350nM、约250nM至约300、约400nM至约1μM、约400nM至约800nM、约400nM至约750nM、约400nM至约700nM、约400nM至约650nM、约400nM至约600nM、约400nM至约550nM、约400nM至约500nM、约400nM至约450nM、约500nM至约1μM、约500nM至约800nM、约500nM至约750nM、约500nM至约700nM、约500nM至约650nM、约500nM至约600nM、约500nM至约550nM、约600nM至约1μM、约600nM至约800nM、约600nM至约750nM、约600nM至约700nM、约600nM至约650nM、约750nM至约1μM、约750nM至约800nM、约800nM至约1μM或约950nM至约1μM)。
在一些实施例中，抗组织因子抗体可为IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)(例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4)、IgA(例如，人IgA)、IgE(例如，人IgE)或IgM(例如，人IgM)。
在一些实施例中，抗组织因子抗体为人或人源化IgG1抗体。在一些实施例中，抗组织因子抗体为人或人源化IgG4抗体。
在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括IgG1 Fc区。在一些实施例中，抗组织因子抗体可包括重链恒定结构域，其包含与SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。
重链恒定区(SEQ ID NO:102)EFASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
重链恒定区(SEQ ID NO:103)EFASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
亲和色谱树脂
本文提供一种亲和色谱树脂，其包含附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段，所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO:1、2或9和3的CDR的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:4、5和6的CDR的轻链可变结构域。在一些实施例中，重链可变结构域包含与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列，并且轻链可变结构域包含与SEQ IDNO:8至少90％相同的序列。在一些实施例中，重链可变结构域包含SEQ ID NO:7，并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8。
在一些实施例中，基础树脂为琼脂糖凝胶。在一些实施例中，基础树脂为Capto或琼脂糖。在一些实施例中，基础树脂(或基质或固定相)为天然聚合物，其包括但不限于纤维素、琼脂糖或壳聚糖；合成聚合物，其包括但不限于丙烯酰胺和乙烯基共聚物、丙烯酸聚合物或聚甲基丙烯酸酯、聚(苯乙烯-二乙烯基-苯)共聚物；或无机材料，其包括但不限于羟基磷灰石、二氧化硅、玻璃或氧化锆。在一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段非共价附接到基础树脂。在一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段共价附接到基础树脂。在一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在抗组织因子抗体或其抗原结合片段中的半胱氨酸和基础树脂上的化学基团之间形成二硫键而共价附接到基础树脂。在一些实施例中，抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在抗组织因子抗体或抗原结合结构域的游离胺和基础树脂上的化学基团之间形成共价键而共价附接到基础树脂。在一些实施例中，基础树脂为CNBr活化的或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的固体载体材料。在一些实施例中，共价键由下式I表示：
Figure BDA0003872947890000241
其中，R表示抗组织因子抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，NHS活化的琼脂糖凝胶被设计用于共价偶联含有伯氨基(最常见的附接形式)的配体(通常为抗原或抗体)。在一些实施例中，NHS活化的琼脂糖凝胶的基质基于具有由表氯醇附接并且由N-羟基琥珀酰亚胺活化的10个原子间隔臂(6-氨基己酸)的高度交联的琼脂糖珠(图7)。在一些实施例中，NHS活化的琼脂糖凝胶4Fast Flow的基质基于具有14个原子间隔臂的高度交联的琼脂糖珠。在一些实施例中，由于基础基质的优异亲水性，蛋白质对NHS活化的琼脂糖凝胶的非特异性吸附(这可降低靶蛋白质的结合能力)可忽略不计。在一些实施例中，基质在高pH下为稳定的以允许严格的洗涤程序(取决于偶联配体的pH稳定性)。在一些实施例中，含有氨基的配体如蛋白质通过酯键处的亲核攻击而快速并且自发地偶联，以产生非常稳定的酰胺键(图8)。在一些实施例中，酰胺键在高达13.0的pH下为稳定的，这使得NHS活化的琼脂糖凝胶适用于需要高pH条件的应用。
在一些实施例中，CNBr-活化的琼脂糖凝胶为预活化树脂，其用于通过溴化氰方法将抗体或其它含有-NH2基团的大蛋白质偶联到琼脂糖凝胶培养基上，而无需中间间隔臂。在一些实施例中，CNBr-活化的琼脂糖凝胶用于通过将抗体或其它含有-NH2基团的大蛋白质偶联到CNBr-活化的琼脂糖凝胶的基质来固定它们。在一些实施例中，CNBr-活化的琼脂糖凝胶4Fast Flow为通过使琼脂糖凝胶4Fast Flow与溴化氰(CNBr)反应产生的珠状、高度交联的预活化基质。在一些实施例中，CNBr活化的琼脂糖凝胶4Fast Flow基于以固定化单克隆抗体作为配体的抗原-抗体反应。
在一些实施例中，试剂盒包含本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的亲和色谱树脂。
基于抗体(例如，单克隆或多克隆)的免疫亲和色谱为广泛使用的方法/过程，以使用包含附接到基础树脂的抗体或抗原结合片段的亲和色谱树脂纯化特异性抗原或含有抗原的蛋白质(例如，含有人组织因子的蛋白质)。对于免疫亲和方法，将抗体(例如，单克隆)或抗体混合物(例如，多克隆)共价固定(例如，偶联)到固体载体材料(例如，基础树脂)如CNBr活化的琼脂糖凝胶、NHS-琼脂糖凝胶和适用于蛋白质偶联或固定的其它相关珠/树脂上。在一些实施例中，基础树脂为共价附接到生物特异性配体的任何材料。在一些实施例中，基础树脂为非共价附接到生物特异性配体的任何材料。在一些实施例中，用于亲和色谱的基础树脂的实例包括琼脂糖、Capto、纤维素、陶瓷、葡聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、二氧化硅、乳胶、受控微孔玻璃和合成/有机聚合物。有用的基础树脂可具有如高表面积与体积比、易于为配体的共价附接而修饰的化学基团、最小的非特异性结合特性、良好的流动特征以及机械和化学稳定性的特性。
在一些实施例中，基础树脂为巯基偶联树脂，其中抗体或其抗原结合片段通过基础树脂上的游离巯基和碘乙酰基共价附接到基础树脂。在一些实施例中，基础树脂为胺偶联树脂，其中胺偶联树脂具有反应性醛基，其与伯胺反应以形成席夫碱，然后用合适的还原剂(例如，氰基硼氢化钠)还原以在抗体或其抗原结合片段与基础树脂之间形成共价键。在一些实施例中，基础树脂为NHS活化的树脂，其中抗体或抗原结合片段通过反应性NHS基团和伯胺结合到树脂，以形成共价键。在一些实施例中，基础树脂为固定化蛋白质A、固定化蛋白质B或固定化蛋白质A/G，其中基础树脂结合抗体或其抗原结合片段的恒定结构域，确保抗原结合结构域背对最佳结合的基础树脂。
在一些实施例中，色谱柱用于亲和色谱，其中色谱柱包含选自由以下组成的组的亲和色谱树脂：CNBr-活化的琼脂糖凝胶、NHS-琼脂糖凝胶、琼脂糖、Capto、纤维素、陶瓷、葡聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、二氧化硅、乳胶、受控微孔玻璃和合成/有机聚合物。
纯化含有组织因子的蛋白质的方法
本文提供纯化含有组织因子的蛋白质的方法，其包含使用本文描述的亲和色谱树脂中的任一种。在一些实施例中，方法包含：用包含含有组织因子的蛋白质的液体装载亲和色谱树脂；使用一种或多种洗涤缓冲液洗涤亲和色谱树脂；和使用洗脱缓冲液洗脱含有组织因子的蛋白质。在一些实施例中，包含含有组织因子的蛋白质的液体为澄清的液体培养基。在一些实施例中，包含含有组织因子的蛋白质的液体包含细胞裂解物。
在一些实施例中，一种或多种洗涤缓冲液为：(i)包含磷酸盐缓冲盐水的第一洗涤缓冲液；和(ii)包含约0.01M至约0.2M柠檬酸盐并且pH为约4.5至约5.5的第二洗涤缓冲液。在一些实施例中，第一洗涤缓冲液为磷酸盐缓冲盐水，和第二洗涤缓冲液为pH为5.0的0.1M柠檬酸盐。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含0.01M至约0.2M乙酸盐并且pH为约2.5至约3.5。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含0.1M乙酸盐并且pH为约2.9。
在一些实施例中，第二洗涤缓冲液包含约0.01M至约0.2M(例如，约0.01M至约0.18M、约0.01M至约0.16M、约0.01M至约0.14M、约0.01M至约0.12M、约0.01M至约0.1M、约0.01M至约0.08M、约0.01M至约0.06M、约0.01M至约0.05M、约0.01M至约0.04M、约0.01M至约0.03M、约0.01M至约0.02M、约0.02M至约0.2M、约0.02M至约0.18M、约0.02M至约0.16M、约0.02M至约0.14M、约0.02M至约0.12M、约0.02M至约0.1M、约0.02M至约0.08M、约0.02M至约0.06M、约0.02M至约0.05M、约0.02M至约0.04M、约0.02M至约0.03M、约0.03M至约0.2M、约0.03M至约0.18M、约0.03M至约0.16M、约0.03M至约0.14M、约0.03M至约0.12M、约0.03M至约0.1M、约0.03M至约0.08M、约0.03M至约0.06M、约0.03M至约0.05M、约0.03M至约0.04M、约0.04M至约0.2M、约0.04M至约0.18M、约0.04M至约0.16M、约0.04M至约0.14M、约0.04M至约0.12M、约0.04M至约0.1M、约0.04M至约0.08M、约0.04M至约0.06M、约0.04M至约0.05M、约0.05M至约0.2M、约0.05M至约0.18M、约0.05M至约0.16M、约0.05M至约0.14M、约0.05M至约0.12M、约0.05M至约0.1M、约0.05M至约0.08M、约0.05M至约0.06M、约0.06M至约0.2M、约0.06M至约0.18M、约0.06M至约0.16M、约0.06M至约0.14M、约0.06M至约0.12M、约0.06M至约0.1M、约0.06M至约0.08M、约0.08M至约0.2M、约0.08M至约0.18M、约0.08M至约0.16M、约0.08M至约0.14M、约0.08M至约0.12M、约0.08M至约0.1M、约0.1M至约0.2M、约0.1M至约0.18M、约0.1M至约0.16M、约0.1M至约0.14M、约0.1M至约0.12M、约0.12M至约0.2M、约0.12M至约0.18M、约0.12M至约0.16M、约0.12M至约0.14M、约0.14M至约0.2M、约0.14M至约0.18M、约0.14M至约0.16M、约0.16M至约0.2M、约0.16M至约0.18M或约0.18M至约0.2M)柠檬酸盐。
在一些实施例中，第二洗涤缓冲液的pH为约4.5至约5.5(例如，约4.5至约5.4、约4.5至约5.3、约4.5至约5.2、约4.5至约5.1、约4.5至约5.0、约4.5至约4.9、约4.5至约4.8、约4.5至约4.7、约4.5至约4.6、约4.6至约5.5、约4.6至约5.4、约4.6至约5.3、约4.6至约5.2、约4.6至约5.1、约4.6至约5.0、约4.6至约4.9、约4.6至约4.8、约4.6至约4.7、约4.7至约5.5、约4.7至约5.4、约4.7至约5.3、约4.7至约5.2、约4.7至约5.1、约4.7至约5.0、约4.7至约4.9、约4.7至约4.8、约4.8至约5.5、约4.8至约5.4、约4.8至约5.3、约4.8至约5.2、约4.8至约5.1、约4.8至约5.0、约4.8至约4.9、约4.9至约5.5、约4.9至约5.4、约4.9至约5.3、约4.9至约5.2、约4.9至约5.1、约4.9至约5.0、约5.0至约5.5、约5.0至约5.4、约5.0至约5.3、约5.0至约5.2、约5.0至约5.1、约5.1至约5.5、约5.1至约5.4、约5.1至约5.3、约5.1至约5.2、约5.2至约5.5、约5.2至约5.4、约5.2至约5.3、约5.3至约5.5、约5.3至约5.4或约5.4至约5.5)。
在一些实施例中，洗脱缓冲液包含约0.01M至约0.2M(例如，约0.01M至约0.18M、约0.01M至约0.16M、约0.01M至约0.14M、约0.01M至约0.12M、约0.01M至约0.1M、约0.01M至约0.08M、约0.01M至约0.06M、约0.01M至约0.05M、约0.01M至约0.04M、约0.01M至约0.03M、约0.01M至约0.02M、约0.02M至约0.2M、约0.02M至约0.18M、约0.02M至约0.16M、约0.02M至约0.14M、约0.02M至约0.12M、约0.02M至约0.1M、约0.02M至约0.08M、约0.02M至约0.06M、约0.02M至约0.05M、约0.02M至约0.04M、约0.02M至约0.03M、约0.03M至约0.2M、约0.03M至约0.18M、约0.03M至约0.16M、约0.03M至约0.14M、约0.03M至约0.12M、约0.03M至约0.1M、约0.03M至约0.08M、约0.03M至约0.06M、约0.03M至约0.05M、约0.03M至约0.04M、约0.04M至约0.2M、约0.04M至约0.18M、约0.04M至约0.16M、约0.04M至约0.14M、约0.04M至约0.12M、约0.04M至约0.1M、约0.04M至约0.08M、约0.04M至约0.06M、约0.04M至约0.05M、约0.05M至约0.2M、约0.05M至约0.18M、约0.05M至约0.16M、约0.05M至约0.14M、约0.05M至约0.12M、约0.05M至约0.1M、约0.05M至约0.08M、约0.05M至约0.06M、约0.06M至约0.2M、约0.06M至约0.18M、约0.06M至约0.16M、约0.06M至约0.14M、约0.06M至约0.12M、约0.06M至约0.1M、约0.06M至约0.08M、约0.08M至约0.2M、约0.08M至约0.18M、约0.08M至约0.16M、约0.08M至约0.14M、约0.08M至约0.12M、约0.08M至约0.1M、约0.1M至约0.2M、约0.1M至约0.18M、约0.1M至约0.16M、约0.1M至约0.14M、约0.1M至约0.12M、约0.12M至约0.2M、约0.12M至约0.18M、约0.12M至约0.16M、约0.12M至约0.14M、约0.14M至约0.2M、约0.14M至约0.18M、约0.14M至约0.16M、约0.16M至约0.2M、约0.16M至约0.18M或约0.18M至约0.2M)乙酸盐。
在一些实施例中，洗脱缓冲液的pH为约2.5至约3.5(例如，约2.5至约3.4、约2.5至约3.3、约2.5至约3.2、约2.5至约3.1、约2.5至约3.0、约2.5至约2.9、约2.5至约2.8、约2.5至约2.7、约2.5至约2.6、约2.6至约3.5、约2.6至约3.4、约2.6至约3.3、约2.6至约3.2、约2.6至约3.1、约2.6至约3.0、约2.6至约2.9、约2.6至约2.8、约2.6至约2.7、约2.7至约3.5、约2.7至约3.4、约2.7至约3.3、约2.7至约3.2、约2.7至约3.1、约2.7至约3.0、约2.7至约2.9、约2.7至约2.8、约2.8至约3.5、约2.8至约3.4、约2.8至约3.3、约2.8至约3.2、约2.8至约3.1、约2.8至约3.0、约2.8至约2.9、约2.9至约3.5、约2.9至约3.4、约2.9至约3.3、约2.9至约3.2、约2.9至约3.1、约2.9至约3.0、约3.0至约3.5、约3.0至约3.4、约3.0至约3.3、约3.0至约3.2、约3.0至约3.1、约3.1至约3.5、约3.1至约3.4、约3.1至约3.3、约3.1至约3.2、约3.2至约3.5、约3.2至约3.4、约3.2至约3.3、约3.3至约3.5、约3.3至约3.4或约3.4至约3.5)。
制造含有组织因子的蛋白质的方法
本文提供制造含有组织因子的蛋白质的方法，其包含：(i)使用本文描述的方法中的任一种纯化含有组织因子的蛋白质；和(ii)对从步骤(i)获得的洗脱液执行一个或多个添加单元操作。可在用于制造含有组织因子的蛋白质的过程中执行的单元操作的非限制性实例包括：捕获蛋白质、纯化蛋白质、精制蛋白质、灭活病毒、调节含有蛋白质的流体的离子浓度和/或pH，并且过滤含有蛋白质的流体。图1中描绘制造含有组织因子的蛋白质的非限制性方法。
在一些实施例中，一个或多个另外的单元操作按顺序包括：执行低pH病毒灭活、执行深层过滤、执行精制色谱、执行纳滤，和执行超滤和渗滤(UF/DF)。
本文还提供通过本文描述的方法中的任一种制造的含有组织因子的蛋白质。在一些实施例中，药物组合物包含制造的含有组织因子的蛋白质。
单链嵌合多肽
含有组织因子的蛋白质的非限制性实例为单链嵌合多肽，其包括：(i)第一靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)、(ii)可溶性组织因子结构域(例如，本文描述或本领域已知的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)，以及(iii)作为第二靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)彼此直接邻接。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性第一靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)彼此直接邻接。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)彼此直接邻接。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽还包含在第一靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性靶标结合结构域)与第二靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性靶标结合结构域)之间的接头序列(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性接头序列)。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，
第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)彼此直接邻接。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含介于第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例可以进一步包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其N端和/或C端的另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其N端的另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽N端的一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一可以直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于单链嵌合多肽N端的至少一个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其C端的另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽C端的一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于单链嵌合多肽C端的至少一个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，单链嵌合多肽包含一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其N端和其C端的另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽N端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于N端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。在一些实施例中，位于C端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于C端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)特异性地结合到相同抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)包括相同的氨基酸序列。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)各自特异性地结合到相同抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)各自特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域各自包含相同的氨基酸序列。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)特异性地结合到不同抗原。
在任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个靶标结合结构域中的一个或多个是抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性抗原结合结构域)。在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性抗原结合结构域)。在一些实施例中，抗原结合结构域可包括scFv或单结构域抗体。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一种或多种另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一种或多种(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十种)特异性地结合到选自由以下组成的组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体和CD28的受体。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例包括：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD和SCF。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子受体。可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的非限制性实例包括：可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKP30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155、可溶性CD122、可溶性CD3或可溶性CD28。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)和一种或多种另外的靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)可以各自独立地特异性结合到选自以下的组的靶标：CD16a、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKP30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体和CD122的受体。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素或细胞因子蛋白选自以下的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD和SCF。
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、TNFα的可溶性受体、IL-4的可溶性受体，或IL-10的可溶性受体。
在一些实施例中，单链嵌合多肽具有与SEQ ID NO:22-29至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的核酸序列或氨基酸序列。
可溶性组织因子结构域
在本文所描述的任何多肽、组合物或方法的一些实施例中，可溶性组织因子结构域可为缺少信号序列、跨膜结构域和细胞内结构域的野生型组织因子多肽。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可为组织因子突变体，其中野生型组织因子多肽缺少信号序列、跨膜结构域和细胞内结构域，并且已在所选择的氨基酸处被进一步修饰。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性人组织因子结构域。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性小鼠组织因子结构域。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可为大鼠可溶性组织因子结构域。下文显示可溶性人组织因子结构域、小鼠可溶性组织因子结构域、大鼠可溶性组织因子结构域和突变可溶性组织因子结构域的非限制性实例。
示例性可溶性人组织因子结构域(SEQ ID NO:10)SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
编码可溶性人组织因子结构域的示例性核酸(SEQ ID NO:11)AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
示例性可溶性小鼠组织因子结构域(SEQ ID NO:12)agipekafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwknkcfsttdtecdltdeivkdvtwayeakvlsvprrnsvhgdgdqlvihgeeppftnapkflpyrdtnlgqpviqqfeqdgrklnvvvkdsltlvrkngtfltlrqvfgkdlgyiityrkgsstgkktnitntnefsidveegvsycffvqamifsrktnqnspgsstvcteqwksflge
示例性可溶性大鼠组织因子结构域(SEQ ID NO:13)agtppgkafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwkykctgttdtecdltdeivkdvnwtyearvlsvpwrnsthgketlfgthgeeppftnarkflpyrdtkigqpviqkyeqggtklkvtvkdsftlvrkngtfltlrqvfgndlgyiltyrkdsstgrktntthtneflidvekgvsycffaqavifsrktnhkspesitkcteqwksvlge
示例性突变可溶性人组织因子结构域(SEQ ID NO:14)SGTTNTVAAYNLTWKSTNFATALEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECALTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVARNNTALSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
示例性突变可溶性人组织因子结构域(SEQ ID NO:15)SGTTNTVAAYNLTWKSTNFATALEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDAKSKCFYTTDTECALTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLAENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVARNNTALSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可包括与SEQ ID NO:10、12、13、14或15至少70％相同、至少72％相同、至少74％相同、至少76％相同、至少78％相同、至少80％相同、至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的序列。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可包括SEQ ID NO:10、12、13、14或15的序列，其N端有一到二十个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸已去除和/或其C端有一到二十个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸已去除。
如本领域中可了解，本领域技术人员将理解，在不同哺乳动物物种之间保守的氨基酸的突变更可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性，而在不同哺乳动物物种之间不具保守性的氨基酸的突变不太可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实例中，可溶性组织因子结构域不能结合到因子VIIa。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实例中，可溶性组织因子结构域不将非活性因子X转化为因子Xa。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，多链嵌合多肽不刺激哺乳动物的凝血。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域可为可溶性人组织因子结构域。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性小鼠组织因子结构域。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可为可溶性大鼠组织因子结构域。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域不包括以下中的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个或七个)：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，突变可溶性组织因子具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域可由包括与SEQ ID NO:11至少70％相同、至少72％相同、至少74％相同、至少76％相同、至少78％相同、至少80％相同、至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的序列的核酸编码。
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域的总长度可为约20个氨基酸至约220个氨基酸、约20个氨基酸至约215个氨基酸、约20个氨基酸至约210个氨基酸、约20个氨基酸至约205个氨基酸、约20个氨基酸至约200个氨基酸、约20个氨基酸至约195个氨基酸、约20个氨基酸至约190个氨基酸、约20个氨基酸至约185个氨基酸、约20个氨基酸至约180个氨基酸、约20个氨基酸至约175个氨基酸、约20个氨基酸至约170个氨基酸、约20个氨基酸至约165个氨基酸、约20个氨基酸至约160个氨基酸、约20个氨基酸至约155个氨基酸、约20个氨基酸至约150个氨基酸、约20个氨基酸至约145个氨基酸、约20个氨基酸至约140个氨基酸、约20个氨基酸至约135个氨基酸、约20个氨基酸至约130个氨基酸、约20个氨基酸至约125个氨基酸、约20个氨基酸至约120个氨基酸、约20个氨基酸至约115个氨基酸、约20个氨基酸至约110个氨基酸、约20个氨基酸至约105个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸、约20个氨基酸至约95个氨基酸、约20个氨基酸至约90个氨基酸、约20个氨基酸至约85个氨基酸、约20个氨基酸至约80个氨基酸、约20个氨基酸至约75个氨基酸、约20个氨基酸至约70个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约20个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约40个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸。
接头序列
在一些实施例中，接头序列可为柔性接头序列。可使用的接头序列的非限制性实例描述于Klein等人,《蛋白质工程、设计和选择(Protein Engineering,Design&Selection)》27(10):325-330,2014；Priyanka等人,《蛋白质科学(Protein Sci.)》22(2):153-167,2013中。在一些实例中，接头序列是合成接头序列。
在一些实施例中，本文描述的单链嵌合多肽中的任一种可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在一些实施例中，本文描述的单链嵌合多肽中的任一种可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所描述或本领域已知的任一种示例性接头序列)。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如，相同或不同的接头序列，例如本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在一些实施例中，接头序列的总长度可为1个氨基酸至约100个氨基酸、1个氨基酸至约90个氨基酸、1个氨基酸至约80个氨基酸、1个氨基酸至约70个氨基酸、1个氨基酸至约60个氨基酸、1个氨基酸至约50个氨基酸、1个氨基酸至约45个氨基酸、1个氨基酸至约40个氨基酸、1个氨基酸至约35个氨基酸、1个氨基酸至约30个氨基酸、1个氨基酸至约25个氨基酸、1个氨基酸至约24个氨基酸、1个氨基酸至约22个氨基酸、1个氨基酸至约20个氨基酸、1个氨基酸至约18个氨基酸、1个氨基酸至约16个氨基酸、1个氨基酸至约14个氨基酸、1个氨基酸至约12个氨基酸、1个氨基酸至约10个氨基酸、1个氨基酸至约8个氨基酸、1个氨基酸至约6个氨基酸、1个氨基酸至约4个氨基酸。
在一些实施例中，接头富含甘氨酸(Gly或G)残基。在一些实施例中，接头富含丝氨酸(Ser或S)残基。在一些实施例中，接头富含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施例中，接头具有一个或多个甘氨酸-丝氨酸残基对(GS)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GS对。在一些实施例中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS)(SEQ ID NO:16)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGS(SEQ ID NO:16)序列。在一些实施例中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)(SEQ ID NO:17)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGGS(SEQ ID NO:17)序列。在一些实施例中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Ser-Gly(GGSG)(SEQ ID NO:18)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGSG(SEQ ID NO:18)序列。
在一些实施例中，接头序列可包含以下或由以下组成：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:19)。在一些实施例中，接头序列可由包含以下或由以下组成的核酸编码：GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT(SEQ ID NO:20)。
在一些实施例中，接头序列可包含以下或由以下组成：GGGSGGGS(SEQ ID NO:21)。
靶标结合结构域
在本文描述的单或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和/或另外的一个或多个靶标结合结构域可为抗原结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的示例性抗原结合结构域中的任一种)、可溶性白介素或细胞因子蛋白(例如，本文描述的示例性可溶性白介素蛋白或可溶性细胞因子蛋白中的任一种)和可溶性白介素或细胞因子受体(例如，本文描述的示例性可溶性白介素受体或可溶性细胞因子受体中的任一种)。
在本文描述的单或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和/或一个或多个另外的靶标结合结构域的氨基酸总数可各自独立为约5个氨基酸至约1000个氨基酸、约5个氨基酸至约950个氨基酸、约5个氨基酸至约900个氨基酸、约5个氨基酸至约850个氨基酸、约5个氨基酸至约800个氨基酸、约5个氨基酸至约750个氨基酸、约5个氨基酸至约700个氨基酸、约5个氨基酸至约650个氨基酸、约5个氨基酸至约600个氨基酸、约5个氨基酸至约550个氨基酸、约5个氨基酸至约500个氨基酸、约5个氨基酸至约450个氨基酸、约5个氨基酸至约400个氨基酸、约5个氨基酸至约350个氨基酸、约5个氨基酸至约300个氨基酸、约5个氨基酸至约280个氨基酸、约5个氨基酸至约260个氨基酸、约5个氨基酸至约240个氨基酸、约5个氨基酸至约220个氨基酸、约5个氨基酸至约200个氨基酸、约5个氨基酸至约195个氨基酸、约5个氨基酸至约190个氨基酸、约5个氨基酸至约185个氨基酸、约5个氨基酸至约180个氨基酸、约5个氨基酸至约175个氨基酸、约5个氨基酸至约170个氨基酸、约5个氨基酸至约165个氨基酸、约5个氨基酸至约160个氨基酸、约5个氨基酸至约155个氨基酸、约5个氨基酸至约150个氨基酸、约5个氨基酸至约145个氨基酸、约5个氨基酸至约140个氨基酸、约5个氨基酸至约135个氨基酸、约5个氨基酸至约130个氨基酸、约5个氨基酸至约125个氨基酸、约5个氨基酸至约120个氨基酸、约5个氨基酸至约115个氨基酸、约5个氨基酸至约110个氨基酸、约5个氨基酸至约105个氨基酸、约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约95个氨基酸、约5个氨基酸至约90个氨基酸、约5个氨基酸至约85个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、约5个氨基酸至约75个氨基酸、约5个氨基酸至约70个氨基酸、约5个氨基酸至约65个氨基酸、约5个氨基酸至约60个氨基酸、约5个氨基酸至约55个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约45个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约35个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约20个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸，
本文描述的靶标结合结构域中的任一种可以小于1×10-7M、小于1×10-8M、小于1×10-9M、小于1×10-10M、小于1×10-11M、小于1×10-12M或小于1×10-13M的解离平衡常数(KD)结合到其靶标。在一些实施例中，本文提供的抗原结合蛋白构建体可以约1×10-3M至约1×10-5M、约1×10-4M至约1×10-6M、约1×10-5M至约1×10-7M、约1×10-6M至约1×10-8M、约1×10-7M至约1×10-9M、约1×10-8M至约1×10-10M，或约1×10-9M至约1×10-11M(包括端点)的KD结合到鉴别的抗原。
本文描述的靶标结合结构域中的任一种可以在约1pM至约30nM(例如，约1pM至约25nM、约1pM至约20nM、约1pM至约15nM、约1pM至约10nM、约1pM至约5nM、约1pM至约2nM、约1pM至约1nM、约1pM至约950pM、约1pM至约900pM、约1pM至约850pM、约1pM至约800pM、约1pM至约750pM、约1pM至约700pM、约1pM至约650pM、约1pM至约600pM、约1pM至约550pM、约1pM至约500pM、约1pM至约450pM、约1pM至约400pM、约1pM至约350pM、约1pM至约300pM、约1pM至约250pM、约1pM至约200pM、约1pM至约150pM、约1pM至约100pM、约1pM至约90pM、约1pM至约80pM、约1pM至约70pM、约1pM至约60pM、约1pM至约50pM、约1pM至约40pM、约1pM至约30pM、约1pM至约20pM、约1pM至约10pM、约1pM至约5pM、约1pM至约4pM、约1pM至约3pM、约1pM至约2pM)之间的KD结合到其靶标。
本文描述的靶标结合结构域中的任一种可以在约1nM至约10nM(例如，约1nM至约9nM、约1nM至约8nM、约1nM至约7nM、约1nM至约6nM、约1nM至约5nM、约1nM至约4nM、约1nM至约3nM、约1nM至约2nM、约2nM至约10nM、约2nM至约9nM、约2nM至约8nM、约2nM至约7nM、约2nM至约6nM、约2nM至约5nM、约2nM至约4nM、约2nM至约3nM、约3nM至约10nM、约3nM至约9nM、约3nM至约8nM、约3nM至约7nM、约3nM至约6nM、约3nM至约5nM、约3nM至约4nM、约4nM至约10nM、约4nM至约9nM、约4nM至约8nM、约4nM至约7nM、约4nM至约6nM、约4nM至约5nM、约5nM至约10nM、约5nM至约9nM、约5nM至约8nM、约5nM至约7nM、约5nM至约6nM、约6nM至约10nM、约6nM至约9nM、约6nM至约8nM、约6nM至约7nM、约7nM至约10nM、约7nM至约9nM、约7nM至约8nM、约8nM至约10nM、约8nM至约9nM和约9nM至约10nM)之间的KD结合到其靶标。
可以使用本领域中已知的多种不同方法来确定本文描述的任一种抗原结合蛋白构建体的KD值(例如，电泳迁移变动分析、滤膜结合分析、表面等离振子体共振和生物分子结合动力学分析等)。
抗原结合结构域
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。在这些单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是抗原结合结构域。在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自是抗原结合结构域。在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，抗原结合结构域包括或为scFv或单结构域抗体(例如，VHH或VNAR结构域)。
在一些实例中，抗原结合结构域(例如，本文描述的抗原结合结构域中的任一种)可以特异性结合到以下中的任一个：CD16a(参见例如第9,035,026号美国专利中描述的那些)、CD28(参见例如第7,723,482号美国专利中描述的那些)、CD3(参见例如第9,226,962号美国专利中描述的那些)、CD33(参见例如第8,759,494号美国专利中描述的那些)、CD20(参见例如WO 2014/026054中描述的那些)、CD19(参见例如第9,701,758号美国专利中描述的那些)、CD22(参见例如WO 2003/104425中描述的那些)、CD123(参见例如WO 2014/130635中描述的那些)、IL-1R(参见例如第8,741,604号美国专利中描述的那些)、IL-1(参见例如WO2014/095808中描述的那些)、VEGF(参见例如第9,090,684号美国专利中描述的那些)、IL-6R(参见例如第7,482,436号美国专利中描述的那些)、IL-4(参见例如第2012/0171197号美国专利申请公开中描述的那些)、IL-10(参见例如第2016/0340413号美国专利申请公开中描述的那些)、PDL-1(参见例如Drees等人,《蛋白质表达和纯化(ProteinExpress.Purif.)》94:60-66,2014中所述的那些)、TIGIT(参见例如美国专利申请公开第2017/0198042号中所述的那些)、PD-1(参见例如美国专利第7,488,802号中所述的那些)、TIM3(参见例如美国专利第8,552,156号中所述的那些、CTLA4(参见例如WO 2012/120125中所述的那些)、MICA(参见例如WO 2016/154585中所述的那些)、MICB(参见例如美国专利第8,753,640号中所述的那些)、IL-6(参见例如Gejima等人,《人抗体(Human Antibodies)》11(4):121-129,2002中所述的那些)、IL-8(参见例如美国专利第6,117,980号中所述的那些)、TNFα(参见例如Geng等人,《免疫学研究(Immunol.Res.)》62(3):377-385,2015中所述的那些)、CD26(参见例如WO 2017/189526中所述的那些)、CD36(参见例如美国专利申请公开第2015/0259429号中所述的那些)、ULBP2(参见例如美国专利第9,273,136号中所述的那些)、CD30(参见例如Homach等人,《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》48(5):497-501,1998中所描述的那些)、CD200(参见例如第9,085,623号美国专利中所描述的那些)、IGF-1R(参见例如第2017/0051063号美国专利申请公开中所描述的那些)、MUC4AC(参见例如WO 2012/170470中所描述的那些)、MUC5AC(参见例如第9,238,084号美国专利中所描述的那些)、Trop-2(参见例如WO 2013/068946中所描述的那些)、CMET(参见例如Edwardraja等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》106(3):367-375,2010中所描述的那些)、EGFR(参见例如Akbari等人,《蛋白质表达和纯化》127:8-15,2016中所描述的那些)、HER1(参见例如第2013/0274446号美国专利申请公开中所描述的那些)、HER2(参见例如Cao等人,《生物技术快报(Biotechnol.Lett.)》37(7):1347-1354,2015中所描述的那些)、HER3(参见例如第9,505,843号美国专利中所描述的那些)、PSMA(参见例如Parker等人,《蛋白质表达和纯化》89(2):136-145,2013中所描述的那些)、CEA(参见例如WO 1995/015341中所描述的那些)、B7H3(参见例如第9,371,395号美国专利中所描述的那些)、EPCAM(参见例如WO 2014/159531中描述的那些)、BCMA(参见例如Smith等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》26(6):1447-1456,2018中所描述的那些)、P-钙粘素(参见例如第7,452,537号美国专利中所描述的那些)、CEACAM5(参见例如第9,617,345号美国专利中所描述的那些)、UL16结合蛋白(参见例如WO 2017/083612中所描述的那些)、HLA-DR(参见例如Pistillo等人,《实验和临床免疫遗传学(Exp.Clin.Immunogenet.)》14(2):123-130,1997中所描述的那些)、DLL4(参见例如WO 2014/007513中所描述的那些)、TYRO3(参见例如WO2016/166348中所描述的那些)、AXL(参见例如WO 2012/175692中所描述的那些)、MER(参见例如WO 2016/106221中所描述的那些)、CD122(参见例如美国专利申请公开第2016/0367664号中所描述的那些)、CD155(参见例如WO 2017/149538中所描述的那些)或PDGF-DD(参见例如美国专利第9,441,034号中所描述的那些)。
存在于本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种中的抗原结合结构域各自独立地选自由以下组成的组：VHH结构域、VNAR结构域和scFv。在一些实施例中，本文描述的抗原结合结构域中的任一种是BiTe、(scFv)2、纳米抗体(nanobody)、纳米抗体-HAS、DART、TandAb、单链双功能抗体(scDiabody)、单链双功能抗体-CH3、scFv-CH-CL-scFv、HSAbody、单链双功能抗体-HAS或串联scFv。可用于单链或多链嵌合多肽中的任一种中的抗原结合结构域的另外实例是本领域已知的。
VHH结构域是可在骆驼科动物中发现的单个单体可变抗体结构域。VNAR结构域是可在软骨鱼中发现的单个单体抗体可变结构域。VHH结构域和VNAR结构域的非限制性方面描述于例如Cromie等人,《医药化学当前话题(Curr.Top.Med.Chem.)》15:2543-2557,2016；DeGenst等人,《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》30:187-198,2006；De Meyer等人,《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》32:263-270,2014；Kijanka等人,《纳米医学(Nanomedicine)》10:161-174,2015；Kovaleva等人,《生物疗法专家观点(Expert.Opin.Biol.Ther.)》14:1527-1539,2014；Krah等人,《免疫药理学和免疫毒理学(Immunopharmacol.Immunotoxicol.)》38:21-28,2016；Mujic-Delic等人,《药理科学趋势(Trends Pharmacol.Sci.)》35:247-255,2014；Muyldermans,《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》74:277-302,2001；Muyldermans等人,《生物化学科学趋势(TrendsBiochem.Sci.)》26:230-235,2001；Muyldermans,《生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)》82:775-797,2013；Rahbarizadeh等人,《免疫学研究(Immunol.Invest.)》40:299-338,2011；Van Audenhove等人,《E生物医学(EBioMedicine)》8:40-48,2016；Van Bockstaele等人,《研究药物当前观点(Curr.Opin.Investig.Drugs)》10:1212-1224,2009；Vincke等人,《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》911:15-26,2012；和Wesolowski等人,《医学微生物学和免疫学(Med.Microbiol.Immunol.)》198:157-174,2009。
在一些实施例中，本文所述的单链或多链嵌合多肽中的每个抗原结合结构域都是VHH结构域，或至少一个抗原结合结构域是VHH结构域。在一些实施例中，本文所述的单链或多链嵌合多肽中的每个抗原结合结构域都是VNAR结构域，或至少一个抗原结合结构域是VNAR结构域。在一些实施例中，本文所述的单链或多链嵌合多肽中的每个抗原结合结构域都是scFv结构域，或至少一个抗原结合结构域是scFv结构域。
在一些实施例中，存在于单链或多链嵌合多肽中的多肽中的两种或更多种可组装(例如非共价组装)以形成本文描述的抗原结合结构域中的任一种，例如抗体的抗原结合片段(例如本文描述的抗体的抗原结合片段中的任一种)、VHH-scAb、VHH-Fab、双scFab、F(ab')2、双功能抗体、互换单抗、DAF(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、臼包杵型共同轻链、臼包杵型组装体、电荷对、Fab臂交换、SEEDbody、LUZ-Y、Fcab、κλ体、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG、双功能抗体-CH3、三体、微型抗体(miniantibody)、微抗体(minibody)、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、F(ab')2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、单链双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、胞内抗体、对接和锁定(dock and lock)、lmmTAC、IgG-IgG偶联物、Cov-X体和scFv1-PEG-scFv2。参见例如Spiess等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》67:95-106,2015，其在此全文并入，以便描述这些元件。抗体的抗原结合片段的非限制性实例包括Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段和Fab'片段。抗体的抗原结合片段的另外实例是IgG的抗原结合片段(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗原结合片段)(例如，人或人源化IgG，例如人或人源化IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗原结合片段)；IgA的抗原结合片段(例如，IgA1或IgA2的抗原结合片段)(例如，人或人源化IgA，例如人或人源化IgA1或IgA2的抗原结合片段)；IgD的抗原结合片段(例如，人或人源化IgD的抗原结合片段)；IgE的抗原结合片段(例如，人或人源化IgE的抗原结合片段)；或IgM的抗原结合片段(例如，人或人源化IgM的抗原结合片段)。
“Fv”片段包括一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接的二聚体。
“Fab”片段包括除Fv片段的重链和轻链可变结构域外，轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。
“F(ab')2”片段包括在铰链区附近通过二硫键接合的两个Fab片段。
“双可变结构域免疫球蛋白”或“DVD-Ig”是指多价且多特异性结合蛋白，如例如DiGiammarino等人,《分子生物学方法》899:145-156,2012；Jakob等人,《单抗(MABs)》5:358-363,2013；和美国专利第7,612,181号；第8,258,268号；第8,586,714号；第8,716,450号；第8,722,855号；第8,735,546号；和第8,822,645号中所描述，其中的每一个均通过引用整体并入。
DART描述于例如Garber,《自然综述：药物发现(Nature Reviews DrugDiscovery)》13:799-801,2014中。
在一些实施例中，本文所述的任一种抗原结合结构域能够结合到选自由以下组成的组的抗原：蛋白质、碳水化合物、脂质和其组合。
抗原结合结构域的其它实例和方面是本领域已知的。
可溶性白介素或细胞因子蛋白
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个可以是可溶性白介素蛋白或可溶性细胞因子蛋白。在一些实施例中，可溶性白介素或可溶性细胞因子蛋白选自以下的组：IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L。可溶性IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L的非限制性实例在下文提供。
人可溶性IL-2(SEQ ID NO:104)
Figure BDA0003872947890000451
人可溶性IL-3(SEQ ID NO:105)
Figure BDA0003872947890000452
人可溶性IL-7(SEQ ID NO:106)
Figure BDA0003872947890000453
人可溶性IL-8(SEQ ID NO:107)
Figure BDA0003872947890000454
人可溶性IL-10(SEQ ID NO:108)
Figure BDA0003872947890000455
人可溶性IL-15(SEQ ID NO:109)
Figure BDA0003872947890000461
人可溶性IL-17(SEQ ID NO:110)
Figure BDA0003872947890000462
人可溶性IL-18(SEQ ID NO:111)
Figure BDA0003872947890000463
人可溶性PDGF-DD(SEQ ID NO:112)
Figure BDA0003872947890000464
人可溶性SCF(SEQ ID NO:113)
Figure BDA0003872947890000465
人可溶性FLT3L(SEQ ID NO:114)
Figure BDA0003872947890000466
以下提供可溶性MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6的非限制性实例。
人可溶性MICA(SEQ ID NO:115)
Figure BDA0003872947890000471
人可溶性MICB(SEQ ID NO:116)
Figure BDA0003872947890000472
人可溶性ULBP1(SEQ ID NO:117)
Figure BDA0003872947890000473
人可溶性ULBP2(SEQ ID NO:118)
Figure BDA0003872947890000474
人可溶性ULBP3(SEQ ID NO:119)
Figure BDA0003872947890000475
人可溶性ULBP4(SEQ ID NO:120)
Figure BDA0003872947890000476
人可溶性ULBP5(SEQ ID NO:121)
Figure BDA0003872947890000481
人可溶性ULBP6(SEQ ID NO:122)
Figure BDA0003872947890000482
可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的另外实例是本领域已知的。
可溶性受体
在本文描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性白介素受体或可溶性细胞因子受体。在一些实施例中，可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)(参见例如Yung等人,《美国呼吸与重症医学杂志(Am.J.Resp.Crit.Care Med.)》194(9):1140-1151,2016中所描述的那些)、可溶性TGF-βRIII(参见例如Heng等人,《胎盘(Placenta)》57:320,2017中所描述的那些)、可溶性NKG2D(参见例如Cosman等人,《免疫(Immunity)》14(2):123-133,2001；Costa等人,《免疫学前沿(Front.Immunol.)》,第9卷,第1150条,2018年5月29日；doi：10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性NKp30(参见例如Costa等人,《免疫学前沿》,第9卷,第1150章,2018年5月29日；数字对象标识符：10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性NKp44(参见例如Costa等人,《免疫学前沿Immunol.)》第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150中所述的那些)、可溶性NKp46(参见例如Mandelboim等人，《自然(Nature)》409:1055-1060，2001；Costa等人，《免疫学前沿(Front.Immunol.)》第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性DNAM1(参见例如Costa等人，《免疫学前沿(Front.Immunol.)》，第9卷，论文1150，2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150中所述的那些)、scMHCI(参见例如Washburn等人，《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》6(3):e18439，2011中所述的那些)、scMHCII(参见例如Bishwajit等人，《细胞免疫学(Cellular Immunol.)》170(1):25-33,1996中所描述的那些)、scTCR(参见例如Weber等人，《自然》356(6372):793-796,1992中所描述的那些)、可溶性CD155(参见例如Tahara-Hanaoka等人,《国际免疫学(Int.Immunol.)》16(4):533-538,2004中所描述的那些)或可溶性CD28(参见例如Hebbar等人,《临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》136:388-392,2004)。可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的另外实例是本领域已知的。
A型单链嵌合多肽的示例性实施例
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和/或第二靶标结合结构域可以独立地特异性结合到CD3(例如，人CD3)或CD28(例如，人CD28)。在一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到CD3(例如，人CD3)，而第二靶标结合结构域特异性结合到CD28(例如，人CD28)。在一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到CD28(例如，人CD28)，而第二靶标结合结构域特异性结合到CD3(例如，人CD3)。
B型单链嵌合多肽的示例性实施例
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和/或第二靶标结合结构域可以独立地特异性结合到IL-2受体(例如，人IL-2受体)。
C型单链嵌合多肽的示例性实施例
在本文描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和/或第二靶标结合结构域可以独立地特异性结合到IL-15受体(例如，人IL-15受体)。
示例性单链嵌合多肽的序列
编码αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链多肽的核酸如下(SEQ ID NO:22)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCC
(αCD3轻链可变区)
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGT
(接头)
GGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGC
(αCD3重链可变区)
CAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGC
(人组织因子219形式)
TCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(αCD28轻链可变区)
GTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGC
(接头)
GGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCC
(αCD28轻链可变区)
GACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG
αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:23)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD3轻链可变区)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD3重链可变区)
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(αCD28轻链可变区)
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD28重链可变区)
DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR
编码αCD28scFv/TF/αCD3scFv单链多肽的核酸序列如下(SEQ ID NO:24)：
(信号肽)
ATGAAATGGGTCACCTTCATCTCTTTACTGTTTTTATTTAGCAGCGCCTACAGC
(αCD28轻链可变区)
GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCC
(接头)
GGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGAGGATCTGGCGGTGGAGGCAGC
(αCD28重链可变区)
GACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGG
(人组织因子219形式)
AGCGGCACCACCAACACAGTGGCCGCCTACAATCTGACTTGGAAATCCACCAACTTCAAGACCATCCTCGAGTGGGAGCCCAAGCCCGTTAATCAAGTTTATACCGTGCAGATTTCCACCAAGAGCGGCGACTGGAAATCCAAGTGCTTCTATACCACAGACACCGAGTGCGATCTCACCGACGAGATCGTCAAAGACGTGAAGCAGACATATTTAGCTAGGGTGTTCTCCTACCCCGCTGGAAACGTGGAGAGCACCGGATCCGCTGGAGAGCCTTTATACGAGAACTCCCCCGAATTCACCCCCTATCTGGAAACCAATTTAGGCCAGCCCACCATCCAGAGCTTCGAACAAGTTGGCACAAAGGTGAACGTCACCGTCGAAGATGAGAGGACTTTAGTGCGGAGGAACAATACATTTTTATCCTTACGTGACGTCTTCGGCAAGGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCTAGCTCCTCCGGCAAGAAGACCGCCAAGACCAATACCAACGAATTTTTAATTGACGTGGACAAGGGCGAGAACTACTGCTTCTCCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACAGTGAACCGGAAGTCCACCGACTCCCCCGTGGAGTGCATGGGCCAAGAGAAGGGAGAGTTTCGTGAG
(αCD3轻链可变区)
CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCTATTATGAGCGCTAGCCCCGGTGAAAAGGTGACTATGACATGCAGCGCCAGCTCTTCCGTGAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGTCCGGCACCAGCCCTAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTCCCCGCTCACTTTCGGGGCTCCGGCTCCGGAACAAGCTACTCTCTGACCATCAGCGGCATGGAAGCCGAGGATGCCGCTACCTATTACTGTCAGCAGTGGAGCTCCAACCCCTTCACCTTTGGATCCGGCACCAAGCTCGAGATTAATCGT
(接头)
GGAGGCGGAGGTAGCGGAGGAGGCGGATCCGGCGGTGGAGGTAGC
(αCD3重链可变区)
CAAGTTCAGCTCCAGCAAAGCGGCGCCGAACTCGCTCGGCCCGGCGCTTCCGTGAAGATGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTATACCTTCACCCGGTACACAATGCACTGGGTCAAGCAACGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCTATATCAACCCCTCCCGGGGCTATACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAAGCCACCCTCACCACCGACAAGTCCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCTTTAACATCCGAGGATTCCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGTACTACGACGATCATTACTGCCTCGATTACTGGGGCCAAGGTACCACCTTAACAGTCTCCTCC
αCD28scFv/TF/αCD3scFv单链嵌合多肽的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:25)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD28轻链可变区)
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD28重链可变区)
DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(αCD3轻链可变区)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD3重链可变区)
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
编码IL-2/TF/IL-2单链嵌合多肽的核酸序列如下(SEQ ID NO:26)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(第一IL-2片段)
GCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACC
(人组织因子219形式)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(第二IL-2片段)
GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT
IL-2/TF/IL-2单链嵌合多肽的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:27)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-2)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-2)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
编码IL-15/TF/IL-15单链嵌合多肽的核酸序列如下(SEQ ID NO:28)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(第一IL-15片段)
AACTGGGTGAACGTGATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAGGATTTAATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACTCTGTACACTGAGAGCGACGTGCACCCTAGCTGCAAGGTGACTGCCATGAAGTGCTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGCGATGCCAGCATCCACGACACTGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAACAACTCTTTAAGCAGCAACGGCAACGTGACAGAGAGCGGCTGCAAGGAGTGCGAGGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTTTACAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACTAGC
(人组织因子219形式)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(第二IL-15片段)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
IL-15/TF/IL-15单链嵌合多肽的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:29)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
多链嵌合多肽
含有组织因子的蛋白质的非限制性实例为多链嵌合多肽，其包括：(a)第一嵌合多肽，其包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；和(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；和(b)第二嵌合多肽，其包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；和(ii)第二靶标结合结构域，其中第一嵌合多肽与第二嵌合多肽通过一对亲和结构域中的第一结构域和第二结构域的结合而缔合。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如，本文所描述的第一靶标结合结构域中的任一种)和可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含在第一嵌合多肽中的第一靶标结合结构域(例如，本文所描述的示例性第一靶标结合结构域中的任一种)与可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含在第一嵌合多肽中的可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)与第二靶标结合结构域(例如，本文所描述的示例性第二靶标结合结构域中的任一种)在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包含介于第二嵌合多肽中的一对亲和结构域中的第二结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的的任一种示例性第二结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域已知的任一种示例性接头序列)。
在多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，其中一个或多个其它抗原结合结构域中的至少一个定位于可溶性组织因子结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子结构域)与亲和结构域对中的第一结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第一结构域)之间。在一些实施例中，第一嵌合多肽可进一步包括在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，和/或一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的本文所接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽在第一嵌合多肽的N端和/或C端进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接亲和结构域对中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)安置于第一嵌合多肽的N和/或C端，并且一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)定位在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述或本领域已知的任何示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于N端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于C端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的接头序列中的任一种)。在一些实施例中，位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的第一结构域中的任一种或本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种)之间的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接可溶性组织因子结构域和/或一对亲和结构域中的第一结构域。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，所述接头序列安置于(i)可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间，和/或(ii)一对亲和结构域中的第一结构域与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域与一对亲和结构域中的第一结构域之间。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽在第二嵌合多肽的N端和/或C端进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接所述一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)包括相同的氨基酸序列。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自包括相同的氨基酸序列。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个靶标结合结构域中的一个或多个(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)是抗原结合结构域。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如，scFv或单结构域抗体)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)特异性地结合到选自由以下组成的组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKP30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体和CD28的受体。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例包括：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD和SCF。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或多个是可溶性白介素或细胞因子受体。可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的非限制性实例包括：可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKP30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155、可溶性CD122、可溶性CD3或可溶性CD28。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)和一个或多个另外的靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)可各自独立地特异性结合到选自以下组的靶标：CD16a、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体和CD122的受体。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)和一个或多个其它结合结构域(例如本文所述的任一种靶标结合结构域)中的一个或两个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素或细胞因子蛋白选自以下的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD和SCF。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性白介素受体或细胞因子受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、TNFα的可溶性受体、IL-4的可溶性受体，或IL-10的可溶性受体。
细胞活化剂的非限制性实例是多链嵌合多肽，其包括：(a)第一和第二嵌合多肽，其各自包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)Fc结构域；和(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第三和第四嵌合多肽，其各自包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；和(ii)第二靶标结合结构域，其中第一和第二嵌合多肽与第三和第四嵌合多肽通过一对亲和结构域中的第一结构域与第二结构域的结合而缔合，并且第一和第二嵌合多肽通过其Fc结构域而缔合。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一和第二嵌合多肽中的第一靶标结合结构域(例如本文所述的任一种第一靶标结合结构域)与Fc结构域(例如本文所述的任一种示例性Fc结构域)彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一和第二嵌合多肽另外包含介于第一和第二嵌合多肽中的第一靶标结合结构域(例如本文所述的示例性第一靶标结合结构域中的任一种)与Fc结构域(例如本文描述的示例性Fc结构域中的任一种)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一和第二嵌合多肽中的Fc结构域(例如本文所述的任一种示例性Fc结构域)与亲和结构域对中的第一结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第一结构域)彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一和第二嵌合多肽进一步包含介于第一和第二嵌合多肽中的Fc结构域(例如本文所述的任一种示例性Fc结构域)与亲和结构域对中的第一结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第一结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第三和第四嵌合多肽中的亲和结构域对中的第二结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第二结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)彼此直接邻接。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第三和第四嵌合多肽进一步包含介于第三和第四嵌合多肽中的亲和结构域对中的第二结构域(例如本文所述的任一种示例性亲和结构域对中的任一种示例性第二结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是抗原结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，抗原结合结构域(例如本文所述的任一种示例性第二靶标结合结构域)包括scFv或单结构域抗体。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或两个特异性地结合到选自由以下组成的组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体和CD28的受体。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一个或两个为可溶性白介素或细胞因子蛋白。可溶性白介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例包括：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD和SCF。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)是可溶性白介素或细胞因子受体。可溶性白介素受体和可溶性细胞因子受体的非限制性实例包括：可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155、可溶性CD122、可溶性CD3或可溶性CD28。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域可以各自独立地特异性结合到选自以下的组的靶标：CD16a、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体，和CD122的受体。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性白介素或细胞因子蛋白。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性白介素或细胞因子蛋白选自以下的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD和SCF。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性白介素受体或细胞因子受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、TNFα的可溶性受体、IL-4的可溶性受体，或IL-10的可溶性受体。
在一些实施例中，多链嵌合多肽具有与SEQ ID NO:30-101至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的核酸序列或氨基酸。
另外的抗原结合结构域
在单或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽另外包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，一个或多个另外的抗原结合结构域中的至少一个可位于可溶性组织因子结构域(例如，本文描述或本领域已知的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间。在一些实施例中，第一嵌合多肽可进一步包括在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，和/或一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的本文所接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽在第一嵌合多肽的N端和/或C端进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接亲和结构域对中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)安置于第一嵌合多肽的N和/或C端，并且一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)定位在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述或本领域已知的任何示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于N端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于C端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的接头序列中的任一种)。在一些实施例中，位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的第一结构域中的任一种或本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种)之间的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接可溶性组织因子结构域和/或一对亲和结构域中的第一结构域。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，所述接头序列安置于(i)可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间，和/或(ii)一对亲和结构域中的第一结构域与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域与一对亲和结构域中的第一结构域之间。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽在第二嵌合多肽的N端和/或C端进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接所述一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)包括相同的氨基酸序列。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自包括相同的氨基酸序列。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个靶标结合结构域中的一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)是抗原结合结构域。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如，scFv或单结构域抗体)。
亲和结构域对
在一些实施例中，多链嵌合多肽包括：1)包括一对亲和结构域中的第一结构域的第一嵌合多肽，和2)包括一对亲和结构域中的第二结构域的第二嵌合多肽，使得第一嵌合多肽和第二嵌合多肽通过一对亲和结构域中的第一结构域和第二结构域的结合而缔合。在一些实施例中，一对亲和结构域是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的寿司结构域和可溶性IL-15。寿司结构域，也称为短共有重复序列或1型糖蛋白基序，是蛋白质-蛋白质相互作用中的常见基序。已在许多蛋白质结合分子，包括补体组分C1r、C1s、因子H和C2m以及非免疫分子因子XIII和β2-糖蛋白上鉴别了寿司结构域。典型的寿司结构域具有大约60个氨基酸残基，并且含有四个半胱氨酸(Ranganathan,《太平洋生物计算专题讨论会(Pac.SympBiocomput.)》2000:155-67)。第一半胱氨酸可与第三半胱氨酸形成二硫键，并且第二半胱氨酸可与第四半胱氨酸形成二硫桥键。在其中一对亲和结构域中的一个成员是可溶性IL-15的一些实施例中，可溶性IL15具有D8N或D8A氨基酸取代。在其中一对亲和结构域中的一个成员是人IL-15受体的α链(IL15Rα)的一些实施例中，人IL15Rα是成熟全长IL15Rα。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是芽胞杆菌核糖核酸酶和芽胞杆菌核糖核酸酶抑制子。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是PKA和AKAP。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块(Rossi,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)》103:6841-6846,2006；Sharkey等人,《癌症研究(CancerRes.)》68:5282-5290,2008；Rossi等人,《药物科学趋势(Trends Pharmacol Sci.)》33:474-481,2012)或基于蛋白质突触蛋白、突触结合蛋白、突触泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块(Deyev等人,《自然·生物技术(Nat Biotechnol.)》1486-1492,2003)。
在一些实施例中，多链嵌合多肽的第一嵌合多肽包括一对亲和结构域中的第一结构域，并且多链嵌合多肽的第二嵌合多肽包括一对亲和结构域中的第二结构域，其中一对亲和结构域中的第一结构域和一对亲和结构域中的第二结构域以小于1×10-7M、小于1×10-8M、小于1×10-9M、小于1×10-10M、小于1×10-11M、小于1×10-12M或小于1×10-13M的解离平衡常数(KD)彼此结合。在一些实施例中，一对亲和结构域中的第一结构域与一对亲和结构域中的第二结构域以如下KD彼此结合：约1×10-4M至约1×10-6M、约1×10-5M至约1×10- 7M、约1×10-6M至约1×10-8M、约1×10-7M至约1×10-9M、约1×10-8M至约1×10-10M、约1×10- 9M至约1×10-11M、约1×10-10M至约1×10-12M、约1×10-11M至约1×10-13M、约1×10-4M至约1×10-5M、约1×10-5M至约1×10-6M、约1×10-6M至约1×10-7M、约1×10-7M至约1×10-8M、约1×10-8M至约1×10-9M、约1×10-9M至约1×10-10M、约1×10-10M至约1×10-11M、约1×10-11M至约1×10-12M或约1×10-12M至约1×10-13M(包括端点)。本领域已知的多种不同方法中的任一种均可以用于确定一对亲和结构域中的第一结构域与一对亲和结构域中的第二结构域的结合的KD值(例如，电泳迁移变动分析、滤膜结合分析、表面等离子体共振和生物分子结合动力学分析等)。
在一些实施例中，多链嵌合多肽的第一嵌合多肽包括一对亲和结构域中的第一结构域，并且多链嵌合多肽的第二嵌合多肽包括一对亲和结构域中的第二结构域，其中一对亲和结构域中的第一结构域、一对亲和结构域中的第二结构域或两者为约10至100个氨基酸的长度。举例来说，一对亲和结构域中的第一结构域、一对亲和结构域中的第二结构域或两者可为约10至100个氨基酸的长度、约15至100个氨基酸的长度、约20至100个氨基酸的长度、约25至100个氨基酸的长度、约30至100个氨基酸的长度、约35至100个氨基酸的长度、约40至100个氨基酸的长度、约45至100个氨基酸的长度、约50至100个氨基酸的长度、约55至100个氨基酸的长度、约60至100个氨基酸的长度、约65至100个氨基酸的长度、约70至100个氨基酸的长度、约75至100个氨基酸的长度、约80至100个氨基酸的长度、约85至100个氨基酸的长度、约90至100个氨基酸的长度、约95至100个氨基酸的长度、约10至95个氨基酸的长度、约10至90个氨基酸的长度、约10至85个氨基酸的长度、约10至80个氨基酸的长度、约10至75个氨基酸的长度、约10至70个氨基酸的长度、约10至65个氨基酸的长度、约10至60个氨基酸的长度、约10至55个氨基酸的长度、约10至50个氨基酸的长度、约10至45个氨基酸的长度、约10至40个氨基酸的长度、约10至35个氨基酸的长度、约10至30个氨基酸的长度、约10至25个氨基酸的长度、约10至20个氨基酸的长度、约10至15个氨基酸的长度、约20至30个氨基酸的长度、约30至40个氨基酸的长度、约40至50个氨基酸的长度、约50至60个氨基酸的长度、约60至70个氨基酸的长度、约70至80个氨基酸的长度、约80至90个氨基酸的长度、约90至100个氨基酸的长度、约20至90个氨基酸的长度、约30至80个氨基酸的长度、约40至70个氨基酸的长度、约50至60个氨基酸的长度或介于两者之间的任何范围。在一些实施例中，一对亲和结构域中的第一结构域、一对亲和结构域中的第二结构域或两者为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸的长度。
在一些实施例中，本文公开的一对亲和结构域中的第一和/或第二结构域中的任一个可以在其N端和/或C端包括一个或多个另外的氨基酸(例如1、2、3、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)，只要一对亲和结构域中第一和/或第二结构域的功能保留完整即可。例如，来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的寿司结构域可以在N端和/或C端包括一个或多个另外的氨基酸，同时仍保留与可溶性IL-15结合的能力。另外地或可替代地，可溶性IL-15可以在N端和/或C端包括一个或多个另外的氨基酸，同时仍保留与来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的寿司结构域结合的能力。
来自IL-15受体α的α链(IL15Rα)的寿司结构域的非限制性实例可包括与ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:123)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列。在一些实施例中，来自IL15Rα的α链的寿司结构域可由包括ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG(SEQ ID NO:124)的核酸编码。
在一些实施例中，可溶性IL-15可包括与NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:125)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列。在一些实施例中，可溶性IL-15可由包括AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC(SEQ ID NO:126)的序列的核酸编码。
示例性多链嵌合多肽-A型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到IL-18的受体或IL-12的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性IL-15或可溶性IL-18。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地是可溶性IL-15或可溶性IL-18。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域都特异性结合到IL-18的受体或IL-12的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-12的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-18的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-18的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-12的受体。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括可溶性IL-18(例如，可溶性人IL-18)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性IL-12(例如，可溶性人IL-12)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人IL-15包括可溶性人IL-12β(p40)的序列和可溶性人IL-12α(p35)的序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性IL-15人IL-15进一步包括可溶性IL-12β(p40)的序列与可溶性人IL-12α(p35)的序列之间的接头序列(例如，本文所描述的示例性接头序列中的任一种)。
示例性多链嵌合多肽-B型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到IL-21的受体或TGF-β。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性IL-21(例如，可溶性人IL-21多肽)或可溶性TGF-β受体(例如，可溶性TGFRβRII受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地为可溶性IL-21或可溶性TGF-β受体(例如，可溶性TGFRβRII受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域均特异性结合到IL-21的受体或TGF-β。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到TGF-β。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合TGF-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性TGF-β受体(例如，可溶性TGFRβRII受体(例如，可溶性人TGFRβRII受体))。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括可溶性人TGFRβRII的第一序列和可溶性人TGFRβRII的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括安置于可溶性人TGFRβRII的第一序列与可溶性人TGFRβRII的第二序列之间的接头。
示例性多链嵌合多肽-C型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7的受体或IL-21的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性IL-21(例如，可溶性人IL-21多肽)或可溶性IL-7(例如，可溶性人IL-7多肽)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地为可溶性IL-21或可溶性IL-7。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域都特异性结合到IL-21的受体或IL-7的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-7的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-7的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括可溶性IL-21(例如，可溶性人IL-21)。
示例性多链嵌合多肽-D型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7的受体或IL-21的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性IL-21(例如，可溶性人IL-21多肽)或可溶性IL-7(例如，可溶性人IL-7多肽)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地为可溶性IL-21或可溶性IL-7。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域都特异性结合到IL-21的受体或IL-7的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-7的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-7的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体。
示例性多链嵌合多肽-E型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到IL-18(例如，可溶性人IL-18)的受体、IL-12(例如，可溶性人IL-12)的受体或CD16(例如，抗CD16 scFv)。在本文所描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到CD16或IL-12的受体。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一个或两个是可溶性IL-15或可溶性IL-18。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地是可溶性IL-15或可溶性IL-18。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域都特异性结合到IL-18的受体或IL-12的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-12的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-18的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-18的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-12的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到CD16，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-18的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-18的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到CD16。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个包含相同的氨基酸序列。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括可溶性IL-18(例如，可溶性人IL-18)。
示例性多链嵌合多肽-F型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7(例如，可溶性人IL-7)的受体、CD16(例如，抗CD16 scFv)或IL-21(例如，可溶性人IL-21)的受体。在本文所描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到CD16或IL-21的受体。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到受体IL-7，而第二靶标结合结构域特异性结合到CD16或IL-21的受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括可溶性IL-7蛋白。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性IL-7蛋白是可溶性人IL-7。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二抗原结合结构域包括特异性结合到CD16的靶标结合结构域。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括特异性结合到CD16的scFv。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性IL-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性IL-21是可溶性人IL-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括特异性结合到IL-21的受体的另外的靶标结合结构域。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，另外的靶标结合结构域包括可溶性IL-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性IL-21是可溶性人IL-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括特异性结合到CD16的另外的靶标结合结构域。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个包含相同的氨基酸序列。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括可溶性IL-7(例如，可溶性人IL-7)。
示例性多链嵌合多肽-G型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到TGFβ(例如，人TGFβRII受体)、CD16(例如，抗CD16 scFv)或IL-21(例如，可溶性人IL-21)的受体。在本文所描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到CD16或IL-21的受体。
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到TGF-β、CD16或IL-21的受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到TGF-β，并且第二靶标结合结构域特异性结合到CD16或IL-21的受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域是可溶性TGF-β受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性TGF-β受体是可溶性TGFβRII受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域特异性结合到CD16。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二抗原结合结构域包括特异性结合到CD16的抗原结合结构域。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二抗原结合结构域包括特异性结合到CD16的scFv。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性IL-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二靶标结合结构域包括可溶性人IL-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括特异性结合到IL-21的受体的另外的靶标结合结构域。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，另外的靶标结合结构域包括可溶性IL-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性IL-21是可溶性人IL-21。在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括特异性结合到CD16的另外的靶标结合结构域。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个包含相同的氨基酸序列。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域包括TGFβRII受体(例如，可溶性人TGFβRII受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括可溶性人TGFRβRII的第一序列和可溶性人TGFRβRII的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括安置于可溶性人TGFRβRII的第一序列与可溶性人TGFRβRII的第二序列之间的接头。
示例性多链嵌合多肽-H型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
示例性多链嵌合多肽-I型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到TGF-β。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到TGF-β。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域是可溶性TGF-β受体(例如，可溶性TGFβRII受体，例如可溶性人TGFβRII)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括可溶性人TGFRβRII的第一序列和可溶性人TGFRβRII的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括安置于可溶性人TGFRβRII的第一序列与可溶性人TGFRβRII的第二序列之间的接头。
示例性多链嵌合多肽-J型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7的受体、IL-21的受体或CD137L的受体。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到IL-21(例如，可溶性IL-21，例如可溶性人IL-21)的受体或CD137L(例如，可溶性CD137L，例如可溶性人CD137L)的受体。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-7的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体或CD137L的受体。在一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体或CD137L的受体。
示例性多链嵌合多肽-K型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到IL-7的受体或TGF-β。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到IL-7的受体，而第二靶标结合结构域特异性结合到TGF-β。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到TGF-β，并且第二靶标结合结构域特异性结合到IL-7的受体。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二靶标结合结构域包含特异性结合到TGF-β的靶标结合结构域。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二靶标结合结构域是可溶性TGF-β受体(例如，可溶性TGFβRII受体，例如可溶性人TGFβRII受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括可溶性人TGFRβRII的第一序列和可溶性人TGFRβRII的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括安置于可溶性人TGFRβRII的第一序列与可溶性人TGFRβRII的第二序列之间的接头。
示例性多链嵌合多肽-L型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到TGF-β、IL-21的受体或CD137L的受体。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到IL-21(例如，可溶性IL-21，例如可溶性人IL-21)的受体或CD137L(例如，可溶性CD137L，例如可溶性人CD137L)的受体。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到TGF-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到IL-21的受体或CD137L的受体。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域是可溶性TGF-β受体(例如，可溶性TGFβRII受体，例如可溶性人TGFβRII受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括可溶性人TGFRβRII的第一序列和可溶性人TGFRβRII的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括安置于可溶性人TGFRβRII的第一序列与可溶性人TGFRβRII的第二序列之间的接头。
示例性多链嵌合多肽-M型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到TGF-β或IL-21的受体。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到IL-21(例如，可溶性IL-21，例如可溶性人IL-21)的受体或TGF-β(例如，可溶性TGF-β受体，例如可溶性TGFβRII受体)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到TGF-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到TGF-β或IL-21的受体。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域是可溶性TGF-β受体(例如，可溶性TGFβRII受体，例如可溶性人TGFβRII受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括可溶性人TGFRβRII的第一序列和可溶性人TGFRβRII的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括安置于可溶性人TGFRβRII的第一序列与可溶性人TGFRβRII的第二序列之间的接头。
示例性多链嵌合多肽-N型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到TGF-β或CD16。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到CD16(例如，抗CD16scFv)或TGF-β(例如可溶性TGF-β受体，例如可溶性TGFβRII受体)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到TGF-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到TGF-β或CD16。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域是可溶性TGF-β受体(例如，可溶性TGFβRII受体，例如可溶性人TGFβRII受体)。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括可溶性人TGFRβRII的第一序列和可溶性人TGFRβRII的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括安置于可溶性人TGFRβRII的第一序列与可溶性人TGFRβRII的第二序列之间的接头。
示例性多链嵌合多肽-O型
在本文描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自独立地特异性结合到TGF-β或CD137L的受体。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括另外的靶标结合结构域。在本文描述的这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域特异性结合到TGF-β的受体(例如可溶性TGF-β受体，例如可溶性TGFβRII受体)或CD137L。
在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一靶标结合结构域和可溶性组织因子结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实例中，第一嵌合多肽还包含在第一嵌合多肽中第一靶标结合结构域与可溶性组织因子结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子结构域和一对亲和结构域中的第一结构域在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一嵌合多肽还包括在第一嵌合多肽中可溶性组织因子结构域与一对亲和结构域中的第一结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，一对亲和结构域中的第二结构域和第二靶标结合结构域在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括在第二嵌合多肽中一对亲和结构域中的第二结构域与第二靶标结合结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在一些实施例中，第二嵌合多肽还在第二嵌合多肽的N端或C端包含一个或多个另外的靶标结合结构域。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域和一对亲和结构域中的第二结构域在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括在第二嵌合多肽中一对亲和结构域中的第二结构域与另外的靶标结合结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，另外的靶标结合结构域和第二靶标结合结构域在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第二嵌合多肽还包括在第二嵌合多肽中第二靶标结合结构域与另外的靶标结合结构域之间的接头序列(例如，本文描述的任一个示例性接头)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是本文描述的任一种示例性可溶性组织因子结构域。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，所述一对亲和结构域可以是本文描述的任一对示例性亲和结构域。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域特异性结合到TGF-β，而第二靶标结合结构域特异性结合到CD137L。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域或另外的靶标结合结构域是可溶性TGF-β受体(例如，可溶性TGFβRII受体，例如可溶性人TGFβRII受体)。
在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括可溶性人TGFRβRII的第一序列和可溶性人TGFRβRII的第二序列。在这些多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性人TGFRβRII包括安置于可溶性人TGFRβRII的第一序列与可溶性人TGFRβRII的第二序列之间的接头。
示例性多链嵌合多肽的序列
IL12/IL-15RαSu构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:30)：
(信号肽)
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC
(人IL-12亚基β(p40))
ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCCGGCGAAATGGTGGTGCTCACTTGTGACACCCCCGAAGAAGACGGCATCACTTGGACCCTCGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGAAAGACCCTCACAATCCAAGTTAAGGAGTTCGGAGACGCTGGCCAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGCTCAGCCATTCCTTATTATTATTACACAAGAAGGAAGACGGAATCTGGTCCACCGACATTTTAAAAGATCAGAAGGAGCCCAAGAATAAGACCTTTTTAAGGTGTGAGGCCAAAAACTACAGCGGTCGTTTCACTTGTTGGTGGCTGACCACCATTTCCACCGATTTAACCTTCTCCGTGAAAAGCAGCCGGGGAAGCTCCGACCCTCAAGGTGTGACATGTGGAGCCGCTACCCTCAGCGCTGAGAGGGTTCGTGGCGATAACAAGGAATACGAGTACAGCGTGGAGTGCCAAGAAGATAGCGCTTGTCCCGCTGCCGAAGAATCTTTACCCATTGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAACTCAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATTAAGCCCGATCCTCCTAAGAATTTACAGCTGAAGCCTCTCAAAAATAGCCGGCAAGTTGAGGTCTCTTGGGAATATCCCGACACTTGGAGCACACCCCACAGCTACTTCTCTTTAACCTTTTGTGTGCAAGTTCAAGGTAAAAGCAAGCGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTTACCGACAAAACCAGCGCCACCGTCATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCAGCGTGAGGGCTCAAGATCGTTATTACTCCAGCAGCTGGTCCGAGTGGGCCAGCGTGCCTTGTTCC
(接头)
GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT
(人IL-12亚基α(p35))
CGTAACCTCCCCGTGGCTACCCCCGATCCCGGAATGTTCCCTTGTTTACACCACAGCCAGAATTTACTGAGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAAGCTAGGCAGACTTTAGAATTTTACCCTTGCACCAGCGAGGAGATCGACCATGAAGATATCACCAAGGACAAGACATCCACCGTGGAGGCTTGTTTACCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCTTGTCTCAACTCTCGTGAAACCAGCTTCATCACAAATGGCTCTTGTTTAGCTTCCCGGAAGACCTCCTTTATGATGGCTTTATGCCTCAGCTCCATCTACGAGGATTTAAAGATGTACCAAGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCTAAACGGCAGATCTTTTTAGACCAGAACATGCTGGCTGTGATTGATGAGCTGATGCAAGCTTTAAACTTCAACTCCGAGACCGTCCCTCAGAAGTCCTCCCTCGAGGAGCCCGATTTTTACAAGACAAAGATCAAACTGTGCATTTTACTCCACGCCTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATTGACCGGGTCATGAGCTATTTAAACGCCAGC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
IL12/IL-15RαSu融合蛋白(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:31)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-12亚基β(p40))
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人IL-12亚基α(p35))
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
IL-18/TF/IL-15构建体的核酸序列如下(SEQ ID NO:32)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTCACATTTATCTCTTTACTGTTCCTCTTCTCCAGCGCCTACAGC
(人IL-18)
TACTTCGGCAAACTGGAATCCAAGCTGAGCGTGATCCGGAATTTAAACGACCAAGTTCTGTTTATCGATCAAGGTAACCGGCCTCTGTTCGAGGACATGACCGACTCCGATTGCCGGGACAATGCCCCCCGGACCATCTTCATTATCTCCATGTACAAGGACAGCCAGCCCCGGGGCATGGCTGTGACAATTAGCGTGAAGTGTGAGAAAATCAGCACTTTATCTTGTGAGAACAAGATCATCTCCTTTAAGGAAATGAACCCCCCCGATAACATCAAGGACACCAAGTCCGATATCATCTTCTTCCAGCGGTCCGTGCCCGGTCACGATAACAAGATGCAGTTCGAATCCTCCTCCTACGAGGGCTACTTTTTAGCTTGTGAAAAGGAGAGGGATTTATTCAAGCTGATCCTCAAGAAGGAGGACGAGCTGGGCGATCGTTCCATCATGTTCACCGTCCAAAACGAGGAT
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
IL-18/TF/IL-15融合蛋白(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:33)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-18)
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL-12/IL-15RαSu/αCD16scFv构建体的核酸序列如下(SEQ ID NO:34)：
(信号肽)
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC
(人IL-12亚基β(p40))
ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCCGGCGAAATGGTGGTGCTCACTTGTGACACCCCCGAAGAAGACGGCATCACTTGGACCCTCGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGAAAGACCCTCACAATCCAAGTTAAGGAGTTCGGAGACGCTGGCCAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGCTCAGCCATTCCTTATTATTATTACACAAGAAGGAAGACGGAATCTGGTCCACCGACATTTTAAAAGATCAGAAGGAGCCCAAGAATAAGACCTTTTTAAGGTGTGAGGCCAAAAACTACAGCGGTCGTTTCACTTGTTGGTGGCTGACCACCATTTCCACCGATTTAACCTTCTCCGTGAAAAGCAGCCGGGGAAGCTCCGACCCTCAAGGTGTGACATGTGGAGCCGCTACCCTCAGCGCTGAGAGGGTTCGTGGCGATAACAAGGAATACGAGTACAGCGTGGAGTGCCAAGAAGATAGCGCTTGTCCCGCTGCCGAAGAATCTTTACCCATTGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAACTCAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATTAAGCCCGATCCTCCTAAGAATTTACAGCTGAAGCCTCTCAAAAATAGCCGGCAAGTTGAGGTCTCTTGGGAATATCCCGACACTTGGAGCACACCCCACAGCTACTTCTCTTTAACCTTTTGTGTGCAAGTTCAAGGTAAAAGCAAGCGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTTACCGACAAAACCAGCGCCACCGTCATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCAGCGTGAGGGCTCAAGATCGTTATTACTCCAGCAGCTGGTCCGAGTGGGCCAGCGTGCCTTGTTCC
(接头)
GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT
(人IL-12亚基α(p35))
CGTAACCTCCCCGTGGCTACCCCCGATCCCGGAATGTTCCCTTGTTTACACCACAGCCAGAATTTACTGAGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAAGCTAGGCAGACTTTAGAATTTTACCCTTGCACCAGCGAGGAGATCGACCATGAAGATATCACCAAGGACAAGACATCCACCGTGGAGGCTTGTTTACCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCTTGTCTCAACTCTCGTGAAACCAGCTTCATCACAAATGGCTCTTGTTTAGCTTCCCGGAAGACCTCCTTTATGATGGCTTTATGCCTCAGCTCCATCTACGAGGATTTAAAGATGTACCAAGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCTAAACGGCAGATCTTTTTAGACCAGAACATGCTGGCTGTGATTGATGAGCTGATGCAAGCTTTAAACTTCAACTCCGAGACCGTCCCTCAGAAGTCCTCCCTCGAGGAGCCCGATTTTTACAAGACAAAGATCAAACTGTGCATTTTACTCCACGCCTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATTGACCGGGTCATGAGCTATTTAAACGCCAGC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
(抗人CD16轻链可变结构域)
TCCGAGCTGACCCAGGACCCTGCTGTGTCCGTGGCTCTGGGCCAGACCGTGAGGATCACCTGCCAGGGCGACTCCCTGAGGTCCTACTACGCCTCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTGTGCTGGTGATCTACGGCAAGAACAACAGGCCCTCCGGCATCCCTGACAGGTTCTCCGGATCCTCCTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCACAGGCGCTCAGGCCGAGGACGAGGCTGACTACTACTGCAACTCCAGGGACTCCTCCGGCAACCATGTGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGGGCCAT
(接头)
GGCGGCGGCGGCTCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGAGGATCC
(抗人CD16重链可变结构域)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGAGTGGTGAGGCCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGTGCTGCCTCCGGCTTCACCTTCGACGACTACGGCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGGCATCAACTGGAACGGCGGATCCACCGGCTACGCCGATTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCAGGTCCCTGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGG
IL-12/IL-15RαSu/αCD16scFv融合蛋白(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQID NO:35)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-12亚基β(p40))
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人IL-12亚基α(p35))
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(抗人CD16轻链可变结构域)
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVGH
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(抗人CD16重链可变结构域)
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSR
IL-18/IL-15RαSu构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:36)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTCACATTTATCTCTTTACTGTTCCTCTTCTCCAGCGCCTACAGC
(人IL-18)
TACTTCGGCAAACTGGAATCCAAGCTGAGCGTGATCCGGAATTTAAACGACCAAGTTCTGTTTATCGATCAAGGTAACCGGCCTCTGTTCGAGGACATGACCGACTCCGATTGCCGGGACAATGCCCCCCGGACCATCTTCATTATCTCCATGTACAAGGACAGCCAGCCCCGGGGCATGGCTGTGACAATTAGCGTGAAGTGTGAGAAAATCAGCACTTTATCTTGTGAGAACAAGATCATCTCCTTTAAGGAAATGAACCCCCCCGATAACATCAAGGACACCAAGTCCGATATCATCTTCTTCCAGCGGTCCGTGCCCGGTCACGATAACAAGATGCAGTTCGAATCCTCCTCCTACGAGGGCTACTTTTTAGCTTGTGAAAAGGAGAGGGATTTATTCAAGCTGATCCTCAAGAAGGAGGACGAGCTGGGCGATCGTTCCATCATGTTCACCGTCCAAAACGAGGAT
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
IL-18/IL-15RαSu融合蛋白(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:37)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-18)
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
IL-12/TF/IL-15构建体(包括前导序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:38)：
(信号肽)
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC
(人IL-12亚基β(p40))
ATTTGGGAACTGAAGAAGGACGTCTACGTGGTCGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCCGGCGAAATGGTGGTGCTCACTTGTGACACCCCCGAAGAAGACGGCATCACTTGGACCCTCGATCAGAGCAGCGAGGTGCTGGGCTCCGGAAAGACCCTCACAATCCAAGTTAAGGAGTTCGGAGACGCTGGCCAATACACATGCCACAAGGGAGGCGAGGTGCTCAGCCATTCCTTATTATTATTACACAAGAAGGAAGACGGAATCTGGTCCACCGACATTTTAAAAGATCAGAAGGAGCCCAAGAATAAGACCTTTTTAAGGTGTGAGGCCAAAAACTACAGCGGTCGTTTCACTTGTTGGTGGCTGACCACCATTTCCACCGATTTAACCTTCTCCGTGAAAAGCAGCCGGGGAAGCTCCGACCCTCAAGGTGTGACATGTGGAGCCGCTACCCTCAGCGCTGAGAGGGTTCGTGGCGATAACAAGGAATACGAGTACAGCGTGGAGTGCCAAGAAGATAGCGCTTGTCCCGCTGCCGAAGAATCTTTACCCATTGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAACTCAAGTACGAGAACTACACCTCCTCCTTCTTTATCCGGGACATCATTAAGCCCGATCCTCCTAAGAATTTACAGCTGAAGCCTCTCAAAAATAGCCGGCAAGTTGAGGTCTCTTGGGAATATCCCGACACTTGGAGCACACCCCACAGCTACTTCTCTTTAACCTTTTGTGTGCAAGTTCAAGGTAAAAGCAAGCGGGAGAAGAAAGACCGGGTGTTTACCGACAAAACCAGCGCCACCGTCATCTGTCGGAAGAACGCCTCCATCAGCGTGAGGGCTCAAGATCGTTATTACTCCAGCAGCTGGTCCGAGTGGGCCAGCGTGCCTTGTTCC
(接头)
GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT
(人IL-12亚基α(p35))
CGTAACCTCCCCGTGGCTACCCCCGATCCCGGAATGTTCCCTTGTTTACACCACAGCCAGAATTTACTGAGGGCCGTGAGCAACATGCTGCAGAAAGCTAGGCAGACTTTAGAATTTTACCCTTGCACCAGCGAGGAGATCGACCATGAAGATATCACCAAGGACAAGACATCCACCGTGGAGGCTTGTTTACCTCTGGAGCTGACAAAGAACGAGTCTTGTCTCAACTCTCGTGAAACCAGCTTCATCACAAATGGCTCTTGTTTAGCTTCCCGGAAGACCTCCTTTATGATGGCTTTATGCCTCAGCTCCATCTACGAGGATTTAAAGATGTACCAAGTGGAGTTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTCATGGACCCTAAACGGCAGATCTTTTTAGACCAGAACATGCTGGCTGTGATTGATGAGCTGATGCAAGCTTTAAACTTCAACTCCGAGACCGTCCCTCAGAAGTCCTCCCTCGAGGAGCCCGATTTTTACAAGACAAAGATCAAACTGTGCATTTTACTCCACGCCTTTAGGATCCGGGCCGTGACCATTGACCGGGTCATGAGCTATTTAAACGCCAGC
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
IL-12/TF/IL-15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:39)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-12亚基β(p40))
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人IL-12亚基α(p35))
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
TGFβRII/IL-15RαSu构建体(包括信号序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:40)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβRII-第1片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCACGATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGAT
(接头)
GGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGT
(人TGFβRII-第2片段)
ATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCACAATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATCACGTGTCCTCCTCCTATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCAGGGAGCGGTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACGTCCAGCCTGACGGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACGAATGTCGCCCACTGGACAACCCCCAGTCTCAAATGTATTAGA
TGFβRII/IL-15RαSu构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:41)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβRII-第1片段)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人TGFβRII-第2片段)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
IL-21/TF/IL-15构建体(包括前导序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:42)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
(人组织因子219)
TCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
成熟的IL-21/TF/IL-15融合蛋白(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ IDNO:43)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL-21/TF突变体/IL-15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:44，加阴影的核苷酸是突变体，并且突变密码子带有下划线)：
(信号序列)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
(人组织因子219突变体)
TCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCGCGACAGCTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGCTTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGGCGCGGAATAACACAGCTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
IL-21/TF突变体/IL-15构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:45，取代的残基被示出为加阴影并且带有下划线)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFATALEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECALTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVARNNTALSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL-21/IL-15RαSu构建体(包括信号序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:46)：
(信号序列)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
IL-21/IL-15RαSu构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:101)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
TGFβRII/TF/IL-15构建体(包括前导序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:47)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβRII-第1片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCACGATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGAT
(接头)
GGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGT
(人TGFβRII-第2片段)
ATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCACAATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人组织因子219)
TCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
TGFβRII/TF/IL-15融合蛋白(包括信号肽)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:48)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβRII-第1片段)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人TGFβRII-第2片段)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
编码IL-7/IL-15RαSu构建体的第二嵌合多肽(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:49)：
(信号肽)
ATGGGAGTGAAAGTTCTTTTTGCCCTTATTTGTATTGCTGTGGCCGAGGCC
(人IL-7)
GATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATATGAGAGTGTTCTAATGGTCAGCATCGATCAATTATTGGACAGCATGAAAGAAATTGGTAGCAATTGCCTGAATAATGAATTTAACTTTTTTAAAAGACATATCTGTGATGCTAATAAGGAAGGTATGTTTTTATTCCGTGCTGCTCGCAAGTTGAGGCAATTTCTTAAAATGAATAGCACTGGTGATTTTGATCTCCACTTATTAAAAGTTTCAGAAGGCACAACAATACTGTTGAACTGCACTGGCCAGGTTAAAGGAAGAAAACCAGCTGCCCTGGGTGAAGCCCAACCAACAAAGAGTTTGGAAGAAAATAAATCTTTAAAGGAACAGAAAAAACTGAATGACTTGTGTTTCCTAAAGAGACTATTACAAGAGATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGATGGGCACTAAAGAACAC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATCACGTGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCAGGGAGCGGTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACGTCCAGCCTGACGGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACGAATGTCGCCCACTGGACAACCCCCAGTCTCAAATGCATTAGA
IL-7/IL-15RαSu构建体的第二嵌合多肽(包括信号肽序列)如下(SEQ ID NO:50)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-7)
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
由金唯智(Genewiz)合成的编码IL-21/TF/IL-15构建体的第一嵌合多肽(包括前导序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:51)：
(信号肽)
ATGGGAGTGAAAGTTCTTTTTGCCCTTATTTGTATTGCTGTGGCCGAGGCC
(人IL-21片段)
CAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCC
(人组织因子219)
TCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATTTAACTTGGAAATCAACTAATTTCAAGACAATTTTGGAGTGGGAACCCAAACCCGTCAATCAAGTCTACACTGTTCAAATAAGCACTAAGTCAGGAGATTGGAAAAGCAAATGCTTTTACACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCGACGAGATTGTGAAGGATGTGAAGCAGACGTACTTGGCACGGGTCTTCTCCTACCCGGCAGGGAATGTGGAGAGCACCGGTTCTGCTGGGGAGCCTCTGTATGAGAACTCCCCAGAGTTCACACCTTACCTGGAGACAAACCTCGGACAGCCAACAATTCAGAGTTTTGAACAGGTGGGAACAAAAGTGAATGTGACCGTAGAAGATGAACGGACTTTAGTCAGAAGGAACAACACTTTCCTAAGCCTCCGGGATGTTTTTGGCAAGGACTTAATTTATACACTTTATTATTGGAAATCTTCAAGTTCAGGAAAGAAAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTGATTGATGTGGATAAAGGAGAAAACTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGATTCCCTCCCGAACAGTTAACCGGAAGAGTACAGACAGCCCGGTAGAGTGTATGGGCCAGGAGAAAGGGGAATTCAGAGAA
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
包括前导序列的IL-21/TF/IL-15构建体的第一嵌合多肽如下(SEQ ID NO:52)：
(信号肽)
MGVKVLFALICIAVAEA
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
由金唯智合成的编码IL-21/IL-15RαSu结构域的第二嵌合多肽(包括前导序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:53)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
IL-21/IL-15Rα寿司结构域的第二嵌合多肽(包括前导序列)如下(SEQ ID NO:54)：
(信号序列)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
编码IL-7/TF/IL-15的第一嵌合多肽的核酸序列如下(SEQ ID NO:55)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL-7片段)
GATTGCGACATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAGATCGGCTCCAACTGCCTCAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTCCTGTTCAGGGCCGCCAGGAAACTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACTCCACCGGCGACTTCGACCTGCACCTGCTGAAGGTGTCCGAGGGCACCACCATCCTGCTGAACTGCACCGGACAGGTGAAGGGCCGGAAACCTGCTGCTCTGGGAGAGGCCCAACCCACCAAGAGCCTGGAGGAGAACAAGTCCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTGTGCTTCCTGAAGAGGCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGCAT
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
IL-7/TF/IL-15的嵌合多肽(包括前导序列)如下(SEQ ID NO:56)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-7)
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL-7/TF/IL-15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:57)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL-7)
GATTGCGACATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAGATCGGCTCCAACTGCCTCAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTCCTGTTCAGGGCCGCCAGGAAACTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACTCCACCGGCGACTTCGACCTGCACCTGCTGAAGGTGTCCGAGGGCACCACCATCCTGCTGAACTGCACCGGACAGGTGAAGGGCCGGAAACCTGCTGCTCTGGGAGAGGCCCAACCCACCAAGAGCCTGGAGGAGAACAAGTCCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTGTGCTTCCTGAAGAGGCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGCAT
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
IL-7/TF/IL-15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:58)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-7)
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
抗-CD16SscFv/IL-15RαSu/IL-21构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQID NO:59)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
((抗人CD16scFv)
TCCGAGCTGACCCAGGACCCTGCTGTGTCCGTGGCTCTGGGCCAGACCGTGAGGATCACCTGCCAGGGCGACTCCCTGAGGTCCTACTACGCCTCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTGTGCTGGTGATCTACGGCAAGAACAACAGGCCCTCCGGCATCCCTGACAGGTTCTCCGGATCCTCCTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCACAGGCGCTCAGGCCGAGGACGAGGCTGACTACTACTGCAACTCCAGGGACTCCTCCGGCAACCATGTGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGGGCCATGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGAGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGAGTGGTGAGGCCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGTGCTGCCTCCGGCTTCACCTTCGACGACTACGGCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGGCATCAACTGGAACGGCGGATCCACCGGCTACGCCGATTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCAGGTCCCTGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGG
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
抗CD16scFv/IL-15RαSu/IL-21构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQID NO:60)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗人CD16scFv)
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVGHGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSR
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
两个TGFβ受体II/TF/IL-15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ IDNO:61)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(两个人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
TGFβ受体II/TF/IL-15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:62)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
抗CD16scFv/IL-15RαSu/IL-21构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ IDNO:63)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(抗人CD16scFv)
TCCGAGCTGACCCAGGACCCTGCTGTGTCCGTGGCTCTGGGCCAGACCGTGAGGATCACCTGCCAGGGCGACTCCCTGAGGTCCTACTACGCCTCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTGTGCTGGTGATCTACGGCAAGAACAACAGGCCCTCCGGCATCCCTGACAGGTTCTCCGGATCCTCCTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCACAGGCGCTCAGGCCGAGGACGAGGCTGACTACTACTGCAACTCCAGGGACTCCTCCGGCAACCATGTGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGGGCCATGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGAGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGAGTGGTGAGGCCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGTGCTGCCTCCGGCTTCACCTTCGACGACTACGGCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGGCATCAACTGGAACGGCGGATCCACCGGCTACGCCGATTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCAGGTCCCTGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGG
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
抗CD16scFv/IL-15RαSu/IL-21构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQID NO:64)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗人CD16scFv)
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVGHGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSR
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
7t15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:65)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL7)
GATTGCGACATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAGATCGGCTCCAACTGCCTCAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTCCTGTTCAGGGCCGCCAGGAAACTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACTCCACCGGCGACTTCGACCTGCACCTGCTGAAGGTGTCCGAGGGCACCACCATCCTGCTGAACTGCACCGGACAGGTGAAGGGCCGGAAACCTGCTGCTCTGGGAGAGGCCCAACCCACCAAGAGCCTGGAGGAGAACAAGTCCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTGTGCTTCCTGAAGAGGCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGCAT
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
7t15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:66)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL7)
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
7s构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:67)：
(信号肽)
ATGGGAGTGAAAGTTCTTTTTGCCCTTATTTGTATTGCTGTGGCCGAGGCC
(人IL7)
GATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATATGAGAGTGTTCTAATGGTCAGCATCGATCAATTATTGGACAGCATGAAAGAAATTGGTAGCAATTGCCTGAATAATGAATTTAACTTTTTTAAAAGACATATCTGTGATGCTAATAAGGAAGGTATGTTTTTATTCCGTGCTGCTCGCAAGTTGAGGCAATTTCTTAAAATGAATAGCACTGGTGATTTTGATCTCCACTTATTAAAAGTTTCAGAAGGCACAACAATACTGTTGAACTGCACTGGCCAGGTTAAAGGAAGAAAACCAGCTGCCCTGGGTGAAGCCCAACCAACAAAGAGTTTGGAAGAAAATAAATCTTTAAAGGAACAGAAAAAACTGAATGACTTGTGTTTCCTAAAGAGACTATTACAAGAGATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGATGGGCACTAAAGAACAC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATCACGTGCCCTCCCCCCATGTCCGTGGAACACGCAGACATCTGGGTCAAGAGCTACAGCTTGTACTCCAGGGAGCGGTACATTTGTAACTCTGGTTTCAAGCGTAAAGCCGGCACGTCCAGCCTGACGGAGTGCGTGTTGAACAAGGCCACGAATGTCGCCCACTGGACAACCCCCAGTCTCAAATGCATTAGA
7s融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:68)：
(信号肽)
MGVKVLFALICIAVAEA
(人IL7)
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
两个TGFβ受体II/TF/IL-15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ IDNO:69)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(两个人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
TGFβ受体II/TF/IL-15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:70)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
TGFβ受体II/IL-15RαSu构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:71)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(两个人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
两个TGFβ受体II/IL-15RαSu构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ IDNO:72)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(两个人TGFβ受体II细胞外结构域)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
7t15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:73)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL7)
GATTGCGACATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAGATCGGCTCCAACTGCCTCAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTCCTGTTCAGGGCCGCCAGGAAACTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACTCCACCGGCGACTTCGACCTGCACCTGCTGAAGGTGTCCGAGGGCACCACCATCCTGCTGAACTGCACCGGACAGGTGAAGGGCCGGAAACCTGCTGCTCTGGGAGAGGCCCAACCCACCAAGAGCCTGGAGGAGAACAAGTCCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTGTGCTTCCTGAAGAGGCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGCAT
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
7t15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:74)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL7)
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
以下显示21s137L的核酸和蛋白质序列。21s137L构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:75)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
((G4S)3接头)
GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT
(人CD137L)
CGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA
21s137L融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:76)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
((G4S)3接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人CD137L)
REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
7t15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:77)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL7)
GATTGCGACATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAGATCGGCTCCAACTGCCTCAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTCCTGTTCAGGGCCGCCAGGAAACTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACTCCACCGGCGACTTCGACCTGCACCTGCTGAAGGTGTCCGAGGGCACCACCATCCTGCTGAACTGCACCGGACAGGTGAAGGGCCGGAAACCTGCTGCTCTGGGAGAGGCCCAACCCACCAAGAGCCTGGAGGAGAACAAGTCCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTGTGCTTCCTGAAGAGGCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGCAT
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
7t15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:78)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL7)
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
以下显示21s137L(短版)的核酸和蛋白质序列。21s137L(短版)构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:79)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
((G4S)3接头)
GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT
(人CD137配体短版)
GATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATC
21s137L(短版)构建体(包括信号肽序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:80)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
((G4S)3接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人CD137配体短版)
DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEI
7t15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:81)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL7)
GATTGCGACATCGAGGGCAAGGACGGCAAGCAGTACGAGAGCGTGCTGATGGTGTCCATCGACCAGCTGCTGGACAGCATGAAGGAGATCGGCTCCAACTGCCTCAACAACGAGTTCAACTTCTTCAAGCGGCACATCTGCGACGCCAACAAGGAGGGCATGTTCCTGTTCAGGGCCGCCAGGAAACTGCGGCAGTTCCTGAAGATGAACTCCACCGGCGACTTCGACCTGCACCTGCTGAAGGTGTCCGAGGGCACCACCATCCTGCTGAACTGCACCGGACAGGTGAAGGGCCGGAAACCTGCTGCTCTGGGAGAGGCCCAACCCACCAAGAGCCTGGAGGAGAACAAGTCCCTGAAGGAGCAGAAGAAGCTGAACGACCTGTGCTTCCTGAAGAGGCTGCTGCAGGAGATCAAGACCTGCTGGAACAAGATCCTGATGGGCACCAAGGAGCAT
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
7t15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:82)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL7)
DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
TGFRs构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:83)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
TGFRs融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:84)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
TGFRt15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:85)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
TGFRt15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:86)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
以下显示21s137L的核酸和蛋白质序列。21s137L构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:87)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
((G4S)3接头)
GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT
(人CD137L)
CGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA
21s137L融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:88)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
((G4S)3接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人CD137L)
REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
TGFRt15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:89)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
TGFRt15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:90)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
TGFRs21构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:91)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
(人IL-21)
CAGGGCCAGGACAGGCACATGATCCGGATGAGGCAGCTCATCGACATCGTCGACCAGCTGAAGAACTACGTGAACGACCTGGTGCCCGAGTTTCTGCCTGCCCCCGAGGACGTGGAGACCAACTGCGAGTGGTCCGCCTTCTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAGCTGAAGTCCGCCAACACCGGCAACAACGAGCGGATCATCAACGTGAGCATCAAGAAGCTGAAGCGGAAGCCTCCCTCCACAAACGCCGGCAGGAGGCAGAAGCACAGGCTGACCTGCCCCAGCTGTGACTCCTACGAGAAGAAGCCCCCCAAGGAGTTCCTGGAGAGGTTCAAGTCCCTGCTGCAGAAGATGATCCATCAGCACCTGTCCTCCAGGACCCACGGCTCCGAGGACTCC
TGFRs21融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:92)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人IL-21)
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
TGFRt15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:93)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
TGFRt15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:94)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
TGFRs16构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:95)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
(抗人CD16scFv)
TCCGAGCTGACCCAGGACCCTGCTGTGTCCGTGGCTCTGGGCCAGACCGTGAGGATCACCTGCCAGGGCGACTCCCTGAGGTCCTACTACGCCTCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTGTGCTGGTGATCTACGGCAAGAACAACAGGCCCTCCGGCATCCCTGACAGGTTCTCCGGATCCTCCTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCACAGGCGCTCAGGCCGAGGACGAGGCTGACTACTACTGCAACTCCAGGGACTCCTCCGGCAACCATGTGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGGGCCATGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGAGGAGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGAGGAGGAGTGGTGAGGCCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGAGCTGTGCTGCCTCCGGCTTCACCTTCGACGACTACGGCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGGCATCAACTGGAACGGCGGATCCACCGGCTACGCCGATTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCAGGTCCCTGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGG
TGFRs16融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:96)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(抗人CD16scFv)
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVGHGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSR
TGFRt15构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:97)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人组织因子219)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL-15)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
TGFRt15融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:98)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-15)
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
TGFRs137L构建体(包括信号肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO:99)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(人TGFβ受体II片段)
ATCCCCCCCCATGTGCAAAAGAGCGTGAACAACGATATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTTCCCCAGCTCTGCAAGTTCTGCGATGTCAGGTTCAGCACCTGCGATAATCAGAAGTCCTGCATGTCCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGCGAGAAGCCCCAAGAAGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGGAAAAATGACGAGAACATCACCCTGGAGACCGTGTGTCACGACCCCAAGCTCCCTTATCACGACTTCATTCTGGAGGACGCTGCCTCCCCCAAATGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGAGAGACCTTCTTTATGTGTTCCTGTAGCAGCGACGAGTGTAACGACAACATCATCTTCAGCGAAGAGTACAACACCAGCAACCCTGATGGAGGTGGCGGATCCGGAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGGAGTATTCCTCCCCACGTGCAGAAGAGCGTGAATAATGACATGATCGTGACCGATAACAATGGCGCCGTGAAATTTCCCCAGCTGTGCAAATTCTGCGATGTGAGGTTTTCCACCTGCGACAACCAGAAGTCCTGTATGAGCAACTGCTCCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCTCAGGAGGTGTGCGTGGCTGTCTGGCGGAAGAATGACGAGAATATCACCCTGGAAACCGTCTGCCACGATCCCAAGCTGCCCTACCACGATTTCATCCTGGAAGACGCCGCCAGCCCTAAGTGCATCATGAAAGAGAAAAAGAAGCCTGGCGAGACCTTTTTCATGTGCTCCTGCAGCAGCGACGAATGCAACGACAATATCATCTTTAGCGAGGAATACAATACCAGCAACCCCGAC
(人IL-15Rα寿司结构域)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
((G4S)3接头)
GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT
(人CD137L)
CGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTCGGAA
TGFRs137L融合蛋白(包括前导序列)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:100)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人TGFβ受体II)
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGGSGGGGSGGGGSIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(人IL-15Rα寿司结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
((G4S)3接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(人CD137L)
REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
组合物/试剂盒
本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的组合物。本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂中的任一种的色谱柱。本文还提供包括本文描述的亲和色谱树脂或色谱柱中的任一种的试剂盒。本文描述的试剂盒中的任一种的一些实施例另外包括用于执行本文描述的方法中的任一种的说明书。
实例
实例1：CNBr活化的琼脂糖凝胶与NHS琼脂糖凝胶的比较
用于偶联蛋白质的固体载体材料可含有不同的活化基团或使用不同的化学反应。因此，评估用于抗组织因子抗体偶联的两种不同固体载体材料，以查看哪一种是用于高产量回收含有人组织因子(TF)的蛋白质(例如，本文描述的单链或多链嵌合蛋白中的任一种)的更好的基础树脂。
使用来自通用电气医疗集团(GE Healthcare)的NHS活化的琼脂糖凝胶4FastFlow树脂和CNBr活化的琼脂糖凝胶4Fast Flow树脂产生两种抗组织因子亲和柱。这些实验中使用的抗组织因子包括包含SEQ ID NO:7的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:8的轻链可变结构域。
对于相同量的每种树脂，根据制造商的说明书在相同条件下缀合相同量的抗组织因子抗体。然后将两种抗组织因子亲和色谱树脂装入两个柱中，并且使用18t15-12s收获物来评估产量回收和性能。当将相同量的18t15-12s装载到每个抗组织因子亲和色谱柱上时，与抗组织因子-NHS琼脂糖凝胶柱(NB#07，PG#08-09)相比，抗组织因子CNBr-琼脂糖凝胶柱在洗脱峰中产生的18t15-12s高出50％(6mg对4mg)(参见表1)。
表1.CNBr活化的琼脂糖凝胶与NHS琼脂糖凝胶的比较
Figure BDA0003872947890001381
实例2：洗脱条件
来自1.6cm×3.4cm(6.83mL CV)抗组织因子CNBr-琼脂糖凝胶亲和柱的18t15-12s洗脱曲线在图2中示出，所述柱用5CV磷酸盐缓冲盐水平衡、用18t15-12s装载、用7CV磷酸盐缓冲盐水洗涤并且用pH为2.9的6CV的0.1M乙酸洗脱。图2中的所得色谱图示出使用0.1M乙酸的洗脱产生具有最小拖尾的尖锐蛋白质峰。鉴于这些数据，选择0.1M乙酸作为抗组织因子亲和色谱树脂的有用洗脱缓冲液。
实例3：靶蛋白质的偶联密度和结合能力
为了评估抗组织因子亲和柱的结合能力，使用CNBr-琼脂糖凝胶制备含有不同偶联密度的抗组织因子的树脂，并且然后装载18t15-12s以生成产量回收数据。图3表示来自许多不同树脂制备批次的历史数据，其示出结合能力随着与CNBr活化的琼脂糖凝胶树脂缀合的抗组织因子的量增加而增加。这种增加的结合能力在大约9mg抗组织因子/mL CNBr活化的琼脂糖凝胶树脂时开始趋于平稳。
实例4：偶联时间和混合方法
针对抗组织因子偶联条件评估不同的混合方法和缀合时间。2-4小时对过夜缀合时间的偶联没有观察到差异。数据在下表2中表示。此外，摇杆对叶轮混合方法没有观察到差异。
表2.历史树脂制备数据
Figure BDA0003872947890001382
Figure BDA0003872947890001391
实例5：洗涤研究
执行一组实验以鉴别本文描述的抗组织因子色谱树脂的最佳洗涤条件。在这些实验中，比较两种不同的第一洗涤缓冲液：磷酸盐缓冲盐水和pH为8.0的20mM Tris、1M NaCl。使用pH为8.0的20mM Tris、1M NaCl作为第一洗涤缓冲液导致材料损失，而不增加产品质量。在此初始实验之后，将pH为5.0的0.1M柠檬酸钠评估为第二洗涤缓冲液(在使用磷酸盐缓冲盐水的第一洗涤缓冲液之后)。
采用使用磷酸盐缓冲盐水的第一洗涤缓冲液，然后是pH为5.0的0.1M柠檬酸钠的第二洗涤缓冲液，因为这导致洗脱池pH增加。发现这种增加的洗脱池pH对产品质量具有保护作用，因为它与聚集有关。图4示出通过抗组织因子CNBr-琼脂糖凝胶亲和柱对18t15-12s纯化的洗涤条件的优化。使用2.6cm×7.4cm(39.27mL CV)柱执行每个实验，所述柱用5CV的磷酸盐缓冲盐水平衡、装载、用5CV的磷酸盐缓冲盐水洗涤，并且另外用5CV的磷酸盐缓冲盐水或pH为5.0的5CV的0.1M柠檬酸盐洗涤并且用pH为2.9的6CV的0.1M乙酸洗脱。
表3.洗涤2(pH为5.0的0.1M柠檬酸钠)对18t15-12s产品质量的影响
实验 洗涤条件 18t15-12s骨料(％) 18t15-12s主峰(％)
15-01 无pH 5.0洗涤 19.81 80.19
15-03 用pH为5.0的0.1M柠檬酸钠洗涤 8.4 91.6
实例6：汽提条件、储存溶液和稳定性数据
选择pH为2.5的0.1M甘氨酸作为抗组织因子-CNBr琼脂糖凝胶柱的汽提缓冲液。将缀合柱储存在磷酸盐缓冲盐水、0.05％叠氮化钠中。为了利用可易于转移到制造中的储存溶液，采用20％乙醇作为新的储存溶液。在20％乙醇中储存长达一年时，没有观察到柱性能损失。此外，抗组织因子CNBr-琼脂糖凝胶柱已使用长达一年，而没有显著损失结合能力。图5和6示出使用新生成的抗组织因子-CNBr琼脂糖凝胶柱的第一次运行和使用同一柱的第51次运行的洗脱曲线。图5示出新生成的2.6cm×9.5cm(50.41mL CV)抗组织因子-CNBr琼脂糖凝胶柱的第一次运行的洗脱曲线，所述柱通过用5CV磷酸盐缓冲盐水平衡、装载、用5CV磷酸盐缓冲盐水洗涤并且用pH为2.9的6CV的0.1M乙酸洗脱来纯化。图6示出第51次纯化运行(图5中使用的同一柱)的洗脱曲线，其中色谱运行使用了使用5CV磷酸盐缓冲盐水平衡、装载、用5CV磷酸盐缓冲盐水洗涤并且用pH为2.9的6CV的0.1M乙酸洗脱的步骤执行。
实例7：卫生方法的开发
为了避免污染，消毒溶液典型地用于柱使用前、使用后和储存之前的柱色谱。最初测试50mM NaOH 1M NaCl，接触时间为15分钟。这导致柱结合能力损失60％，并且因此50mMNaOH、1M NaCl不再用作卫生溶液。还测试pH为5.0的120mM磷酸、167mM乙酸、2.2％苯甲醇的商业溶液作为可以的消毒缓冲液。尽管pH为5.0的120mM磷酸、167mM乙酸、2.2％苯甲醇产生良好的柱稳定性，但由于其与塑料容器的相互作用而被放弃作为消毒策略。然后，将pH为5.0的50mM柠檬酸盐、2％苯甲醇以15分钟接触时间评估为卫生溶液。结果指示柱结合能力没有损失。因此，选择pH为5.0的50mM柠檬酸盐、2％苯甲醇作为抗组织因子亲和色谱柱的卫生溶液。
还执行研究以确定是否发生从一次运行到下一次运行的装载产品的产品携带。这是通过以下来完成的：用5CV磷酸盐缓冲盐水平衡2.6cm×9.5cm(50.41mL CV)抗组织因子-CNBr琼脂糖凝胶柱、将18t15-12s装载到柱上、用5CV的PBS洗涤、用pH为5.0的5CV的0.1M柠檬酸盐洗涤、用pH为2.9的0.1M乙酸洗脱、用pH为2.5的4CV的0.1M甘氨酸汽提、用4CV的磷酸盐缓冲盐水中和并且用7CV的20％乙醇储存。然后重复相同的过程，但不是装载18t15-12s，而是用磷酸盐缓冲盐水装载柱，并且通过ELISA分析洗脱池中残留的18t15-12s在下一次运行的洗脱中检测到最小量-1.162μg/mL 18t15-12s。
使用上面列出的相同纯化过程，通过ELISA测试来自过程演示运行的洗脱液的残留抗组织因子抗体，以评估柱的稳定性，并且验证在处理期间从柱中浸出到洗脱池的抗体量最小。在洗脱液中检测到的量可忽略不计，即17ppm。
实例8：TF融合蛋白和TF融合蛋白复合物的实例
已使用本文提供的抗组织因子CNBr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂成功纯化包括可溶性组织因子结构域的各种不同的单链和多链嵌合多肽。已使用本文提供的抗组织因子CNBr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂成功纯化的多链嵌合多肽包括18t15-12s、7t15-21s、TGFRt15-TGFRs、7t15-21s137L、21t15-TGFRs、TGFRt15-21s137L、TGFRt15-TGFRs137L、TGFRt15-TGFRs21、TGFRt15-TGFRs16、7t15-TGFRs、21t15-7s、18t15-12s16、7t15-16s21、TGFRt15-16s21和7t15-7s。已使用本文描述的抗组织因子CNBr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂成功纯化的单链嵌合多肽为2t2、3t28和15t15。
对通过抗组织因子-CNBr琼脂糖凝胶柱纯化的18t15-12s融合蛋白产品执行初步稳定性研究，并且然后执行后续的单元操作(如图1中所概述)。所得制造的18t15-12s稳定长达5周(表4)。
表4.在2-8℃、25℃和37℃下孵育的18t15-12s的稳定性数据，并且然后通过HPLC-SEC分析1周至长达5周的时间点。
Figure BDA0003872947890001411
实例9：TGFRt15-TGFRs和2t2的纯化
使用如本文描述的亲和色谱树脂(抗组织因子CNBr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂)纯化TGFRt15-TGFRs和2t2的条件。通常，抗组织因子CNBr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂如先前所述制备。然后将抗组织因子CNBr琼脂糖凝胶亲和色谱树脂装入柱中，并且将含有TGFRt15-TGFRs或2t2的澄清细胞收获物装载到已用4柱体积(CV)的PBS平衡的柱上。在样品装载后，用5CV的PBS和pH为5.0的5CV的0.1M柠檬酸钠洗涤柱。然后用pH为2.9的3-4CV的0.1M乙酸洗脱靶蛋白质(TGFRt15-TGFRs或2t2)。如果蛋白质材料用于研究目的，那么用1M Tris将TGFRt15-TGFRs或2t2的洗脱蛋白质峰调节至中性pH(7-8)，如果蛋白质材料用于临床研究，那么用1M柠檬酸调节至pH 3.6，随后在室温下在此低pH下孵育1小时。低pH孵育用于灭活细胞培养收获物中可潜在存在的病毒。在低pH孵育后，然后添加1M Tris以将TGFRt15-TGFRs的pH调节至6.0，或将2t2的pH调节至5.0，随后进行深层过滤以去除或减少与产品或过程相关的蛋白质污染物。在蛋白质洗脱后，如实例7中所述将柱汽提并且储存。
图9和图10中分别示出了示出TGFRt15-TGFRs和2t2的洗脱的色谱图。
序列表
<110> HCW生物制剂公司（HCW BIOLOGICS, INC.）
<120> 色谱树脂以及其用途
<130> 47039-0018WO1
<140>
<141>
<150> 62/982,002
<151> 2020-02-26
<150> 62/975,141
<151> 2020-02-11
<160> 130
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 1
Asp Tyr Asn Val Tyr
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 2
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 3
Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 4
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 5
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 6
Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 7
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Val Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 9
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Leu Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
20 25 30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
<210> 11
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
agcggcacaa ccaacacagt cgctgcctat aacctcactt ggaagagcac caacttcaaa 60
accatcctcg aatgggaacc caaacccgtt aaccaagttt acaccgtgca gatcagcacc 120
aagtccggcg actggaagtc caaatgtttc tataccaccg acaccgagtg cgatctcacc 180
gatgagatcg tgaaagatgt gaaacagacc tacctcgccc gggtgtttag ctaccccgcc 240
ggcaatgtgg agagcactgg ttccgctggc gagcctttat acgagaacag ccccgaattt 300
accccttacc tcgagaccaa tttaggacag cccaccatcc aaagctttga gcaagttggc 360
acaaaggtga atgtgacagt ggaggacgag cggactttag tgcggcggaa caacaccttt 420
ctcagcctcc gggatgtgtt cggcaaagat ttaatctaca cactgtatta ctggaagtcc 480
tcttcctccg gcaagaagac agctaaaacc aacacaaacg agtttttaat cgacgtggat 540
aaaggcgaaa actactgttt cagcgtgcaa gctgtgatcc cctcccggac cgtgaatagg 600
aaaagcaccg atagccccgt tgagtgcatg ggccaagaaa agggcgagtt ccgggag 657
<210> 12
<211> 223
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 12
Ala Gly Ile Pro Glu Lys Ala Phe Asn Leu Thr Trp Ile Ser Thr Asp
1 5 10 15
Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Gln Pro Lys Pro Thr Asn Tyr Thr Tyr
20 25 30
Thr Val Gln Ile Ser Asp Arg Ser Arg Asn Trp Lys Asn Lys Cys Phe
35 40 45
Ser Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp
50 55 60
Val Thr Trp Ala Tyr Glu Ala Lys Val Leu Ser Val Pro Arg Arg Asn
65 70 75 80
Ser Val His Gly Asp Gly Asp Gln Leu Val Ile His Gly Glu Glu Pro
85 90 95
Pro Phe Thr Asn Ala Pro Lys Phe Leu Pro Tyr Arg Asp Thr Asn Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Val Ile Gln Gln Phe Glu Gln Asp Gly Arg Lys Leu Asn
115 120 125
Val Val Val Lys Asp Ser Leu Thr Leu Val Arg Lys Asn Gly Thr Phe
130 135 140
Leu Thr Leu Arg Gln Val Phe Gly Lys Asp Leu Gly Tyr Ile Ile Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Lys Gly Ser Ser Thr Gly Lys Lys Thr Asn Ile Thr Asn Thr
165 170 175
Asn Glu Phe Ser Ile Asp Val Glu Glu Gly Val Ser Tyr Cys Phe Phe
180 185 190
Val Gln Ala Met Ile Phe Ser Arg Lys Thr Asn Gln Asn Ser Pro Gly
195 200 205
Ser Ser Thr Val Cys Thr Glu Gln Trp Lys Ser Phe Leu Gly Glu
210 215 220
<210> 13
<211> 224
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus rattus）
<400> 13
Ala Gly Thr Pro Pro Gly Lys Ala Phe Asn Leu Thr Trp Ile Ser Thr
1 5 10 15
Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Gln Pro Lys Pro Thr Asn Tyr Thr
20 25 30
Tyr Thr Val Gln Ile Ser Asp Arg Ser Arg Asn Trp Lys Tyr Lys Cys
35 40 45
Thr Gly Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys
50 55 60
Asp Val Asn Trp Thr Tyr Glu Ala Arg Val Leu Ser Val Pro Trp Arg
65 70 75 80
Asn Ser Thr His Gly Lys Glu Thr Leu Phe Gly Thr His Gly Glu Glu
85 90 95
Pro Pro Phe Thr Asn Ala Arg Lys Phe Leu Pro Tyr Arg Asp Thr Lys
100 105 110
Ile Gly Gln Pro Val Ile Gln Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Lys Val Thr Val Lys Asp Ser Phe Thr Leu Val Arg Lys Asn Gly Thr
130 135 140
Phe Leu Thr Leu Arg Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Gly Tyr Ile Leu
145 150 155 160
Thr Tyr Arg Lys Asp Ser Ser Thr Gly Arg Lys Thr Asn Thr Thr His
165 170 175
Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Glu Lys Gly Val Ser Tyr Cys Phe
180 185 190
Phe Ala Gln Ala Val Ile Phe Ser Arg Lys Thr Asn His Lys Ser Pro
195 200 205
Glu Ser Ile Thr Lys Cys Thr Glu Gln Trp Lys Ser Val Leu Gly Glu
210 215 220
<210> 14
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 14
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn Phe Ala Thr Ala Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
20 25 30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Ala Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Ala Arg Asn Asn Thr Ala Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
<210> 15
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 15
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn Phe Ala Thr Ala Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
20 25 30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Ala Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Ala Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Ala Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Ala Arg Asn Asn Thr Ala Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 16
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 18
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 20
ggcggtggag gatccggagg aggtggctcc ggcggcggag gatct 45
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成肽”
<400> 21
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 22
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 22
atgaagtggg tgaccttcat cagcttatta tttttattca gctccgccta ttcccagatc 60
gtgctgaccc aaagccccgc catcatgagc gctagccccg gtgagaaggt gaccatgaca 120
tgctccgctt ccagctccgt gtcctacatg aactggtatc agcagaaaag cggaaccagc 180
cccaaaaggt ggatctacga caccagcaag ctggcctccg gagtgcccgc tcatttccgg 240
ggctctggat ccggcaccag ctactcttta accatttccg gcatggaagc tgaagacgct 300
gccacctact attgccagca atggagcagc aaccccttca cattcggatc tggcaccaag 360
ctcgaaatca atcgtggagg aggtggcagc ggcggcggtg gatccggcgg aggaggaagc 420
caagttcaac tccagcagag cggcgctgaa ctggcccggc ccggcgcctc cgtcaagatg 480
agctgcaagg cttccggcta tacatttact cgttacacaa tgcattgggt caagcagagg 540
cccggtcaag gtttagagtg gatcggatat atcaaccctt cccggggcta caccaactat 600
aaccaaaagt tcaaggataa agccacttta accactgaca agagctcctc caccgcctac 660
atgcagctgt cctctttaac cagcgaggac tccgctgttt actactgcgc taggtattac 720
gacgaccact actgtttaga ctattgggga caaggtacca ctttaaccgt cagcagctcc 780
ggcaccacca ataccgtggc cgcttataac ctcacatgga agagcaccaa cttcaagaca 840
attctggaat gggaacccaa gcccgtcaat caagtttaca ccgtgcagat ctccaccaaa 900
tccggagact ggaagagcaa gtgcttctac acaacagaca ccgagtgtga tttaaccgac 960
gaaatcgtca aggacgtcaa gcaaacctat ctggctcggg tcttttccta ccccgctggc 1020
aatgtcgagt ccaccggctc cgctggcgag cctctctacg agaattcccc cgaattcacc 1080
ccttatttag agaccaattt aggccagcct accatccaga gcttcgagca agttggcacc 1140
aaggtgaacg tcaccgtcga ggatgaaagg actttagtgc ggcggaataa cacattttta 1200
tccctccggg atgtgttcgg caaagacctc atctacacac tgtactattg gaagtccagc 1260
tcctccggca aaaagaccgc taagaccaac accaacgagt ttttaattga cgtggacaaa 1320
ggcgagaact actgcttcag cgtgcaagcc gtgatccctt ctcgtaccgt caaccggaag 1380
agcacagatt cccccgttga gtgcatgggc caagaaaagg gcgagttccg ggaggtccag 1440
ctgcagcaga gcggacccga actcgtgaaa cccggtgctt ccgtgaaaat gtcttgtaag 1500
gccagcggat acaccttcac ctcctatgtg atccagtggg tcaaacagaa gcccggacaa 1560
ggtctcgagt ggatcggcag catcaaccct tacaacgact ataccaaata caacgagaag 1620
tttaagggaa aggctacttt aacctccgac aaaagctcca tcacagccta catggagttc 1680
agctctttaa catccgagga cagcgctctg tactattgcg cccggtgggg cgacggcaat 1740
tactggggac ggggcacaac actgaccgtg agcagcggag gcggaggctc cggcggaggc 1800
ggatctggcg gtggcggctc cgacatcgag atgacccagt cccccgctat catgtccgcc 1860
tctttaggcg agcgggtcac aatgacttgt acagcctcct ccagcgtctc ctcctcctac 1920
ttccattggt accaacagaa acccggaagc tcccctaaac tgtgcatcta cagcaccagc 1980
aatctcgcca gcggcgtgcc ccctaggttt tccggaagcg gaagcaccag ctactcttta 2040
accatctcct ccatggaggc tgaggatgcc gccacctact tttgtcacca gtaccaccgg 2100
tcccccacct tcggaggcgg caccaaactg gagacaaaga gg 2142
<210> 23
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 23
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser
20 25 30
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser
35 40 45
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp
50 55 60
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu
85 90 95
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
100 105 110
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp
165 170 175
Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn
180 185 190
Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr
225 230 235 240
Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
245 250 255
Val Ser Ser Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr
260 265 270
Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro
275 280 285
Val Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp
290 295 300
Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp
305 310 315 320
Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser
325 330 335
Tyr Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu
340 345 350
Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly
355 360 365
Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val
370 375 380
Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu
385 390 395 400
Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr
405 410 415
Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn
420 425 430
Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val
435 440 445
Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser
450 455 460
Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Val Gln
465 470 475 480
Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
485 490 495
Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Ile Gln
500 505 510
Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile
515 520 525
Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys
530 535 540
Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr Met Glu Phe
545 550 555 560
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp
565 570 575
Gly Asp Gly Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
595 600 605
Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu
610 615 620
Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr
625 630 635 640
Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Cys Ile
645 650 655
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
660 665 670
Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
675 680 685
Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Thr Phe
690 695 700
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg
705 710
<210> 24
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 24
atgaaatggg tcaccttcat ctctttactg tttttattta gcagcgccta cagcgtgcag 60
ctgcagcagt ccggacccga actggtcaag cccggtgcct ccgtgaaaat gtcttgtaag 120
gcttctggct acacctttac ctcctacgtc atccaatggg tgaagcagaa gcccggtcaa 180
ggtctcgagt ggatcggcag catcaatccc tacaacgatt acaccaagta taacgaaaag 240
tttaagggca aggccactct gacaagcgac aagagctcca ttaccgccta catggagttt 300
tcctctttaa cttctgagga ctccgcttta tactattgcg ctcgttgggg cgatggcaat 360
tattggggcc ggggaactac tttaacagtg agctccggcg gcggcggaag cggaggtgga 420
ggatctggcg gtggaggcag cgacatcgag atgacacagt cccccgctat catgagcgcc 480
tctttaggag aacgtgtgac catgacttgt acagcttcct ccagcgtgag cagctcctat 540
ttccactggt accagcagaa acccggctcc tcccctaaac tgtgtatcta ctccacaagc 600
aatttagcta gcggcgtgcc tcctcgtttt agcggctccg gcagcacctc ttactcttta 660
accattagct ctatggaggc cgaagatgcc gccacatact tttgccatca gtaccaccgg 720
tcccctacct ttggcggagg cacaaagctg gagaccaagc ggagcggcac caccaacaca 780
gtggccgcct acaatctgac ttggaaatcc accaacttca agaccatcct cgagtgggag 840
cccaagcccg ttaatcaagt ttataccgtg cagatttcca ccaagagcgg cgactggaaa 900
tccaagtgct tctataccac agacaccgag tgcgatctca ccgacgagat cgtcaaagac 960
gtgaagcaga catatttagc tagggtgttc tcctaccccg ctggaaacgt ggagagcacc 1020
ggatccgctg gagagccttt atacgagaac tcccccgaat tcacccccta tctggaaacc 1080
aatttaggcc agcccaccat ccagagcttc gaacaagttg gcacaaaggt gaacgtcacc 1140
gtcgaagatg agaggacttt agtgcggagg aacaatacat ttttatcctt acgtgacgtc 1200
ttcggcaagg atttaatcta cacactgtat tactggaagt ctagctcctc cggcaagaag 1260
accgccaaga ccaataccaa cgaattttta attgacgtgg acaagggcga gaactactgc 1320
ttctccgtgc aagctgtgat cccctcccgg acagtgaacc ggaagtccac cgactccccc 1380
gtggagtgca tgggccaaga gaagggagag tttcgtgagc agatcgtgct gacccagtcc 1440
cccgctatta tgagcgctag ccccggtgaa aaggtgacta tgacatgcag cgccagctct 1500
tccgtgagct acatgaactg gtatcagcag aagtccggca ccagccctaa aaggtggatc 1560
tacgacacca gcaagctggc cagcggcgtc cccgctcact ttcggggctc cggctccgga 1620
acaagctact ctctgaccat cagcggcatg gaagccgagg atgccgctac ctattactgt 1680
cagcagtgga gctccaaccc cttcaccttt ggatccggca ccaagctcga gattaatcgt 1740
ggaggcggag gtagcggagg aggcggatcc ggcggtggag gtagccaagt tcagctccag 1800
caaagcggcg ccgaactcgc tcggcccggc gcttccgtga agatgtcttg taaggcctcc 1860
ggctatacct tcacccggta cacaatgcac tgggtcaagc aacggcccgg tcaaggttta 1920
gagtggattg gctatatcaa cccctcccgg ggctatacca actacaacca gaagttcaag 1980
gacaaagcca ccctcaccac cgacaagtcc agcagcaccg cttacatgca gctgagctct 2040
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<213> 人工序列
<220>
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<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
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<213> 人工序列
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acaattagcg tgaagtgtga gaaaatcagc actttatctt gtgagaacaa gatcatctcc 300
tttaaggaaa tgaacccccc cgataacatc aaggacacca agtccgatat catcttcttc 360
cagcggtccg tgcccggtca cgataacaag atgcagttcg aatcctcctc ctacgagggc 420
tactttttag cttgtgaaaa ggagagggat ttattcaagc tgatcctcaa gaaggaggac 480
gagctgggcg atcgttccat catgttcacc gtccaaaacg aggatagcgg cacaaccaac 540
acagtcgctg cctataacct cacttggaag agcaccaact tcaaaaccat cctcgaatgg 600
gaacccaaac ccgttaacca agtttacacc gtgcagatca gcaccaagtc cggcgactgg 660
aagtccaaat gtttctatac caccgacacc gagtgcgatc tcaccgatga gatcgtgaaa 720
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actggttccg ctggcgagcc tttatacgag aacagccccg aatttacccc ttacctcgag 840
accaatttag gacagcccac catccaaagc tttgagcaag ttggcacaaa ggtgaatgtg 900
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aagacagcta aaaccaacac aaacgagttt ttaatcgacg tggataaagg cgaaaactac 1080
tgtttcagcg tgcaagctgt gatcccctcc cggaccgtga ataggaaaag caccgatagc 1140
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agcgatttaa agaagatcga agatttaatt cagtccatgc atatcgacgc cactttatac 1260
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gtccagatgt tcatcaatac ctcc 1524
<210> 33
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 33
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn
20 25 30
Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe
35 40 45
Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile
50 55 60
Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val
65 70 75 80
Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn
85 90 95
Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp
100 105 110
Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp
115 120 125
Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala
130 135 140
Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp
145 150 155 160
Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp Ser
165 170 175
Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr
180 185 190
Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val
195 200 205
Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys
210 215 220
Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys
225 230 235 240
Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly
245 250 255
Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser
260 265 270
Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile
275 280 285
Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp
290 295 300
Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp
305 310 315 320
Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser
325 330 335
Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile
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Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile
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Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys
370 375 380
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Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp
405 410 415
Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr
420 425 430
Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser
435 440 445
Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala
450 455 460
Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys
465 470 475 480
Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser
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<210> 34
<211> 2523
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 34
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<210> 35
<211> 841
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 35
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp
20 25 30
Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr
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Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile
100 105 110
Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu
115 120 125
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Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val
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Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp
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260 265 270
Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp
275 280 285
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Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser
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Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
325 330 335
Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe
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Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met
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Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser
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Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu
435 440 445
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450 455 460
Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile
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Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln
485 490 495
Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu
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Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg
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Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn
675 680 685
Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
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Leu Thr Val Gly His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
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Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
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Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg
835 840
<210> 36
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 36
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<210> 37
<211> 240
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 37
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn
20 25 30
Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe
35 40 45
Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile
50 55 60
Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val
65 70 75 80
Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn
85 90 95
Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp
100 105 110
Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp
115 120 125
Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala
130 135 140
Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp
145 150 155 160
Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp Ile
165 170 175
Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys
180 185 190
Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe
195 200 205
Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys
210 215 220
Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
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<210> 38
<211> 2607
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 38
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ctgaccacca tttccaccga tttaaccttc tccgtgaaaa gcagccgggg aagctccgac 480
cctcaaggtg tgacatgtgg agccgctacc ctcagcgctg agagggttcg tggcgataac 540
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<210> 39
<211> 869
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 39
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ttttcctacc ccgctggcaa tgtcgagtcc accggctccg ctggcgagcc tctctacgag 1200
aattcccccg aattcacccc ttatttagag accaatttag gccagcctac catccagagc 1260
ttcgagcaag ttggcaccaa ggtgaacgtc accgtcgagg atgaaaggac tttagtgcgg 1320
cggaataaca catttttatc cctccgggat gtgttcggca aagacctcat ctacacactg 1380
tactattgga agtccagctc ctccggcaaa aagaccgcta agaccaacac caacgagttt 1440
ttaattgacg tggacaaagg cgagaactac tgcttcagcg tgcaagccgt gatcccttct 1500
cgtaccgtca accggaagag cacagattcc cccgttgagt gcatgggcca agaaaagggc 1560
gagttccggg agaactgggt gaacgtcatc agcgatttaa agaagatcga agatttaatt 1620
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aacggcaacg tgacagagtc cggctgcaag gagtgcgaag agctggagga gaagaacatc 1860
aaggagtttc tgcaatcctt tgtgcacatt gtccagatgt tcatcaatac ctcc 1914
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<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 48
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile
20 25 30
Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe
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Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser
50 55 60
Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val
65 70 75 80
Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys
85 90 95
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100 105 110
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe
115 120 125
Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe
130 135 140
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Pro His Val Gln Lys
165 170 175
Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys
180 185 190
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Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp
245 250 255
Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys
260 265 270
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu
275 280 285
Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro
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305 310 315 320
Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn
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Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile
355 360 365
Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro
370 375 380
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385 390 395 400
Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro
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Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu
435 440 445
Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys
450 455 460
Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe
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Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala
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Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val
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Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His
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Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys
545 550 555 560
Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu
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Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile
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Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly
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Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu
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<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
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Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
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Tyr Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser
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Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile
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Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile
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Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys
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Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Ser Gly Thr Thr Asn Thr
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Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile
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Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp
210 215 220
Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr
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Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys
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Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys
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Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 52
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Ala Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp
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Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe
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Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr
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Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn
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Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys
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Glu Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
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Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
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His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
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Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
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Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
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<220>
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<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 53
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<220>
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<211> 503
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp
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Gly Glu Phe Arg Glu Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
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Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
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Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
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Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
435 440 445
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
450 455 460
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
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Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
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<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 57
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<400> 60
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ctgacccagg accctgctgt gtccgtggct ctgggccaga ccgtgaggat cacctgccag 120
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245 250 255
Ser Arg Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile
260 265 270
Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn
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Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val
290 295 300
Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys
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Cys Ile Arg Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu
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Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro
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Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser
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Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 65
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<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
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Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp
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Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu
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Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala
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<213> 人工序列
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<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 97
atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgttct ccagcgccta ctccatcccc 60
ccccatgtgc aaaagagcgt gaacaacgat atgatcgtga ccgacaacaa cggcgccgtg 120
aagtttcccc agctctgcaa gttctgcgat gtcaggttca gcacctgcga taatcagaag 180
tcctgcatgt ccaactgcag catcacctcc atctgcgaga agccccaaga agtgtgcgtg 240
gccgtgtggc ggaaaaatga cgagaacatc accctggaga ccgtgtgtca cgaccccaag 300
ctcccttatc acgacttcat tctggaggac gctgcctccc ccaaatgcat catgaaggag 360
aagaagaagc ccggagagac cttctttatg tgttcctgta gcagcgacga gtgtaacgac 420
aacatcatct tcagcgaaga gtacaacacc agcaaccctg atggaggtgg cggatccgga 480
ggtggaggtt ctggtggagg tgggagtatt cctccccacg tgcagaagag cgtgaataat 540
gacatgatcg tgaccgataa caatggcgcc gtgaaatttc cccagctgtg caaattctgc 600
gatgtgaggt tttccacctg cgacaaccag aagtcctgta tgagcaactg ctccatcacc 660
tccatctgtg agaagcctca ggaggtgtgc gtggctgtct ggcggaagaa tgacgagaat 720
atcaccctgg aaaccgtctg ccacgatccc aagctgccct accacgattt catcctggaa 780
gacgccgcca gccctaagtg catcatgaaa gagaaaaaga agcctggcga gacctttttc 840
atgtgctcct gcagcagcga cgaatgcaac gacaatatca tctttagcga ggaatacaat 900
accagcaacc ccgacagcgg cacaaccaac acagtcgctg cctataacct cacttggaag 960
agcaccaact tcaaaaccat cctcgaatgg gaacccaaac ccgttaacca agtttacacc 1020
gtgcagatca gcaccaagtc cggcgactgg aagtccaaat gtttctatac caccgacacc 1080
gagtgcgatc tcaccgatga gatcgtgaaa gatgtgaaac agacctacct cgcccgggtg 1140
tttagctacc ccgccggcaa tgtggagagc actggttccg ctggcgagcc tttatacgag 1200
aacagccccg aatttacccc ttacctcgag accaatttag gacagcccac catccaaagc 1260
tttgagcaag ttggcacaaa ggtgaatgtg acagtggagg acgagcggac tttagtgcgg 1320
cggaacaaca cctttctcag cctccgggat gtgttcggca aagatttaat ctacacactg 1380
tattactgga agtcctcttc ctccggcaag aagacagcta aaaccaacac aaacgagttt 1440
ttaatcgacg tggataaagg cgaaaactac tgtttcagcg tgcaagctgt gatcccctcc 1500
cggaccgtga ataggaaaag caccgatagc cccgttgagt gcatgggcca agaaaagggc 1560
gagttccggg agaactgggt gaacgtcatc agcgatttaa agaagatcga agatttaatt 1620
cagtccatgc atatcgacgc cactttatac acagaatccg acgtgcaccc ctcttgtaag 1680
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gctagcatcc acgacaccgt ggagaattta atcattttag ccaataactc tttatccagc 1800
aacggcaacg tgacagagtc cggctgcaag gagtgcgaag agctggagga gaagaacatc 1860
aaggagtttc tgcaatcctt tgtgcacatt gtccagatgt tcatcaatac ctcc 1914
<210> 98
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 98
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile
20 25 30
Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe
35 40 45
Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser
50 55 60
Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val
65 70 75 80
Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys
85 90 95
His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala
100 105 110
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe
115 120 125
Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe
130 135 140
Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Pro His Val Gln Lys
165 170 175
Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys
180 185 190
Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp
195 200 205
Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu
210 215 220
Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn
225 230 235 240
Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp
245 250 255
Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys
260 265 270
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu
275 280 285
Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro
290 295 300
Asp Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys
305 310 315 320
Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn
325 330 335
Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser
340 345 350
Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile
355 360 365
Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro
370 375 380
Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu
385 390 395 400
Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro
405 410 415
Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val
420 425 430
Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu
435 440 445
Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys
450 455 460
Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe
465 470 475 480
Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala
485 490 495
Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val
500 505 510
Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Asn Trp Val Asn
515 520 525
Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His
530 535 540
Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys
545 550 555 560
Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu
565 570 575
Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile
580 585 590
Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly
595 600 605
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu
610 615 620
Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
625 630 635
<210> 99
<211> 1707
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 99
atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgttct ccagcgccta ctccatcccc 60
ccccatgtgc aaaagagcgt gaacaacgat atgatcgtga ccgacaacaa cggcgccgtg 120
aagtttcccc agctctgcaa gttctgcgat gtcaggttca gcacctgcga taatcagaag 180
tcctgcatgt ccaactgcag catcacctcc atctgcgaga agccccaaga agtgtgcgtg 240
gccgtgtggc ggaaaaatga cgagaacatc accctggaga ccgtgtgtca cgaccccaag 300
ctcccttatc acgacttcat tctggaggac gctgcctccc ccaaatgcat catgaaggag 360
aagaagaagc ccggagagac cttctttatg tgttcctgta gcagcgacga gtgtaacgac 420
aacatcatct tcagcgaaga gtacaacacc agcaaccctg atggaggtgg cggatccgga 480
ggtggaggtt ctggtggagg tgggagtatt cctccccacg tgcagaagag cgtgaataat 540
gacatgatcg tgaccgataa caatggcgcc gtgaaatttc cccagctgtg caaattctgc 600
gatgtgaggt tttccacctg cgacaaccag aagtcctgta tgagcaactg ctccatcacc 660
tccatctgtg agaagcctca ggaggtgtgc gtggctgtct ggcggaagaa tgacgagaat 720
atcaccctgg aaaccgtctg ccacgatccc aagctgccct accacgattt catcctggaa 780
gacgccgcca gccctaagtg catcatgaaa gagaaaaaga agcctggcga gacctttttc 840
atgtgctcct gcagcagcga cgaatgcaac gacaatatca tctttagcga ggaatacaat 900
accagcaacc ccgacattac atgcccccct cccatgagcg tggagcacgc cgacatctgg 960
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<210> 100
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 100
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile
20 25 30
Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe
35 40 45
Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser
50 55 60
Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val
65 70 75 80
Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys
85 90 95
His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala
100 105 110
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe
115 120 125
Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe
130 135 140
Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Pro His Val Gln Lys
165 170 175
Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys
180 185 190
Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp
195 200 205
Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu
210 215 220
Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn
225 230 235 240
Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp
245 250 255
Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys
260 265 270
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu
275 280 285
Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro
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Asp Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
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Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
325 330 335
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
340 345 350
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
355 360 365
Ile Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu
385 390 395 400
Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu
405 410 415
Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly
420 425 430
Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu
435 440 445
Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu
450 455 460
Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu
465 470 475 480
His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu
485 490 495
Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe
500 505 510
Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly
515 520 525
Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr
530 535 540
Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro
545 550 555 560
Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
565
<210> 101
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 101
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile
20 25 30
Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu
35 40 45
Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala
50 55 60
Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn
65 70 75 80
Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro
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100 105 110
Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg
115 120 125
Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg
130 135 140
Thr His Gly Ser Glu Asp Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val
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Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu
165 170 175
Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser
180 185 190
Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr
195 200 205
Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
210 215
<210> 102
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 102
Glu Phe Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
35 40 45
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
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Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
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115 120 125
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
130 135 140
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
145 150 155 160
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
165 170 175
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
180 185 190
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
195 200 205
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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
225 230 235 240
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
245 250 255
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
260 265 270
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
275 280 285
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
305 310 315 320
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 103
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 103
Glu Phe Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
1 5 10 15
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
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50 55 60
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Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 104
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
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<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys
1 5 10 15
Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln Pro Pro Leu
20 25 30
Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln Asp Ile Leu
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50 55 60
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115 120 125
Ser Leu Ala Ile Phe
130
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
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<210> 107
<211> 79
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys
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35 40 45
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<213> 智人
<400> 108
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Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 109
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 110
<211> 132
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys
1 5 10 15
Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn
20 25 30
Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr
35 40 45
Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser
50 55 60
Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp
65 70 75 80
Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile
85 90 95
Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu
100 105 110
Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val
115 120 125
His His Val Ala
130
<210> 111
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 112
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Arg Asp Thr Ser Ala Thr Pro Gln Ser Ala Ser Ile Lys Ala Leu Arg
1 5 10 15
Asn Ala Asn Leu Arg Arg Asp Glu Ser Asn His Leu Thr Asp Leu Tyr
20 25 30
Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val Gln Ser
35 40 45
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65 70 75 80
Phe Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp Phe Val
85 90 95
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100 105 110
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130 135 140
Phe Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Phe Gln Pro Ala Ala Ala
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Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile Gln Leu
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Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro Pro Arg
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<213> 智人
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Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser
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Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val
65 70 75 80
Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys
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Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro
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Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp
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Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu
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Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly
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Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu
225 230 235 240
Lys Glu Arg Glu Phe Gln Glu Val
245
<210> 114
<211> 209
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
1 5 10 15
Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val
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195 200 205
His
<210> 115
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly
1 5 10 15
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195 200 205
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Val Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Ile Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr
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Val Arg Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu
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Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Ala
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<210> 116
<211> 361
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
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Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Gln Glu Ser
115 120 125
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245 250 255
Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Gly Thr His Pro
260 265 270
Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser Gln Arg Thr Asp Phe
275 280 285
Pro Tyr Val Ser Ala Ala Met Pro Cys Phe Val Ile Ile Ile Ile Leu
290 295 300
Cys Val Pro Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser Ala Ala Glu Gly Pro Glu
305 310 315 320
Leu Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His Pro Val Gly Thr Gly Asp
325 330 335
His Arg Asp Ala Ala Gln Leu Gly Phe Gln Pro Leu Met Ser Ala Thr
340 345 350
Gly Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Ala
355 360
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<211> 190
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Trp Val Asp Thr His Cys Leu Cys Tyr Asp Phe Ile Ile Thr Pro Lys
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Ser Arg Pro Glu Pro Gln Trp Cys Glu Val Gln Gly Leu Val Asp Glu
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180 185 190
<210> 118
<211> 191
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Gly Arg Ala Asp Pro His Ser Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro
1 5 10 15
Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp
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Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys Val Val Ala Met Ser Phe His Tyr Phe
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165 170 175
Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser
180 185 190
<210> 119
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
Asp Ala His Ser Leu Trp Tyr Asn Phe Thr Ile Ile His Leu Pro Arg
1 5 10 15
His Gly Gln Gln Trp Cys Glu Val Gln Ser Gln Val Asp Gln Lys Asn
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Glu Lys Asp Ser Gly Leu Thr Thr Phe Phe Lys Met Val Ser Met Arg
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Leu Glu Pro Thr Ala Pro Pro Thr Met Ala Pro Gly
180 185
<210> 120
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
His Ser Leu Cys Phe Asn Phe Thr Ile Lys Ser Leu Ser Arg Pro Gly
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<210> 121
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Gly Leu Ala Asp Pro His Ser Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro
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165 170 175
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180 185 190
Gly
<210> 122
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Arg Arg Asp Asp Pro His Ser Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro
1 5 10 15
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130 135 140
Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys Asp Val Ala Met Ser Phe His Tyr Ile
145 150 155 160
Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met
165 170 175
Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser Ser
180 185 190
Gly
<210> 123
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 123
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
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Arg
65
<210> 124
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 124
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ctctacagcc gggagaggta tatctgtaac agcggcttca agaggaaggc cggcaccagc 120
agcctcaccg agtgcgtgct gaataaggct accaacgtgg ctcactggac aacaccctct 180
ttaaagtgca tccgg 195
<210> 125
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 125
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
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65 70 75 80
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100 105 110
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<210> 126
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 126
aactgggtga acgtcatcag cgatttaaag aagatcgaag atttaattca gtccatgcat 60
atcgacgcca ctttatacac agaatccgac gtgcacccct cttgtaaggt gaccgccatg 120
aaatgttttt tactggagct gcaagttatc tctttagaga gcggagacgc tagcatccac 180
gacaccgtgg agaatttaat cattttagcc aataactctt tatccagcaa cggcaacgtg 240
acagagtccg gctgcaagga gtgcgaagag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300
caatcctttg tgcacattgt ccagatgttc atcaatacct cc 342
<210> 127
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 127
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
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Asn Val Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Glu Phe Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 128
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 128
cagatccagc tggtgcagag cggcggcgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgagggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc gactacaacg tgtactgggt gaggcagagc 120
cccggcaagg gcctggagtg gatcggctac atcgacccct acaacggcat caccatctac 180
gaccagaact tcaagggcaa ggccaccctg accgtggaca agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt acttctgcgc cagggacgtg 300
accaccgccc tggacttctg gggccagggc accaccgtga ccgtgagcag cgagttcgcc 360
agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420
accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 480
aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggcccc 720
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag gacccccgag 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gggaggagca gtacaacagc 900
acctacaggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1020
gccaagggcc agcccaggga gccccaggtg tacaccctgc cccccagcag ggacgagctg 1080
accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1200
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag caggtggcag 1260
cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320
aagagcctga gcctgagccc cggcaagtga 1350
<210> 129
<211> 210
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 129
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp Leu
20 25 30
Ala Trp Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala
35 40 45
Ala Thr Asn Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Thr Asp Phe Ser Phe Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
65 70 75 80
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln
85 90 95
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
100 105 110
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
115 120 125
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
130 135 140
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
145 150 155 160
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
165 170 175
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
180 185 190
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
195 200 205
Glu Cys
210
<210> 130
<211> 647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /标注 =“人工序列的描述：合成多核苷酸”
<400> 130
gacatccaga tgacccagag ccccgccagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgcc tggccagcca gaccatcgac acctggctgg cctggtacct gcagaagccc 120
ggcaagagcc cccagctgct gatctacgcc gccaccaacc tggccgacgg cgtgcccagc 180
aggttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcagcttca accatcagca gcctgcagcc 240
cgaggacttc gccacctact actgccagca ggtgtactag cagccccttc accttcggcc 300
agggcaccaa gctggagatc aagaggaccg tggccgcccc cagcgtgttc atcttccccc 360
ccagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgcctgctg aacaacttct 420
accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc ggcaacagcc 480
aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctgagc agcaccctga 540
ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaggtg acccaccagg 600
gcctgagcag ccccgtgacc aagagcttca acaggggcga gtgctga 647

Claims (70)

1.一种亲和色谱树脂，其包含附接到基础树脂的抗组织因子抗体或其抗原结合片段，所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段包含包含SEQ ID NO:1、2或9和3的CDR的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:4、5和6的CDR的轻链可变结构域。
2.根据权利要求1所述的亲和色谱树脂，其中所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。
3.根据权利要求2所述的亲和色谱树脂，其中所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:7，并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的亲和色谱树脂，其中所述基础树脂为琼脂糖凝胶。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的亲和色谱树脂，其中所述基础树脂为任何载体材料。
6.根据权利要求5所述的亲和色谱树脂，其中所述载体材料为琼脂糖或capto树脂。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的亲和色谱树脂，其中所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段非共价附接到所述基础树脂。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的亲和色谱树脂，其中所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段共价附接到所述基础树脂。
9.根据权利要求8所述的亲和色谱树脂，其中所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段中的半胱氨酸和所述基础树脂上的化学基团之间形成二硫键而共价附接到所述基础树脂。
10.根据权利要求8所述的亲和色谱树脂，其中所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段通过在所述抗组织因子抗体或抗原结合结构域的游离胺和所述基础树脂上的化学基团之间形成共价键而共价附接到所述基础树脂。
11.根据权利要求10所述的亲和色谱树脂，其中所述基础树脂为CNBr活化的或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的固体载体材料。
12.根据权利要求10所述的亲和色谱树脂，其中所述共价键由下式I表示：
Figure FDA0003872947880000011
其中R表示所述抗组织因子抗体或其抗原结合片段。
13.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的亲和色谱树脂。
14.一种纯化含有组织因子的蛋白质的方法，其包含使用根据权利要求1至12中任一项所述的亲和色谱树脂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法包含：
用包含所述含有组织因子的蛋白质的液体装载所述亲和色谱树脂；
使用一种或多种洗涤缓冲液洗涤所述亲和色谱树脂；和
使用洗脱缓冲液洗脱所述含有组织因子的蛋白质。
16.根据权利要求15所述的方法，其中包含所述含有组织因子的蛋白质的所述液体为澄清的液体培养基。
17.根据权利要求15所述的方法，其中包含所述含有组织因子的蛋白质的所述液体包含细胞裂解物。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述一种或多种洗涤缓冲液为：
(i)包含磷酸盐缓冲盐水的第一洗涤缓冲液；和
(ii)包含约0.01M至约0.2M柠檬酸盐并且pH为约4.5至约5.5的第二洗涤缓冲液。
19.根据权利要求18所述的方法，其中：
(i)所述第一洗涤缓冲液为磷酸盐缓冲盐水；和
(ii)所述第二洗涤缓冲液为pH为5.0的0.1M柠檬酸盐。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含0.01M至约0.2M乙酸盐并且pH为约2.5至约3.5。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含0.1M乙酸盐并且pH为约2.9。
22.一种制造含有组织因子的蛋白质的方法，其包含：
(i)使用根据权利要求14至21中任一项所述的方法纯化含有组织因子的蛋白质；和
(ii)对从步骤(i)获得的洗脱液执行一个或多个另外的单元操作。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述一个或多个另外的单元操作按顺序包含：
执行低pH病毒灭活；
执行深层过滤；
执行精制色谱；
执行纳滤；和
执行超滤和渗滤(UF/DF)。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的方法，其中所述含有组织因子的蛋白质为单链嵌合多肽。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包含：
(i)第一靶标结合结构域；
(ii)可溶性组织因子结构域；和
(iii)第二靶标结合结构域。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述单链嵌合多肽另外包含介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。
29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽另外包含介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域包含相同的氨基酸序列。
33.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一个或两个为抗原结合结构域。
35.根据权利要求25至34中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一个或两个结合到选自由以下组成的组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体和CD28的受体。
36.根据权利要求25至34中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述可溶性白介素、可溶性细胞因子蛋白或可溶性细胞表面蛋白选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、FLT3L、MICA、MICB和ULP16结合蛋白。
38.根据权利要求25至34中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素受体、可溶性细胞因子受体或可溶性细胞表面受体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述可溶性白介素受体、所述可溶性细胞因子受体或所述可溶性细胞表面受体为可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155或可溶性CD28。
40.根据权利要求25至39中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域为可溶性人组织因子结构域。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ IDNO:10至少80％相同的序列。
42.根据权利要求25至39中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包含以下中的任一个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
43.根据权利要求25至39中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包含以下中的一个或多个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
44.根据权利要求25至43中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽另外包含在所述单链嵌合多肽的N和/或C端的一个或多个另外的靶标结合结构域。
45.根据权利要求14至23中任一项所述的方法，其中所述含有组织因子的蛋白质为多链嵌合多肽。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述多链嵌合多肽包含：
(a)第一嵌合多肽，其包含：
(i)第一靶标结合结构域；
(ii)可溶性组织因子结构域；和
(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；
(b)第二嵌合多肽，其包含：
(i)一对亲和结构域中的第二结构域；和
(ii)第二靶标结合结构域，
其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的所述结合而缔合。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一嵌合多肽另外包含介于所述第一嵌合多肽中的所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域和所述一对亲和结构域中的所述第一结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
50.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽另外包含介于所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域与所述一对亲和结构域中的所述第一结构域之间的接头序列。
51.根据权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述一对亲和结构域中的所述第二结构域和所述第二靶标结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。
52.根据权利要求46至50中任一项所述的方法，其中第二嵌合多肽另外包含介于所述第二嵌合多肽中的所述一对亲和结构域中的所述第二结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
53.根据权利要求46至52中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。
54.根据权利要求46至52中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。
55.根据权利要求46至54中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一个或两个为抗原结合结构域。
56.根据权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一个或两个特异性结合到选自由以下组成的组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体和CD28的受体。
57.根据权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素或细胞因子蛋白。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述可溶性白介素、细胞因子或配体蛋白选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L。
59.根据权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一个或两个为可溶性白介素或细胞因子受体。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述可溶性受体为可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155或可溶性CD28。
61.根据权利要求46至60中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽另外包含一个或多个另外的靶标结合结构域。
62.根据权利要求46至61中任一项所述的多链嵌合多肽，其中所述第二嵌合多肽另外包含一个或多个另外的靶标结合结构域。
63.根据权利要求46至62中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域为可溶性人组织因子结构域。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包含与SEQ IDNO:10至少80％相同的序列。
65.根据权利要求46至62中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包含以下中的任一个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
66.根据权利要求46至62中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包含以下中的一个或多个：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；和
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
67.根据权利要求46至66中任一项所述的方法，其中所述一对亲和结构域为来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的寿司结构域和可溶性IL-15。
68.根据权利要求46至66中任一项所述的方法，其中所述一对亲和结构域选自由以下组成的组：芽胞杆菌核糖核酸酶和芽胞杆菌核糖核酸酶抑制子、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块以及基于蛋白质突触蛋白、突触结合蛋白、突触泡蛋白和SNAP25的相互作用的SNARE模块。
69.一种含有组织因子的蛋白质，其通过根据权利要求14至68中任一项所述的方法制造。
70.一种药物组合物，其包含根据权利要求69所述的制造的含有组织因子的蛋白质。
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